Introducción a la

Cromatografía
La cromatografía es una técnica de
separación de los componentes de una
muestra por distribución entre dos fases,
una de ellas fija ó estacionaria y la otra
móvil. La fase estacionaria puede ser
sólida ó líquida (soportada en un sólido ó
gel) y la móvil puede ser gaseosa ó líquida

[EXTRACTO DE LA DEFINICIÓN IUPAC]

Cuando se mide la concentración de cada componente a la salida de la
columna y se representa en función del volumen o el tiempo desde la
Inyección de la muestra se obtiene una gráfica llamada CROMATOGRAMA

Cromatograma – Señal del detector

vs. volumen o tiempo de
retención

Señal del detector 1 2

Volumen ó tiempo
 CLASIFICACIÓN DE LAS TÉCNICAS
CROMATOGRÁFICAS

clasificación

segun la técnica según mecanismo Según la Según la

operativa de interacción Fase Móvil Fase Estacionaria

en columna adsorción gas sólido

plana reparto líquido líquido

intercambio iónico FS

exclusión molecular

afinidad
NATURALEZA DE LAS FASES

Naturaleza de la F.E.
Cromatografía
de Gases  Líquido adsorbido en un sólido  GLC
 Sólido  GSC

Cromatografía Naturaleza de la F.E.

de fluidos
 Especie orgánica unida a una
supercríticos
superficie sólida  CFS
NATURALEZA DE LAS FASES

Cromatografía plana
Cromatografía
de líquidos
Cromatografía en columna

Naturaleza de la F.E.
 Líquido adsorbido en un sólido  LLC
 Sólido  LSC
 Especie orgánica unida a una superficie
sólida  AC
 Resina de intercambio iónico  IIC
 Liquido en los intersticios de un polímero
sólido  EMC
TIPOS DE INTERACCIONES

Según el mecanismo de interacción

 Cromatografía de adsorción
La separación de los solutos depende de una serie de
etapas de adsorción / desorción debidas a interacciones
entre el soluto y lugares activos fijados sobre un sólido
adsorbente que se utiliza como FE

gas o líquido  FM FE  sólido

TIPOS DE INTERACCIONES
 Cromatografía de partición o reparto
La separación de los solutos se debe a su “distribución”
entre los dos fluidos que constituyen ambas fases

FE polar FE apolar
FM apolar FM polar

Fase normal Fase reversa

gas o líquido  FM FE  líquida

Película sobre un
soporte sólido
TIPOS DE INTERACCIONES

 Cromatografía de intercambio iónico

La separación se realiza por atracción electrostática
entre los iones de la disolución (analitos) y los de carga
opuesta situados en la superfice de la FE (resina de
intercambio iónico)

líquido  FM FE  sólida

Resina a la que se unen

covalentemente aniones
o cationes
TIPOS DE INTERACCIONES

 Cromatografía de exclusión molecular

La separación de los analitos se basa en su tamaño
molecular (tamizado)
También llamada filtración en gel

líquido  FM FE  gel

Polímero sólido
no iónico de
tamaño de poro
controlado
TIPOS DE INTERACCIONES

 Cromatografía de afinidad
La separación depende de las FM + Muestra
interacciones muy específicas
entre el analito y las moléculas
(ligandos de afinidad)
covalentemente unidas
(inmovilizadas) a la FE

Moléculas inmovilizadas FE

Inhibidor
enzimático Tipo especial de cromatografía de adsorción
Ag, Ac especialmente utilizada en bioquímica
Tipo especial de cromatografía de adsorción
especialmente utilizada en bioquímica

adsorción lavado elución

PROCEDIMIENTO GENERAL

 La separación se realiza haciendo pasar la FM sobre la FE fija

 El flujo se consigue por capilaridad, presión o gravedad
 La muestra se inyecta, o se coloca, en la F.M.
 Los componentes de la muestra se desplazan con la F.M. y se distribuyen
entre ambas fases en función de sus diferentes afinidades
 Los más retenidos en la F.E. se eluyen después

FM+Muestra Eluyente: lo que entra

en la columna
Eluato: lo que sale de
la columna
FE Elución: proceso de
paso de la FM a través
de la columna

Eluato
PROCEDIMIENTO GENERAL Instrumentación

 Varia según la técnica

 Cromatografía en columna  CROMATOGRAFO

Columna: Detector:

contiene la F.E.y a su través se dispositivo que detecta las

desplaza la FM con la muestra distintas sustancias eluidas
PARÁMETROS CROMATOGRÁFICOS

Parámetros característicos
de la separación cromatográfica

de RETENCIÓN de EFICACIA de RESOLUCIÓN

Parámetros de Retención
Informan sobre la distribución del F.M. soluto
analito entre las dos fases 
soluto
Tiempo de retención (tR)
F.E.
Tiempo muerto (tm)
Tiempo de retención ajustado (t´R)
Velocidad lineal migración de F.M. (u)
Factor de capacidad (k´)
Factor de selectividad (’)
PARÁMETROS CROMATOGRÁFICOS

Ciertos parámetros cromatográficos de RETENCIÓN

se encuentran relacionados entre sí.

• Tiempo de retención (tR) / Tiempo muerto (t0)

• Volumen de retención (VR) / Volumen muerto (V0)
• Flujo ó caudal de fase móvil (F): V0 = F t0
• Velocidad lineal de la fase móvil: u = L / t0
La velocidad lineal del soluto puede estimarse como
una media ponderada de las velocidades del soluto
cuando está retenido y cuando se mueve con la fase
móvil
(ui ) s (ni ) s  (ui ) m ( ni ) m ( ni ) m
ui  u
(ni ) s  (ni ) m (ni ) s  (ni ) m
 PARÁMETROS CROMATOGRÁFICOS

tR.- Tiempo transcurrido desde la VR.- volumen de FM necesario

inyección de la muestra hasta que para eluir ese compuesto
el componente llegue al detector VR = tR x F

t0.-tiempo requerido para que la F.M. t’R.- tiempo desde el máximo del pico
atraviese la columna sin retención de la especie no retenida hasta el
máximo del compuesto eluido. Tiempo
V0 = t0 x F en la F.E. t’R = tR – t0

u.- depende de la longitud de la

V’R = t’R x F
columna u = L / t0

tRB t = minutos
tRA V = ml
F = ml / minuto
t0
u = cm / s
PARÁMETROS CROMATOGRÁFICOS

ui (ni ) m L / tR
 
u (ni ) s  (ni ) m L / t0
t0 1

tR 1  k '
t R  t0
k'
t0
PARÁMETROS CROMATOGRÁFICOS

k’.- indica la mayor o menor retención de t R  t0

un componente por parte de la columna. k'
t0
Relación entre el tiempo que las
moléculas de analito están en la FE y el
que están en la FM. 0 < k’ < infinito

Valor constante y característico de cada k’ <<1  elución muy rápida

analito k’ > 20  elución muy lenta
1 < k’ < 5 intervalo útil

.- se define para dos

k 'B t 'RB tRB > tRA
componentes e indica la  
separación que hay k ' A t 'RA
entre dos máximos  1
 TEORÍA DEL PLATO CROMATOGRÁFICO

Desarrollada en 1941 por A.J.P. Martin y R.L.M. Synge

Consiste en imaginar que en la columna tienen lugar equilibrios sucesivos de
Reparto en contracorriente por parte del soluto entre las dos fases
La columna se divide en N estratos imaginarios llamados
r = 0 PLATOS TEÓRICOS
r = 1 En cada PLATO TEÓRICO se produce un equilibrio de
reparto
Altura Equivalente del Plato Teórico
H=L/N
Volumen de fase móvil presente en un plato teórico
v0 = V0 / N

Llega un volumen v0 de fase móvil al plato r = 0.

Tiene lugar el equilibrio del soluto entre las dos fases
El eluyente se transfiere al plato r =1
Un nuevo volumen fresco v0 llega al plato r = 0
r = N El proceso continúa hasta que el eluyente llega al
plato r = N y sale de la columna
TEORÍA DEL PLATO CROMATOGRÁFICO

Cuando el soluto emerge de la columna el detector produce una señal

proporcional a la cantidad de soluto que abandona el plato r = N

Puede demostrarse que la señal del detector en función del tiempo es:

a 1  ( t t R )2 / 2( t R2 / N )
S (t )  K e
F 2 (t / N )
2
R

a es la cantidad de analito inyectada en la columna

La distribución del pico cromatográfico cuando N es grande es GAUSSIANA
con lo cual, la varianza será
2
t 2 t
  2 R Y el número de
N R

t PLATOS TEÓRICOS 2
N t
TEORÍA DEL PLATO CROMATOGRÁFICO

Si el pico gaussiano se TRIANGULA trazando las tangentes por los

puntos de inflexión, se obtiene un triángulo ISÓSCELES con la
cúspide en tR y base w = 4σt
tR

2
16t
N 2
R
w
w
EL NÚMERO DE PLATOS TEÓRICOS ES UNA MEDIDA DE LA
EFICACIA DE LA SEPARACIÓN
Distintos componentes de una mezcla conducen a distintos valores de N
TEORÍA DEL PLATO CROMATOGRÁFICO

Un pico es gaussiano cuando la constante de reparto KD = (xi)s/(xi)m = Cs/Cm es

constante a una temperatura dada. Una representación de Cs vs Cm es una
ISOTERMA. Cuando la isoterma es lineal (a), la banda es gaussiana, pero cuando
es convexa ó cóncava se producen deformaciones en las bandas originándose
(b) colas ó (c) frentes
 TEORÍA DEL PLATO CROMATOGRÁFICO

Las colas aparecen en sistemas de adsorción con centros activos donde la FE

retiene fuertemente al soluto. Cuando los centros se saturan, KD disminuye y
aparece una cola

Los frentes suelen observarse en sistemas de reparto en los que las interacciones
soluto-FE son débiles comparadas con las soluto-soluto o cuando se inyecta una
gran cantidad de soluto (sobrecarga). En este caso la FE sobrecargada se comporta
Como una fase líquida constituida por el propio soluto. Como “lo semejante disuelve
a lo semejante”, el valor de KD aumenta con la concentración y se produce un frente

El cálculo de N cuando los picos no son simétricos es más complicado:

41.7(tR / w0.1 ) 2 W0.1 es la anchura del pico al décimo de su

N Altura y a/b es un factor de asimetría
(a / b  1.25)
TEORÍA DEL PLATO CROMATOGRÁFICO

Escojamos la unidad de longitud en lugar de tiempo para establecer el

Valor de la AEPT (HETP)

VR  F t R  V2  F 2 t2
L  ui t R  L2  ui2 t2
VR ui
L 2 2 2 2
F t
V /F L
N  R
 2 R
  / ui  L
t
2
2 2
L

L L  2 2
H  2  L L
N L L
TEORÍA CINÉTICA DE LA CROMATOGRAFÍA

La teoría cinética describe más exactamente el movimiento del soluto

en la columna. Fue desarrollada por GIDDINGS en 1965. Al no ser instantáneo
el equilibrio de reparto, la forma de la banda depende de la velocidad del
proceso de elución. El ensanchamiento de la banda cromatográfica σ2L es la
suma de las varianzas de los distintos procesos que contribuyen a la elución

  
2
L
2
procesos

 L2
H   H procesos
L
Y estos procesos son fundamentalmente:
• DIFUSIÓN DE REMOLINO
• DIFUSIÓN LONGITUDINAL
• DIFUSIÓN POR RESISTENCIA A LA TRANSFERENCIA DE MATERIA

H  H Eddy  H LD  H TMR
 TEORÍA CINÉTICA DE LA CROMATOGRAFÍA

DIFUSIÓN DE REMOLINO (EDDY)

En las columnas con relleno hay innumerables rutas para que discurra la
Fase móvil. La velocidad media en los diversos canales es diferente

Esto provoca que unas moléculas

eluyan más ó menos rápidamente
Que el promedio

Esto se debe a dos efectos acoplados: uno de flujo (A) que depende del
tamaño de partícula y otro de difusión radial que es proporcional a la
velocidad de la fase móvil (G u). GIDDINGS (1965) demostró que el efecto
Global en la HETP, HEddy es:
En GC, como u es grande

H Eddy 
1

A

A H Eddy  A
1 1 A E
 1 1 En columnas sin relleno
(capilares) H 0
A Gu Gu u Eddy
TEORÍA CINÉTICA DE LA CROMATOGRAFÍA

A  2 d p
d 2

G
p

Dm

dp es el tamaño promedio de las partículas de relleno

Dm es el coeficiente de difusión de la fase móvil
y  son coeficientes numéricos

Para minimizar el ensanchamiento en columnas empaquetadas

se recomiendan tamaños de 3-5 μm para LC y 100 μm para GC
 TEORÍA CINÉTICA DE LA CROMATOGRAFÍA

DIFUSIÓN LONGITUDINAL
Las moléculas tienden a difundirse por delante y detrás de su zona de
Distribución hacia regiones menos concentradas

A medida que el soluto permanece

más tiempo en la columna, más
se difunde.
A medida que mayor es el flujo de
la fase móvil, menos se ensancha
la banda

La contribución por difusión longitudinal a la HEPT viene dada por

B
H LD  Es inversamente proporcional a la velocidad
de la fase móvil
u
TEORÍA CINÉTICA DE LA CROMATOGRAFÍA

B  2 m Dm  2 s Ds k '
m y s hacen referencia a la fase móvil y la estacionaria
D es el coeficiente de difusión: del orden de 0.1 cm2/s para gases
y de 10-5 cm2/s para líquidos
 es un parámetro que vale 0.6-0.8 en columnas empaquetadas y 1
en las capilares
k’ es el factor de capacidad

En LC Dm = Ds~ 10-5 H LD  0
En GC la contribución es de mayor importancia, especialmente
a bajas velocidades
 TEORÍA CINÉTICA DE LA CROMATOGRAFÍA

RESISTENCIA A LA TRANSFERENCIA DE MASA

El reparto del soluto entre las fases no es instantáneo. El soluto necesita
un tiempo finito para distribuirse entre ambas fases.

Aunque algo de soluto queda en

la fase estacionaria, el resto, que
se encuentra en la fase móvil,
avanza, y la zona se ensancha

La contribución de este término

a la HETP crece con la velocidad
de la fase móvil

HTMR  Cu
TEORÍA CINÉTICA DE LA CROMATOGRAFÍA

C  C s  Cm
2
k' d
Cs  qc s

1  k '
2
Ds
d p2
Cm   m
Dm

qc y m son parámetros numéricos

ds es el espesor de la fase estacionaria
En columnas capilares en lugar de dp, se
pone dc, el diámetro interno de la columna
TEORÍA CINÉTICA DE LA CROMATOGRAFÍA

Sumando todas las contribuciones a la HETP

LC: Ecuación de GIDDINGS

A B
H   Cu
E u
1
u
B/u es insignificante a velocidades normales

GC: Ecuación de VAN DEEMTER

B
H  A   Cu
u
En columnas capilares A = 0
TEORÍA CINÉTICA DE LA CROMATOGRAFÍA

Contribución de los distintos términos en la ecuación de Van Deemter

Hay un mínimo cuando

H B
umin  0   2 C
u u
B
umin 
C
Para u < umin el término B ensancha
La banda
Para u > umin el término C ensancha
La banda

Todo el tratamiento se considera a T constante

 PARÁMETROS CROMATOGRÁFICOS

Parámetro de Resolución Capacidad para separar

dos sustancias teniendo
Medida del grado de separación
en cuenta no solo la
entre dos picos consecutivos
separación entre picos
t RB  t RA
Res  (SELECTIVIDAD) sino
(WA  WB ) / 2 también los anchos de
las bandas (EFICACIA)

tRB
tRA

WA WB
PARÁMETROS CROMATOGRÁFICOS

Cuando los picos son gaussianos y similares, la RESOLUCIÓN MÍNIMA que

Debe conseguirse es de 1.5, para considerarlos RESUELTOS
Se admite que WA = WB = W

R  1,5  picos bien resueltos

R < 1,5  picos solapados
PARÁMETROS CROMATOGRÁFICOS

La resolución puede expresarse en función del número de

platos teóricos (N) y la selectividad (α)

16tR2B tRB  t RA
k '   k A  k B' 
k 'B 1 '
 N 2
Res 
k 'A w w 2
1    1  k '  1 L    1  k ' 
Res  N     
4    1  k '  4 H    1  k ' 
PARÁMETROS CROMATOGRÁFICOS

PARA AUMENTAR LA RESOLUCIÓN

Aumentando L (Columna más larga)

AUMENTAR EL VALOR DE N
Disminuyendo H
• Optimizando el flujo FM
• Reduciendo el tamaño de partícula FE

CAMBIAR LA COMPOSICIÓN DE LA FM (LC) Optimizar k’

pero no demasiado
TRABAJAR A T PROGRAMADA (GC) Óptimo: k’ = 2-5
PARÁMETROS CROMATOGRÁFICOS
PARÁMETROS CROMATOGRÁFICOS

Optimización del
proceso cromatográfico

Su objetivo es conseguir, en el
menor tiempo posible de análisis,
picos bien separados y definidos

 Selección adecuada de FM y FE
 Variación de las condiciones experimentales
 velocidad de flujo
 tamaño de partículas del soporte
 temperatura de la columna
 longitud de la columna...
APLICACIONES ANÁLITICAS

 ANÁLISIS CUALITATIVO
Posición
IDENTIFICA
de los picos
 ANÁLISIS CUANTITATIVO
Altura / área
CUANTIFICA
de los picos

CUANTI

tRA tRB
CUALI
APLICACIONES ANÁLITICAS

Los picos cromatográficos deben presentar una calidad suficiente

● PUREZA (ESPECTRAL): No hay co-elución y el pico responde a un único

componente
● SIMETRÍA: El pico debe ser simétrico sin presentar frentes ni colas

● RESOLUCIÓN COMPLETA: Res ≥ 1.5 BB

APLICACIONES ANÁLITICAS
ANÁLISIS CUALITATIVO
1.- Comparación con parámetros de retención
▲Tiempo de retención: Bajo determinadas condiciones el tR es
característico de una sustancia, aunque no tiene en cuenta:
 Efecto de la matriz de la muestra
 Posibles interacciones con otros componentes
▲Tiempos de retención relativos y otros índices de retención
2.- Empleo de detectores selectivos con información cualitativa
 Fila de Diodos (LC)
 Espectrometria de masas (GC)
3.- Formación de derivados
 Pre columna
 Post columna
APLICACIONES ANÁLITICAS
ANÁLISIS CUANTITATIVO
 Se basa en la comparación de la señal (altura/área del pico) del analito con la
de uno o varios patrones ya que ambos parámetros varían linealmente con la
concentración si se controlan adecuadamente las condiciones
 La medida del área se hace integrando electrónicamente la señal del pico
tf tf
m 1 m vC
A   S (t )dt   K e  ( t t R )2 / 2 t2
dt  K  K
ti ti
F  t 2 F F
ti  t R  3 t ; t f  tR  3 t
La relación entre la señal (A),
y la concentración o masa Señal A = a + bC
de analito (C) se obtiene mediante

LA RECTA DE
CALIBRACIÓN Concentración
ó masa de analito
 CUANTIFICACIÓN POR CALIBRACIÓN

CALIBRADO EXTERNO
Inyectamos cantidades conocidas del analito a determinar, obtenemos el
cromatograma, determinamos el área del pico y la representamos frente
a la cantidad inyectada, en unidades de masa ó concentración dependiendo
de la naturaleza del detector.
La representación debe conducir a una recta que pase por el origen :
a
A  a  bC ; a  0 :  t ( N  2,95%)
sa
A  bC ; C  fA La pendiente de la recta de calibrado
es el recíproco del factor de respuesta (f)
del detector para dicho analito b = 1/f
En GC, la inyección manual no es satisfactoria y es necesario utilizar un
PATRÓN INTERNO
La cantidad presente del analito en una muestra se determina interpolando
El área del pico del cromatograma de la muestra (Ax) en la recta
Ax
 fAx  C x
b
 CUANTIFICACIÓN POR CALIBRACIÓN

A menudo, en análisis de rutina se usa la “calibración de un punto”:

Se inyecta un patrón de concentración conocida y luego la muestra

La concentración del analito se estima por proporcionalidad directa

Ax C x

A C
 CUANTIFICACIÓN POR CALIBRACIÓN

CALIBRADO CON PATRON INTERNO

Se usa cuando la técnica es poco reproducible y cuando no podemos recalibrar
a menudo. Muy útil en inyección manual en GC.
El PI no puede ser componente de la muestra a analizar y no debe solapar con
ningún pico
Se añade una cantidad conocida de PI tanto al estándar como a la muestra
y debe cumplir ciertos requisitos:
Eluir cerca del pico de interés
Estar bien resuelto
Ser químicamente similar a los analitos de interés y no reaccionar con ninguno
Ser asequible en alto estado de pureza

Se representa el cociente del área

del estándar de analito y del PI frente
A la concentración de analito

A b C
  kC
API bPI CPI
 CUANTIFICACIÓN POR CALIBRACIÓN

La calibración de un punto con el PI : Se inyecta el estándar de analito + PI y

La muestra + PI
( A / API ) x C x

( A / API ) C
Pero en ciertos casos, en los que se conoce a priori que los factores de
Respuesta de los analitos y del PI son iguales, no es necesario ni usar
ANALITO ESTÁNDAR

 A  b Cx Cx
   
 API  x bPI CPI CPI
 A 
Cx  CPI  
 API  x
 CUANTIFICACIÓN POR CALIBRACIÓN

CALIBRADO CON ADICIÓN PATRON

En este caso añadimos sobre la muestra una cantidad conocida del analito.
La cantidad de analito se estima a partir de las áreas del pico en la muestra
sin adicionar y la enriquecida. En el caso de una única adición:

Ax  bCx  Ax Cx
a  a
 La medida del volumen debe ser
Ax  b(Cx  C )  Ax Cx  C a
a reproducible o usar PI

En el caso de adición múltiple:

A  b(C x  C )  bC x  bC  a  bC
a
x ,i i
a
i
a
i
a

a
Cx 
b
Cuando Axa, j  0  C x  C aj
 CUANTIFICACIÓN POR CALIBRACIÓN

CALIBRADO CON ADICIÓN PATRON

 CUANTIFICACIÓN POR CALIBRACIÓN

NORMALIZACIÓN DE ÁREA
El % de área de cada componente se toma como % en peso, corregido por el
factor de respuesta

   
% X  100  Ax f x 
Si i, j  fi  f j : % X  100  Ax 
 A f   A 
 i i i
  i i 

REQUISITOS:
Todos los componentes han de ser eluidos
Todos los componentes tienen que ser detectados
Todos los analitos han de tener el mismo factor de respuesta
 BIBLIOGRAFÍA
D.C. Harris, Análisis Químico Cuantitativo,
Reverté, 1999
D.A. Skoog & J.J. Leary, Análisis Instrumental,
McGraw-Hill, 1993
L. Hernández & C. González, Introducción al
análisis instrumental, Ariel Ciencia, 2002
F. Rouessac & A. Rouessac, Métodos y
Técnicas Instrumentales Modernas, McGraw-
Hill, 2000