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REACCIÓN DE LA CADENA
DE POLIMERASA PCR

BIO. MSC. CARMEN BARBA G.

DOCENTE
UNIVERSIDAD TÉCNICA DE AMBATO
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OBJETIVOS

Conocer los fundamentos de amplificación de ADN por PCR

Establecer las ventajas y desventajas de la PCR

Reconocer el uso y aplicaciones de la PCR en la práctica

clínica

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REACCIÓN DE LA CADENA DE POLIMERASA (PCR)

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de laboratorio
utilizada para amplificar secuencias de ácidos nucleicos como: ADN, ARN.

La amplificación de ácidos nucleicos in vitro se realiza por medio de la

polimerización de las cadenas de éstos ácidos en un equipo conocido como
termociclador.
El propósito de la PCR es hacer muchas copias de un fragmento específico de
ADN o ARN, se realiza esta amplificación teniendo un mínimo de material
genético disponible.
Kary Mullis nacido en 1944, estadounidense, PhD en Bioquímica, en
1983 crea la técnica de la PCR(polymerase chain reaction) y en 1985
presenta su invento y utilizó la PCR para amplificar el gen de la Beta-
hemoglobina, para el diagnóstico prenatal de la anemia falciforme.
Por su descubrimiento gana el premio nobel de Química en 1993.

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Termociclador
Un termociclador consta de las partes siguientes: tapa deslizante, placa de
calentamiento, bandeja porta muestras (96 pocillos) pantalla con tecla de stop y teclas
de función variable, interruptor, teclas direccionales, numéricas y puerto USB.

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Preparación de la Mezcla Maestra (Master Mix)

Para iniciar el procedimiento se prepara la mezcla que esta compuesta de:

La polimerasa que se utiliza actualmente es la Taq

polimerasa obtenida de la bacteria Thermus acuaticus.

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Procedimiento

Se desarrolla en 3 pasos básicos que se repiten

de 25 veces o más: Desnaturalización,
Apareamiento o hibridación (Anneling) y
Polimerización o extensión.

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Reacción de la Cadena de Polimerasa PCR

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Análisis de la Muestra

La detección del producto de la PCR se realiza por lo general mediante un corrido

electroforético.
Dependiendo del tamaño de la amplificación y la resolución que deseamos, utilizamos
diferentes medios (agarosa, poliacrilamida) a distintas concentraciones.

La posterior visualización se puede realizar por bromuro de etidio, syber safe, tinción
de plata, fluorescencia, radioactividad en lámpara de luz UV o en el
fotodocumentador (Chimidoc).

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Ventajas

La PCR es la técnica que ofrece como principal ventaja general millones de

copias de la región de interés a partir de un fragmento de ADN (ARN)
A partir de una muestra pequeña de ADN o ARN se puede obtener una
cantidad suficiente para realizar un estudio.

Es una técnica robusta debido a la capacidad de los oligonucleótidos

iniciadores o primers de unirse firme y complementariamente a la región diana
aislando fácilmente ésta molécula en medio de millones de fragmentos de
ADN.
El proceso se puede utilizar para clonar, secuenciar y analizar muestras de
ácidos nucleicos.
Se puede amplificar el ADN de cualquier organismo vivo o muerto.

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Desventajas

La principal desventaja es la necesidad de estandarizar la técnica para el

organismo o la técnica de interés, lo cual puede ser tardado y costoso.

Se puede reproducir solamente partes del genoma, en donde se conoce por lo

menos una mínima secuencia de 20 a 40 pb.

Se necesitan cebadores (primers) específicos que sean complementarios al

fragmento que se desea amplificar.

Al momento de la polimerización puede darse errores al sintetizar el ADN.

Puede contaminarse con otro ADN o molécula (ARN o proteínas) que puede
ser del mismo investigador o cualquier otro.

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Utilidad

La PCR es la técnica más importante en la biología molecular porque con ella

se ha logrado la simplificación e innovación de muchas técnicas moleculares
que permiten abordar nuevas líneas de investigación en diferentes ramas de la
ciencia como: biotecnología, ecología, evolución, biología de la conservación,
arqueología, patología, medicina clínica y forense, entre otras.

Sus aplicaciones son múltiples en la práctica clínica como: en el diagnóstico

molecular, análisis prenatales, terapia génica, genotipificación, ancestría,
filogenia, farmacogenómica, pruebas de paternidad y pruebas de identificación
en criminalística.

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PCR una visión de la aplicación de esta técnica

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SECUENCIACIÓN

Bio. MsC. Carmen Barba G.

Docente
Universidad Técnica Ambato

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OBJETIVOS

Definir el fundamento de la técnica

Explicar el procedimiento de la técnica.

Secuenciación de Sanger

Conocer las aplicaciones

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SECUENCIACIÓN

La secuenciación del ADN principalmente determina el orden de los

nucleótidos de un fragmento de interés.

Existen distintos
métodos para la
secuenciación: -
Rotura química
(método de Maxan y
Gilbert).
Terminación de
cadena (secuenciación
de Sanger).
Secuenciación cíclica
térmica.

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Secuenciación Sanger

El principio de esta secuenciación es que el ADN polimerasa no puede añadir

nucleótidos a una cadena de ADN en crecimiento una vez que se incorpora un
análogo nucleotídico o sea un ddNPT que carece del grupo hidroxilo en posición 3’.

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Interpretación de los resultados

Los resultados de la secuenciación se leen en un electroferograma o
cromatograma.

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Secuenciación de Sanger

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Aplicaciones

Detección de mutaciones.
Secuenciación de ADN fósiles.
Diagnóstico de enfermedades genéticas.
Identificación de especies y control de cruces entre animales.
Proyecto de Genoma Humano.

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VENTAJAS DE LOS TEST MOLECULARES

• Análisis de desordenes en una muestra.

• Igual técnica para el diagnóstico de patologías.
• La presencia de una única mutación para algunas patologías facilita el
diagnóstico.
• Los resultados son objetivos y definitivos.
• Se puede predecir el fenotipo desde el genotipo en algunos
desordenes.
• Estas técnicas no son afectadas por factores como: prematuridad,
nutrición o edad.
• Toma de muestra no invasiva.
• Resultados relativamente rápidos.
• Permite individualizar el tratamiento basado en el genotipo.
• Posibilidad de realizar diagnóstico prenatal y estudio de portadores.

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CUESTIONARIO

• Explique el fundamento de la PCR

• Elabore un protocolo de el proceso de la PCR
• Describa las semejanzas y diferencias entre la PCR punto final y la PCR
tiempo real
• Diga ¿cuáles son las ventajas y desventajas de la PCR?
• Fundamente las aplicaciones de la PCR
• Explique en ¿qué consiste la Secuenciación?
• ¿Qué tipos de secuenciación existen y cuáles son la diferencia?
• Enuncie las aplicaciones de la Secuenciación en la biología molecular y la
clínica
• Establezca semejanzas y diferencias entre las técnicas moleculares estudiadas

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Atención

por su
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