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AMPLIFICACIÓN
DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Heidy Cabrera, MSc.

Miguel Ángel Zúñiga, M.Sc.

El ADN es desnaturalizable

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MÉTODOS DE AMPLIFICACIÓN AN

• MÉTODOS DE AMPLIFICACIÓN

• Amplificación de diana

• Amplificación de sonda

• Amplificación de señal

• Combinación de las anteriores

MÉTODOS DE AMPLIFICACIÓN AN

Tietz-Textbook of Clinical Chemistry and Molecular Diagnostics-7ed-2018

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REACCIÓN EN CADENA
DE LA POLIMERASA (PCR)

PCR
Kary Mullis
(1944-2019)

Bioquímico
Americano

Premio Nobel de
Química de 1993

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¿Qué es PCR?

Amplificación de

secuencias

“Polymerase Chain específicas de ADN

Reaction” a través de ciclos

repetidos, de manera

rápida y confiable.

PCR
Es extremadamente sensible y requiere muy poco material de

partida.
Puede ser aplicada a:
• Investigación básica,

• Forense,

• Identidad genética,

• Control de calidad en industria,

• Diagnóstico in vitro,

• Biotecnología,

• Veterinaria,

• Agricultura, etc.

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PCR

COMPONENTES DE LA MEZCLA
DE REACCIÓN

DNA
Desoxinucleótidos
Polimeras ADN Pareja de trifosfatos (dNTPS):
a molde cebadores - dATP Tampón
H2O
(≈20
dsDNA o -dGTP mQ (≈pH 8.6)
nucleótid
cDNA -dTTP
Cofactore os)
-dCTP
s (MgCl2)

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REQUERIMIENTOS PCR
• Cebadores/iniciadores/primers
(Específicos o al Azar)
– Secuencias delimitantes de la región a
amplificar
• POLIMERASA TERMOESTABLE
– Taq pol (Thermus aquaticus) *
– Pfu pol (Pyrococcus furiosus)
– Vent pol (Thermococcus litoralis)

• ÁCIDO NUCLEICO DIANA (MOLDE)

– Usualmente DNA
DNA POLIMERASA:
– Puede ser RNA si se agrega una etapa Yellowstone National Park
extra (Transcripción reversa)

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Selección de región de interés

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Cebadores (Primers)
• Oligonucleótidos
sintéticos que
delimitan la región
específica que se
quiere amplificar
uniéndose por
complementariedad
de bases.
• Deben ser diseñados
de acuerdo con
criterios definidos.

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SELECCIÓN DE CEBADORES

• Longitud
– Conservación, tamaño y composición de
secuencia

• Temperatura de derretimiento o de fusión

(Tm, Temperature Melting)

– Temperatura a la cual 50% de los

cebadores unidos y 50% en solución
– Dependiente:
• Concentración
• Composición de la secuencia y
solvente
– Valor de Tm más próximo entre
cebadores.

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SELECCIÓN DE CEBADORES

• Especificidad de la secuencia diana

• Evitar homologías inter e intra cadenas

• Determina la temperatura de anillamiento (hibridación)

• Tm cebador forward = Tm cebador reverse

• Contenido de G/C de 40-60%

• Evitar repeticiones largas del mismo nucleótido (poly-x) – AAAAA
• Tamaño del producto:(100 – 1000 pb, PCR convencionales ) y (70 – 200pb, qPCR)

Tm= Temperatura de fusión (melting)

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Cálculo Tm de Primers
• Ecuación de Wallace:

Cálculo con http://biotools.nubic.northwestern.edu/OligoCalc.html

software:

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Temperatura de Hibridación (Ta)

• a= annealing (Hibridación)

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Termociclador

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CICLOS DE AMPLIFICACIÓN EN UNA

PCR

Desnaturalización por
calor (95°C)

Hibridación con los

Polimerización mediante
iniciadores específicas y
la polimerasa complementarios
(72°C)
(45-65°C).

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Detección de productos

• Electroforesis

30/5/22 Marcadores Moleculares - MEIZ-UNAH 20

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Detección de productos
• Electroforesis

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PCR TRANSCRIPCIÓN
REVERSA
La transcripción reversa es una técnica que permite sintetizar DNA complementario
(cDNA) a partir de RNA previamente extraído de una muestra, usando para ello la
enzima transcriptasa reversa. El cDNA obtenido es la cadena complementaria de la
cadena molde de RNA.
El ADNc puede utilizarse como templado (muestra) para la amplificación por PCR.

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PCR TRANSCRIPCIÓN REVERSA

Utilidad clínica:
• Diagnóstico de infecciones (virus RNA), desordenes Genéticos, investigación de evaluación de la expresión génica.

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PCR TRANSCRIPCIÓN
REVERSA
Ø Material de partida: RNA
Ø Enzimas Transcriptasa reversa.
• MMLV
• AMV
• Tth
• SuperScript

• Oligo-DTs, random primers o primers

específicos.
• dNTPs

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PCR TRANSCRIPCIÓN REVERSA

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PCR–TR vs. PCR convencional

Análisis de la cinética de la reacción Análisis de punto final
• Amplificación y detección del • Amplificación y detección
producto en cada ciclo de la de productos en 2 etapas
reacción. separadas.

• ↑ Sensibilidad
• Cuantificación (ADN, ADNc o ARN)

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PCR: Variantes
Singleplex (Convencional)

1. Multiplex 11. Colonia

2. Anidada (Nested) 12. Digital
3. Alelo-especifica ~ ARMS 13. Inversa
4. Transcripción Reversa 14. Fase sólida
5. Tiempo Real 15. VNTRs
(Cuantitativa) 16. Intersecuencia-específica
6. PCR Larga 17. Metilación-específica
7. Hot-Start 18. (…)
8. Touch-down
9. In-situ

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Multiplex PCR
• Varias parejas de cebadores en una
sola reacción.
• Las temperaturas de hibridación y
el tamaño de los amplicones deben
ser optimizadas.
• Ventajas:
– Controles internos
– Eficiencia (gasto de reactivos,
tiempo de preparación)

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Multiplex PCR

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Nested PCR
• Comprende dos rondas de amplificación con distintos pares de
cebadores en cada una, con el fin de incrementar la sensibilidad y la
especificidad de la detección.
• Primero se realiza una reacción con los cebadores externos para
amplificar una región de ADN mas extensa, que contiene el segmento
diana.
• Después, este producto de amplificación se utiliza como molde de una
segunda PCR con los cebadores internos para amplificar la región
específica.

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Allele-specific PCR

Se utiliza como técnica

de diagnóstico o clonación para
identificar o utilizar polimorfismos
de un solo nucleótido (SNPs)

Ø Farmacogenética
Ø Desordenes genéticos
Ø Microbiología

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Multiplex allele-specific
PCR

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Hot-Start PCR

• Elimina la producción de dímeros de primer causados por

la hibridación de los primers a bajas temperaturas (55ºC)
antes de que inicie el programa del termociclador
• Reduce la amplificación no específica durante las etapas
iniciales de la PCR
• Se usan anticuerpos o inhibidores covalentemente unidos
para inhibir la actividad polimerasa a temperatura baja.
• Usa enzimas especiales (Amplitaq Gold) que se activa a
94ºC

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Touch down PCR

Incrementa la especificidad

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Resumen
Pasos para llevar a cabo una PCR

Análisis posteriores

Detección de productos

Amplificación

Extracción de ácidos
nucleicos

Análisis In silico

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Análisis posteriores

Coleman-Diagnostic Molecular Pathology. A Guide to Applied Molecular Testing-2017

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Análisis posteriores
Restriction fragment length polymorphism (RFLP)

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Análisis posteriores
Restriction fragment length polymorphism (RFLP)

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Secuenciación
• Muchos métodos de análisis de ADN, ARN y proteínas se basan en el conocimiento
previo de la secuencia de nucleotidos de un genoma de interés.

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Mapa de enfermedades
• Muchas enfermedades, no son solo hereditarias, sino consecuencia de interacciones
complejas entre genes y factores ambientales afectando la expresión de genes.

Lewis-Human_Genetics_Concepts_and_
Applications-11ed-2015

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Muchas gracias

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