Downstream Processing.

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Procesamiento en bajada
6.1 Introducción
El procesamiento aguas abajo sirve para (a) recuperar la proteína terapéutica de su fuente de células productoras
al finalizar la fase de procesamiento aguas arriba, (b) purificar la proteína y (c) formular la proteína en formato de
producto final.
En la Figura 6.1 se presenta una descripción general de los pasos que normalmente se llevan a cabo durante el
procesamiento posterior . El fabricante suele considerar confidenciales los detalles de los pasos exactos que se
llevan a cabo durante el procesamiento posterior de cualquier producto biofarmacéutico específico. Por lo tanto,
estos detalles rara vez se ponen a disposición del público en general. Sin embargo, en la Figura 6.2 se presenta un
posible procedimiento de procesamiento posterior para el tPA recombinante , y se proporcionan otros ejemplos en
varias etapas a lo largo del resto de este texto.
El procesamiento posterior se lleva a cabo en condiciones de sala limpia para proteger el flujo del producto de
la contaminación ambiental (Figura 6.3). Además, el agua utilizada como disolvente durante el procesamiento
posterior (y, de hecho, a menudo durante el procesamiento anterior) es 'agua para inyecciones' (WFI, por sus siglas
en inglés) altamente purificada. El agua potable (potable) estándar contiene contaminantes (p. ej., microorganismos,
materia orgánica y particulada disuelta, etc.) que podrían reaccionar directamente con la proteína o que tendrían
un efecto adverso sobre la salud del paciente si estuvieran presentes en el producto final. En la Figura 6.4 se
resume la generación de 'agua purificada' (usada a menudo para preparar medios para la fermentación microbiana)
junto con WFI aún más pura .
Todas las proteínas conservan su integridad estructural y actividad biológica solo en rangos de pH característicos.
Las proteínas se desnaturalizan fuera de estos rangos, perdiendo su estructura tridimensional característica y, por
lo tanto, su actividad (Capítulo 2). La mayoría de los productos biofarmacéuticos son estables solo a valores de pH
cercanos a la neutralidad (aproximadamente pH de 5 a 8 para muchos). Como tal, el procesamiento posterior no se
lleva a cabo usando WFI per se como solvente, sino soluciones tampón hechas de WFI.
Un tampón es una solución que resiste un cambio en su valor de pH incluso con la adición de pequeñas cantidades
de ácido o álcali y, por lo tanto, controla de manera efectiva el entorno de pH de la proteína.
Biotecnología farmacéutica: conceptos y aplicaciones Gary Walsh
© 2007 John Wiley & Sons, Ltd ISBN 978 0 470 01244 4 (HB) 978 0 470 01245 1 (PB)
132 PROCESAMIENTO DE DESCENSO DE CH6
Fermentación
Si la proteína se expresa Si la proteína se expresa
intracelularmente extracelularmente
Recuperación de células Eliminación de células de los
productoras (centrifugación o filtración) medios (centrifugación o filtración)
Disrupción celular
(homogeneización)
Eliminación
de restos
celulares
(centrifugación o filtración)
Concentración de medios extracelulares
Purificación/concentración inicial
que contienen producto (ultrafiltración o
(ultrafiltración/intercambio de iones
precipitación)
o precipitación)
purificación
cromatográfica;
generalmente 24 pasos
cromatográficos
Ajuste de potencia
y adición de excipientes
Filtración estéril y
llenado aséptico
Secar en frío
preparación de polvo preparación líquida
Sellado del envase del
producto final, etiquetado y embalaje
Figura 6.1 Descripción general de un procedimiento generalizado de procesamiento posterior empleado para producir un producto biofarmacéutico (proteína) terminado. El control de calidad también juega
un papel destacado en el procesamiento posterior. El personal de control de calidad recolecta muestras de productos durante/después de cada etapa del procesamiento. Estas muestras se analizan para
garantizar que se cumplan varias especificaciones en proceso. De esta manera, el proceso de producción está estrictamente controlado en cada
escenario
(centrifugación)
Homogeneización
solubilización
intercambio de aniones
cromatografía
cromatografía
Figura 6.2 Procedimiento de purificación probable para tPA producido en células de E. coli recombinantes. El producto heterólogo
se acumula intracelularmente en forma de cuerpos de inclusión. En este procedimiento particular, se introduce un paso de
ultrafiltración en varias ocasiones para concentrar la corriente de producto, particularmente antes de la aplicación a las columnas
cromatográficas. Se emplea cromatografía de afinidad con lisina (cromatografía Lys), ya que se sabe que el tPA se une a
moléculas de lisina inmovilizadas. Adaptado con permiso de Bio/Technology (1993), 11, 351
Figura 6.3 Fotografía que ilustra una sala limpia farmacéutica típica y algunos de los equipos que normalmente se encuentran
en ella. Tenga en cuenta la presencia de una cortina de tiras de polietileno (transparente) de gran calibre (que se nota más
directamente frente al operador). Estas tiras encajan en una estación de trabajo de flujo laminar de grado A. El llenado del
producto en los contenedores del producto final se realiza dentro de la zona de grado A. El proceso de llenado está altamente
automatizado y no requiere contacto directo entre el operador y el producto. Esto minimiza las posibilidades de contaminación
accidental del producto por parte del personal de producción. Fotografía cortesía de SmithKline Beecham Biological Services, sa, Bélgica
Agua
potable entrante
Trampa organica Carbón activado
Filtración profunda intercambiador de aniones
agua para Destilación
inyecciones (u ósmosis inversa Filtración intercambiador de cationes
(WFI) en algunos casos)
Agua purificada
Figura 6.4 Descripción general de un procedimiento generalizado mediante el cual se generan agua purificada y WFI en una instalación
farmacéutica. Consulte el texto para obtener detalles específicos
6.2 Recuperación inicial del producto
El paso inicial de cualquier procedimiento de procesamiento posterior implica la recuperación de la proteína de su
fuente. La complejidad de este paso depende en gran medida de si el producto es intracelular o extracelular (Figura
6.1). En general, los productos biofarmacéuticos derivados de cultivos de células animales se secretan en los medios
(es decir, se producen como proteínas extracelulares), mientras que el producto se acumula intracelularmente en
muchos tipos de células productoras procarióticas recombinantes. En ambos casos, el procesamiento anterior va
seguido de la recolección inicial (cosecha) de las células. Esto normalmente se logra mediante centrifugación o, a
veces, microfiltración. Si el producto es extracelular, entonces la pasta celular generalmente se inactiva (por ejemplo,
en autoclave) y se desecha, mientras que el fluido extracelular que contiene el producto se somete a un procesamiento
adicional. En el caso del producto intracelular, la recuperación celular es seguida por la disrupción celular para liberar
los contenidos intracelulares, incluida la proteína de interés.
6.3 Disrupción celular
La ruptura de las células microbianas se hace difícil debido a la presencia de la pared celular microbiana.
A pesar de esto, existen varios sistemas muy eficientes que son capaces de alterar grandes cantidades de biomasa
microbiana (Cuadro 6.1). Las técnicas de disrupción, como la sonicación o el tratamiento con la enzima lisozima,
generalmente se limitan a operaciones a escala de laboratorio, debido a limitaciones del equipo o por motivos
económicos.
Los procedimientos de extracción de proteínas que emplean productos químicos tales como detergentes son
efectivos en muchos casos, pero adolecen de una serie de inconvenientes, uno de los cuales es que a menudo inducen
la desnaturalización y precipitación de proteínas. Esto obviamente limita su utilidad. Además, incluso si
los productos químicos empleados no afectan negativamente a la proteína, su presencia puede afectar negativamente
a un paso de purificación posterior (por ejemplo, la presencia de detergente puede evitar que las proteínas se unan a un
columna de interacción hidrofóbica). Además, la presencia de tales materiales en la preparación final, incluso en
pequeñas cantidades, puede ser inaceptable por razones médicas.
La alteración de las células microbianas (y, de hecho, de algunos tipos de tejidos animales/vegetales) se logra con
mayor frecuencia mediante métodos mecánicos, como la homogeneización o la agitación vigorosa con abrasivos.
DISRUPCIÓN CELULAR 135
Tabla 6.1 Algunas técnicas químicas, físicas y basadas en enzimas que pueden emplearse para lograr
la disrupción de células microbianas
Tratamiento con productos químicos:
detergentes
antibióticos
disolventes (por ejemplo, tolueno,
acetona) agentes caotrópicos (por ejemplo, urea, guanidina)
Exposición a condiciones alcalinas
Sonicación
Homogeneización
Agitación en presencia de abrasivos (generalmente perlas de vidrio)
Tratamiento con lisozima
Durante el proceso de homogeneización, se fuerza una suspensión celular a través de un orificio de diámetro interno
muy estrecho a presiones extremadamente altas. Esto genera fuerzas de cizallamiento extremadamente altas. A medida
que la suspensión microbiana pasa por el punto de salida, experimenta una caída de presión casi instantánea hasta la
presión atmosférica normal. Las altas fuerzas de cizallamiento y la subsiguiente caída de presión rápida actúan como
fuerzas de disrupción celular muy efectivas y dan como resultado la ruptura de la mayoría de los tipos de células
microbianas (Figura 6.5). En la mayoría de los casos, un solo paso a través del homogeneizador da como resultado una
rotura adecuada de la celda, pero también es posible recircular el material a través del sistema para un segundo o tercer
paso.
Un sistema de enfriamiento eficiente minimiza la desnaturalización de la proteína (de lo contrario, se produciría una
desnaturalización debido a la considerable cantidad de calor generado durante el proceso de homogeneización). Ahora
se encuentran disponibles homogeneizadores capaces de manejar grandes cantidades de suspensiones celulares,
muchos de los cuales pueden procesar eficientemente varios miles de litros por hora.
Un método adicional empleado a menudo para lograr la disgregación de células microbianas, tanto a nivel de
laboratorio como a escala industrial, implica la agitación celular en presencia de perlas de vidrio. En tales molinos de
perlas, los microorganismos se colocan en una cámara junto con una cantidad de perlas de vidrio de 0,2 a 0,3 mm de
diámetro. Luego, esta mezcla se agita vigorosamente, lo que da como resultado
Figura 6.5 Representación esquemática de un homogeneizador de células. Esto representa uno de una serie de instrumentos que se
utilizan de forma rutinaria para romper células microbianas y, en algunos casos, tejido animal o vegetal.
CONCENTRACIÓN INICIAL DEL PRODUCTO 136
en numerosas colisiones entre las células microbianas y las perlas de vidrio. También da como resultado la trituración de
células entre las perlas giratorias. Estas fuerzas promueven la disrupción eficiente de la mayoría de los tipos de células
microbianas. Los parámetros operativos, como la proporción de células a perlas y la velocidad/duración de la agitación,
pueden ajustarse para lograr una ruptura óptima de las células particulares en cuestión.
Los sistemas de laboratorio pueden homogeneizar varios gramos de células microbianas en minutos. Los sistemas de
molienda de perlas a escala industrial pueden procesar más de 1000 l de suspensión celular por hora. Los sistemas de
refrigeración minimizan la inactivación de proteínas al disipar el considerable calor generado durante este proceso.
Una vez completada la etapa de homogeneización, los residuos celulares y cualquier célula intacta restante pueden
eliminarse mediante centrifugación o microfiltración. Como se mencionó anteriormente, estas técnicas también se utilizan
para eliminar células enteras del medio durante las etapas iniciales de la purificación de proteínas extracelulares.
6.4 Eliminación de ácido nucleico
En algunos casos, es deseable/necesario eliminar/destruir el contenido de ácido nucleico de un homogeneizado celular
antes de la posterior purificación de la proteína intracelular liberada. La liberación de grandes cantidades de ácidos nucleicos
a menudo aumenta significativamente la viscosidad del homogeneizado celular.
Esto generalmente hace que el homogeneizado sea más difícil de procesar, particularmente a escala industrial. Los
aumentos significativos en la viscosidad imponen demandas adicionales sobre el método de eliminación de desechos
celulares empleado. Es posible que se requieran fuerzas centrífugas aumentadas durante períodos de tiempo más
prolongados para recolectar restos celulares (pellets) en tales soluciones de manera eficiente. Si se emplea un sistema de
filtración para eliminar los desechos celulares, el aumento de la viscosidad también afectará negativamente el caudal y el
rendimiento del filtro.
La eliminación eficaz de ácidos nucleicos es especialmente importante cuando se purifica una proteína destinada a un
uso terapéutico. Las autoridades reguladoras generalmente insisten en que el contenido de ácido nucleico presente en la
preparación final sea, como máximo, de unos pocos picogramos por dosis terapéutica (consulte el Capítulo 7).
La eliminación efectiva de ácidos nucleicos durante la purificación de proteínas puede lograrse mediante precipitación o
mediante tratamiento con nucleasas. Varias moléculas catiónicas (cargadas positivamente) son precipitantes efectivos de
ADN y ARN; forman complejos con los ácidos nucleicos cargados negativamente y los precipitan. El precipitante más
comúnmente empleado es la polietilenimina, un polímero catiónico de cadena larga. A continuación, se elimina el
precipitado, junto con los restos celulares, mediante centrifugación o filtración.
Sin embargo, a menudo se desaconseja el uso de polietilenimina durante la purificación de proteínas destinadas a
aplicaciones terapéuticas, ya que pueden estar presentes pequeñas cantidades de monómero sin reaccionar en la
preparación de polietilenimina. Tales especies monoméricas pueden ser cancerígenas. Si se utiliza polietilenimina en tales
casos, entonces se debe demostrar que los pasos de procesamiento subsiguientes son capaces de eliminar de manera
efectiva y completa cualquiera de los polímeros o sus unidades monoméricas que puedan permanecer en solución.
Los ácidos nucleicos también pueden eliminarse mediante tratamiento con nucleasas, que catalizan la degradación
enzimática de estas biomoléculas. De hecho, el tratamiento con nucleasas se está convirtiendo rápidamente en el método
más popular de eliminación de ácidos nucleicos durante la purificación de proteínas. Este tratamiento es eficaz, económico
y, a diferencia de muchos de los precipitantes químicos utilizados, las preparaciones de nucleasas en sí mismas son inocuas
y no comprometen el producto proteico final.
6.5 Concentración inicial del producto
La siguiente fase del procesamiento posterior generalmente implica la concentración del producto de proteína cruda.
Esto produce volúmenes de producto más pequeños, que son más convenientes para trabajar y pueden procesarse
posteriormente con mayor velocidad. La concentración puede lograrse induciendo la precipitación del producto usando
sales, como sulfato de amonio, o solventes, como etanol. A continuación, se recoge el precipitado (normalmente
mediante centrifugación, pero también potencialmente mediante filtración) y se vuelve a disolver en un pequeño
volumen de tampón de procesamiento. La cromatografía de intercambio iónico (en la que las proteínas se unen a
perlas cargadas inmovilizadas en una columna) también se puede utilizar potencialmente para concentrar soluciones
de proteínas. Esto se discute más adelante en este capítulo. Ambos métodos también dan como resultado una
purificación de proteínas limitada, ya que no todos los tipos de proteínas presentes en la preparación cruda
coprecipitarán o se unirán al intercambiador de iones junto con la proteína objetivo. Sin embargo, la ultrafiltración es,
con mucho, el método más común que se usa ahora para lograr la concentración inicial del producto.
6.5.1 Ultrafiltración
Como se discutió anteriormente, la técnica de microfiltración se utiliza de manera efectiva para eliminar células enteras
o restos celulares de la solución. Los filtros de membrana empleados en el proceso de microfiltración generalmente
tienen diámetros de poro que oscilan entre 0,1 y 10 m. Dichos poros, aunque retienen células enteras y partículas
grandes, no retienen la mayoría de los componentes macromoleculares, como las proteínas. En el caso de las
membranas de ultrafiltración, los diámetros de los poros normalmente oscilan entre 1 y 20 nm. Estos poros son lo
suficientemente pequeños para retener proteínas de baja masa molecular. Las membranas de ultrafiltración con puntos
de corte de masa molecular que van de 1 a 300 kDa están disponibles comercialmente. Las membranas con puntos
de corte de masa molecular de 3, 10, 30, 50 y 100 kDa son las más utilizadas.
Tradicionalmente, los ultrafiltros se han fabricado a partir de acetato de celulosa o nitrato de celulosa.
Varios otros materiales, como el cloruro de polivinilo y el policarbonato, ahora también se utilizan en la fabricación de
membranas. Tales membranas de tipo plástico exhiben una estabilidad química y física mejorada en comparación
con las membranas de ultrafiltración basadas en celulosa. Un requisito previo importante en la fabricación de ultrafiltros
es que el material utilizado exhiba propiedades de adsorción bajas en proteínas.
La ultrafiltración generalmente se lleva a cabo a escala de laboratorio utilizando un sistema de celda agitada (Figura
6.6a). La membrana plana se coloca sobre una malla de soporte en el fondo de la cámara de la celda y la
el material a concentrar se transfiere luego a la celda. Aplicación de presión, generalmente nitrógeno
gas, asegura un flujo adecuado a través del ultrafiltro. Las moléculas de menor masa molecular que el tamaño de poro
de corte del filtro (por ejemplo, agua, sal y compuestos de bajo peso molecular) pasan todas a través del ultrafiltro,
concentrando así las especies moleculares presentes cuya masa molecular es significativamente mayor que el punto
de corte de masa molecular. La polarización por concentración (la acumulación de una capa concentrada de moléculas
directamente sobre la superficie de la membrana que no pueden atravesar la membrana) se minimiza mediante un
mecanismo de agitación que opera cerca de la superficie de la membrana. Si no se controla, la polarización de la
concentración daría como resultado una disminución del caudal. Los formatos de ultrafiltro adicionales utilizados a
escala de laboratorio incluyen sistemas de cartucho, dentro de los cuales la membrana de ultrafiltración está presente
en un formato altamente plegado. En tales casos, la presión necesaria para mantener un caudal satisfactorio a través
de la membrana suele generarse mediante una bomba peristáltica.
N2 bajo
presión
molécula de proteína ultrafiltro
de bajo peso molecular
molécula de peso
Soporte poroso
para filtro
Efluente
(a) (b)
Foto cortesía de Elga Ltd.
(C)
Figura 6.6 La ultrafiltración separa las moléculas según su tamaño y forma. (a) Representación esquemática de un sistema
típico de ultrafiltración a escala de laboratorio. La muestra (p. ej., solución de proteína cruda) se coloca en la cámara de
ultrafiltración, donde se asienta directamente sobre la membrana del ultrafiltro. La membrana, a su vez, se asienta sobre un
soporte macroporoso para dotarla de resistencia mecánica. Luego se aplica presión (generalmente en forma de gas inerte),
como se muestra. Las moléculas más grandes que el diámetro del poro (p. ej., proteínas grandes) se retienen en el lado aguas
arriba de la membrana del ultrafiltro. Sin embargo, las moléculas más pequeñas (particularmente las moléculas de agua) son
fácilmente forzadas a través de los poros, concentrando así efectivamente la solución de proteína (ver también (b)). Se pueden
fabricar membranas que muestran diferentes tamaños de poro, es decir, tienen diferentes puntos de corte de masa molecular. (c) Fotografía
representación de un sistema de ultrafiltración a escala industrial (fotografía cortesía de Elga Ltd, Reino Unido)
Los sistemas de ultrafiltración a gran escala emplean invariablemente filtros tipo cartucho (Figura 6.6c).
Esto permite acomodar una gran superficie de filtración en un área compacta. La polarización por
concentración se evita permitiendo que el líquido entrante fluya a través de la superficie de la membrana en
ángulo recto, es decir, flujo tangencial. La membrana de ultrafiltración puede ser plisada, con posterior unión
de los dos extremos para formar un cartucho cilíndrico. Alternativamente, la membrana se puede colocar
sobre una malla espaciadora y luego se puede envolver en espiral alrededor de un tubo de recolección central,
en el que puede fluir el filtrado.
Otra configuración de membrana muy utilizada es la de las fibras huecas. En este caso, la carcasa del cartucho cilíndrico
hueco se carga con haces de fibras huecas. Las fibras huecas tienen una apariencia exterior algo similar a una pajilla para
beber, aunque sus diámetros internos pueden ser
considerablemente más pequeño. En esta configuración, el líquido a filtrar se bombea a través del núcleo central de las
fibras huecas. Las moléculas de masa molecular más baja que el punto de corte nominal de la membrana pasan a través
de las paredes de la fibra hueca. El permeado, que sale de las fibras huecas en toda su longitud, se drena del cartucho a
través de una válvula. El concentrado emerge por el otro extremo de la fibra hueca y es recogido por un tubo de salida;
esto se conoce como el retenido. A continuación, normalmente se desecha el permeado, mientras que el retenido, que
contiene la proteína de interés, se sigue procesando. El retenido se puede reciclar a través del sistema si se requiere una
mayor concentración.
La ultrafiltración se ha vuelto prominente como un método de concentración de proteínas para una variedad de
razones:
• el método es muy suave y tiene pocos efectos adversos sobre la bioactividad de las moléculas de proteína;
• Por lo general, se registran altas tasas de recuperación, y algunos fabricantes afirman recuperaciones de más de
99 por ciento;
• los tiempos de procesamiento son rápidos en comparación con métodos alternativos de concentración;
• se requiere poco equipo auxiliar.
Un inconveniente relacionado con esta técnica de filtración es su susceptibilidad a la rápida obstrucción de la membrana.
Las soluciones viscosas también provocan disminuciones rápidas en las tasas de flujo y tiempos de procesamiento
prolongados.
La ultrafiltración también se puede utilizar para lograr una serie de otros objetivos. Como se discutió anteriormente,
puede producir un grado limitado de purificación de proteínas y también puede ser eficaz para despirogenizar soluciones.
Esto se discutirá más adelante en el Capítulo 7. La técnica también se usa ampliamente para eliminar moléculas de bajo
peso molecular de soluciones de proteínas mediante diafiltración.
6.5.2 Diafiltración
La diafiltración es un proceso mediante el cual se utiliza un sistema de ultrafiltración para reducir o eliminar moléculas de
bajo peso molecular de una solución y, a veces, se emplea como parte del procesamiento biofarmacéutico posterior. En
la práctica, esto normalmente implica la eliminación de, por ejemplo, sales, etanol y otros disolventes, componentes
tampón, aminoácidos, péptidos, estabilizadores de proteínas añadidos o
otras moléculas de una solución de proteína. La diafiltración generalmente está precedida por un paso de ultrafiltración
para reducir inicialmente los volúmenes del proceso. El proceso de diafiltración real es idéntico al de la ultrafiltración,
excepto por el hecho de que el nivel del depósito se mantiene a un volumen constante. Esto se logra mediante la adición
continua de disolvente que carece de las moléculas de bajo peso molecular que se van a eliminar. Al reciclar el material
concentrado y agregar suficiente solvente fresco al sistema de tal manera que cinco veces el volumen original haya
emergido del sistema como permeado, más del 99
el porcentaje de todas las moléculas que atraviesan libremente la membrana habrán sido eliminadas ('enjuagadas') de la solución.
La eliminación de contaminantes de bajo peso molecular de las soluciones de proteínas también se puede lograr mediante otras
técnicas, como la diálisis o la cromatografía de filtración en gel. Sin embargo, la diafiltración se está convirtiendo en el método de
elección, ya que es rápido, eficiente y utiliza el mismo equipo que se usa en la ultrafiltración.
6.6 Purificación cromatográfica
Una vez que la proteína se recupera de su fuente productora y se concentra, debe purificarse hasta homogeneidad. En otras
palabras, se deben eliminar todas las proteínas contaminantes y otros contaminantes potenciales de importancia médica potencial
(discutidos en el Capítulo 7). La purificación se logra generalmente por cromatografía en columna.
La cromatografía en columna se refiere a la separación de diferentes tipos de proteínas entre sí según su reparto diferencial
entre dos fases: una fase estacionaria sólida (las perlas cromatográficas, normalmente empaquetadas en una columna cilíndrica)
y una fase móvil (normalmente un tampón). Con la excepción de la filtración en gel, todas las formas de cromatografía utilizadas
en los protocolos de purificación de proteínas son de naturaleza adsortiva. La mezcla de proteínas se aplica a la columna
(generalmente) en condiciones que promuevan la retención selectiva de la proteína objetivo. Idealmente, esta proteína diana
debería ser la única retenida en la columna, pero esto rara vez se logra en la práctica. Después de la aplicación de la muestra, la
columna se lava ("irriega") con fase móvil para eliminar todo el material no unido. Luego se altera la composición de la fase móvil
para promover la desorción de la proteína unida. Las fracciones del eluato se recogen en tubos de ensayo, que luego se analizan
tanto para la proteína total como para la proteína de interés (Figura 6.7). Las fracciones que contienen la proteína objetivo se
agrupan y se someten al siguiente paso del proceso de purificación.
Los tipos de proteínas individuales poseen una variedad de características que los distinguen de otros
moléculas de proteína. Tales características incluyen el tamaño y la forma, la carga general, la presencia de grupos hidrófobos en
la superficie y la capacidad de unirse a diversos ligandos. Un buen número de moléculas de proteína pueden ser similares entre
sí si se comparan sobre la base de cualquiera de esas características. Todos los tipos de proteínas, sin embargo, presentan su
propia combinación única de características, una 'huella digital' cromatográfica de proteínas. Se han desarrollado varias técnicas
cromatográficas que separan las proteínas entre sí sobre la base de las diferencias en dichas características (Tabla 6.2). La
utilización de cualquiera de estos métodos para explotar el carácter distintivo molecular generalmente da como resultado un
aumento espectacular en la pureza de la proteína de interés. Puede emplearse una combinación de métodos para producir
preparaciones de proteínas altamente purificadas.
En general, se emplea una combinación de dos a cuatro técnicas cromatográficas diferentes en un procedimiento típico de
procesamiento posterior. La filtración en gel y la cromatografía de intercambio iónico se encuentran entre las más comunes. La
cromatografía de afinidad se emplea siempre que es posible, ya que su alta bioespecificidad facilita la consecución de un grado
de purificación muy alto. Los ejemplos incluyen el uso de cromatografía de inmunoafinidad para purificar factor VIII sanguíneo y
cromatografía de afinidad de lisina para purificar tPA.
Como ocurre con la mayoría de los aspectos del procesamiento posterior, el funcionamiento de los sistemas cromatográficos
está altamente automatizado y, por lo general, controlado por computadora. Mientras que las columnas cromatográficas a escala
de proceso de tamaño medio (por ejemplo, de 5 a 15 l de capacidad) se fabrican con vidrio templado o plástico, las más grandes
PURIFICACIÓN CROMATOGRÁFICA 141
1. Aplicar una muestra que contenga proteínas
2. Irrigar con tampón (lavar el material no adherido)
3. Aplicar tampón de elución y recoger fracciones
Ensayo para
la proteína diana
A280
aicnabrosbA
Recolectar fracciones 5 10 15 20 25 30
cuando se aplica tampón
Número de fracción
de elución
(a) (b)
Figura 6.7 (a) Secuencia típica de eventos realizados durante un paso cromatográfico de purificación de proteínas (basado en adsorción). Tenga
en cuenta que las perlas cromatográficas no están dibujadas a escala y, en realidad, muestran diámetros de 0,1 mm. Las fracciones recolectadas
durante la desorción de proteínas se analizan para determinar (i) la proteína total, generalmente midiendo la absorbancia a 280 nm, y (ii) la actividad
de la proteína objetivo. (b) En el caso ilustrado, son evidentes dos picos principales de proteína, de los cuales solo uno contiene la proteína de
interés. Así, los pasos de desorción y adsorción
puede resultar en una purificación selectiva
Hay disponibles columnas de procesamiento fabricadas en acero inoxidable. La separación cromatográfica a escala de
proceso generalmente se lleva a cabo a baja presión, pero a veces se utilizan sistemas de alta presión a escala de
producción (es decir, HPLC a escala de proceso), siempre que el producto proteico no se vea afectado negativamente por
la alta presión experimentada. A veces se emplea un "paso de pulido" basado en HPLC,
por ejemplo, durante la producción de preparaciones de insulina altamente purificada (Capítulo 11). A continuación,
consideraremos individualmente las formas más comunes de cromatografía utilizadas para purificar proteínas terapéuticas.
Tabla 6.2 Técnicas cromatográficas más utilizadas en los protocolos de purificación de proteínas. La base de separación se enumera en
cada caso.
Técnica Base de separación
Cromatografía de intercambio de iones Diferencias en la carga superficial de la proteína a un pH dado
Cromatografía de filtración en gel Diferencias en masa/forma de diferentes proteínas
Cromatografía de afinidad Basado en la interacción bioespecífica entre una proteína y un ligando
apropiado
Cromatografía de interacción hidrofóbica Diferencias en la hidrofobicidad de la superficie de las proteínas.
Cromatoenfoque Separa las proteínas en función de sus puntos isoeléctricos.
Cromatografía de hidroxiapatita Interacciones complejas entre las proteínas y el calcio
medios a base de fosfato; no completamente entendido
6.6.1 Cromatografía de exclusión por tamaño (filtración en gel)
La cromatografía de exclusión por tamaño, también denominada cromatografía de permeación en gel o filtración en gel, separa las
proteínas en función de su tamaño y forma. Dado que se considera que la mayoría de las proteínas fraccionadas mediante esta
técnica tienen una forma molecular aproximadamente similar, la separación se describe a menudo basándose en la masa molecular,
aunque tal descripción es algo simplista.
El fraccionamiento de proteínas mediante cromatografía de exclusión por tamaño se logra filtrando la solución que contiene
proteínas a través de una columna rellena con una matriz de gel poroso en forma de perlas (Figura 6.8). A medida que la muestra
desciende por la columna, las proteínas grandes no pueden entrar en las perlas de gel y, por lo tanto, eluyen rápidamente. Se
retarda el progreso de las proteínas más pequeñas a través de la columna, ya que tales moléculas son capaces de entrar en las
perlas de gel. La estructura interna de las perlas de la matriz podría visualizarse como un laberinto, a través del cual deben pasar
proteínas lo suficientemente pequeñas como para entrar en el gel. Varias rutas posibles a través de este laberinto son de distancias
variadas. Por tanto, todas las proteínas capaces de entrar en el gel no se retienen dentro de la matriz del gel durante períodos de
tiempo iguales. Cuanto más pequeña es la proteína, más rutas internas potenciales se le abren y, por lo tanto, generalmente, más
tiempo se retiene dentro de la estructura de la perla. Las moléculas de proteína, por lo tanto, normalmente se eluyen de una columna
de filtración en gel en orden de tamaño molecular decreciente.
En la mayoría de los casos, las matrices de gel utilizadas se preparan químicamente entrecruzando moléculas poliméricas como
dextrano, agarosa, acrilamida y polímeros vinílicos. El grado de reticulación controla el tamaño medio de poro del gel preparado.
La mayoría de los geles sintetizados a partir de cualquier tipo de polímero están disponibles en una variedad de tamaños de poro.
Cuanto mayor sea el grado de reticulación introducido, menor será el tamaño medio de los poros y más rígida será la perla de gel
resultante. Las matrices de gel altamente entrecruzadas tienen tamaños de poro que impiden que todas las proteínas entren en la
matriz de gel. Dichos geles se pueden usar para separar proteínas de otras moléculas que son órdenes de magnitud más pequeñas
y, a menudo, se usan para eliminar componentes tampón de bajo peso molecular y sales de soluciones de proteínas ( Figura
6.9).
La cromatografía de exclusión por tamaño rara vez se emplea durante las etapas iniciales de la purificación de proteínas. Se
deben aplicar pequeños volúmenes de muestra a la columna para lograr una resolución efectiva.
Los volúmenes de aplicación suelen oscilar entre el 2% y el 5% del volumen de la columna. Además, las columnas se ensucian
fácilmente con una variedad de impurezas de la muestra. Por lo tanto, la cromatografía de exclusión por tamaño se emplea a
menudo hacia el final de una secuencia de purificación, cuando la proteína de interés ya es relativamente pura y está presente en
un volumen pequeño y concentrado. Después de la aplicación de la muestra, los componentes proteicos se eluyen progresivamente
de la columna lavándolos con un tampón adecuado. En muchos casos, el eluato de la columna pasa por un detector. Esto facilita la
detección inmediata de bandas que contienen proteínas a medida que eluyen de la columna. El eluato normalmente se recoge como
una serie de fracciones. En una escala preparativa, cada fracción puede ser un número de litros en volumen. Aunque la cromatografía
de exclusión por tamaño es una técnica de fraccionamiento efectiva, generalmente resulta en una dilución significativa de la solución
de proteína en relación con el volumen inicial.
aplicado a la columna. Las velocidades de flujo de la columna también suelen ser considerablemente más bajas que las velocidades
de flujo empleadas con otros medios cromatográficos. Esto da como resultado largos tiempos de procesamiento que, para
aplicaciones industriales, tiene implicaciones adversas en el costo del proceso.
6.6.2 Cromatografía de intercambio iónico
Varios de los 20 aminoácidos que constituyen los componentes básicos de las proteínas exhiben cadenas laterales cargadas. A pH
7,0, los ácidos aspártico y glutámico tienen una carga ácida globalmente negativa.
Figura 6.8 Columnas cromatográficas. La columna de vidrio ilustrada en (a) es fabricada por Merck. Hay disponible una amplia variedad de columnas
(que varían en tamaño desde 1 ml hasta varios litros, y construidas de vidrio/plástico o acero inoxidable) de este y otros fabricantes (p. ej., BioRad y
Pharmacia Biotech). (b)
Sistema cromatográfico a escala de proceso. Este sistema en particular es utilizado por una empresa de biotecnología con sede en el Reino Unido en el
fabricación de un fármaco (proteico) para ensayos clínicos. La columna real se coloca a la izquierda de la imagen.
Columna que contiene
bajo peso molecular Bajo mol. peso sustancia
perlas cromatográficas
sustancia de peso A (fracción proteica) 280
Bajo mol. peso
sustancia ha
entrado en las
Proteína cuentas
Muestra a aplicar
a la columna
(a)
Fracción No.
(C)
fracciones
(b)
Figura 6.9 La aplicación de la cromatografía de filtración en gel para separar proteínas de moléculas de peso molecular mucho más bajo. La fase
móvil (el 'tampón de ejecución') estará desprovista de las especies moleculares que se eliminarán de la proteína. Se utilizan perlas porosas altamente
reticuladas, que excluyen todas las moléculas de proteína. Sin embargo, las sustancias de menor peso molecular pueden entrar en las perlas; por lo
tanto, se retardará su avance hacia abajo a través de la columna (ayb). Las primeras fracciones recolectadas contendrán las proteínas y las últimas
fracciones contendrán los contaminantes de bajo peso molecular (c). En la práctica, esta aplicación de 'separación de grupos' de la cromatografía de
filtración en gel se utiliza principalmente para separar proteínas de la sal (p. ej., después de un paso de precipitación con sulfato de amonio) o para
el intercambio de tampones. Nota: en la práctica, las perlas cromatográficas están muy apretadas en la columna. Están separados unos de otros en
este diagrama solo con fines de claridad. También el dibujo
no está a escala; las moléculas de proteína son considerablemente más pequeñas que las perlas individuales
grupos laterales, mientras que la lisina, la arginina y la histidina tienen grupos laterales básicos cargados
positivamente (Figura 6.10). Las moléculas de proteína, por lo tanto, poseen cargas tanto positivas como
negativas, en gran parte debido a la presencia de cantidades variables de estos siete aminoácidos. (Los
grupos amino Nterminales y los grupos carboxi Cterminales también contribuyen a las características
generales de carga de la proteína). La carga neta exhibida por cualquier proteína depende de las cantidades
relativas de estos aminoácidos presentes en la proteína y del pH de la solución de proteína. El valor de pH en
el que una molécula de proteína posee carga total cero se denomina punto isoeléctrico (pI). A valores de pH
por encima de su pI, una proteína exhibirá una carga neta negativa, mientras que las proteínas exhibirán una
carga neta positiva a valores de pH por debajo de su pI.
La cromatografía de intercambio iónico se basa en el principio de la atracción electrostática reversible de
una molécula cargada hacia una matriz sólida que contiene grupos laterales de carga opuesta unidos
covalentemente (figura 6.11). Posteriormente, las proteínas se pueden eluir alterando el pH o aumentando la
concentración de sal del tampón de irrigación. Las matrices de intercambio iónico que contienen grupos
positivos unidos covalentemente se denominan intercambiadores de aniones. Estos adsorberán proteínas
aniónicas, por ejemplo, proteínas con una carga neta negativa. Las matrices a las que se unen covalentemente
grupos cargados negativamente se denominan intercambiadores de cationes, adsorbiendo proteínas
catiónicas, por ejemplo, proteínas cargadas positivamente. Los grupos funcionales cargados positivamente
(intercambiadores de aniones) incluyen especies como los grupos aminoetilo y dietilaminoetilo. Los grupos
cargados negativamente unidos a matrices adecuadas que forman intercambiadores de cationes incluyen grupos sulfo y carbo
6.3).
ASPARTATO GLUTAMATO
ARRULLO ARRULLO
+ + H
NUEVA HAMPSHIRE H NUEVA HAMPSHIRE
3 C 3 C
CH2 CH2
ARRULLO CH2
ARRULLO
ARGININA HISTIDINA LISINA
ARRULLO ARRULLO
ARRULLO
+ + H
H
+
NUEVA HAMPSHIRE NUEVA HAMPSHIRE
NUEVA HAMPSHIRE H
3 C 3 C 3 C
CH2 CH2 CH2
CH2 C CH2
C
CH2 CH2
N+ C
H H
NUEVA HAMPSHIRE
CH2
+
C NH3
+
H2N NH2
Figura 6.10 Estructuras de aminoácidos que tienen cargas netas totales a pH 7,0. En las proteínas, las cargas asociadas con los grupos
amino y carboxilo en todos los aminoácidos excepto en los terminales no están presentes, ya que estos grupos son
directamente involucrado en la formación de enlaces peptídicos
Durante el proceso de intercambio de cationes, las proteínas con carga positiva se unen a la matriz de
intercambio de iones con carga negativa al desplazar el contraión (a menudo H), que inicialmente se une a
la resina por atracción electrostática. La elución puede lograrse utilizando un tampón de irrigación que
contenga sal. El catión salino, a menudo Na o NaCl, a su vez desplaza a la proteína de la matriz de
intercambio iónico. En el caso de proteínas cargadas negativamente, obviamente se emplea un
intercambiador de aniones, con la proteína adsorbiéndose en la columna reemplazando un contraión cargado negativamente.
La gran mayoría de los procedimientos de purificación emplean al menos un paso de intercambio iónico;
representa la técnica cromatográfica más popular en el contexto de la purificación de proteínas. Su
popularidad se basa en el alto nivel de resolución que se puede lograr, su sencillo escalado (para
aplicaciones industriales), junto con su facilidad de uso y regeneración de columnas. Además,
+
+ +
+ +
+ +
+
Proteína cargada
negativamente
Perla de intercambio
iónico cargada positivamente
Figura 6.11 Principio de la cromatografía de intercambio iónico, en este caso la cromatografía de intercambio aniónico. Las
perlas cromatográficas exhiben una carga positiva general. Proteínas que muestran una carga negativa neta al pH
seleccionado para la cromatografía se unirá a las perlas debido a interacciones electrostáticas
conduce a una concentración de la proteína de interés. También es uno de los métodos cromatográficos disponibles
menos costosos. A valores de pH fisiológicos, la mayoría de las proteínas exhiben una carga negativa neta.
Por lo tanto, la cromatografía de intercambio de aniones es la más utilizada.
6.6.3 Cromatografía de interacción hidrofóbica
De los 20 aminoácidos que se encuentran comúnmente en las proteínas, ocho se clasifican como hidrófobos, debido a la
naturaleza no polar de sus cadenas laterales (grupos R, Figura 6.12). La mayoría de las proteínas se pliegan de tal
Tabla 6.3 Grupos funcionales comúnmente unidos a perlas cromatográficas para generar intercambiadores de cationes
o aniones
Nombre del grupo Estructura de grupo tipo de intercambiador
Dietilaminoetilo (DEAE) !O!(CH2)2 !NH !(CH2 !CH3)2 !CH2 !NH ! Anión

Amonio cuaternario (Q) (CH3)3 !O!(CH2)2 !N Anión
Aminoetilo cuaternario (QAE) (C2H5)2 !CH2 !CHOH!CH3 !O!CH2 !COO Anión
Carboximetilo (CM) Catión
Sulfonato de metilo (S) !CH2 !SO3 Catión
Sulfopropilo (SP) !CH2 !CH2 !CH2SO3 Catión

que la mayoría de sus residuos de aminoácidos hidrofóbicos están enterrados internamente en la molécula
y, por lo tanto, están protegidos del ambiente acuoso circundante (Capítulo 2). Los grupos hidrofóbicos
internalizados normalmente se asocian con grupos hidrofóbicos adyacentes. Sin embargo, una minoría
de aminoácidos hidrofóbicos están presentes en la superficie de la proteína y, por lo tanto, están expuestos
al ambiente acuoso exterior. Las diferentes moléculas de proteína difieren en el número y tipos de
aminoácidos hidrofóbicos en su superficie y, por lo tanto, en su grado de hidrofobicidad superficial.
Los aminoácidos hidrofóbicos tienden a organizarse en grupos o parches en la superficie de la proteína.
La cromatografía de interacción hidrófoba fracciona las proteínas explotando sus diferentes grados de
hidrofobicidad superficial. Depende de la aparición de interacciones hidrofóbicas entre los parches
hidrofóbicos en la superficie de la proteína y los grupos hidrofóbicos unidos covalentemente a una matriz
adecuada .
Las perlas cromatográficas de interacción hidrofóbica más populares (resinas) son geles de aga rosa
reticulados a los que se han unido covalentemente grupos hidrofóbicos. Los ejemplos específicos incluyen
ALANINA VALINA LEUCINA ISOLEUCINA
ARRULLO ARRULLO ARRULLO ARRULLO
H3N+ CH CH H3N+ CH H3N+ CH

H3N+
CH3 CH2
CH
CH3 CH3
TRIPTÓFANO METIONINA FENILALANINA PROLINA
ARRULLO ARRULLO ARRULLO H
H3N+ CH H3N+ CH H3N+ CH

n+
H
CH2 CH2 C
CH
C C
CC 2
C C
S
S.S CH3
H
Figura 6.12 Fórmulas estructurales de los ocho aminoácidos comunes que muestran características
hidrofóbicas
OH
(a) SEFAROSA O CH2 CH CH2 O
OH
(b) SEFAROSA O CH2 CH CH2 O (CH2 )7 CH3
Figura 6.13 Estructura química de (a) fenilo y (b) octil sefarosa, ampliamente utilizada en cromatografía de
interacción hidrofóbica
geles de octilo y fenilsefarosa, que contienen grupos hidrofóbicos octilo y fenilo respectivamente (Figura 6.13).
La separación de proteínas por cromatografía de interacción hidrófoba depende de las interacciones entre la
propia proteína, la matriz del gel y el disolvente acuoso circundante. El aumento de la fuerza iónica de una
solución mediante la adición de una sal neutra (por ejemplo, sulfato de amonio o cloruro de sodio) aumenta la
hidrofobicidad de las moléculas de proteína. Esto puede explicarse (de manera algo simplista) sobre la base de
que la hidratación de los iones de sal en solución da como resultado una capa ordenada de moléculas de agua
que se forman alrededor de cada ion. Esto atrae las moléculas de agua lejos de las moléculas de proteína, lo que
a su vez ayuda a desenmascarar los dominios hidrofóbicos en la superficie de la proteína.
Las muestras de proteínas, por lo tanto, se aplican mejor a las columnas de interacción hidrofóbica en
condiciones de alta fuerza iónica. A medida que se filtran a través de la columna, las proteínas pueden retenerse
a través de interacciones hidrofóbicas. Cuanto más hidrófoba es la proteína, más fuerte es la unión. Después de
un paso de lavado, la proteína unida se puede eluir utilizando condiciones que promuevan una disminución de
las interacciones hidrofóbicas. Esto se puede lograr mediante el riego con un tampón de fuerza iónica reducida,
la inclusión de un detergente adecuado o la reducción de la polaridad del tampón al incluir agentes como etanol o
etilenglicol.
La cromatografía de fase inversa también se puede usar para separar proteínas sobre la base de la
hidrofobicidad diferencial. Esta técnica consiste en aplicar la muestra de proteína a una columna altamente
hidrófoba a la que se unirán la mayoría de las proteínas. La elución se promueve al disminuir la polaridad de la
fase móvil. Esto normalmente se consigue mediante la introducción de un disolvente orgánico. Las condiciones
de elución son duras y generalmente dan como resultado la desnaturalización de muchas proteínas.
6.6.4 Cromatografía de afinidad
La cromatografía de afinidad se describe a menudo como el método de purificación de proteínas altamente
selectivo más poderoso disponible. Esta técnica se basa en la capacidad de la mayoría de las proteínas para
unirse de manera específica y reversible a otros compuestos, a menudo denominados ligandos (Figura 6.14). Se
puede unir covalentemente una amplia variedad de ligandos a una matriz de soporte inerte y, posteriormente,
empaquetarlos en una columna cromatográfica. En tal sistema, solo las moléculas de proteína que se unen
selectivamente al ligando inmovilizado serán retenidas en la columna. Lavar la columna con un tampón adecuado enjuagará
Figura 6.14 Representación esquemática del principio de la cromatografía de afinidad bioespecífica. El ligando de afinidad elegido
se une químicamente a la matriz de soporte (perlas de agarosa) a través de un brazo espaciador adecuado . Solo esos ligandos
en solución que exhiben afinidad bioespecífica por las especies inmovilizadas serán retenidas
todas las moléculas no unidas. Un cambio apropiado en la composición del tampón, como la inclusión de un ligando
competitivo, dará como resultado la desorción de las proteínas retenidas.
La elución de la proteína unida de una columna de afinidad se logra alterando la composición del tampón de elución, de
modo que la afinidad de la proteína por el ligando inmovilizado se reduce considerablemente.
Una variedad de interacciones no covalentes contribuyen a la interacción proteínaligando. En muchos casos, los cambios en
el pH del tampón, la fuerza iónica, la inclusión de un detergente o agentes como el etilenglicol (que reducen la polaridad de
la solución) pueden ser suficientes para eluir la proteína. En otros casos, la inclusión de un ligando competidor promueve la
desorción. Los ligandos competidores que se emplean a menudo incluyen sustratos libres, análogos de sustrato o cofactores.
El uso de un ligando competitivo generalmente da como resultado una desorción de proteínas más selectiva que un enfoque
generalizado como la alteración del pH del tampón o la fuerza iónica.
En algunos casos, puede ser necesaria una combinación de tales condiciones de elución. La identificación de las condiciones
óptimas de desorción a menudo requiere un estudio empírico considerable.
La cromatografía de afinidad ofrece muchas ventajas sobre las técnicas cromatográficas convencionales. La especificidad
y la selectividad de la cromatografía de afinidad bioespecífica no pueden igualarse con otros procedimientos cromatográficos.
A menudo se informan aumentos en la pureza de más de 1000 veces, con rendimientos de casi el 100 por ciento, al menos
a escala de laboratorio. La incorporación de un paso de afinidad podría
por lo tanto, reduce drásticamente el número de pasos posteriores necesarios para lograr la purificación de proteínas.
Esto, a su vez, podría resultar en ahorros dramáticos de tiempo y costos, lo que sería particularmente significativo en un
entorno industrial. A pesar de tal promesa, la cromatografía de afinidad bioespecífica muestra algunas limitaciones prácticas:
• muchos ligandos bioespecíficos son extremadamente caros ya menudo muestran poca estabilidad;
• muchas de las técnicas de acoplamiento de ligandos son químicamente complejas, peligrosas y requieren mucho tiempo
y costoso;
• cualquier lixiviación de ligandos acoplados de la matriz también es motivo de preocupación por dos razones, como
(a) reduce efectivamente la capacidad del sistema y (b) la lixiviación de lo que a menudo son sustancias químicas
nocivas en los productos proteicos es indeseable.
Normalmente, no es prudente emplear la cromatografía de afinidad bioespecífica como paso de purificación
inicial, ya que varias actividades enzimáticas presentes en las fracciones crudas pueden modificar o degradar los
costosos geles de afinidad. Sin embargo, debe utilizarse lo antes posible en el procedimiento de purificación para
obtener todos los beneficios que ofrece su alta especificidad.
6.6.5 Purificaciones por inmunoafinidad
Los anticuerpos inmovilizados pueden usarse como adsorbentes de afinidad para los antígenos que estimularon su
producción (Figura 6.15). Los anticuerpos, como muchas otras biomoléculas, pueden inmovilizarse en una matriz de
soporte adecuada mediante una variedad de procedimientos de acoplamiento químico.
La cromatografía de inmunoafinidad se encuentra entre las más altamente específicas de todas las formas de
cromatografía bioespecífica. La alta afinidad con la que un anticuerpo normalmente se une a su ligando a menudo
puede dificultar la posterior desorción del ligando de la columna. La desorción puede requerir condiciones que resulten
en la desnaturalización parcial de la proteína unida. A menudo, esto se logra mediante la alteración del pH del tampón
o mediante el empleo de agentes disruptores químicos, como la urea o la guanidina.
Uno de los métodos de elución más populares implica la irrigación con un tampón de glicinaHCl a un pH de 2,2 a 2,8.
En algunos casos, la elución se logra más fácilmente a valores de pH alcalinos. Se han documentado ejemplos
específicos en los que la elución de proteínas se realizó en condiciones relativamente suaves, como un cambio de
sistema tampón o un aumento de la fuerza iónica; sin embargo, tales ejemplos son excepcionales. La inclusión de un
paso de inmunoafinidad en la purificación del factor VIII recombinante de la sangre utilizado para tratar la hemofilia
(Capítulo 12) es un ejemplo del uso industrial de esta técnica.
6.6.6 Cromatografía de proteína A
La mayoría de las especies de Staphylococcus aureus producen una proteína conocida simplemente como proteína
A. Esta proteína consta de una sola cadena polipeptídica de peso molecular 42 kDa. La proteína A se une a la región
Fc (la región constante) de la inmunoglobulina G (IgG; Capítulo 13) obtenida de humanos y muchas otras especies
de mamíferos con alta especificidad y afinidad. La inmovilización de la proteína A en perlas de cromatografía
proporciona un poderoso sistema de afinidad que puede usarse para purificar IgG. Sin embargo, existe una variación
considerable en la afinidad de unión de la proteína A por varias subclases de IgG obtenidas de diferentes fuentes de
mamíferos. En algunos casos, se puede usar otra proteína, la proteína G, en lugar de la proteína A. La mayoría de
las moléculas de inmunoglobulina que se unen a la proteína A inmovilizada lo hacen en condiciones alcalinas y,
posteriormente, pueden eluirse a valores de pH ácidos.
6.6.7 Cromatografía de afinidad con lectinas
La cromatografía de afinidad con lectina se puede usar para purificar una variedad de glicoproteínas. Las lectinas son
un grupo de proteínas sintetizadas por plantas, vertebrados y varias especies de invertebrados. Especialmente
Los altos niveles de lectinas son producidos por una variedad de semillas de plantas. Las lectinas vegetales a menudo se denominan
Tabla 6.4 Algunas lectinas comúnmente utilizadas en formato inmovilizado para la purificación de glicoproteínas. Se enumera
la especificidad del azúcar, al igual que los azúcares libres utilizados para eluir la glicoproteína unida.
lectina Fuente Especificidad del azúcar Azúcar de elución
Con A Semillas de habichuelas DManosa, Dglucosa DMetilmanosa

GT A Germen de trigo Nacetil Dglucosamina Nacetil Dglucosamina
PSA Guisantes Dmanosa Dmetilmanosa
LEI Tomate Nacetil Dglucosamina Nacetil Dglucosamina
STL tubérculos de patata Nacetil Dglucosamina Nacetil Dglucosamina
PHA frijol rojo NacetilDgalactosamina NacetilDgalactosamina
ELB Corteza de saúco Ácido siálico o NacetilDgalactosamina Lactosa
GNL bulbos de campanillas 1 → 3 manosa metilmanosa
AAA anguila de agua dulce LFucosa Lfucosa
fitohemaglutininas. Todas las lectinas tienen la capacidad de unirse a ciertos monosacáridos (como D manosa,
Dglucosa, DNacetil galactosamina), y se conoce la especificidad de azúcar para muchos (Tabla 6.4). Entre las
lectinas más conocidas y utilizadas se encuentran la concanavalina A (Con A), la lectina de soja (SBL) y la aglutinina
de germen de trigo (WGA).
Las glicoproteínas generalmente se unen a las columnas de afinidad de lectina a valores de pH cercanos a la
neutralidad. La desorción se puede lograr en algunos casos mediante la alteración del pH del tampón de elución.
Sin embargo, el método más común de desorción implica la inclusión de moléculas de azúcar libres por las que la
lectina muestra una alta afinidad en este tampón de elución, es decir, la inclusión de un ligando competitivo.
Aunque la cromatografía de afinidad con lectina se puede utilizar para purificar una variedad de glicoproteínas,
no se ha empleado ampliamente por varias razones:
anticuerpo inmovilizado
Soporte de cuentas Antígeno que se empleó originalmente Ligandos adicionales en solución no

para estimular reconocidos por el anticuerpo
producción de anticuerpos
Figura 6.15 Principio de la cromatografía de inmunoafinidad. Solo el antígeno que es reconocido específicamente por el anticuerpo
inmovilizado se retendrá en la columna.
• La mayoría de las lectinas son bastante caras.
• Las fuentes de proteína cruda que contienen una glicoproteína generalmente contienen múltiples glicoproteínas. En la mayoría de
estos casos, los sistemas de afinidad basados en lectinas darán como resultado la purificación conjunta de varias de estas
glicoproteínas.
• La aplicación limitada de este enfoque significa que tiene poca trayectoria, particularmente en un
escala industrial.
6.6.8 Cromatografía de afinidad por colorante
El desarrollo de la cromatografía de afinidad por colorante puede atribuirse a la observación de que algunas proteínas presentaban
características de elución anómalas cuando se fraccionaban en columnas de filtración en gel en presencia de azul dextrano. El azul
dextrano consiste en un colorante de triazina (cibacron blue F3GA) unido covalentemente al azúcar dextrano de alto peso molecular.
El descubrimiento de que algunas proteínas se unen al colorante de triazina pronto condujo a su uso como adsorbente de afinidad por
inmovilización en una matriz de agarosa. Una variedad de otros colorantes de triazina (Figura 6.16) también se unen a ciertas proteínas
y, por lo tanto, también se han utilizado como adsorbentes de afinidad. La cromatografía de afinidad por colorante muestra algunas
características generales positivas:
• Los tintes están fácilmente disponibles a granel y son relativamente económicos.
• El acoplamiento químico de los colorantes a la matriz suele ser sencillo y, a menudo, no requiere más que incubación en condiciones
alcalinas a temperatura elevada. Se evita el uso de productos químicos de acoplamiento nocivos, como el bromuro de cianógeno.
• El enlace coloranteperla matriz es relativamente resistente a la degradación química, física y enzimática. De esta manera, la fuga
de ligandos de la columna se minimiza y es fácilmente reconocible si ocurre, debido al color del colorante.
• La capacidad de unión a proteínas de los adsorbentes de colorantes inmovilizados también es alta y supera la capacidad de unión
capacidad de adsorción que normalmente exhiben los ligandos de adsorción bioespecíficos naturales.
• La elución de la proteína unida también se logra con relativa facilidad.
Sin embargo, una desventaja potencial importante es que no es posible predecir con precisión si una proteína específica se retendrá
en una columna de afinidad de colorante, o qué condiciones permitirán una unión/elución óptima. Tal información debe derivarse de
un estudio empírico. Por lo general, falta una comprensión de las interacciones específicas que permiten que muchas proteínas
aparentemente no relacionadas se unan a los ligandos de afinidad del colorante, mientras que otras proteínas no se retienen. La
presencia de grupos sulfonato cargados negativamente confiere a los colorantes de triazina un carácter de intercambio iónico. Estos
colorantes también contienen grupos aromáticos que pueden otorgarles cierto grado de hidrofobicidad. Las interacciones hidrofóbicas,
junto con las interacciones basadas en carga, por lo tanto, pueden desempeñar algún papel en la adsorción de proteínas. Los tintes
también pueden formar puentes de hidrógeno con las proteínas.
Proción Azul MX 3G
X O NH2
SO3 –
cl
norte
Una X = SO – 3
NUEVA HAMPSHIRE
NUEVA HAMPSHIRE
Otro X = H
SO3 – cl
Procion Rojo H3B
cl
SO3 – OH NUEVA HAMPSHIRE
NN NUEVA HAMPSHIRE
–O3S SO3 –
Proción Amarillo HA
cl
SO3 –
NN NUEVA HAMPSHIRE
NHCOCH3 NH2
SO3 –
Figura 6.16 Algunos colorantes de mono y diclorotriazina comúnmente utilizados como ligandos de afinidad en la cromatografía de
afinidad de colorantes
6.6.9 Cromatografía de afinidad de quelatos metálicos
La cromatografía de afinidad de quelatos metálicos es una técnica de purificación de proteínas de
pseudoafinidad desarrollada por primera vez en la década de 1970. El modo de adsorción se basa en la
formación de enlaces coordinados débiles entre grupos básicos en la superficie de una proteína con iones
metálicos inmovilizados en perlas cromatográficas (Figura 6.17). El medio de afinidad se sintetiza mediante la
unión covalente de un quelante metálico a la perla cromatográfica a través de un brazo espaciador. Los
agentes quelantes, como el iminodiacetato, son capaces de unirse a una serie de iones metálicos (p. ej., Fe,
Co, Ni, Cu, Zn, Al) y la unión inmoviliza eficazmente el ion en la perla. El gel de afinidad normalmente se
suministra sin metal ligado, por lo que el gel se puede 'cargar' con el metal elegido (enjuagando la columna
con una solución que contenga una sal de ese metal, por ejemplo, CuSO4 en el caso del cobre). Los iones , metálicos más utilizad
y Cu2 . Grupos básicos en superficies de proteínas, más notablemente la cadena lateral de residuos de histidina,
quelante
Matriz de metales
talón
(a) CM Proteína
brazo espaciador Metal inmovilizado
OH
CH2COO
(b)
CH2 CH CH2 N
CH2COO
Figura 6.17 Representación esquemática de los principios básicos de la cromatografía de afinidad de quelatos metálicos.
Ciertas proteínas se retienen en la columna mediante la formación de enlaces coordinados con el ion metálico inmovilizado (a).
La estructura real del quelante de metales más utilizado, el ácido iminodiacético, se presenta en (b)
son atraídos por los iones metálicos, formando enlaces coordinados débiles. La elución de las proteínas unidas se
lleva a cabo mediante la reducción del pH del tampón (esto provoca la protonación de los residuos de histidina, que
luego no pueden coordinarse con el ion metálico). Alternativamente, se puede agregar a la elución un agente
complejante competidor fuerte (p. ej., el agente quelante ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)).
buffer.
La cromatografía de afinidad de quelatos metálicos encuentra la aplicación más destacada en la purificación por
afinidad de proteínas recombinantes a las que se ha unido una etiqueta de histidina (descrita más adelante). Dado
que la unión a proteínas se produce a través de los residuos de histidina, esta técnica no es inherentemente más útil
para la purificación de metaloproteínas que para la purificación de no metaloproteínas (un concepto erróneo común,
dado su nombre).
6.6.10 Cromatografía en hidroxiapatita
La hidroxiapatita se presenta naturalmente como mineral en la roca fosfórica y también constituye la porción mineral
del hueso. También se puede utilizar para fraccionar proteínas por cromatografía.
La hidroxiapatita se prepara mezclando una solución de fosfato de sodio (Na2HPO4) con cloruro de calcio (CaCl2).
Se forma un precipitado blanco conocido como brushita. Luego, la brushita se convierte en hidroxiapatita calentándola
a 100 C en presencia de amoníaco:
Ca HPO ∙2H O 1 00 C /NH 3→Ca (PO ) (OH)

2 2 10 4 6 2
4 brushita hidroxiapatita
El mecanismo subyacente por el cual esta sustancia se une y fracciona las proteínas es poco conocido. Se cree
que la adsorción de proteínas implica la interacción tanto con el calcio como con el fosfato.
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RENDIMIENTO DE PROTEÍNAS 155
fracciones de la matriz de hidroxiapatita. La elución de las especies unidas de tales columnas se logra normalmente mediante
irrigación con un gradiente de fosfato de potasio.
6.6.11 Cromatoenfoque
El fraccionamiento por cromatoenfoque separa las proteínas en función de sus puntos isoeléctricos. Esta técnica consiste
básicamente en filtrar un tampón de un pH a través de una columna de intercambio iónico que se equilibra previamente a un
pH diferente. Debido a la capacidad tampón natural del intercambiador, se puede establecer un gradiente de pH continuo a lo
largo de la columna. Para lograr la máxima resolución, se debe construir un gradiente de pH lineal. Esto requiere el uso de un
tampón de eluyente y un intercambiador que muestre una capacidad de tamponamiento uniforme en una amplia gama de
valores de pH. El rango del gradiente de pH logrado dependerá obviamente del pH al que se equilibra previamente el
intercambiador de iones y del pH del tampón eluyente. La muestra se aplica, generalmente, en el tampón de funcionamiento,
cuyo pH es inferior al de la columna preequilibrada. Después de la aplicación de la muestra, la columna se filtra constantemente
con un tampón especialmente formulado que establece un gradiente de pH creciente a lo largo de la columna.
Tras la aplicación de la muestra, las proteínas cargadas negativamente se adsorben inmediatamente en el intercambiador
de aniones, mientras que las proteínas cargadas positivamente fluyen hacia abajo por la columna. Debido al aumento del
gradiente de pH formado, dichas proteínas cargadas positivamente llegarán finalmente a un punto dentro de la columna donde
el pH de la columna es igual a sus propios valores de pI (sus puntos isoeléctricos, es decir, el valor de pH en el que la proteína
tiene una carga neta total de cero). Inmediatamente después de una mayor migración por la columna, tales proteínas se cargan
negativamente, ya que los valores de pH circundantes aumentan por encima de sus valores de pI; por lo tanto, se unen a la
columna. En general, por lo tanto, tras la aplicación inicial del tampón de elución, todas las especies de proteínas migrarán por
la columna hasta que alcancen un punto en el que el pH de la columna esté ligeramente por encima de sus puntos isoeléctricos.
En esta etapa se unen al intercambiador de aniones. Las proteínas de diferentes puntos isoeléctricos se fraccionan así sobre
la base de este parámetro de distinción molecular.
El gradiente de pH formado no es estático. A medida que se aplica más tampón de elución, el valor de pH en cualquier
punto dado a lo largo de la columna aumenta continuamente. Por lo tanto, cualquier proteína que se una a la columna se
desorberá casi de inmediato, ya que una vez más experimenta un valor de pH circundante superior a su pI y se carga
positivamente. Cualquiera de estas proteínas desorbidas fluye por la columna hasta que alcanza un punto más donde el valor
de pH está marginalmente por encima de su valor de pI, y se vuelve a unir. Este proceso se repite hasta que la proteína emerge
de la columna en su punto isoeléctrico. Para lograr los mejores resultados, el punto isoeléctrico (valor pI) de la proteína
requerida debería estar idealmente en el medio del gradiente de pH generado. Chromatofocusing puede dar como resultado un
alto grado de resolución de proteínas, con bandas de proteínas que se eluyen como picos ajustados. Esta técnica es
particularmente efectiva cuando se usa junto con otros métodos cromatográficos durante la purificación de proteínas. La
mayoría de las aplicaciones documentadas de este método aún pertenecen a procedimientos a escala de laboratorio. Los
factores económicos, en particular el costo del eluyente requerido, desalientan un poco el escalamiento hasta el nivel industrial.
6.7 Cromatografía líquida de alta resolución de proteínas
La mayoría de las técnicas cromatográficas descritas hasta ahora se realizan generalmente a presiones relativamente bajas,
donde las tasas de flujo a través de la columna se generan mediante bombas de baja presión (es decir, bombas de baja presión).
cromatografía líquida). El fraccionamiento de una sola muestra en tales columnas cromatográficas normalmente requiere un
mínimo de varias horas para completarse. Se requieren velocidades de flujo bajas porque, a medida que la muestra de proteína
fluye a través de la columna, las proteínas se ponen en contacto con la superficie de las perlas cromatográficas por flujo directo
(convectivo). Las moléculas de proteína entonces dependen completamente de la difusión molecular para entrar en las perlas de
gel poroso. Este es un proceso lento, especialmente cuando se compara con la transferencia directa de proteínas a través de la
superficie exterior de las perlas de gel mediante el flujo de líquido. Si se usa una velocidad de flujo significativamente más alta
que la velocidad de difusión, se producirá una "difusión de la banda de proteína" (y, por lo tanto, una pérdida de resolución). Esto
ocurre porque cualquier molécula de proteína que no haya entrado en la perla fluirá a través de la columna a un ritmo más rápido
que las moléculas (idénticas) que han entrado en las partículas de la perla. Velocidades de flujo tan altas también darán como
resultado una disminución de la capacidad de adsorción, ya que muchas moléculas no tendrán la oportunidad de difundirse en las
perlas a medida que pasan a través de la columna.
Un enfoque que permite mayores velocidades de flujo cromatográfico sin pérdida de resolución implica el uso de medios de
fase estacionaria de micropartículas de diámetro muy estrecho. Esto reduce efectivamente el tiempo requerido para que las
moléculas se difundan dentro y fuera de las partículas porosas. Cualquier reducción en el diámetro de las partículas aumenta
dramáticamente la presión requerida para mantener una tasa de flujo dada.
Dichos caudales elevados pueden lograrse utilizando sistemas de cromatografía líquida de alta presión.
Mediante el empleo de dichos métodos, los tiempos de fraccionamiento de la muestra pueden reducirse de horas a minutos.
La aplicación exitosa de HPLC fue posible en gran parte por (a) el desarrollo de sistemas de bombas que pueden proporcionar
caudales constantes a alta presión y (b) la identificación de
medios cromatográficos resistentes a la presión. Los medios de gel blando tradicionales utilizados en aplicaciones de baja presión
son totalmente inadecuados para los sistemas de alta presión debido a su compresibilidad.
En el contexto de la purificación/caracterización de proteínas, la HPLC se puede utilizar con fines analíticos o preparativos.
La mayoría de las columnas HPLC analíticas disponibles tienen diámetros que oscilan entre 4 y 4,6 mm y longitudes que oscilan
entre 10 y 30 cm. Las columnas de HPLC preparativas actualmente disponibles tienen diámetros mucho más amplios, normalmente
de hasta 80 cm, y pueden tener una longitud superior a 1 m (Figura 6.18). Se pueden incorporar varios grupos químicos en las
perlas de la matriz; por lo tanto, técnicas como el intercambio iónico, la filtración en gel, la afinidad, la interacción hidrofóbica y la
cromatografía de fase inversa son todas aplicables a la HPLC.
Muchas proteínas pequeñas, en particular las que funcionan extracelularmente (p. ej., insulina, GH y varias citoquinas) son
bastante estables y pueden fraccionarse en una variedad de columnas de HPLC sin desnaturalización significativa o disminución
de la bioactividad. La HPLC preparativa se utiliza en la purificación a escala industrial de insulina y de IL2. Por el contrario, muchas
proteínas más grandes (p. ej., el factor VIII sanguíneo) son relativamente lábiles y se puede observar una pérdida de actividad
debido a la desnaturalización de la proteína tras el fraccionamiento a alta presión.
Tanto a nivel preparativo como analítico, la HPLC exhibe varias ventajas importantes en comparación con las técnicas
cromatográficas de baja presión:
• HPLC ofrece una resolución superior debido a la reducción del tamaño de las partículas de las perlas. La distancia de difusión
dentro de las partículas de la matriz se minimiza, lo que da como resultado picos más agudos que los que se obtienen cuando
se emplean sistemas de baja presión.
• Debido al aumento de las tasas de flujo, los sistemas de HPLC también ofrecen velocidades de fraccionamiento mucho mejores,
normalmente en el orden de minutos en lugar de horas.
• HPLC es susceptible de un alto grado de automatización.
Las principales desventajas asociadas con HPLC incluyen el costo y, en menor medida, la capacidad.
Así, por razones tanto técnicas como económicas, la HPLC preparativa se emplea casi exclusivamente
PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES 157
Figura 6.18 Columna de HPLC preparativa (15 cm de diámetro) utilizada en el procesamiento de proteínas necesarias
para fines terapéuticos o de diagnóstico. Columna fabricada por Prochrom, Nancy, Francia (fotografía cortesía de
Affinity Chromatography Ltd)
en el procesamiento posterior de proteínas de bajo volumen y valor extremadamente alto, destinadas principalmente para
uso terapéutico, a diferencia de las proteínas utilizadas para preparaciones industriales.
También está disponible un sistema cromatográfico alternativo a la HPLC. Esta técnica, denominada cromatografía
líquida rápida de proteínas (FPLC), emplea presiones operativas significativamente más bajas que las utilizadas en los
sistemas HPLC convencionales. Las presiones más bajas permiten el uso de perlas de matriz basadas en polímeros como
la agarosa. Las columnas de FPLC están construidas con vidrio o materiales plásticos inertes. Las columnas de HPLC
convencionales se fabrican con acero inoxidable de alta calidad. En muchos casos, los sistemas de FPLC son
económicamente más atractivos que los de HPLC. A pesar de su funcionamiento a presiones más bajas, aún combinan una
alta resolución con una mayor velocidad de funcionamiento en comparación con los sistemas tradicionales de baja presión.
6.8 Purificación de proteínas recombinantes
Las proteínas producidas mediante la tecnología del ADN recombinante suelen purificarse por medios idénticos a los
disponibles para la purificación de proteínas tradicionales no recombinantes extraídas directamente de
FORMULACIÓN DEL PRODUCTO FINAL 158
una fuente productora natural. De hecho, la purificación de proteínas recombinantes puede ser algo más sencilla, ya que
se pueden alcanzar altos niveles de expresión de la proteína diana. Esto aumenta la relación entre la proteína diana y los
contaminantes.
Dos características de la producción recombinante en particular pueden tener un impacto muy significativo en el enfoque
adoptado posteriormente para purificar el producto recombinante: la formación de cuerpos de inclusión y la incorporación
de etiquetas de purificación. Los procesos de formación de cuerpos de inclusión, recuperación y renaturalización de la
proteína recombinante se consideraron en el Capítulo 5. Una vez que la proteína recombinante se ha replegado, la
purificación adicional (si es necesaria) sigue las líneas tradicionales.
Las técnicas de ingeniería genética también facilitan la incorporación de etiquetas peptídicas o proteicas específicas a
la proteína de interés. Se elige una etiqueta que confiera a la proteína híbrida resultante alguna característica fisicoquímica
pronunciada, facilitando su posterior purificación. Dicha molécula normalmente se produce al fusionar una secuencia de
ADN que codifica la etiqueta con un extremo de la información genética que codifica la proteína de interés. Se han diseñado
y empleado con éxito etiquetas que permiten una purificación rápida y sencilla de la proteína híbrida mediante técnicas
como el intercambio iónico, la interacción hidrófoba o la cromatografía de afinidad.
La adición de una etiqueta de poliarganina (o polilisina) al extremo C de una proteína le confiere una fuerte carga
positiva. Entonces, la proteína puede purificarse más fácilmente mediante cromatografía de intercambio catiónico. Este
enfoque se ha utilizado en la purificación de varios interferones y urogastrona al menos a escala de laboratorio. La adición
de una etiqueta que contiene varios aminoácidos hidrófobos confiere a la molécula resultante un carácter fuertemente
hidrófobo, que permite su purificación eficaz mediante cromatografía de interacción hidrófoba. Puede emplearse una
etiqueta de purificación que consta de polihistidina para purificar proteínas mediante cromatografía de quelatos metálicos.
También se han desarrollado etiquetas que facilitan la purificación de proteínas por cromatografía de afinidad.
El gen que codifica la proteína A puede fusionarse con el gen o el ADNc que codifica la proteína de interés.
El híbrido resultante se puede purificar utilizando una columna que contiene IgG inmovilizada. Puede emplearse la
purificación por inmunoafinidad si se han generado anticuerpos contra la etiqueta utilizada.
Tras la purificación de la proteína híbrida, es necesario eliminar la etiqueta, ya que la propia etiqueta será inmunogénica.
La eliminación de la etiqueta generalmente se lleva a cabo por medios químicos o enzimáticos. Esto se logra diseñando la
secuencia de la etiqueta de manera que contenga un punto de división para una proteasa específica o un método de
división química en la unión de fusión proteínaetiqueta. Las proteasas específicas de secuencia empleadas a menudo
para lograr la eliminación de etiquetas incluyen las endopeptidasas tripsina, factor Xa y enteroquinasa.
A veces también se utilizan exopeptidasas, como la carboxipeptidasa A. En términos generales, las endopeptidasas, que
escinden los enlaces peptídicos de las proteínas internas, se utilizan para eliminar etiquetas largas, mientras que
las exopeptidasas se usan con mayor frecuencia para eliminar etiquetas cortas. La exopeptidasa carboxipeptidasa A, por
ejemplo, elimina secuencialmente los aminoácidos del extremo C de una proteína hasta que encuentra un residuo de lisina,
arginina o prolina. La escisión química de enlaces peptídicos específicos se basa en el uso de productos químicos como el
bromuro de cianógeno o la hidroxilamina.
Aunque existen varios métodos que pueden conseguir la eliminación de etiquetas, la mayoría de estos métodos
adolecen de algunos inconvenientes inherentes. Un requisito previo esencial para cualquier método es que la proteína de
interés debe permanecer intacta después del tratamiento de escisión. La proteína requerida, por lo tanto, no debe contener
enlaces peptídicos susceptibles de escisión por el método específico elegido. Los métodos químicos, por ejemplo,
generalmente deben llevarse a cabo en condiciones duras, que a menudo requieren altas temperaturas o extremos de pH.
Tales condiciones pueden tener un efecto perjudicial sobre el funcionamiento normal de las proteínas. La eliminación
proteolítica de etiquetas también suele ser menos del 100 por ciento eficiente. La escisión selectiva de la etiqueta debe ir
seguida de la subsiguiente separación de la etiqueta de la proteína de interés. Esto puede requerir un paso cromatográfico adicional.
6.9 Formulación del producto final
La cromatografía de alta resolución normalmente produce una proteína que tiene una pureza del 98 al 99 por ciento. La
siguiente fase del procesamiento posterior implica la formulación en formato de producto final. Esto generalmente implica:
• Adición de varios excipientes (sustancias distintas del ingrediente o ingredientes activos que, por ejemplo, estabilizan el
producto final o mejoran las características del producto final de alguna otra manera).
• Filtración del producto final a través de un filtro absoluto de 0,22 m para generar producto estéril, seguido de su llenado
aséptico en envases de producto final.
• Liofilización (liofilización) si el producto se va a comercializar en forma de polvo.
La decisión de comercializar el producto en forma líquida o en polvo a menudo depende de la estabilidad de la proteína
en solución. Esto, a su vez, debe determinarse experimentalmente, ya que no hay forma de predecir el resultado de una
proteína en particular. Algunas proteínas pueden permanecer estables durante meses (o incluso años) en solución,
particularmente si se agregan excipientes estabilizadores y la solución se refrigera.
Otras proteínas, en particular cuando se purifican, pueden retener la actividad biológica durante solo unas horas o días
cuando se encuentran en una solución acuosa.
6.9.1 Algunas influencias que pueden alterar la actividad biológica de las proteínas
Varias influencias diferentes pueden desnaturalizar o modificar las proteínas, haciéndolas menos activas/inactivas. Dado
que todos los productos proteicos se comercializan en función de su actividad, se deben tomar todas las precauciones
necesarias para minimizar la pérdida de actividad biológica durante el procesamiento posterior y el almacenamiento
posterior. Las influencias disruptivas pueden ser químicas (p. ej., agentes oxidantes, detergentes, etc.), físicas (p. ej.,
valores extremos de pH, temperatura elevada, agitación vigorosa) o biológicas (p. ej., degradación proteolítica). La
minimización de la inactivación se puede lograr minimizando la exposición de la corriente del producto a tales influencias y
realizando el procesamiento posterior en el menor tiempo posible.
Además, es posible proteger la proteína de muchas de estas influencias mediante la adición de agentes estabilizadores
adecuados . La adición de tales agentes al producto final a menudo es esencial para conferir al producto una vida útil
aceptablemente larga. Durante el desarrollo inicial, los formuladores realizan un estudio empírico considerable para
determinar qué excipientes son más efectivos para mejorar la estabilidad del producto.
Una serie de diferentes mecanismos moleculares pueden sustentar la pérdida de actividad biológica de cualquier
proteína. Estos incluyen la modificación tanto covalente como no covalente de la molécula de proteína, como se resume en
la Tabla 6.5. La desnaturalización de proteínas, por ejemplo, implica una alteración parcial o total de la forma tridimensional
de la proteína. Esto está subrayado por la interrupción de las fuerzas intramoleculares que estabilizan la conformación
nativa de una proteína, a saber, los enlaces de hidrógeno, las atracciones iónicas y las interacciones hidrofóbicas (Capítulo
2). Las modificaciones covalentes de la estructura de la proteína que pueden afectar negativamente a su actividad biológica
se resumen a continuación.
Cuadro 6.5 Las diversas alteraciones moleculares que suelen provocar
la pérdida de la actividad biológica de una proteína
Alteraciones no covalentes
Desnaturalización parcial/completa de proteínas
Alteraciones covalentes
Hidrólisis Oxidación
desamidación Intercambio de disulfuro
formación de imina isomerización
raceimización Fotodescomposición
6.9.1.1 Degradación proteolítica y alteración de las cadenas laterales del azúcar
La degradación proteolítica de una proteína se caracteriza por la hidrólisis de uno o más enlaces peptídicos (amida) en el
esqueleto de la proteína, lo que generalmente da como resultado la pérdida de actividad biológica. La hidrólisis suele ser
promovida por la presencia de pequeñas cantidades de enzimas proteolíticas, pero también puede ser causada por algunas
influencias químicas.
Las proteasas pertenecen a una de seis clases mecánicas:
• serina proteasas I (mamíferos) o II (bacterianas);
• cisteína proteasas;
• proteasas aspárticas;
• metaloproteasas I (mamíferos) y II (bacterianas).
Las clases se diferencian sobre la base de los grupos presentes en el sitio activo de la proteasa que se sabe que son
esenciales para la actividad, por ejemplo, un residuo de serina forma un componente esencial del sitio activo de las serina
proteasas. Existen exoproteasas (que catalizan la escisión secuencial de los enlaces peptídicos que comienzan en un extremo
de la proteína) y endoproteasas (que escinden los enlaces peptídicos internos, generando fragmentos peptídicos). Incluso la
degradación endoproteolítica o exoproteolítica limitada de los productos biofarmacéuticos suele alterar/destruir su actividad
biológica.
Las proteínas difieren mucho en su susceptibilidad intrínseca al ataque proteolítico. La resistencia a la proteólisis parece
depender de niveles más altos de estructura proteica (es decir, estructura secundaria y terciaria), ya que el empaquetamiento
apretado a menudo protege los enlaces peptídicos susceptibles del ataque. La desnaturalización hace que las proteínas sean
muy susceptibles a la degradación proteolítica.
Se pueden adoptar varias estrategias para minimizar la probabilidad de grados proteolíticos.
radiación del producto proteico, estos incluyen:
• minimizar los tiempos de procesamiento;
• procesamiento a baja temperatura;
• uso de inhibidores de proteasa específicos.
Tabla 6.6 Algunas de las inhibiciones de proteasas más utilizadas
y las clases específicas de proteasas que inhiben
inhibidor Clase de proteasa inhibida
fluoruro de fenilmetilsulfonilo Serina proteasas
Algunas cisteína proteasas
benzamidina Serina proteasas
Pepstatina A proteasas aspárticas
EDTA Metaloproteasas
Minimizar los tiempos de procesamiento obviamente limita la duración durante la cual las proteasas pueden entrar en
contacto directo con el producto proteico. El procesamiento a bajas temperaturas (a menudo 4 C) reduce la
tasa de actividad proteolítica. La inclusión de inhibidores proteolíticos específicos en los tampones de procesamiento, en
particular los tampones de homogeneización, puede ser muy eficaz para prevenir la proteolisis descontrolada.
Aunque ningún inhibidor inhibirá las proteasas de todas las clases mecánicas, se conocen varios inhibidores efectivos
para clases específicas (Tabla 6.6). Por lo tanto, el uso de un cóctel de tales inhibidores es más efectivo. Sin embargo, la
aplicación de muchos de estos inhibidores en el procesamiento biofarmacéutico es inapropiada debido a su toxicidad.
En la mayoría de los casos, la instauración de medidas de precaución que protegen las proteínas contra la degradación
proteolítica es de suma importancia durante las primeras etapas de la purificación. Durante las últimas etapas, la mayoría
de las proteasas presentes se habrán eliminado de la corriente del producto. Un objetivo principal de cualquier sistema
de purificación es la eliminación completa de tales proteasas, ya que la presencia de incluso cantidades mínimas de estos
catalizadores puede dar como resultado una degradación proteolítica significativa del producto terminado con el tiempo.
Como se discutió en el Capítulo 2, muchas proteínas terapéuticas están glicosiladas y las cadenas laterales de azúcar
pueden influir en la función, estructura y estabilidad de las proteínas. La modificación química o enzimática del
glicocomponente de una proteína, por lo tanto, podría afectar sus propiedades terapéuticas. La presencia de enzimas
glicosidasas en preparaciones crudas, por ejemplo, podría conducir a una degradación parcial de las cadenas laterales
de azúcar. En general, sin embargo, tales eventualidades pueden minimizarse de manera efectiva llevando a cabo el
procesamiento posterior a temperaturas más bajas y lo más rápido posible.
6.9.1.2 Desamidación de proteínas
La desamidación y la formación de imidas también pueden influir negativamente en la actividad biológica de una proteína.
La desamidación se refiere a la hidrólisis del grupo amida de la cadena lateral de la asparagina y/o la glutamina,
produciendo ácido aspártico y ácido glutámico respectivamente (Figura 6.19). Esta reacción se promueve especialmente
a temperaturas elevadas y extremos de pH. Representa la ruta principal por la cual las preparaciones de insulina
generalmente se degradan. La formación de imida se produce cuando el nitrógeno amino de la asparagina, el ácido
aspártico, la glutamina o el ácido glutámico ataca el grupo carbonilo de la cadena lateral de estos aminoácidos. Las
estructuras resultantes formadas se denominan aspartimidas o glutarimidas respectivamente. Estas estructuras de imida
cíclica son, a su vez, propensas a la hidrólisis.
jefe jefe
desaminación
HC CH2 COOH
HC CH2
NUEVA HAMPSHIRE
NUEVA HAMPSHIRE
Residuo de Residuo de ácido
asparagina aspártico
jefe jefe
O
desamidación
HC CH2 C H C CH2 COOH CH2
CH2
NH2
NUEVA HAMPSHIRE
NUEVA HAMPSHIRE
Residuo de Residuo de ácido
glutamina glutámico
Figura 6.19 Desamidación de asparagina y glutamina, produciendo ácido aspártico y ácido glutámico
respectivamente. Este proceso a menudo se puede minimizar reduciendo el pH del producto final a 45
6.9.1.3 Oxidación e intercambio de disulfuro
Las cadenas laterales de varios aminoácidos son susceptibles de oxidación por el aire. Aunque las cadenas
laterales de tirosina, triptófano e histidina pueden oxidarse, los átomos de azufre presentes en la metionina o la
cisteína son, con mucho, los más susceptibles. La metionina puede oxidarse con el aire o con oxidantes más
potentes, formando inicialmente un sulfóxido y, posteriormente, una sulfona (Figura 6.20). El átomo de azufre de
la cisteína se oxida fácilmente, formando un enlace disulfuro o (en presencia de agentes oxidantes potentes)
ácido sulfónico (Figura 6.20). La oxidación por aire normalmente da como resultado solo la formación de enlaces
disulfuro. La oxidación de cualquier residuo de aminoácido constituyente puede (potencialmente) reducir
drásticamente la actividad biológica de un polipéptido.
La oxidación de la metionina se ve particularmente favorecida en condiciones de pH bajo y en presencia de
varios iones metálicos. Los residuos de metionina en la superficie de una proteína son obviamente particularmente
susceptibles a la oxidación. Los enterrados internamente en la proteína son menos accesibles al oxidante. hGH
contiene tres residuos de metionina (en las posiciones 14, 125 y 170). Los estudios han encontrado que la
oxidación de la metionina 14 y 125 (las más fácilmente accesibles) no afecta en gran medida la actividad de la
hGH. Sin embargo, la oxidación de los tres residuos de metionina da como resultado la inactivación casi total de
la molécula.
La oxidación se puede minimizar mejor reemplazando el aire en el espacio superior del recipiente del producto
final con un gas inerte como el nitrógeno y/o la adición de antioxidantes al producto final.
El intercambio de disulfuro también puede ocurrir a veces y provocar una reducción en la actividad biológica
(Figura 6.21). El intercambio de disulfuro intermolecular puede resultar en la agregación de moléculas polipeptídicas
individuales.
(a)
C C C
CH2 CH2 CH2

[O] [O]
CH2 CH2 CH2
S ENTONCES oso
CH3 CH3 CH3
Cadena lateral sulfóxido sulfona

de metionina
(b)
C C C C
[O]
CH2 + CH2 CH2 CH2
SH SH S S
Residuos de cisteína Enlace disulfuro
formación
[O]
CH2
SO3H
Ácido cisteico
(ácido sulfónico)
Figura 6.20 Oxidación de (a) metionina y (b) cadenas laterales de cisteína, como puede ocurrir tras la exposición al aire oa agentes
oxidantes más potentes (p. ej., peróxido, superóxido, radicales hidroxilo o hipoclorito). Consulte el texto para obtener información específica.
detalles
(a) S S
OOOOO OOOOO OOOOOOO OOO
S S
(b)
OOOOOOOO OOOOOOOO
S S S S
+ S S
OOOOOOOO OOOOOOOO
S S
Figura 6.21 Diagrama que representa el proceso molecular del intercambio de disulfuro intracatenario (a) e intercatenario (b).
Consulte el texto para obtener detalles específicos. (—O— son residuos de aminoácidos en el polipéptido)
6.9.2 Excipientes estabilizadores utilizados en formulaciones de productos finales
Se puede agregar una gama de diversas sustancias a una proteína terapéutica purificada para estabilizar ese
producto (Tabla 6.7). Dichos agentes pueden estabilizar proteínas de varias maneras diferentes, ya continuación
se describen algunos ejemplos específicos.
Se ha demostrado que la adición de albúmina sérica estabiliza varios polipéptidos diferentes (Tabla 6.8).
La HSA se emplea a menudo en el caso de productos biofarmacéuticos destinados a la administración parenteral
a humanos. En muchos casos, se usa en combinación con estabilizadores adicionales, incluidos los aminoácidos.
(principalmente glicina) y carbohidratos. La albúmina sérica en sí es una molécula bastante estable , capaz de
soportando condiciones de pH bajo o temperatura elevada (es estable por más de 10 h a 60 C). También
muestra excelentes características de solubilidad. Se postula que los estabilizadores de albúmina ejercen sus
influencias estabilizadoras por medios tanto directos como indirectos. Ciertamente, ayuda a disminuir el nivel de
adsorción superficial del biofarmacéutico activo a las paredes internas de los envases del producto final. También
podría actuar como un objetivo alternativo, por ejemplo, para trazas de proteasas u otros agentes que podrían ser
perjudiciales para el producto. También puede funcionar para estabilizar la conformación nativa de muchas
proteínas directamente. Se ha demostrado que es un crioprotector eficaz para varios productos biofarmacéuticos
(p. ej., IL2, tPA y varias preparaciones de interferón), lo que ayuda a minimizar los efectos potencialmente
perjudiciales del proceso de liofilización en el producto.
Sin embargo, el uso de HSA ahora se desaconseja debido a la posibilidad de transmisión accidental.
de patógenos transmitidos por la sangre. El uso de HSA recombinante superaría tales temores.
Varios aminoácidos también se utilizan como agentes estabilizadores para algunos productos biofarmacéuticos
(Cuadro 6.9). La glicina se emplea con mayor frecuencia y se ha descubierto que (así como otros aminoácidos)
ayuda a estabilizar varias preparaciones de interferón, así como EPO, factor VIII, uroquinasa y arginasa. Los
aminoácidos generalmente se agregan al producto final en concentraciones que oscilan entre el 0,5 y el 5 por
ciento. Parecen ejercer su influencia estabilizadora por varios medios, incluida la reducción de la adsorción
superficial del producto, la inhibición de la formación de agregados y la estabilización directa.
Tabla 6.7 Algunos de los principales grupos de excipientes que se pueden agregar a los
productos biofarmacéuticos a base de proteínas para estabilizar la actividad biológica del producto terminado
Albúmina de suero
Varios aminoácidos individuales
Carbohidratos varios
Alcoholes y polioles
Surfactantes
Cuadro 6.8 Varias preparaciones biofarmacéuticas para las que se ha descrito la HSA
como estabilizador potencial
Interferones IFN y tPA

IFN Factor de necrosis tumoral
IL2 Preparaciones de anticuerpos monoclonales
uroquinasa Preparados de globulina
OEP Antígeno de superfície para la hepatitis B
Tabla 6.9 Aminoácidos, carbohidratos y polioles que han encontrado
mayor aplicación como estabilizadores para algunas preparaciones
biofarmacéuticas
Aminoácidos carbohidratos polioles

Glicina Glucosa Glicerol
alanina sacarosa manitol
Lisina trehalosa Sorbitol
Treonina Maltosa CLAVIJA
la conformación de algunas proteínas, particularmente contra la desnaturalización por calor. Quedan por dilucidar los
mecanismos moleculares exactos mediante los cuales se logran tales efectos.
Varios polioles (es decir, moléculas que muestran múltiples grupos hidroxilo) han encontrado aplicación como
agentes estabilizadores de polipéptidos. Los polioles incluyen sustancias como glicerol, manitol, sorbitol y
PEG, así como asinositol (Tabla 6.9 y Figura 6.22). Un subconjunto de polioles son los carbohidratos, que se enumeran
por separado (y, por lo tanto, de manera un tanto artificial) de los polioles en la Tabla 6.9. Se ha encontrado que varios
polioles estabilizan las proteínas en solución directamente, y los carbohidratos en particular también se agregan a
menudo a los productos biofarmacéuticos antes de la liofilización para proporcionar volumen físico a la torta liofilizada.
Los tensioactivos son desnaturalizantes proteicos bien conocidos. Sin embargo, cuando están suficientemente
diluidos, algunos tensioactivos (p. ej., el polisorbato) ejercen una influencia estabilizadora sobre algunos tipos de
proteínas. Las proteínas muestran una tendencia a agregarse en las interfaces (airelíquido o líquidolíquido), un proceso
que a menudo promueve su desnaturalización. La adición de tensioactivo reduce la tensión superficial de las soluciones
acuosas y, a menudo, aumenta la solubilidad de las proteínas disueltas en ellas. Esto ayuda a reducir la tasa de proteína
CH2OH CH2OH
HO CH OH OH HC OH
HO CH OH HO CH
HC OH HO OH HC OH
HC OH OH HC OH
CH2OH CH2OH
manitol inositol Sorbitol
CH2OH _
HC OH HO CH2 CH2 OH
norte
CH2OH _
Glicerol Polietilenglicol
Figura 6.22 Estructura de algunos polioles que a veces se utilizan para estabilizar proteínas
desnaturalización en las interfases. El polisorbato, por ejemplo, se incluye en algunas preparaciones de globulina, citoquinas
y en algunos productos basados en anticuerpos monoclonales.
Aunque se utilizan varios polisorbatos, la experiencia con un producto basado en EPO (nombre comercial Eprex) suena
como una nota de advertencia potencial en términos de desarrollo de fórmulas, como se describe en el Cuadro 4.1.
6.9.3 Llenado de producto final
En la Figura 6.23 se presenta una descripción general de un proceso de llenado de producto final típico . El producto final a
granel primero se somete a pruebas de control de calidad para asegurar que cumple con las especificaciones del producto a granel.
Aunque la implementación de buenas prácticas durante la fabricación garantizará que el producto lleve una carga microbiana
baja, no será estéril en esta etapa. Luego, el producto se pasa a través de un filtro (esterilizante) de 0,22 m (Figura 6.24). El
producto estéril se aloja (temporalmente) en un tanque de almacenamiento de productos estériles, desde donde se llena
asépticamente en contenedores de producto final preestériles (generalmente viales de vidrio). El proceso de llenado normalmente
emplea sistemas de llenado de líquidos altamente automatizados. Todos los elementos del equipo, tuberías, etc. con los que el
producto esterilizado entre en contacto directo, obviamente deben estar esterilizados. La mayoría de estos equipos pueden
esterilizarse en autoclave y ensamblarse asépticamente antes de la operación de llenado (que
se lleva a cabo en condiciones de flujo laminar de grado A).
Llenado aséptico en Clase A, Puerta del
condiciones de flujo laminar liofilizador
Fondo de clase A o B
Contenedor de
Producto filtro de 0,22 micras producto final
final a granel Producto a
granel estéril
liofilizador
Figura 6.23 Llenado de producto final. El producto a granel final (después de la adición de excipientes y la prueba de control de calidad
del producto final) se esteriliza por filtración al pasar por un filtro de 0,22 m. El producto estéril se envasa asépticamente en
recipientes de producto final (preestériles) en condiciones de flujo laminar de grado A. Gran parte de la operación de llenado utiliza
equipos de llenado altamente automatizados. Después del llenado, el envase del producto se sella (mediante un sistema de sellado
aséptico automatizado) o se liofiliza primero y luego se sella.
Figura 6.24 Representación fotográfica de una variedad de tipos de filtros y su carcasa de acero inoxidable. La mayoría de los
filtros utilizados a escala industrial tienen un diseño de cartucho plisado, lo que facilita el alojamiento de la máxima área de filtro
dentro de un espacio compacto (a). Por lo general, se alojan en unidades de alojamiento de acero inoxidable (b). Algunas
operaciones de proceso, sin embargo, aún utilizan filtros planos (disco), que están alojados en un trípode de acero inoxidable.
vivienda (c). Todas las fotografías son cortesía de Pall Life Sciences, Irlanda
Los envases del producto final también deben ser preesterilizados. Esto se puede lograr mediante la esterilización en
autoclave o el paso por un equipo especial que somete los viales a un enjuague con WFI caliente, seguido de un
tratamiento de esterilización con calor seco y UV.
Figura 6.24 (Continuación)
6.9.4 Secado por congelación
El secado por congelación (liofilización) se refiere a la eliminación del solvente directamente de una solución mientras se
encuentra en estado congelado. La eliminación del agua directamente de los productos biofarmacéuticos (congelados)
mediante liofilización produce un producto en polvo, que normalmente muestra un contenido de agua del orden del 3 por ciento.
En general, la eliminación del agua disolvente de dichos productos reduce en gran medida la probabilidad de inactivación
del producto biofarmacéutico mediada por productos químicos/biológicos. Los productos biofarmacéuticos liofilizados
suelen exhibir una vida útil más larga que los productos vendidos en solución. Las autoridades reguladoras también
reconocen que la liofilización es un método seguro y aceptable para conservar muchos productos parenterales.
La liofilización es una forma relativamente suave de eliminar el agua de las proteínas en solución. Sin embargo, este
proceso puede promover la inactivación de algunos tipos de proteínas, y se suelen añadir excipientes específicos
(crioprotectores) al producto para minimizar dicha inactivación. Los crioprotectores de uso común incluyen carbohidratos
(como glucosa y sacarosa), proteínas (como HSA) y aminoácidos (como lisina, arginina o ácido glutámico). Los alcoholes/
polioles también han encontrado alguna aplicación como crioprotectores.
El proceso de liofilización se inicia con la congelación del producto biofarmacéutico en sus envases de producto final. A
medida que la temperatura disminuye, los cristales de hielo comienzan a formarse y crecer. Esto da como resultado una
concentración eficaz de todos los solutos presentes en la fase líquida restante, incluida la proteína y todos los excipientes
añadidos. Por ejemplo, la concentración de sales puede aumentar a
1. El aumento de la concentración de soluto por sí solo puede acelerar las reacciones químicas.
niveles tan altos como 3 mol l
que dañan el producto proteico. Además, dicha concentración hace que las moléculas de proteína individuales entren en
contacto más íntimo entre sí, lo que puede provocar interacciones proteínaproteína y, por lo tanto, agregación.
A medida que la temperatura desciende aún más, algunos de los solutos presentes también pueden cristalizar, siendo así
eliminados efectivamente de la solución. En algunos casos, los constituyentes individuales del tampón pueden cristalizar fuera
de la solución a diferentes temperaturas. Esto alterará drásticamente los valores de pH de la solución restante y, de esta forma,
puede conducir a la inactivación de proteínas.
A medida que la temperatura desciende aún más, la viscosidad de la solución descongelada aumenta drásticamente hasta
que cesa efectivamente la movilidad molecular. Esta solución descongelada contendrá la proteína, así como algunos excipientes
y (como máximo) un 50 por ciento de agua. Como la movilidad molecular se ha detenido efectivamente, la reactividad química
también casi cesa. La consistencia de esta 'solución' es la del vidrio, y la temperatura a la que se alcanza se denomina
temperatura de transición vítrea Tg´. Para la mayoría de las soluciones de proteínas, los valores de Tg´ se encuentran entre 40
C y 60 C. El objetivo principal de las etapas iniciales
del proceso de liofilización es disminuir la temperatura del producto por debajo de su valor Tg´ y como
lo antes posible para minimizar los posibles efectos negativos descritos anteriormente.
La siguiente fase del proceso de liofilización implica la aplicación de vacío al sistema.
Cuando se establece el vacío, se aumenta la temperatura, por lo general a temperaturas ligeramente superiores a 0 C. Esto
promueve la sublimación del agua cristalina, dejando atrás una torta en polvo de material seco. Una vez logrado un secado
satisfactorio, se sella el envase del producto.
La cámara de secado de los liofilizadores a escala industrial generalmente se abre a una sala limpia (Figura 6.23).
Esto facilita la transferencia directa de los viales que contienen el producto a la cámara. Inmediatamente antes del llenado, los
tapones de goma generalmente se insertan parcialmente en la boca de cada vial de tal manera que no obstaculicen el flujo
hacia afuera del vapor de agua durante el proceso de liofilización. La cámara de secado normalmente contiene varias filas de
estantes, cada uno de los cuales puede acomodar varios miles de viales (Figura 6.25). Estos estantes están cableados para
permitir su calentamiento eléctrico, su enfriamiento y su movimiento hacia arriba o hacia abajo. Una vez que se completa el ciclo
de secado por congelación (que puede demorar 3 días o más), los estantes se mueven hacia arriba. A medida que cada estante
se mueve hacia arriba, los sellos de goma parcialmente insertados se insertan completamente en la boca del vial cuando entran
en contacto con la placa base del estante inmediatamente encima de ellos. Después de la recuperación del producto, la cámara
vacía se cierra y luego se esteriliza con calor (usando su propio mecanismo de calentamiento de la cámara). El liofilizador está
entonces listo para aceptar su próxima carga.
6.9.5 Etiquetado y embalaje
Después de que el producto haya sido llenado (y sellado) en su contenedor de producto final. Luego, el personal de control de
calidad extrae muestras representativas del producto y realiza pruebas para garantizar la conformidad con la especificación del
producto final. Las especificaciones más importantes estarán relacionadas con la potencia del producto, la esterilidad y el
volumen final de llenado, así como con la ausencia de endotoxinas u otras sustancias potencialmente tóxicas. También se
realizará la detección y cuantificación de los excipientes añadidos. El análisis del producto se considera en el Capítulo 7.
Solo después de que el personal de control de calidad esté satisfecho de que el producto cumple con estas especificaciones,
se etiquetará y empacará. Estas operaciones están altamente automatizadas. El etiquetado, en particular, merece especial
atención. El etiquetado incorrecto del producto sigue siendo una de las razones más comunes para el retiro del producto. Esto
puede ocurrir con relativa facilidad, particularmente si la instalación fabrica varios productos diferentes, o incluso un solo
producto con varias concentraciones diferentes. La información presentada en una etiqueta normalmente debe incluir:
Figura 6.25 Representación fotográfica de (a) liofilizadores a escala de laboratorio, (b) a escala piloto y (c) a escala industrial.
Consulte el texto para obtener más detalles. Fotografía cortesía de Virtis, EE. UU.
OTRAS LECTURAS 171
Figura 6.25 (Continuación)
• nombre y concentración/potencia del producto;
• número de lote específico del producto;
• fecha de fabricación y fecha de caducidad;
• condiciones de almacenamiento requeridas.
La información adicional que se presenta a menudo incluye el nombre del fabricante, una lista de excipientes
incluidos y un breve resumen del modo correcto de uso del producto.
Cuando se etiqueta y empaqueta un lote de producto, y el personal de control de calidad está satisfecho de
que el etiquetado y el empaque se completaron según las especificaciones, el gerente de control de calidad
redactará y firmará un 'Certificado de análisis'. Esto detalla las especificaciones predefinidas del producto y
confirma la conformidad del lote real del producto en cuestión con estas especificaciones. En este punto, el
producto, junto con su Certificado de Análisis, puede ser enviado al cliente.
Otras lecturas
Libros
Ahmed, H. 2005. Principios y reacciones de extracción, purificación y caracterización de proteínas. CDN
Prensa.
Carpenter, J. 2002. Diseño racional de formulaciones de proteínas estables . Kluwer.
Costantino, H. y Pikal, M. (eds). 2005. Liofilización de productos biofarmacéuticos. Prensa AAPS.
Desai, M. 2000. Métodos de procesamiento de proteínas aguas abajo. Prensa Humana.
Flickinger, M. 1999. La Enciclopedia de Tecnología de Bioprocesos. Wiley.
Frokjaer, S. 2000. Desarrollo de Formulaciones Farmacéuticas de Péptidos y Proteínas. Taylor y Francisco.
Grindley, J. y Ogden, J. 2000. Comprensión de los productos biofarmacéuticos. Cuestiones de fabricación y normativas.
Prensa Interfarmacéutica.
Harris, E. 2000. Aplicaciones de purificación de proteínas. Prensa de la Universidad de Oxford.
Merten, O.W., Mattanovich, D., Lang, C., Larsson, G., Neubauer, P., Porro, D., Postma, P., Teixeira de Mattos, J. y Cole, JA Producción
de proteínas recombinantes con células procariotas y eucariotas: ¿una visión comparativa de la fisiología del huésped ? Kluwer.
Janson, J. 1998. Purificación de proteínas. Wiley.
Oxender, D. y Post, L. 1999. Nuevas terapias de la biotecnología moderna. Springer Verlag. Roe, S. 2001. Técnicas
de purificación de proteínas. Prensa de la Universidad de Oxford.
Walsh, G. 2002. Proteínas: Bioquímica y Biotecnología. Wiley.
Artículos
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estabilidades a largo plazo de las proteínas. Revisiones avanzadas de entrega de medicamentos 46, 307–326.
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ARGININA HISTIDINA LISINA

CH2 CH2 CH2

Nombre del grupo Estructura de grupo tipo de intercambiador

Dietilaminoetilo (DEAE) !O!(CH2)2 !NH !(CH2 !CH3)2 !CH2 !NH ! Anión

Sulfopropilo (SP) !CH2 !CH2 !CH2SO3 Catión

ALANINA VALINA LEUCINA ISOLEUCINA

ARRULLO ARRULLO ARRULLO ARRULLO

H3N+ CH CH H3N+ CH H3N+ CH

TRIPTÓFANO METIONINA FENILALANINA PROLINA

ARRULLO ARRULLO ARRULLO H

H3N+ CH H3N+ CH H3N+ CH

(a) SEFAROSA O CH2 CH CH2 O

(b) SEFAROSA O CH2 CH CH2 O (CH2 )7 CH3

lectina Fuente Especificidad del azúcar Azúcar de elución

Con A Semillas de habichuelas ­D­Manosa, ­D­glucosa ­D­Metilmanosa

Soporte de cuentas Antígeno que se empleó originalmente Ligandos adicionales en solución no

Ca HPO ∙2H O 1 00 C /NH 3→Ca (PO ) (OH)

CH2 CH2 CH2

CH3 CH3 CH3

Cadena lateral sulfóxido sulfona

OOOOO OOOOO OOOOOOO OOO

Interferones IFN­ y ­ tPA

Aminoácidos carbohidratos polioles

HO CH OH OH HC OH

manitol inositol Sorbitol

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