Cap 621

Impreso el: jue. mar. 23 2023, 06:36:01 a. m.
(EST) Estado: Oficial Vigente al 23-mar-2023 DocId: GUID-6C3DF8B8-D12E-4253-A0E7-6855670CDB7B_6_es-ES

Impreso por: Leydy Baena Fecha Oficial: Oficial desde 01-dic-2022 Tipo de Documento: Capítulos Generales @2023 USPC
No Distribuir DOI Ref: nu938 DOI: https://doi.org/10.31003/USPNF_M99380_06_01
1
á621ñ CROMATOGRAFÍA
(Las secciones Sensibilidad del Sistema y Simetría de los Picos serán oficiales a partir del 1º de diciembre de 2023, según
se indica.)
Para ver el Aviso del Comité de Expertos que fue publicado junto con esta revisión acelerada, hacer clic en https://
www.uspnf.com/rb-621-20221028.
Cambio en la redacción:
▲
INTRODUCCIÓN
Las técnicas de separación cromatográfica son procedimientos de separación de múltiples etapas en los que los componentes
de una muestra se distribuyen entre dos fases, una de las cuales es estacionaria mientras que la otra es móvil. La fase estacionaria
puede ser un sólido, un líquido adsorbido sobre un sólido o un gel. La fase estacionaria puede estar empacada en una columna,
extendida como una capa o distribuida como una película, etc. La fase móvil puede ser gaseosa o líquida o fluido supercrítico.
La separación puede basarse en adsorción, distribución de masa (partición), intercambio iónico, etc. o puede basarse en
diferencias en las propiedades fisicoquímicas de las moléculas, tales como tamaño, masa, volumen, etc.
Las partes del texto de este capítulo general que son texto USP–NF nacional y, por lo tanto, no forman parte del texto
armonizado, están indicadas con símbolos (♦♦) para especificar este hecho.
♦Este capítulo describe procedimientos generales, definiciones y cálculos de parámetros comunes y requisitos generales
aplicables para la aptitud del sistema.
l
Los tipos de cromatografía útiles en el análisis cualitativo y cuantitativo que se emplean en los procedimientos cromatográficos
de la USP son: cromatografía en columna, de gases, en papel, en capa delgada (incluyendo la cromatografía en capa delgada
ia
de alta resolución) y de líquidos presurizados (comúnmente llamada cromatografía líquida de alta presión o alta resolución).
PROCEDIMIENTOS GENERALES
Esta sección describe los procedimientos básicos usados cuando se describe un método cromatográfico en una monografía.
fic
Se deben seguir los siguientes procedimientos a menos que se indique algo distinto en la monografía individual.
Cromatografía en Papel
FASE ESTACIONARIA
O
La fase estacionaria es una hoja de papel de textura y espesor adecuados. El desarrollo puede ser ascendente, en cuyo caso
el disolvente se desplaza hacia arriba por el papel mediante fuerzas de capilaridad, o descendente, en cuyo caso el flujo del
disolvente se ve ayudado por la fuerza de gravedad. La orientación de las fibras del papel con respecto al flujo del disolvente
se debe mantener constante en una serie de cromatogramas. (Por lo general, el fabricante indica la dirección de máquina.)
APARATO
El equipo esencial para cromatografía en papel comprende una cámara hermética al vapor, provista de entradas para agregar
el disolvente y una gradilla de material resistente a la corrosión aproximadamente 5 cm más corta que la altura interior de la
cámara. La gradilla sirve como soporte para la cubeta de disolvente y para las varillas antisifón que, a su vez, sostienen las hojas
cromatográficas. El fondo de la cámara está cubierto con la mezcla de disolventes o fase móvil indicada. La saturación de la
cámara con el vapor del disolvente se facilita revistiendo las paredes del interior con un papel humedecido con la fase móvil
indicada.
SIEMBRA
La sustancia o sustancias a ser analizadas se disuelven en un disolvente adecuado. Se aplican volúmenes convenientes,
medidos con micropipetas adecuadas, de la solución resultante que contengan normalmente de 1–20 µg del compuesto, en
zonas de 6 a 10 mm de diámetro y con una separación de no menos de 3 cm.
PROCEDIMIENTO PARA CROMATOGRAFÍA DESCENDENTE EN PAPEL

1. Suspender la hoja cromatográfica sembrada en el aparato, usando la varilla antisifón para sostener el extremo superior
de la hoja en la cubeta de disolvente. [NOTA—Asegurar que la porción de la hoja que cuelga por debajo de las varillas
esté suspendida libremente en la cámara sin tocar la gradilla o las paredes de la cámara o el líquido que está en el interior
de la cámara.]
2. La cámara se sella para permitir su equilibrio (saturación) y el del papel con el vapor del disolvente. Liberar cualquier
exceso de presión, si fuera necesario.
3. Después de equilibrar la cámara, la fase móvil previamente preparada se introduce en la cubeta a través de la entrada.
4. Cerrar la entrada y dejar que la fase móvil se desplace hacia abajo la distancia deseada sobre el papel.
5. Retirar la hoja de la cámara.
https://online.uspnf.com/uspnf/document/4_GUID-6C3DF8B8-D12E-4253-A0E7-6855670CDB7B_6_es-ES 1/22
Impreso el: jue. mar. 23 2023, 06:36:01 a. m.(EST) Estado: Oficial Vigente al 23-mar-2023 DocId: GUID-6C3DF8B8-D12E-4253-A0E7-6855670CDB7B_6_es-ES
2
6. Marcar rápidamente la ubicación del frente de la fase móvil y secar la hoja.

7. Observar el cromatograma y medir directamente o después del revelado adecuado para localizar las manchas del
fármaco o de los fármacos aislados.
PROCEDIMIENTO PARA CROMATOGRAFÍA ASCENDENTE EN PAPEL

1. Agregar la fase móvil al fondo de la cámara.
2. La cámara se sella para permitir su equilibrio (saturación) y el del papel con el vapor del disolvente. Liberar cualquier
exceso de presión, si fuera necesario.
3. Sumergir el borde inferior de la fase estacionaria en la fase móvil para permitir que la fase móvil ascienda en la hoja
cromatográfica por capilaridad.
4. Cuando el frente de la fase móvil haya alcanzado la altura deseada, abrir la cámara, retirar la hoja, marcar rápidamente
la ubicación del frente de la fase móvil y secar la hoja.
5. Observar el cromatograma y medir directamente o después del revelado adecuado para localizar las manchas del
fármaco o de los fármacos aislados.
Cromatografía en Capa Delgada

FASE ESTACIONARIA
La fase estacionaria es una capa relativamente delgada y uniforme de material seco y reducido a polvo fino que se aplica
sobre una lámina o placa de vidrio, plástico o metal (generalmente conocida como la placa). La fase estacionaria de las placas
l
para cromatografía en capa delgada (TLC, por sus siglas en inglés) tiene un tamaño de partícula promedio de 10–15 µm, y la
de las placas para TLC de alta resolución (HPTLC, por sus siglas en inglés) tiene un tamaño de partícula promedio de 5 µm. Se
ia
pueden usar placas disponibles comercialmente con una zona preadsorbente, si se especifican en una monografía. La muestra
aplicada a la región preadsorbente se desarrolla en forma de bandas estrechas y definidas en la interfase entre el preadsorbente y
el sorbente. Las separaciones logradas pueden basarse en la adsorción, la partición o una combinación de ambos efectos, según
el tipo específico de fase estacionaria.
fic
APARATO
Usar una cámara cromatográfica de material inerte y transparente con las siguientes especificaciones: una cubeta de fondo
plano o cubetas gemelas, una tapa que cierre herméticamente y un tamaño adecuado para las placas. Revestir como mínimo
una pared de la cámara cromatográfica con papel de filtro. Agregar una cantidad suficiente de fase móvil a la cámara
cromatográfica de modo que proporcione, después de impregnar el papel de filtro, un nivel de profundidad apropiado a la
dimensión de la placa utilizada. Cerrar la cámara cromatográfica y dejar que se equilibre. [NOTA—A menos que se indique algo
diferente, las separaciones se realizan en una cámara saturada.]
O
DETECCIÓN/VISUALIZACIÓN
A menudo se usa una fuente de luz ultravioleta (UV) adecuada para observaciones bajo luz UV de longitud de onda corta
(254 nm) y larga (365 nm), así como una variedad de soluciones reveladoras para visualizar las manchas.
SIEMBRA
Aplicar las soluciones en forma de zonas sobre la superficie de la fase estacionaria (placa) en el volumen prescrito en porciones
lo suficientemente pequeñas para obtener manchas circulares de 2–5 mm de diámetro (1–2 mm sobre placas para HPTLC) o
bandas de 10–20 mm × 1–2 mm (5–10 mm × 0,5–1 mm sobre placas para HPTLC) a una distancia adecuada del borde inferior y
de los bordes laterales de la placa. [NOTA—Durante el desarrollo, la posición de la aplicación debe estar por lo menos 5 mm
(TLC) o 3 mm (HPTLC) por encima del nivel de la fase móvil.] Aplicar las soluciones sobre una línea paralela al borde inferior
de la placa con una separación mínima de 10 mm (5 mm en placas para HPTLC) entre los centros de las manchas, o 4 mm
(2 mm en placas para HPTLC) entre los bordes de las bandas y dejar que se sequen.
PROCEDIMIENTO
1. Colocar la placa en la cámara, asegurando que las manchas o bandas estén por encima de la superficie de la fase móvil.
2. Cerrar la cámara.
3. Dejar que la fase móvil ascienda en la placa hasta que el frente de la fase móvil haya recorrido tres cuartos de la longitud
de la placa o la distancia indicada en la monografía.
4. Retirar la placa, marcar el frente de la fase móvil con un lápiz y dejar que se seque.
5. Visualizar los cromatogramas según se indica.
6. Determinar los valores del factor de retardo (RF) cromatográfico para las manchas o zonas principales.
7. Se puede realizar una identificación presuntiva mediante la observación de las manchas o zonas con valores RF idénticos y
de magnitud similar, obtenidas respectivamente cromatografiando una muestra desconocida y un estándar en la misma
placa. Una comparación visual del tamaño o intensidad de las manchas o zonas puede servir para una estimación
semicuantitativa. Las mediciones cuantitativas se pueden efectuar mediante densitometría (mediciones de absorbancia o
fluorescencia).
3
Cromatografía en Columna
SOPORTE SÓLIDO
Usar tierra silícea purificada para separación por partición en fase normal. Usar tierra silícea cromatográfica silanizada para
cromatografía de partición en fase reversa.
FASE ESTACIONARIA
Modificar el soporte sólido agregando la fase estacionaria especificada en la monografía individual. Si se emplea una mezcla
de líquidos como fase estacionaria, mezclarlos antes de la introducción del soporte sólido.
FASE MÓVIL
La fase móvil se especifica en la monografía individual. Si la fase estacionaria es una solución acuosa, equilibrar con agua. Si
la fase estacionaria es un líquido orgánico polar, equilibrar con ese líquido.
APARATO
A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, el tubo cromatográfico tiene un diámetro interno de
aproximadamente 22 mm y una longitud de 200–300 mm. Acoplado al tubo cromatográfico, se encuentra un tubo de salida
sin llave de paso con un diámetro interno de aproximadamente 4 mm y una longitud de aproximadamente 50 mm.
Preparación del aparato: Apisonar un trozo de lana de vidrio fina en la base del tubo. Combinar el volumen especificado de
l
fase estacionaria y la cantidad especificada de soporte sólido para producir una mezcla homogénea y liviana. Transferir esta
mezcla al tubo cromatográfico y apisonar empleando presión suave, hasta obtener una masa uniforme. Si la cantidad
ia
especificada de soporte sólido es más de 3 g, transferir la mezcla a la columna en porciones de aproximadamente 2 g y apisonar
cada porción. Si la valoración o la prueba requieren una columna multisegmentada, con una fase estacionaria diferente
especificada para cada segmento, apisonar después de la adición de cada segmento y agregar cada segmento directamente
sobre el anterior. Apisonar un trozo de lana de vidrio fina por encima del relleno de la columna. [NOTA—La fase móvil debe
fluir a través de una columna rellena adecuadamente como una corriente moderada o, si se lleva a cabo una cromatografía en
fic
fase reversa, como un goteo lento.]
Si se incorpora la solución del analito en la fase estacionaria, completar la transferencia cuantitativa al tubo cromatográfico
raspando el vaso de precipitados usado para la preparación de la mezcla de prueba con una mezcla de aproximadamente 1 g
de soporte sólido y varias gotas del disolvente usado para preparar la solución muestra antes de agregar el trozo final de lana
de vidrio por encima del relleno.
PROCEDIMIENTO
O
1. Transferir la fase móvil al espacio de la columna por encima del relleno y dejar que fluya a través de la columna por acción
de la gravedad.
2. Enjuagar la punta de la columna cromatográfica con aproximadamente 1 mL de fase móvil antes de cada cambio en la
composición de la fase móvil y después de completar la elución.
3. Si se introduce el analito en la columna como una solución en la fase móvil, dejar que pase completamente al relleno de
la columna, luego agregar la fase móvil en varias porciones pequeñas, dejando que cada porción drene completamente,
antes de agregar el grueso de la fase móvil.
4. Cuando el procedimiento indique el uso de múltiples columnas cromatográficas montadas en serie y se especifique la
adición de fase móvil en porciones divididas, dejar que cada porción drene por completo a través de cada columna y
enjuagar la punta de la columna con fase móvil antes de la adición de cada porción sucesiva.
Cromatografía de Gases (GC)

FASE ESTACIONARIA LÍQUIDA
Este tipo de fase está disponible en columnas rellenas o capilares.
CROMATOGRAFÍA DE GASES EN COLUMNA CON RELLENO

La fase estacionaria líquida se deposita sobre un soporte sólido inerte finamente dividido, como por ejemplo tierra de
diatomeas, polímeros porosos, o carbono grafito, con el que se rellena la columna que por lo regular tiene un diámetro interno
de 2–4 mm y una longitud de 1–3 m.
CROMATOGRAFÍA DE GASES EN COLUMNA CAPILAR

En las columnas capilares, las cuales no están rellenas con soporte sólido, la fase estacionaria líquida se deposita sobre la
superficie interna de la columna y puede unirse químicamente a ella.
4
FASE ESTACIONARIA SÓLIDA

Este tipo de fase está disponible únicamente en columnas rellenas. En estas columnas, la fase sólida es un adsorbente activo,
como por ejemplo alúmina, sílice o carbono, con el que se rellena una columna. Las resinas poliaromáticas porosas, que a veces
se emplean en las columnas rellenas, no se recubren con una fase líquida. [NOTA—Las columnas capilares y rellenas deben
acondicionarse antes del uso, hasta que la línea base y otras características sean estables. Los distribuidores de columnas y
materiales de relleno proveen instrucciones relativas al acondicionamiento recomendado.]
APARATO
Un cromatógrafo de gases consta de una fuente de gas transportador, un inyector, una columna, un detector y un dispositivo
registrador. El inyector, la columna y el detector tienen temperaturas controladas y se pueden variar como parte del análisis.
Los gases transportadores típicos son helio, nitrógeno o hidrógeno, dependiendo de la columna y el detector en uso. El tipo
de detector que se usa depende de la naturaleza de los compuestos que se analizan y se especifica en la monografía individual.
La señal de salida del detector se registra en función del tiempo, y la respuesta del instrumento, que se mide como el área o
altura del pico, en función de la cantidad presente.
PROGRAMA DE TEMPERATURA
La longitud y la calidad de una separación por GC se pueden controlar alterando la temperatura de la columna
cromatográfica. Cuando sea necesario un programa de temperatura, la monografía individual indica las condiciones en formato
de tabla. La tabla indica la temperatura inicial, la velocidad de cambio de temperatura (rampa), la temperatura final y el tiempo
de espera (hold time) a la temperatura final.
l
PROCEDIMIENTO
1.
2.
3.
4.
ia
Equilibrar la columna, el inyector y el detector con un flujo de gas transportador hasta obtener una señal constante.
Inyectar una muestra a través del septo del inyector, o usar un muestreador automático.
Comenzar el programa de temperatura.
Registrar el cromatograma.
fic
5. Analizar según se indica en la monografía.
Cromatografía de Líquidos
El término "cromatografía de líquidos" (LC, por sus siglas en inglés), según se usa en los compendios, es sinónimo de
cromatografía líquida de alta presión y de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, por sus siglas en inglés). La
cromatografía de líquidos es una técnica de separación basada en una fase estacionaria sólida y una fase móvil líquida.
O
FASE ESTACIONARIA
Las separaciones se logran por procesos de partición, adsorción o intercambio iónico, según el tipo de fase estacionaria
empleada. Las fases estacionarias más comúnmente usadas son la sílice modificada o las microperlas de polímero. Las
microperlas se modifican agregando hidrocarburos de cadena larga. El tipo de relleno específico necesario para completar un
análisis se indica mediante la designación “L” en la monografía individual (ver también la sección Columnas Cromatográficas). A
menudo, el tamaño de las microperlas también se describe en la monografía. Los cambios en el tipo y tamaño del relleno se
analizan en la sección Aptitud del Sistema de este capítulo.
COLUMNA CROMATOGRÁFICA
El término "columna" incluye columnas de acero inoxidable, de acero inoxidable con recubrimiento interno y poliméricas,
rellenas con una fase estacionaria. La longitud y el diámetro interno de la columna afectan la separación y, por lo tanto, las
dimensiones típicas de la columna se incluyen en la monografía individual. Los cambios en las dimensiones de la columna se
analizan en la sección Aptitud del Sistema de este capítulo. Las monografías farmacopeicas no incluyen el nombre comercial de
las columnas apropiadas; esta omisión evita la interpretación de cualquier tipo de respaldo para un producto de un proveedor y
permite la adaptación a cambios normales en el mercado. Ver la sección Columnas Cromatográficas para más información.
En los procedimientos de HPLC, se puede usar una guarda columna siempre que se cumplan los siguientes requisitos, a
menos que se indique algo diferente en la monografía individual: (a) la longitud de la guarda columna debe ser no mayor de
15% de la longitud de la columna analítica, (b) el diámetro interno debe ser igual o menor que el de la columna analítica y (c)
el material de relleno debe ser el mismo que el de la columna analítica (p. ej., sílice) y contener la misma fase ligada (p. ej.,
C18). En todo caso, se deben cumplir todos los requisitos de aptitud del sistema especificados en el procedimiento oficial con
la guarda columna instalada.
FASE MÓVIL
La fase móvil es un disolvente o mezcla de disolventes, según se define en la monografía individual.
5
APARATO
Un cromatógrafo de líquidos consta de un recipiente que contiene la fase móvil, una bomba para forzar el paso de la fase
móvil a través del sistema a alta presión, un inyector para introducir la muestra en la fase móvil, una columna cromatográfica,
un detector y un dispositivo de recolección de datos.
ELUCIÓN EN GRADIENTE
Se denomina elución en gradiente o programación del disolvente a la técnica de cambiar continuamente la composición del
disolvente durante la cromatografía. El perfil de elución en gradiente se presenta en la monografía individual como una tabla
de gradientes, que indica el tiempo y la composición proporcional de la fase móvil en el tiempo indicado.
PROCEDIMIENTO
1. Equilibrar la columna y el detector con fase móvil a la velocidad de flujo especificada hasta obtener una señal constante.
2. Inyectar una muestra a través del inyector o usar un muestreador automático.
3. Comenzar el programa de gradientes.
4. Registrar el cromatograma.
5. Analizar según se indica en la monografía.
COLUMNAS CROMATOGRÁFICAS
l
Una lista completa de rellenos (L), fases (G) y soportes (S) usados en las pruebas y valoraciones de USP–NF se encuentra en
la sección Reactivos, Indicadores y Soluciones—Columnas Cromatográficas de USP–NF. Esta lista pretende ser una referencia útil
monografía individual.♦
ia
para el técnico en cromatografía en la identificación de la columna cromatográfica correspondiente especificada en la
DEFINICIONES
fic
La aptitud del sistema y los criterios de aceptación en las monografías se han establecido usando los parámetros según se
define a continuación. Con algunos equipos, ciertos parámetros, tal como la relación señal-ruido y la resolución, se pueden
calcular usando el software provisto por el fabricante. Es responsabilidad del usuario asegurarse de que los métodos de cálculo
usados en el software sean equivalentes a los requisitos de la Farmacopea de los EE. UU. y hacer las correcciones necesarias si
este no es el caso.
Cromatograma: Representación gráfica o de otro tipo de la respuesta del detector, concentración del efluente u otra
O
cantidad usada como una medida de la concentración del efluente en función del tiempo o volumen. Los cromatogramas
idealizados se representan como una secuencia de picos gaussianos sobre una línea base (Figura 1).
6
l
ia
fic
Figura 1.
VM = volumen muerto
O
tM = tiempo muerto
VR1 = volumen de retención del pico 1
tR1 = tiempo de retención del pico 1
VR2 = volumen de retención del pico 2
tR2 = tiempo de retención del pico 2
Wh = ancho del pico a la mitad de la altura
Wi = ancho del pico en el punto de inflexión
h = altura del pico
h/2 = mitad de la altura del pico
Constante de distribución (K0): En la cromatografía de exclusión por tamaño, las características de elución de un
componente en una columna particular pueden estar dadas por la constante de distribución (también denominada coeficiente
de distribución), que se calcula usando la siguiente ecuación:
�� − �
0
�0 = � − �
� 0
tR = tiempo de retención
t0 = tiempo de retención de un compuesto no retenido
tt = tiempo total de la fase móvil
Volumen de residencia (D) (también denominado VD): El volumen de residencia (también conocido como
volumen de demora de la elución en gradiente) es el volumen entre el punto en el que se encuentran los eluyentes y la entrada
de la columna. Se puede determinar usando el siguiente procedimiento.
COLUMNA: Reemplazar la columna cromatográfica con un tubo capilar apropiado (p. ej., 1 m × 0,12 mm).
FASE MÓVIL: Ver la Tabla 1.
FASE MÓVIL A: Agua
FASE MÓVIL B: Solución al 0,1% v/v de acetona en agua
7
Tabla 1
Tiempo Fase móvil A Fase móvil B
(min) (% v/v) (% v/v)
0–20 100→0 0→100
20–30 0 100
VELOCIDAD DE FLUJO: Ajustar para obtener suficiente contrapresión (p. ej., 2 mL/min).
DETECCIÓN: Espectrofotómetro a 265 nm
Determinar el tiempo (t0,5), en minutos, cuando la absorbancia ha aumentado en un 50% (Figura 2).
D = tD × F
tD = t0,5 — 0,5tG (min)

tG = tiempo de gradiente predefinido, 20 min
F = velocidad de flujo (mL/min)
l
ia
fic
O
Figura 2.
[NOTA—cuando corresponda, esta medición se realiza con el muestreador automático en la posición de "inyectar" para incluir
el volumen del bucle de inyección en el volumen de residencia.]
Tiempo muerto (tM): El tiempo requerido para eluir un componente no retenido (ver la Figura 1, siendo la escala de
la línea base en minutos o segundos).
En la cromatografía de exclusión por tamaño, se usa el término tiempo de retención de un compuesto no retenido (t0).
Volumen muerto (VM): El volumen de fase móvil requerido para eluir un componente no retenido. Se puede calcular a
partir del tiempo muerto y la velocidad de flujo (F), en mililitros por minuto, usando la siguiente ecuación:
VM = tM × F
En la cromatografía de exclusión por tamaño, se usa el término "volumen de retención" de un compuesto no retenido V0.
Pico: La porción del cromatograma que registra la respuesta del detector cuando un componente individual (o dos o más
compuestos no resueltos) eluye de la columna.
La respuesta del pico se puede representar por el área del pico o la altura del pico (h).
Cociente entre el Pico y el Valle (p/v): El cociente entre el pico y el valle se puede emplear como un criterio de
aptitud del sistema cuando no se logra la separación entre dos picos en la línea base (ver la Figura 3).
8
l
ia
fic
O
Figura 3.
��
�/� = �
�
Hp = altura del pico menor por encima de la línea base extrapolada

Hv = altura en el punto más bajo de la curva que separa los picos menor y mayor por encima de la línea base extrapolada
Altura del plato (H) (altura equivalente a un plato teórico [HETP, por sus siglas en inglés]):
Cociente entre la longitud de la columna (L), en micrómetros, y el número de platos (N):
�
�= �
Número de platos (N) (número de platos teóricos): Un número indicativo del desempeño de la columna
(eficiencia de la columna) solo se puede calcular a partir de datos obtenidos en condiciones isotérmicas, isocráticas o isodensas,
dependiendo de la técnica, como el número de platos, usando la siguiente ecuación, siendo los valores de tR y Wh expresados
en las mismas unidades:
�� 2
� = 5,54 �
ℎ
tR = tiempo de retención del pico correspondiente al componente

Wh = ancho del pico a la mitad de la altura (h/2)
9
El número de platos varía con el componente, así como con la columna, la temperatura de la columna, la fase móvil y el
tiempo de retención.
Altura reducida del plato (h): Cociente entre la altura del plato (H), en micrómetros, y el diámetro de partícula (dp)
en micrómetros:
�
ℎ= �
�
Retardo relativo (Rrel): El retardo relativo, que se usa en la cromatografía en capa delgada, se calcula como el cociente
entre las distancias recorridas por la mancha del compuesto de interés y un compuesto de referencia (Figura 4).
l
ia
fic
O
Figura 4.
�� = �/�
a = distancia de migración de la fase móvil

b = distancia de migración del compuesto de interés
c = distancia de migración del compuesto de referencia
Retención relativa (r): La retención relativa se calcula como un estimado usando la siguiente ecuación:
�� − ��
�= �
�� − ��
tRi = tiempo de retención del pico de interés

tRst = tiempo de retención del pico de referencia (generalmente el pico correspondiente a la sustancia a examinar)
tM = tiempo muerto
Retención relativa no ajustada (rG)♦o (RRT, por sus siglas en inglés)♦

La retención relativa no ajustada se calcula usando la siguiente ecuación:
10
��
�� = �
��
A menos que se indique algo distinto, los valores de retención relativa especificados en las monografías corresponden a la
retención relativa no ajustada.
♦Tiempo de retención relativo (RRT, por sus siglas en inglés): Ver Retención relativa no ajustada♦
Resolución (Rs): La resolución entre los picos de dos componentes (Figura 1) se puede calcular usando la siguiente
ecuación:
1,18 ��2 − ��1

�� = �ℎ1 + �ℎ2
��2 > ��1
tR1, tR2 = tiempos de retención de los picos

Wh1, Wh2 = ancho de los picos a la mitad de la altura
En la cromatografía en capa delgada cuantitativa, usando densitometría, se usan las distancias de migración en lugar de los
tiempos de retención y la resolución entre los picos de dos componentes se puede calcular usando la siguiente ecuación:
1,18� ��2 − ��1

�� = �ℎ1 + �ℎ2
l
��2 > ��1
RF1, RF2 = factores de retardo de los picos

Wh1, Wh2 = ancho de los picos a la mitad de la altura
a = distancia de migración del frente de la fase móvil ia
fic
Factor de retardo (RF): El factor de retardo, que se usa en la cromatografía en capa delgada, es el cociente entre la
distancia desde el punto de aplicación hasta el centro de la mancha y la distancia recorrida simultáneamente por el frente de
la fase móvil desde el punto de aplicación (Figura 4).
�
�� = �
b = distancia de migración del componente

O
a = distancia de migración del frente de la fase móvil
Factor de retención (k): El factor de retención (también conocido como coeficiente de distribución de la masa (Dm)
o factor de capacidad (k′)) se define como:
��
cantidad del componente en la fase estacionaria
�= cantidad del componente en la fase móvil
= ��
�
KC = constante de distribución (también conocida como coeficiente de distribución de equilibrio)

VS = volumen de la fase estacionaria
VM = volumen de la fase móvil
El factor de retención de un componente se puede determinar a partir del cromatograma usando la siguiente ecuación:
�� − ��
�= ��
tR = tiempo de retención
tM = tiempo muerto
Tiempo de retención (tR): El tiempo transcurrido entre la inyección de la muestra y la aparición de la respuesta
máxima del pico en la zona de la muestra eluida (Figura 1, siendo la escala de la línea base en minutos o segundos).
Volumen de retención (VR):

El volumen de fase móvil requerido para la elución de un componente. Se puede calcular a partir del tiempo de retención y
la velocidad de flujo (F), en mililitros por minuto, usando la siguiente ecuación:
�� = �� × �
11
Tiempo de retención de un compuesto no retenido (t0): En la cromatografía de exclusión por tamaño, el

tiempo de retención de un componente cuyas moléculas son más grandes que los poros más grandes del gel (Figura 5).
l
ia
fic
O
Figura 5.
Volumen de retención de un compuesto no retenido (V0): En la cromatografía de exclusión por tamaño,

el volumen de retención de un componente cuyas moléculas son más grandes que los poros más grandes del gel. Se puede
calcular a partir del tiempo de retención de un compuesto no retenido y la velocidad de flujo (F), en mililitros por minuto,
usando la siguiente ecuación:
V 0 = �0 × �
Factor de separación (α): La retención relativa calculada para dos picos adyacentes (por convención, el valor del
factor de separación siempre es >1):
12
� = �2 /�1
k1 = factor de retención del primer pico

k2 = factor de retención del segundo pico
Relación señal-ruido (S/N): El ruido de corto plazo influye en la precisión y la exactitud de la cuantificación. La
relación señal-ruido se calcula usando la siguiente ecuación:
2�
�/� = ℎ
H = altura del pico (Figura 6) correspondiente al componente de interés, en el cromatograma obtenido con la solución
de referencia prescrita, que se mide a partir del punto máximo del pico a la línea base extrapolada de la señal
observada sobre una distancia igual a 20 veces el ancho a la mitad de la altura
h = intervalo del ruido en un cromatograma obtenido después de la inyección de un blanco (Figura 7), observado sobre
una distancia igual a 20 veces el ancho a la mitad de la altura del pico en el cromatograma obtenido con la solución
de referencia prescrita y, si fuera posible, igualmente distribuida a ambos lados del lugar en donde se encontraría
este pico
l
ia
fic
O
Figura 6. Cromatograma de la solución de referencia.
13
l
ia
Figura 7. Cromatograma de un blanco.
Si una línea base de 20 veces el ancho a la mitad de la altura no es obtenible a causa de picos debidos a los disolventes o
reactivos, o generados de la fase móvil o la matriz de la muestra, o a causa del programa de temperatura de la cromatografía
fic
de gases, se permite una línea base de al menos 5 veces el ancho a la mitad de la altura.
Factor de simetría (AS): El factor de simetría de un pico (también conocido como factor de asimetría o factor de cola)
(Figura 8) se calcula usando la siguiente ecuación:
�0,05
�� = 2�
O
W0,05 = ancho del pico a una vigésima parte de la altura del pico
d = distancia entre la perpendicular trazada desde el máximo del pico y el borde frontal del pico a una vigésima parte
de la altura del pico
Un valor As de 1,0 significa simetría. Cuando As > 1,0, el pico es asimétrico en la parte posterior (tailing o cola). Cuando As <
1,0, el pico es asimétrico en la parte anterior (fronting).
14
l
ia
fic
Figura 8.
Repetibilidad del sistema: La repetibilidad de respuesta se expresa como una desviación estándar relativa porcentual
O
(%RSD, por sus siglas en inglés) estimada a partir de una serie consecutiva de mediciones para no menos de tres inyecciones o
aplicaciones de una solución de referencia, y se calcula usando la siguiente ecuación.
2
100 Σ �� − �
% �� = � �−1
yi = valores individuales expresados como área del pico, altura del pico o cociente entre las áreas de los picos mediante
el método de normalización interna
y = media de los valores individuales
n = número de valores individuales
Tiempo total de la fase móvil (tt): En la cromatografía de exclusión por tamaño, el tiempo de retención de un
componente cuyas moléculas son más pequeñas que los poros más pequeños del gel (Figura 5).
Volumen total de fase móvil (Vt): En la cromatografía de exclusión por tamaño, el volumen de retención de un
componente cuyas moléculas son más pequeñas que los poros más pequeños del gel. Se puede calcular a partir del tiempo
total de la fase móvil y la velocidad de flujo (F), en mililitros/minuto, usando la siguiente ecuación:
�� = �� × �
APTITUD DEL SISTEMA
[NOTA—Esta sección solo abarca la cromatografía de líquidos y la cromatografía de gases.]

Los diversos componentes del equipo empleado deben estar calificados y ser capaces de lograr el desempeño requerido para
realizar la prueba o valoración. Las pruebas de aptitud del sistema representan una parte integral del procedimiento analítico y
se usan para garantizar el desempeño adecuado del sistema cromatográfico. El número de platos de la columna, el factor de
retención (coeficiente de distribución de masa), la repetibilidad del sistema, la relación señal-ruido, el factor de simetría y la
resolución/cociente entre el pico y el valle son los parámetros que se pueden emplear en la evaluación del desempeño del
sistema cromatográfico. Cuando se indique en la monografía individual, en el caso de perfiles cromatográficos complejos (p.
15
ej., para productos biotecnológicos y biológicos), la comparación visual de los perfiles se puede usar como una prueba de
aptitud del sistema. Los factores que pueden afectar el comportamiento cromatográfico incluyen:
• Composición y temperatura de la fase móvil
• Fuerza iónica y pH del componente acuoso, de la fase móvil
• Velocidad de flujo, dimensiones de la columna, temperatura de la columna y presión
• Las características de la fase estacionaria, incluyendo el tipo de soporte cromatográfico (basado en partículas o monolítico),
tamaño de partícula o de poro y porosidad, y área de la superficie específica
• En fase reversa y otras modificaciones de la superficie de las fases estacionarias, el grado de modificación química (según
se expresa mediante recubrimiento exhaustivo (end-capping), carga de carbono, entre otros)
Los tiempos de retención y las retenciones relativas se pueden proporcionar en las monografías solo con fines informativos, a
menos que se indique algo diferente en la monografía. No existen criterios de aceptación pertinentes a las retenciones relativas.
Se requiere el cumplimiento con los criterios de aptitud del sistema durante todo el procedimiento cromatográfico. Ningún
análisis de muestras es aceptable a menos que se haya demostrado la aptitud del sistema.
Los siguientes requisitos deben cumplirse, además de cualquier otro criterio de aptitud del sistema especificado en la
monografía. Cuando se indican requisitos específicos en la monografía, esos reemplazan a los requisitos mencionados en este
capítulo.
Repetibilidad del Sistema▲▲ (ERR 1-dic-2022)
♦Cuando se especifica un requisito de desviación estándar relativa en una monografía individual, si el requisito es 2,0 o menos,
el cálculo se basa en los datos de cinco inyecciones repetidas del analito, si el requisito es más de 2,0%, se usan los datos de
l
seis inyecciones repetidas.♦
ia
En la valoración de una sustancia activa o un excipiente, donde el valor diana es 100% para una sustancia pura, y no se
especifica un requisito de repetibilidad del sistema, la desviación estándar relativa máxima (%RSDmáx) permitida para los límites
definidos se calcula para una serie (n = 3 a 6) de inyecciones de la solución de referencia. La desviación estándar relativa máxima
permitida de la respuesta del pico no excede del valor apropiado provisto en la Tabla 2.
��
fic
% ��máx = �
90 % , � − 1
K �90 % , � − 1
0,6 0,6
= constante (0,349), obtenida de la expresión � = × en donde representa la desviación estándar
2 6 2
relativa porcentual requerida determinada en 6 inyecciones para B = 1,0
B = límite superior especificado en la definición de la monografía individual menos 100%
n = número de inyecciones repetidas de la solución de referencia (3 ≤ n ≤ 6)
O
t90%,n–1 = valor t de Student al 90% del nivel de probabilidad (dos colas) con n−1 grados de libertad
Tabla 2. Desviación Estándar Relativa Máxima Permitida de la Respuesta del Pico (Valoración)
Número de Inyecciones Individuales (n)
3 4 5 6
B (%) Desviación Estándar Relativa Máxima Permitida (%)
2,0 0,41 0,59 0,73 0,85
2,5 0,52 0,74 0,92 1,06
3,0 0,62 0,89 1,10 1,27
B = límite superior de contenido especificado en la monografía individual menos 100%
▲
Sensibilidad del Sistema
La relación señal-ruido se usa para definir la sensibilidad del sistema. El límite de cuantificación (correspondiente a una relación
señal-ruido de 10) es igual o menor que el umbral de informe.
Simetría de los Picos

A menos que se indique de otro modo, en una prueba o valoración, el factor de simetría (factor de asimetría) del pico usado
para la cuantificación es 0,8–1,8.▲ (BR 1-dic-2023)
16
AJUSTES DE LAS CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS
Las condiciones cromatográficas descritas han sido validadas durante la elaboración de la monografía.
El grado en el cual los diversos parámetros de una prueba cromatográfica se pueden ajustar sin modificar fundamentalmente
los procedimientos analíticos farmacopeicos se enumeran a continuación. Cambios distintos a los indicados requieren una
revalidación del procedimiento.
Múltiples ajustes pueden tener un efecto acumulativo en el desempeño del sistema y deben ser evaluados adecuadamente
por los usuarios. Esto es particularmente importante en los casos en que el patrón de separación se describe como un perfil. En
estos casos, se tiene que llevar a cabo una evaluación de riesgos.
Cualquier ajuste debe hacerse basándose en el procedimiento farmacopeico.
Si se hacen ajustes a un procedimiento farmacopeico, se pueden requerir pruebas adicionales de verificación. Para verificar
la aptitud del procedimiento farmacopeico ajustado, evaluar las características pertinentes del desempeño analítico que sean
potencialmente afectadas por el cambio.
Cuando se ha ajustado un procedimiento farmacopeico según los requisitos especificados a continuación, no se permite
ningún ajuste adicional sin la revalidación apropiada.
Se requiere el cumplimiento con los criterios de aptitud del sistema para verificar que se logren las condiciones para el
desempeño satisfactorio de la prueba o valoración.
El ajuste de las condiciones de elución en gradiente (HPLC) o programación de temperatura (GC) es más crítico para la
elución isocrática (HPLC) o isotérmica (GC), dado que puede desplazar algunos picos a una etapa diferente del gradiente o a
diferentes temperaturas de elución, potencialmente causando la coelución parcial o completa de picos adyacentes o la inversión
de los picos y, por ende, llevando a la asignación incorrecta de los picos y al enmascaramiento de los picos o un desplazamiento
l
tal que la elución ocurre más allá del tiempo de elución prescrito.
Para algunos parámetros, los ajustes se definen explícitamente en la monografía para garantizar la aptitud del sistema.
ia
Cromatografía en Capa Delgada
Composición de la fase móvil: la cantidad de los componentes de los disolventes minoritarios se puede ajustar en ±30% en
términos relativos o ±2% en términos absolutos, lo que sea mayor; ningún otro componente se modifica en más de 10% en
fic
términos absolutos. Un componente minoritario comprende menos que o igual a (100/n)%, siendo n el número total de
componentes de la fase móvil. Para un componente minoritario que represente el 10% de la fase móvil, un ajuste relativo del
30% permite un intervalo de 7%–13% mientras que un ajuste absoluto del 2% permite un intervalo de 8%–12%, siendo
entonces el valor relativo el mayor; para un componente minoritario del 5% de la fase móvil, un ajuste relativo del 30% permite
un intervalo de 3,5%–6,5% mientras que un ajuste absoluto del 2% permite un intervalo de 3%–7%, siendo en este caso el
valor absoluto el mayor.
pH del componente acuoso de la fase móvil: ±0,2 unidades de pH, a menos que se indique de otro modo.
O
Concentración de sales en el componente solución amortiguadora de una fase móvil: ± 10%

Volumen de aplicación: 10%–20% del volumen prescrito si se usan placas de granulometría fina (2–10 µm).
Cromatografía de Líquidos: Elución Isocrática

PARÁMETROS DE LA COLUMNA Y VELOCIDAD DE FLUJO
Fase estacionaria: Ningún cambio de la identidad del sustituyente (p .ej., ningún reemplazo de C18 por C8); las otras
características fisicoquímicas de la fase estacionaria, es decir, soporte cromatográfico, modificación de la superficie y alcance
de modificación química deben ser similares; se permite un cambio de columnas con partículas totalmente porosas (TPP, por
sus siglas en inglés) a columnas con partículas superficialmente porosas (SPP, por sus siglas en inglés) siempre que se cumplan
los requisitos anteriormente mencionados.
Dimensiones de la columna (tamaño de partícula, longitud): Se puede modificar el tamaño de partícula y/o la longitud de la
columna, siempre que la relación entre la longitud de la columna (L) y el tamaño de partícula (dp) permanezca constante o
dentro del intervalo entre −25% a +50% de la relación L/dp prescrita.
Ajustes de partículas totalmente porosas a superficialmente porosas: Para la aplicación del ajuste del tamaño de partícula, de
partículas totalmente porosas a superficialmente porosas, se pueden usar otras combinaciones de L y dp, siempre que el número
de platos (N) esté dentro del intervalo −25% a +50%, con respecto a la columna prescrita. Estos cambios son aceptables, siempre
que se cumplan los criterios de aptitud del sistema y se demuestre que la selectividad y el orden de elución de las impurezas
especificadas a controlar son equivalentes.
Diámetro interno: En ausencia de un cambio en el tamaño de partícula y/o longitud, se puede ajustar el diámetro interno de
la columna.
Se debe tener cuidado cuando el ajuste da como resultado volúmenes de pico menores debido a un tamaño de partícula
menor o un diámetro interno de la columna menor, una situación que puede requerir ajustes para minimizar el ensanchamiento
de banda extra-columna originado por factores tales como las conexiones del instrumento, el volumen de la celda del detector y
la velocidad de muestreo, y el volumen de inyección.
Cuando se modifica el tamaño de partícula, es necesario ajustar la velocidad de flujo debido a que las columnas con un
tamaño de partícula menor requerirán de velocidades lineales más altas para el mismo desempeño (medido por la altura
reducida del plato). La velocidad de flujo se ajusta para el cambio en el diámetro de la columna y para el tamaño de partícula
17
�2 = �1 × ��22 × ��1 / ��21 × ��2
F1 = velocidad de flujo según se indica en la monografía (mL/min)

F2 = velocidad de flujo ajustada (mL/min)
dc1 = diámetro interno de la columna según se indica en la monografía
dc2 = diámetro interno de la columna usada (mm)
dp1 = tamaño de partícula según se indica en la monografía (µm)
dp2 = tamaño de partícula de la columna usada (µm)
Cuando se realiza un cambio de partículas de ≥3 µm a <3 µm en separaciones isocráticas, se puede justificar un aumento
adicional en la velocidad lineal (ajustando la velocidad de flujo), siempre que el desempeño de la columna no caiga en más del
20%. De manera similar, cuando se hace un cambio de partículas de <3 µm a ≥3 µm, se puede justificar una reducción adicional
de la velocidad lineal (velocidad de flujo) para evitar la reducción del desempeño de la columna en más del 20%.
Después de un ajuste debido a un cambio en las dimensiones de la columna, se permite un cambio adicional en la velocidad
de flujo de ±50%.
Temperatura de la columna: ± 10°C, cuando se especifica la temperatura operativa, a menos que se indique algo diferente
Pueden ser necesarios ajustes adicionales en las condiciones del procedimiento analítico (fase móvil, temperatura, pH, etc.),
dentro de los intervalos permitidos descritos en las secciones Aptitud del Sistema y Ajustes de las Condiciones Cromatográficas de
este capítulo.
FASE MÓVIL
Composición: La cantidad de los componentes minoritarios de la fase móvil se puede ajustar en un ±30% en términos relativos.
l
Sin embargo, el cambio en cualquier componente no puede exceder de ±10% en términos absolutos. Un componente
ia
minoritario comprende menos que o igual a (100/n) %, siendo n el número total de componentes de la fase móvil:
♦A continuación se presentan ejemplos de ajustes para mezclas binarias y ternarias.
MEZCLAS BINARIAS
Relación especificada de 50:50: 30% de 50 es 15% en términos absolutos, pero esto excede el cambio máximo permitido de
fic
±10% en términos absolutos en cada componente. Por lo tanto, solo se puede ajustar la relación de la fase móvil dentro del
intervalo de 40:60–60:40.
Relación especificada de 2:98: 30% de 2 es 0,6% en términos absolutos. Por lo tanto, el ajuste máximo permitido se encuentra
dentro del intervalo de 1,4: 98,6–2,6: 97,4.
MEZCLAS TERNARIAS
O
Relación especificada de 70:25:5: Para el segundo componente, 30% de 25 es 7,5% en términos absolutos. Por lo tanto, el
segundo componente puede ajustarse dentro del intervalo de 32,5%–17,5% en términos absolutos. Para el tercer componente,
30% de 5 es 1,5% en términos absolutos. En todos los casos, usar una cantidad suficiente del primer componente para obtener
un total de 100%. Como consecuencia, los intervalos de mezclas de 62,5: 32,5: 5 a 77,5: 17,5: 5 ó 68,5: 25: 6,5 a 71,5: 25:
3,5 cumplirán con el requisito.♦
• pH del componente acuoso de la fase móvil: ±0,2 unidades de pH, a menos que se indique de otro modo.
• Concentración de sales en el componente solución amortiguadora de una fase móvil: ±10%
• Velocidad de flujo: En ausencia de un cambio en las dimensiones de la columna, se permite un ajuste en la velocidad de
flujo de ±50%.
LONGITUD DE ONDA DEL DETECTOR

No se permiten ajustes.
VOLUMEN DE INYECCIÓN
Cuando se cambian las dimensiones de la columna, se puede usar la siguiente ecuación para ajustar el volumen de inyección:
▲
��2 = ��1 �2��22 / �1��12 ▲ (ERR 1-dic-2022)
Viny1 = volumen de inyección según se indica en la monografía (µL)

Viny2 = volumen de inyección ajustado (μL)
L1 = longitud de la columna según se indica en la monografía (mm)
L2 = ▲nueva longitud de la columna (mm)▲ (ERR 1-dic-2022)
dc1 = ▲diámetro interno de la columna según se indica en la monografía (mm)▲ (ERR 1-dic-2022)
dc2 = ▲nuevo diámetro interno de la columna (mm)▲ (ERR 1-dic-2022)
Esta ecuación puede no ser aplicable a cambios de columnas TPP a columnas SPP.
Incluso en ausencia de cualquier cambio en las dimensiones de la columna, el volumen de inyección puede variar si los
criterios de Aptitud del Sistema permanecen dentro de sus límites de aceptabilidad establecidos. Cuando se disminuye el
18
volumen de inyección, prestar especial atención al (límite de) detección y repetibilidad de las respuestas de los picos a
determinar. Se permite un incremento siempre que, en particular, la linealidad y resolución de los picos a determinar se
mantengan satisfactorias.
Cromatografía de Líquidos: Elución en Gradiente

El ajuste de las condiciones cromatográficas para sistemas en gradiente exige más cautela que para sistemas isocráticos.
PARÁMETROS DE LA COLUMNA Y VELOCIDAD DE FLUJO

Fase estacionaria: Ningún cambio de la identidad del sustituyente (p .ej., ningún reemplazo de C18 por C8); otras
características fisicoquímicas de la fase estacionaria, es decir, soporte cromatográfico, modificación de la superficie y alcance
de modificación química, deben ser similares; se permite un cambio de columnas con partículas totalmente porosas (TPP, por
sus siglas en inglés) a columnas con partículas superficialmente porosas (SPP, por sus siglas en inglés) siempre que se cumplan
los requisitos anteriormente mencionados.
Dimensiones de la columna (tamaño de partícula, longitud): Se puede modificar el tamaño de partícula y/o la longitud de la
columna siempre que la relación entre la longitud de la columna (L) y el tamaño de partícula (dp) permanezca constante o
dentro del intervalo entre −25% a +50% de la relación L/dp prescrita.
Ajustes de partículas totalmente porosas a superficialmente porosas: Para la aplicación del ajuste del tamaño de partícula, de
partículas totalmente porosas a superficialmente porosas, se pueden usar otras combinaciones de L y dp siempre que la relación
(tR/Wh)2 esté dentro del intervalo −25% a +50%, con respecto a la columna prescrita ♦para todos los picos usados para
determinar los parámetros de aptitud del sistema♦. Estos cambios son aceptables siempre que se cumplan los criterios de aptitud
del sistema y se demuestre que la selectividad y el orden de elución de las impurezas especificadas a controlar son equivalentes.
l
Diámetro interno: En ausencia de un cambio en el tamaño de partícula y/o longitud, se puede ajustar el diámetro interno de
la columna.
ia
Se debe tener cuidado cuando el ajuste da como resultado un volumen de pico menor debido a un tamaño de partícula
menor o un diámetro interno de la columna menor, una situación que puede requerir ajustes para minimizar el ensanchamiento
de la banda extra columna originado por factores tales como las conexiones del instrumento, el volumen de la celda del
detector y la velocidad de muestreo, y el volumen de inyección.
Cuando se modifica el tamaño de partícula, es necesario ajustar la velocidad de flujo debido a que las columnas con un
fic
tamaño de partícula menor requerirán de velocidades lineales más altas para el mismo desempeño (medido por la altura
reducida del plato). La velocidad de flujo se ajusta para el cambio en el diámetro de la columna y para el tamaño de partícula
▲
�2 = �1 × ��22 × ��1 / ��12 × ��2 ▲ (ERR 1-dic-2022)
F1 = velocidad de flujo según se indica en la monografía (mL/min)

O
F2 = velocidad de flujo ajustada (mL/min)

dc1 = diámetro interno de la columna según se indica en la monografía (mm)
dc2 = diámetro interno de la columna usada (mm)
dp1 = tamaño de partícula según se indica en la monografía (µm)
dp2 = tamaño de partícula de la columna usada (µm)
Un cambio en las dimensiones de la columna, y por ende en el volumen de la columna, afecta el volumen del gradiente lo
cual controla la selectividad. Los gradientes se ajustan al volumen de la columna cambiando el volumen del gradiente en
proporción al volumen de la columna. Esto aplica a cada volumen del segmento del gradiente. Dado que el volumen del
gradiente es el tiempo del gradiente, tG, multiplicado por la velocidad de flujo, F, el tiempo del gradiente para cada segmento
del gradiente debe ajustarse para mantener una relación constante entre el volumen del gradiente y el volumen de la columna
(expresado como L × dc2). Por ende, el nuevo tiempo del gradiente, tG2 se puede calcular a partir del tiempo del gradiente
original, tG1, la(s) velocidad(es) de flujo y las dimensiones de la columna, según se indica a continuación:
��2 = ��1 × �1 /�2 �2 × ��22 / �1 × ��12
Por ende, el cambio en las condiciones para la elución en gradiente requiere tres pasos:
1. Ajustar la longitud de la columna y el tamaño de partícula de acuerdo con L/dp.
2. Ajustar la velocidad de flujo para cambios en el tamaño de partícula y en el diámetro de la columna.
3. Ajustar el tiempo de cada segmento del gradiente para cambios en la longitud, el diámetro y la velocidad de flujo de la
columna. El ejemplo a continuación ilustra este proceso.
Tabla 3
Variable Condiciones Originales Condiciones Ajustadas Comentarios
Longitud de la columna (L), en mm 150 100 Elección del usuario
Diámetro de la columna (dc), en mm 4,6 2,1 Elección del usuario
Tamaño de partícula (dp), en µm 5 3 Elección del usuario
19
Tabla 3 (continuación)
Variable Condiciones Originales Condiciones Ajustadas Comentarios
L/dp 30,0 33,3 (1)
Velocidad de flujo, en mL/min 2,0 0,7 (2)
Factor de ajuste del gradiente (tG2/tG1) — 0,4 (3)
Condiciones de gradiente — — —
Tiempo Tiempo
B (%) (min) (min)
30 0 0 —
30 3 (3 × 0,4) = 1,2 —
70 13 [1,2 + (10 × 0,4)] = 5,2 —
30 16 [5,2 + (3 × 0,4)] = 6,4 —
1. Un aumento del 11% dentro del cambio L/dp permitido de −25% a +50%
2. Se calcula usando F2 = F1 [(dc22 × dp1)/(dc12 × dp2)]
3. Se calcula usando tG2 = tG1 × (F1/F2) [(L2 × dc22)/(L1 × dc12)]
Temperatura de la columna: ±5° C, cuando se especifica la temperatura operativa, a menos que se indique algo diferente
Pueden ser necesarios ajustes adicionales en las condiciones del procedimiento (fase móvil, temperatura, pH, etc.), dentro
l
de los intervalos permitidos descritos en las secciones Aptitud del Sistema y Ajustes de las Condiciones Cromatográficas de este
capítulo.
ia
FASE MÓVIL
Composición/gradiente: Los ajustes de la composición de la fase móvil y el gradiente son aceptables siempre que:
• Se cumplan los criterios de aptitud del sistema.
fic
• Los picos principales eluyan dentro de ±15% de los tiempos de retención obtenidos con las condiciones originales; este
requisito no aplica cuando se cambian las dimensiones de la columna.
• La composición de la fase móvil y el gradiente sean tal que los primeros picos sean retenidos suficientemente y los últimos
picos son eluidos.
pH del componente acuoso de la fase móvil: ±0,2 unidades de pH, a menos que se indique de otro modo.
Concentración de sales en el componente solución amortiguadora de una fase móvil: ±10%
Cuando no se pueda lograr el cumplimiento de los criterios de aptitud del sistema, a menudo es preferible considerar el
O
volumen de residencia o cambiar la columna.
VOLUMEN DE RESIDENCIA
La configuración del equipo empleado puede cambiar significativamente la resolución, el tiempo de retención y las
retenciones relativas descritos. Si esto ocurre, puede deberse a un cambio en el volumen de residencia. Es preferible que las
monografías incluyan una etapa isocrática antes del comienzo del programa del gradiente para que se pueda hacer una
adaptación de los tiempos del gradiente para tener en cuenta las diferencias en el volumen de residencia entre el sistema usado
para el desarrollo del procedimiento analítico y el utilizado en la práctica. Es responsabilidad del usuario adaptar la longitud de
la etapa isocrática al equipo analítico usado. Si el volumen de residencia usado durante la elaboración de la monografía se
proporciona en la monografía, los tiempos de muestreo (t min) indicados en la tabla de gradientes pueden reemplazarse con
los tiempos de muestreo adaptados (tc min), que se calculan usando la siguiente ecuación:
� − �0
�� = � − �
D = volumen de residencia (mL)

D0 = volumen de residencia usado en el desarrollo del método (mL)
F = velocidad de flujo (mL/min)
Se puede omitir la etapa isocrática introducida para este propósito si los datos de validación para la aplicación del
procedimiento analítico sin esta etapa están disponibles.
Longitud de onda del detector: No se permiten ajustes.
Volumen de inyección: Cuando se cambian las dimensiones de la columna, se puede usar la siguiente ecuación para ajustar
el volumen de inyección:
��2 = ��1 �2��22 / �1��21
Viny1 = volumen de inyección según se indica en la monografía (µL)

Viny2 = volumen de inyección ajustado (µL)
20
L1 = longitud de la columna según se indica en la monografía (cm)

L2 = nueva longitud de la columna (cm)
dc1 = diámetro interno de la columna según se indica en la monografía (mm)
dc2 = nuevo diámetro interno de la columna (mm)
Esta ecuación puede no ser aplicable a cambios de columnas TPP a columnas SPP.
Incluso en ausencia de cualquier cambio en las dimensiones de la columna, el volumen de inyección puede variar siempre
que los criterios de aptitud del sistema permanezcan dentro de sus límites de aceptabilidad establecidos. Cuando se disminuye
el volumen de inyección, prestar especial atención al (límite de) detección y repetibilidad de las respuestas de los picos a
determinar. Se permite un incremento siempre que, en particular, la linealidad y resolución de los picos a determinar se
mantengan satisfactorias.
Cromatografía de Gases
PARÁMETROS DE LA COLUMNA
Fase estacionaria
Tamaño de partícula: Reducción máxima del 50%; no se permite ningún aumento (columnas rellenas)
Espesor de la película: −50% a +100% (columnas capilares)
Dimensiones de la columna
Longitud: −70% a +100%
Diámetro interno: ±50%
Temperatura de la columna: ±10%
l
Programa de temperatura: Se permiten ajustes de la temperatura según se especificó anteriormente; se permiten ajustes de
velocidades de rampa y tiempos de espera de hasta ±20%.
Velocidad de flujo: ±50%
ia
Los cambios anteriores son aceptables siempre que se cumplan los criterios de aptitud del sistema y se demuestre que la
selectividad y el orden de elución de las impurezas especificadas a controlar son equivalentes.
Volumen de inyección y relación de partición: Pueden variar siempre que los criterios de aptitud del sistema permanezcan
dentro de sus límites de aceptabilidad establecidos. Cuando se disminuye el volumen de inyección, o se incrementa la relación
fic
de partición, prestar especial atención al (límite de) detección y a la repetibilidad de las respuestas de los picos a determinar.
Se permite un aumento en el volumen de inyección o una reducción en la relación de partición siempre que, en particular, la
linealidad y la resolución de los picos a determinar se mantengan satisfactorias.
Temperatura del inyector y temperatura de la línea de transferencia en condiciones de fase gaseosa estática: ±10° C,
siempre que no se produzca descomposición o condensación
CUANTIFICACIÓN
O
Los siguientes métodos de cuantificación pueden usarse en textos generales o monografías.
Método del Estándar Externo

Usando una función de calibración: Las soluciones estándar con varias cantidades medidas de un estándar de referencia del
compuesto a analizar se preparan en un intervalo que se ha demostrado que da una respuesta lineal, y se inyecta un volumen
fijo de estas soluciones estándar. Con los cromatogramas obtenidos, se prepara una función de calibración graficando las áreas
de los picos o las alturas de los picos en la ordenada en función de la cantidad de estándar de referencia en la abscisa. La función
de calibración por lo general se obtiene por regresión lineal. Luego, se prepara una solución muestra según se indica en el
procedimiento especificado en la monografía individual. La cromatografía se realiza en las mismas condiciones operativas que
las de la preparación de la función de calibración, se mide el área del pico o la altura del pico del compuesto a analizar y la
cantidad del compuesto se obtiene o calcula a partir de la función de calibración.
Usando la calibración de un solo punto: En una monografía individual, generalmente se preparan una de las soluciones
estándar con una concentración dentro del intervalo lineal de la función de calibración y una solución muestra con una
concentración cercana a la de la solución estándar, y la cromatografía se realiza en condiciones fijas para obtener la cantidad
del componente comparando las respuestas obtenidas. En este método, todos los procedimientos, tal como el procedimiento
de inyección, deben realizarse en condiciones constantes.
Método del Estándar Interno

Usando una función de calibración: En el método del estándar interno, se elige un compuesto estable como un estándar
interno que muestra un tiempo de retención cercano al del compuesto a analizar, y cuyo pico está bien separado de todos los
otros picos en el cromatograma. Se preparan varias soluciones estándar que contienen una cantidad fija de estándar interno y
varias cantidades medidas de un estándar de referencia del compuesto a analizar. Basándose en los cromatogramas obtenidos
al inyectar un volumen fijo de soluciones estándar individuales, se calcula el cociente entre el área del pico o la altura del pico
del estándar de referencia y el del estándar interno. Se prepara una función de calibración graficando estos cocientes en la
ordenada en función de la cantidad del estándar de referencia o el cociente entre la cantidad del estándar de referencia y la del
estándar interno en la abscisa. La función de calibración por lo general se obtiene por regresión lineal. Luego, se prepara una
solución muestra que contiene el estándar interno en la misma cantidad que en las soluciones estándar usadas para la
21
preparación de la función de calibración según el procedimiento especificado en la monografía individual. La cromatografía se

realiza en las mismas condiciones operativas que las utilizadas para la preparación de la función de calibración. Se calcula el
cociente entre el área del pico o la altura del pico del compuesto a analizar y el del estándar interno, y la cantidad del compuesto
se obtiene o calcula a partir de la función de calibración.
Usando la calibración de un solo punto: En una monografía individual, generalmente se preparan una de las soluciones
estándar con una concentración dentro del intervalo lineal de la función de calibración y una solución muestra con una
concentración cercana a la de la solución estándar, las dos con una cantidad fija del estándar interno, y la cromatografía se
realiza en condiciones fijas para determinar la cantidad del compuesto a analizar comparando los cocientes obtenidos.
Procedimiento de normalización: Siempre que se haya demostrado la linealidad de los picos, las monografías individuales
pueden prescribir que el contenido porcentual de un componente de la sustancia a examinar se calcula determinando el área
del pico correspondiente como un porcentaje del área total de todos los picos, excluyendo aquellos debidos a disolventes o
reactivos o que surgen de la fase móvil o de la matriz de la muestra, y aquellos en o por debajo del límite de descarte o umbral
de informe.
OTRAS CONSIDERACIONES
Respuesta del detector: ♦La sensibilidad del detector es la señal de salida por unidad de concentración o unidad de masa de
una sustancia (también se conoce como factor de respuesta) en la fase móvil que entra al detector. El factor de respuesta relativa
del detector, comúnmente conocido como factor de respuesta relativa, expresa la sensibilidad de un detector para una sustancia
determinada con respecto a una sustancia estándar.
En las pruebas de sustancias relacionadas, se aplica cualquier factor de corrección indicado en la monografía.♦
Picos de interferencia: No se toman en cuenta los picos debidos a disolventes y reactivos o generados por la fase móvil o la
matriz de la muestra.
l
Medición de los picos: La integración del área del pico de cualquier impureza que no se separe por completo del pico principal
ia
se realiza preferiblemente mediante la extrapolación tangencial (Figura 9).
fic
O
Figura 9.
22
umbral de informe
Cuando la prueba de sustancias relacionadas indica un límite para el total de impurezas o una determinación cuantitativa de
una impureza, es importante seleccionar un umbral de informe apropiado y condiciones apropiadas para la integración de las
áreas de los picos.
En tales pruebas, el umbral de informe, es decir, el límite por encima del cual se informa un pico, es generalmente establecido
al 0,05%.▲ (USP 1-dic-2022)
l
ia
fic
O

Cap 621

Cargado por

Información del documento

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Cap 621

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

Impreso el: jue. mar. 23 2023, 06:36:01 a. m.

(EST) Estado: Oficial Vigente al 23-mar-2023 DocId: GUID-6C3DF8B8-D12E-4253-A0E7-6855670CDB7B_6_es-ES

PROCEDIMIENTO PARA CROMATOGRAFÍA DESCENDENTE EN PAPEL

6. Marcar rápidamente la ubicación del frente de la fase móvil y secar la hoja.

PROCEDIMIENTO PARA CROMATOGRAFÍA ASCENDENTE EN PAPEL

Cromatografía en Capa Delgada

Cromatografía de Gases (GC)

CROMATOGRAFÍA DE GASES EN COLUMNA CON RELLENO

CROMATOGRAFÍA DE GASES EN COLUMNA CAPILAR

FASE ESTACIONARIA SÓLIDA

tD = t0,5 — 0,5tG (min)

Hp = altura del pico menor por encima de la línea base extrapolada

tR = tiempo de retención del pico correspondiente al componente

a = distancia de migración de la fase móvil

tRi = tiempo de retención del pico de interés

Retención relativa no ajustada (rG)♦o (RRT, por sus siglas en inglés)♦

1,18 ��2 − ��1

tR1, tR2 = tiempos de retención de los picos

1,18� ��2 − ��1

RF1, RF2 = factores de retardo de los picos

b = distancia de migración del componente

a = distancia de migración del frente de la fase móvil

KC = constante de distribución (también conocida como coeficiente de distribución de equilibrio)

Volumen de retención (VR):

Tiempo de retención de un compuesto no retenido (t0): En la cromatografía de exclusión por tamaño, el

Volumen de retención de un compuesto no retenido (V0): En la cromatografía de exclusión por tamaño,

k1 = factor de retención del primer pico

Figura 6. Cromatograma de la solución de referencia.

APTITUD DEL SISTEMA

[NOTA—Esta sección solo abarca la cromatografía de líquidos y la cromatografía de gases.]

B (%) Desviación Estándar Relativa Máxima Permitida (%)

2,0 0,41 0,59 0,73 0,85

2,5 0,52 0,74 0,92 1,06

3,0 0,62 0,89 1,10 1,27

B = límite superior de contenido especificado en la monografía individual menos 100%

Simetría de los Picos

Concentración de sales en el componente solución amortiguadora de una fase móvil: ± 10%

Cromatografía de Líquidos: Elución Isocrática

�2 = �1 × ��22 × ��1 / ��21 × ��2

F1 = velocidad de flujo según se indica en la monografía (mL/min)

LONGITUD DE ONDA DEL DETECTOR

Viny1 = volumen de inyección según se indica en la monografía (µL)

Cromatografía de Líquidos: Elución en Gradiente

PARÁMETROS DE LA COLUMNA Y VELOCIDAD DE FLUJO

F1 = velocidad de flujo según se indica en la monografía (mL/min)

F2 = velocidad de flujo ajustada (mL/min)

��2 = ��1 × �1 /�2 �2 × ��22 / �1 × ��12

Diámetro de la columna (dc), en mm 4,6 2,1 Elección del usuario

Tamaño de partícula (dp), en µm 5 3 Elección del usuario

Velocidad de flujo, en mL/min 2,0 0,7 (2)

Factor de ajuste del gradiente (tG2/tG1) — 0,4 (3)

70 13 [1,2 + (10 × 0,4)] = 5,2 —

30 16 [5,2 + (3 × 0,4)] = 6,4 —

volumen de residencia o cambiar la columna.

D = volumen de residencia (mL)

����2 = ����1 �2��22 / �1��21

Viny1 = volumen de inyección según se indica en la monografía (µL)

L1 = longitud de la columna según se indica en la monografía (cm)

Los siguientes métodos de cuantificación pueden usarse en textos generales o monografías.

Método del Estándar Externo

Método del Estándar Interno

preparación de la función de calibración según el procedimiento especificado en la monografía individual. La cromatografía se

También podría gustarte

��2 = ��1 �2��22 / �1��21