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UNIDAD 2
2.1.
Mtodos de cultivo
2.1.1. Tipos de medios (Slidos , Lquidos)
Cultivo: poblaciones bacterianas con millones de individuos.
Cultivo puro o axnico: el que contiene una sola clase de microorganismo.
Cultivo mixto: el que contiene varios microorganismos creciendo juntos.
Para el aislamiento se de organismos utilizan medios slidos (agar ) Semislidos o
lquidos.
Cultivos bacterianos
Colonias de bacterias Escherichia coli (ms grande, rosa) y Proteus vulgaris (ms
pequea, de color castao) que crecen juntas en una placa Petri. En circunstancias
normales estas bacterias son inofensivas y habitan en el intestino humano favoreciendo la
digestin, si bien pueden convertirse en patgenas y producir infecciones del tracto
urinario. Los cientficos y mdicos llevan a cabo cultivos bacterianos y estudian sus
caractersticas con el fin de adquirir conocimientos respecto a las enfermedades
bacterianas y su prevencin.

Un mtodo fundamental para estudiar las bacterias es cultivarlas en un medio lquido o

en la superficie de un medio slido de agar. Los medios de cultivo contienen distintos
nutrientes que van, desde azcares simples hasta sustancias complejas como la sangre o
el extracto de caldo de carne. Para aislar o purificar una especie bacteriana a partir de
una muestra formada por muchos tipos de bacterias, se siembra en un medio de cultivo
slido donde las clulas que se multiplican no cambian de localizacin; tras muchos ciclos

2
reproductivos, cada bacteria individual genera por escisin binaria una colonia
macroscpica compuesta por decenas de millones de clulas similares a la original. Si
esta colonia individual se siembra a su vez en un nuevo medio crecer como cultivo puro
de un solo tipo de bacteria.
Muchas especies bacterianas son tan parecidas morfolgicamente que es imposible
diferenciarlas slo con el uso del microscopio; en este caso, para identificar cada tipo de
bacteria, se estudian sus caractersticas bioqumicas sembrndolas en medios de cultivo
especiales. As, algunos medios contienen un producto que inhibe el crecimiento de la
mayora de las especies bacterianas, pero no la de un tipo que deseamos averiguar si
est presente.
Otras veces el medio de cultivo contiene determinados azcares especiales que slo
pueden utilizar algunas bacterias. En algunos medios se aaden indicadores de pH que
cambian de color cuando uno de los nutrientes del medio es fermentado y se generan
catabolitos cidos. Si las bacterias son capaces de producir fermentacin, generan gases
que pueden ser apreciados cuando el cultivo se realiza en un tubo cerrado. Con otros
medios de cultivo se identifica si las bacterias producen determinadas enzimas que
digieren los nutrientes: as, algunas bacterias con enzimas hemolticas (capaces de
romper los glbulos rojos) producen hemlisis y cambios apreciables macroscpicamente
en las placas de agar-sangre. Los diferentes medios y tcnicas de cultivo son esenciales
en el laboratorio de microbiologa de un hospital, pues sirven para identificar las bacterias
causantes de las enfermedades infecciosas y los antibiticos a los que son sensibles esas
bacterias
Medios slidos: siembra (extensin o vertido) en placa.
Separacin e inmovilizacin de organismos de forma individualizada en un medio nutritivo
slido. Cada individuo al multiplicarse origina una colonia.
Medios lquidos
Solo utilizable para aislar la especie predominante en un cultivo mixto. Mtodo de la
dilucin lmite.
2.1.2. Clasificacin de Medios (Enriquecidos Selectivos Diferenciales ETC.)
MEDIOS DE CULTIVOS
Aunque muchos de los hetertrofos se desarrollan bien en agar nutritivo o caldo nutritivo,
otros no crecen bien,, y otros ms, simplemente no se desarrollan. Algunos hetertrofos

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tienen requerimientos nutricionales muy elaborados para nutrientes especficos, por
ejemplo: vitaminas y sustancias promotoras del crecimiento. A estos organismos se les
llama

hetertrofos exigentes. Adems, se necesitan muchos medios de cultivos

elaborados para propsitos especiales que facilitan la identificacin, aislamiento y

cuantificacin de ciertos tipos de bacterias. Para conocer estas necesidades, el
bacterilogo cuenta con numerosos medios de cultivo a los cuales, de acuerdo con su
funcin o aplicacin, se les puede clasificar de la siguiente manera:
MEDIOS ENRIQUECIDOS: son medios en el que se le adiciona componentes como
sangre, suero o extracto de tejidos de animales y plantas al caldo nutritivo o agar, les
proporciona sustancias nutritivas complementarias para que el medio pueda soportar el
crecimiento de los hetertrofos exigentes.
MEDIOS SELECTIVOS: son medios en el que se le adiciona

agar nutritivo de ciertas

sustancias qumicas especficas, no permitir el desarrollo de un grupo de bacterias, sin

inhibir al mismo tiempo el crecimiento de otros grupos. Por ejemplo, el cristal violeta en
concentraciones especficas previene el crecimiento de bacterias grampositivas sin
afectar el desarrollo de variedades de gramnegativas. De manera similar, un medio en el
cual la nica fuente de carbono sea la maltosa,

permite seleccionar las bacterias que

puede asimilarla. En principio se puede seleccionar las bacterias que slo se desarrollen
en presencia de compuestos orgnicos pocos comunes agregando dichos compuestos al
medio de cultivo y omitiendo todos los dems compuestos de carbono.
MEDIOS DIFERENCIALES: son medios en el que se le adiciona

ciertos reactivos o

sustancias qumicas a los medios de cultivo y trae como resultado determinado tipo de
crecimiento bacteriano o de cambios, lo cual permite al observador diferenciar distintos
tipos de bacterias. por ejemplo, si se siembra una mezcla de bacterias en un medio agar
sangre, algunas de las bacterias pueden hermolizar (destruir) los glbulos rojos, mientras
que otros no lo hacen. Cuando aparece una zona clara alrededor de la colonia bacteriana
es indicativo

de que ocurre la hemlisis. As es posible distinguir entre bacteria

hermolticas y no hemolitcas que proliferan en el mismo medio.

4
MEDIOS DE PRUEBA: son medios para el ensayo de vitaminas, aminocidos y
antibiticos, se utilizan medios de cultivos de composicin conocida. As mismo, se
recurre a medios de composicin especial para probar desinfectantes.
MEDIOS PARA CUENTA DE BACTERIAS: son medios para determinar el contenido
bacteriano de sustancias tales como la leche y el agua, se emplean ciertos tipos
especficos de medios de cultivos. Se debe sealar

su frmula, as como las

especificaciones prescritas.
MEDIOS PARA CARACTERIZAR BACTERIAS: son medios para determinar el tipo de
crecimiento producido por los organismos, as como la capacidad de las bacterias para
producir cambios qumicos, se utiliza de manera convencional una amplia variedad de
medios de cultivos.
MEDIOS DE MANTENIMIENTO: son medios para preservar las caractersticas
fisiolgicas y la viabilidad de un cultivo, quizs se requiera de un medio diferente de
aquellos que son ptimos para el crecimiento. El crecimiento rpido y prolfico suele
ocasionar la muerte rpida de clulas. En relacin con su estado fsico se puede
establecer diferencias ms amplas entre los medios. Se emplea ocasionalmente. Medios
slidos tales como rebanadas de papas, para cultivos especiales de bacterias. Medios
slidos - reversibles a lquidos se ejemplifican con el agar nutritivo. Los medios
semislidos contienen pequeas cantidades de agar (0.5 % o menos), el cual le imparte
una consistencia de natillas.
2.2. Preparacin de medios
2.2.1 Medios bacterianos ( preparacin)
Medio sinttico o definido: compuesto por nutrientes qumicamente definidos.
Medio complejo o indefinido: contiene ingredientes de composicin desconocida (v.g.:
extracto de levaduras).
Cuando se desea un medio slido Los ejemplos de medios de cultivos que se han
apuntado su de composicin qumica conocida (medios sintticos o definidos
qumicamente), los cuales, se han diseado para el cultivo de tipos especficos de
bacterias conocidas. Se necesita un gran nmero de sustancias qumicamente puras
para cultivar bacteria que tengan necesidades nutricionales como los lactobaclos. Aunque

5
para el cultivo de bacterias hetertrofas en laboratorio de rutina, tanto si son similares a
las especies de escherichia o de lactobacillus, generalmente se basan en medios de
cultivos sintticos. En lugar de esto, se usan ciertos materiales crudos como peptonas,
extracto de carne y extracto de levadura y as el medio de cultivo que se obtiene hace
posible el desarrollo de gran variedad de bacterias y otros microorganismos, se toma el
agar como agente solidificante.
En la se hace una descripcin de estos materiales crudos. Ejemplos de medios lquidos
y slidos relativamente simples que hacen simple el desarrollo de muchas bacterias
hetertrofas comunes, son el caldo nutritivo y el agar nutritivo. Mediante la adiccin de
extracto de levadura a estos medios, se mejora de manera importante la calidad nutritiva
de los mismos, ya que el extracto de levadura contiene varias de las vitaminas B y otras
sustancias promotoras del crecimiento.
MATERIAL CRUDO
Agar
Extracto de carne

CARACTERISTICAS
VALOR NUTRITIVO
Carbohidratos complejos
Extracto acuoso de carne Contiene la sustancia
magra

de

res soluble

concentrado en pasta.

en

agua

de

tejidos animales. entre

ellas carbohidratos

Extracto de levadura

Solucin

Peptona

levaduras
Es le producto que resulta Fuente
de

la

materiales
Por

acuosa

de

digestin

principal

de nitrgeno

orgnico,

protenicos. puede

ejemplo:

casena y gelatina.

carne, vitaminas

de

contener
y

algunas

veces carbohidratos.

PREPARACION DE LOS MEDIOS BACTERIANOS :

Para el cultivo de las bacterias se recurre a algunas sustancias naturales comunes. En
relacin con esto, se usa la leche desnatada y no entera. Los materiales , en su forma
natural, no presentan ningn problema para tomarlos como medios de cultivos ya que
simplemente se depositan dentro de los envases adecuados tales como tubos de ensayo,
o matraces, los cuales deben ser esterilizados. Los medios que se preparan del tipo agar
o caldos nutritivos, sean mezclado ingredientes individuales necesarios, o de manera ms

6
practica, agregando agua o productos deshidratados que contienen todos los
ingredientes.

En la preparacin de los medios de cultivos se deben seguir los siguientes pasos:

1. Cada ingrediente, o el medio deshidratado completo, se puede disolver en un
volumen adecuado de agar destilado.
2. Se determinar el ph del medio y si es necesario se ajustar. El ph se determina
por medio de indicadores o potencimetro.
3. El medio se pondr en recipiente adecuados, como tubos, matraces, botellas cuyas
bocas se cierran con tapones de algodn , plstico o cubiertas de metal.
4. Los medios se esterilizan generalmente en autoclaves.
2.2.2 Medios para virus ( preparacin)
MEDIOS DE CULTIVO DE VIRUS
En casi todos los trabajos iniciales, los virus se desarrollan en huspedes virus. El primer
mtodo. Y uno de los ms tiles para cultivarlos en el laboratorio y obtenerlos en cultivo
puro, fue la tcnica del embrin de pollo, huevos de gallina fecundados e incubados 5-12
das. se incubados quitando aspticamente un trocito de la cscara e introduciendo por
ese orificio el material que contiene el virus. La abertura se tapa con cera parafinada y el
huevo se incuba a 36 Cpor todo el tiempo necesario para que el virus se desarrolle. El
embrin se inocula en la membrana orioalantoidea, en donde algunos virus, tambin se
utiliza el saco vitelino. La tcnica de cultivo en embrin de pollo se ha utilizado para la
produccin de los virus para vacunas contra la viruela, fiebre amarilla, influenza y otras
enfermedades, as como para pruebas inmunologicas y otros estudios.
Cogulos De Plasma
En esta tcnica se deja coagular el plasma alrededor de trasplantes de tejido y los virus
se inoculan en el plasma que contiene fragmentos de tejidos vivo. Una modificacin de
este mtodo consiste en encerrar el cogulo en un saco de colodin perforado. Las
clulas incluidas en el plasma sirven de huspedes para el desarrollo del virus, pero al ser
ste liberado se difunde a travs de la membrana al lquido circulante libre de clulas. As
el virus se obtiene apartado de las clulas huspedes que son demasiados grandes para
pasar por las perforaciones en colodin.
OTROS

7
1. Supervivencia del virus en las heces y en la orina:
El virus es estable en las heces (y en la orina) a temperatura ambiente por al menos 1 a 2
das. El virus es ms estable (hasta 4 das) en las heces de pacientes con diarrea (que
tienen un pH ms elevado que las heces normales).
2. Desinfectantes y fijadores (para su uso en laboratorios):
El virus pierde su capacidad de infectar despus de su exposicin a diferentes fijadores y
desinfectantes generalmente empleados.
3. Supervivencia del virus en el sobrenadante del cultivo de clulas:
Reduccin mnima solamente en la concentracin del virus despus de 21 das a 4C y a
-80C.
Reduccin en la concentracin del virus mediante un log slo a temperatura ambiente
estable durante dos das. Esto podra indicar que el virus es ms estable que los
coronavirus humanos conocidos en estas condiciones.
El calor a 56C inactiva el coronavirus del SARS en alrededor de l0000 unidades por l5
minutos (reduccin rpida).
Lab*

Substrato

GVU

Virus mezclado en 1.00E+03 PH 6-7

las heces del nio

3 horas

Aislamiento
del virus en
cultivo de
clulas

Virus mezclado en 7.50E+03 PH 8

las heces
normales

6 horas

Aislamiento
del virus en
cultivo
celular

Virus en diarrea

7.50E+03 PH 9

4 das

Aislamiento
del virus en
cultivo
celular

Heces fecales

1.00E+03 Temperatura Al menos dos Aislamiento

ambiente
das
del virus en
cultivo
celular

Orina

1.00E+03 A
temperatura
ambiente

QMH

Conteo
inicial
viral
Log 10PFU

Estado

Tiempo de
Mtodo de
supervivencia la prueba
de
viabilidad

Al menos 24
horas

Aislamiento
del virus en
cultivo
celular

NIID

UniM

Medio de cultivo
del virus + 1% de
suero bovino

1.00E+03 Sobre
superficie
plstica a
temperatura
ambiente

Al menos dos Aislamiento

das
del virus en
cultivo
celular

Medio de cultivo
del virus + l% de
suero bovino

1.00E+04 30-37C

Al menos l
hora

Aislamiento
del virus en
cultivo
celular

Medio de cultivo
del virus +1% de
suero de feto de
ternero

1.00E+04 56C

Degradacin
del ttulo con
el tiempo
(10000
unidades
infecciosas
del virus en
15 min.

Aislamiento
del virus en
cultivo
celular

Virus en acetona, 1.00E+06 A

10% formaldehido
temperatura
y
ambiente
paraformaldehido,
10% de cloro,
75% de etanol, 2
% de fenol

5 min.

Aislamiento
del virus en
cultivo
celular

Cultivo del virus + 1.00E+06 Minus 80C

2% del suero
bovino

Al menos 4
das

Aislamiento
del virus y
RT-PCR

Culltivo del virus + 1.00E+06 4C

2% de suero de
feto de ternero

Al menos 4
das

Aislamiento
del virus y
RT-PCR

Cultivo del virus + 1.00E

2% de suero del
+06
feto del ternero

Menos de 4
das

Aislamiento
del virus y
RT-PCR

37C

Cultivo del virus + 1.00E+05 56C

2% de suero del
feto de ternero

Menos de 30
min.

Cultivo del virus

1.00E+06 4C

Al menos 21
das

Aislamiento
del virus

Cultivo del virus

1.00E+06 Minus 80C

Al menos 21
das

Aislamiento
del virus

2.3. Tcnicas de cultivo

2.3.1. Siembra en placa por estra
TCNICA DE SIEMBRA POR ESTRIAS EN PLACA Y TCNICA DE SIEMBRA POR
DIFUSIN EN PLACA.
Con un asa bacteriolgica, se pasa una porcin de la muestra a la superficie de un
medio de cultivo hecho basado en agar y se siembra en el medio ya sea por estra o
por difusin. Para sembrar por difusin en placa, por lo comn se usa una varilla de
cristal estril para esparcir la muestra.
Esta operacin hace posible adelgazar la muestra de tal manera que en la superficie
del agar quedan las bacterias separadas unas de otras. Cuando se raya
adecuadamente agar con el asa de siembras, las clulas bacterianas quedan lo
suficientemente separadas en algunas reas de la placa lo que permite estar seguro
que las colonias que se desarrollan a partir de una clula no se junte con la que se
est desarrollndose a partir de otra clula.
Cada colonia aislada es la descendencia de una sola clula y, por tanto, un cultivo
puro. En las especies donde las clulas se agrupan de forma caracterstica, la colonia
se desarrolla a partir de un grupo de clulas del mismo tipo e igualmente representa
un cultivo puro. Una porcin de una colonia que se pase a un medio de cultivo en tubo
viene a ser un cultivo puro.
Las tcnicas de siembra en placa por estras o por difusin se puede hacer
convencionalmente y con equipo mnimo; stos son procedimientos de rutina que se
efectan para aislar bacteria en cultivo puro. Una de sus limitaciones es que slo
pequeas cantidades de la muestra pueden ser esparcidas sobre la superficie del
medio del cultivo.

10

2.3.2. SIEMBRA EN PLACA POR DILUCIN

Tcnica de la placa vertida: El principio de la tcnica de la placa vertida es la dilucin
(adelgazamiento) de la muestra en tubos de agar fundido y enfriado. Se necesita hacer
diluciones en ms de un tubo para obtener colonias bien aisladas, si no se conoce la
magnitud de la poblacin bacteriana, el medio se mantiene al estado lquido a 45 grados
centgrados para permitir que el inculo se distribuya adecuadamente en el medio. Una
vez sembrado el medio se pone en la caja de petri, se deja solidificar y despus se
encuba. Esta tcnica se hace en forma cuantitativa o cualitativa. Cuando se emplea el
procedimiento cuantitativo podemos determinar el nmero de bacterias ( de un tipo
particular) en la muestra, as como aislarlas en cultivo puro. La tcnica de siembra por
estra (o por liseminacin) y las de placa vertida para aislar cierta clase de bacterias,
pueden mejorarse con medios de cultivos selectivos o diferenciales.
Tcnica de las diluciones en serie: si el microorganismo que se busca en un cultivo
mixto se encuentra en mayor cantidad que cualquiera de cualquiera de los otros
microorganismos, es posible obtenerlo en cultivo puro mediante una serie de
diluciones en tubo, del medio de cultivo apropiado. Cuando la muestre est muy
diluida contendr solamente la bacteria que buscamos.
2.3.3. Siembra en tubo en agar, en caldo

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lustracin esquemtica del desarrollo de bacterias sembradas en tubos con agar en

profundidad,
Tcnica de aislamiento de una sola clula:

para poder obtener un solo

microorganismo de una preparacin en gota suspendida, se necesita equipo especial,

como el micromanipulador. Este aparato permite al operador controlar los movimientos
de una micropipeta o microcnula (aguja muy fina) dentro de una gota pendiente de tal
manera que se pueda tomar una sola clula dentro del tubo y pasarlo a un medio de
cultivo adecuado para su desarrollo. Esta tcnica se usa principalmente en estudios
muy especializados.

2.4. Preparaciones para microscopia

2.4.1. Tipos de preparaciones para la observacin microscpica
La observacin microscpica constituye la primera etapa del estudio de los
microorganismos y tambin del diagnstico microbiolgico ya que permite conocer
algunas caractersticas de los microorganismos, como ser: forma, disposicin o
agrupacin, presencia o ausencia de estructuras (cpsulas, esporas, flagelos), movilidad,
etc.
Existen numerosas tcnicas para la observacin microscpica de los
microorganismos, de las cuales en el laboratorio son fciles de realizar las siguientes:
1. Observacin de bacterias vivas:
a) en fresco
b) con fondo oscuro
c) gota pendiente

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2. Observacin de bacterias muertas:
a) con tincin simple
b) con tincin diferencial
c) con tincin especial
d) ETC
3. Observacin microscpica de hongos
a) Observacin en fresco
b) Preparaciones fijas
c) Tcnica del microcultivo
1. OBSERVACIN DE BACTERIAS VIVAS
a) Observacin en fresco. Este mtodo de examen permite observar el microorganismo
al estado vivo y evita las deformaciones artificiales de su morfologa que producen las
tcnicas de coloracin. Su aplicacin ms importante se refiere al estudio de la movilidad
de los microorganismos.
Consiste en suspender el microorganismo a observar en un lquido y depositar una gota
de la suspensin sobre un portaobjeto sobre el cual a la vez se coloca un cubreobjeto,
luego se procede a la observacin microscpica.
b) Observacin microscpica en fondo oscuro. Se basa en el fenmeno de Tyndall, de
reflexin luminosa. Para la observacin se sustituye el condensador de Abb por el
condensador de fondo oscuro, o de ultra. Se ilumina la preparacin en forma oblicua,
incidiendo los rayos luminosos directamente sobre los microorganismos sin penetrar en el
objetivo del microscopio. Se le emplea para la observacin de bacterias muy pequeas o
de aquellas que difcilmente se observan al microscopio de campo claro por su falta de
contraste con el medio.
c) Gota pendiente. Para tal observacin se utiliza un portaobjeto cavado. En el borde de
la excavacin se deposita una fina pelcula de vaselina; luego, en un cubreobjeto se
deposita una pequea gota de suspensin bacteriana y ste se coloca sobre la
excavacin del portaobjeto. La vaselina impide la penetracin de corrientes de aire y
permite la adhesin del cubreobjeto al portaobjeto.
2. OBSERVACIN DE BACTERIAS MUERTAS
El procedimiento es el siguiente: primeramente se procede a extender las bacterias a
observar; para ello, stas se suspenden en un lquido y se extiende una gota de la
suspensin sobre los dos tercios distales de un portaobjeto con la ayuda de un asa.
Luego se procede a la fijacin por medios qumicos o fsicos. El medio qumico consiste
en colocar en contacto el material extendido con una sustancia qumica. Ejemplo: alcohol
metlico, ter, etc. En el medio fsico el extendido se expone al calor.
Una vez extendida y fijada la muestra, se realiza la tincin que consiste en dejar actuar
sobre ella colorantes de uso microbiolgico.
El usar esta ltima tcnica tiene la ventaja que permite que las clulas bacterianas se
observen ms claramente despus de teidas y adems, puede proporcionar informacin
de propiedades qumicas de stas.

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3. OBSERVACIN MICROSCPICA DE HONGOS

a) Observacin en fresco
- Deposite una gota de agua sobre un portaobjeto y posteriormente con una aguja o asa
con hilo de platino, proceda a sacar el hongo (micelio, esporas, etc.) del sustrato en el
cual el microorganismo se est desarrollando.
- Separe suavemente el micelio en la gota de agua sobre el portaobjeto ayudndose con
otra aguja.
- Coloque el cubreobjeto sobre la gota de agua en un ngulo de 45 y djelo caer sobre
sta asegurndose que no queden burbujas.
- Observe al microscopio.

b) Preparaciones fijas
Se procede de manera similar a las preparaciones en fresco, pero en vez de utilizar agua
se utiliza lactofenol u otro producto qumico para fijar la preparacin. Posteriormente, si es
necesario, se procede a sellar con cutex los bordes del cubreobjeto y se observa al
microscopio.
Esta tcnica permite conservar por un largo tiempo las preparaciones en el laboratorio.
c) Tcnica del microcultivo
Esta tcnica se utiliza en micologa para el estudio de ciertas estructuras de los hongos
que son muy frgiles y se deterioran fcilmente, al ser obtenidas para su observacin a
partir de un macrocultivo (comn y corriente).
La tcnica consiste en una placa de Petri estril en cuyo interior se encuentran: un
portaobjeto, cubreobjeto, tubo de vidrio en U y papel filtro.
Sobre el portaobjeto se deposita en forma asptica, un trocito del medio de cultivo a
utilizar (se corta con un sacabocados). Luego se siembra el hongo en estudio pasando el
asa con el hilo de platino en la periferia superior del medio de cultivo, a continuacin se
cubre con el cubreobjeto estril y se agrega al fondo de la placa agua destilada estril
(cmara hmeda); finalmente se incuba a la temperatura deseada. Despus de 3-4 das
se retira en forma cuidadosa el cubreobjeto al cual se ha adherido el hongo y se monta
sobre un portaobjeto para observar en fresco, o realizar una preparacin permanente.
2.4.2.

TCNICAS PARA LA OBSERVACIN MICROSCPICA

Preparaciones: Tcnicas para observar en el microscopio electrnico.

14
En microscopia electrnica, el espcimen que se va a examinar se prepara con una
pelcula muy fina y seca sobre pantallas pequeas y se introduce en el instrumento en un
punto situado entre el condensador magntico y el objetivo magntico, comparado con a
la platina de luz. La imagen se ve en una pantalla fluorescente por una ventana a prueba
de aire o se registra en una placa fotografas por una cmara introducida en el
instrumento.
Tcnica del sombreado: esta tcnica consiste en colocar una capa de metal sumamente
delgada, en un ngulo oblicuo sobre el organismo, as que este adquiera una sombra en
el lado no cubierto. La tcnica del sombreado produce una representacin topogrfica
d3e la superficie del espcimen).
Cortes ultrafino: al hacer observaciones a nivel macromolecular, el material para examen
debe ser delgado en grado sumo. Se disponen de tcnicas para cortar (rebanar) una
clula bacteriana; una clula aislada incluida en material plstico puede cortarse en
rebanadas ultrafinas mediante un micrtomo. El uso de colorantes especiales para
microscopia electrnica, acenta el contraste de las estructuras.
Tincin negativa: el uso de material denso en electrones, actan como un colorante que
delimita el objeto de la misma manera que el del microscopio de luz. El fosfotungstato, no
penetra en las estructuras sino que forma depsitos espesos en las hendiduras.
Tcnica a de criofractura: esta tcnica se ha ideado para preparar cortes del espcimen
sin recurrir al tratamiento qumico del proceso de fijacin, que se tema pudieran producir
los artefactos. La muestra se corta mientras est contenida en un bloque de hielo, se
preparan rplicas en carbn de estas superficies expuestas, las cuales

revelan

estructuras de la muestra.
Localizacin de los constituyentes celulares: se han ideado tcnicas especiales que
hacen posible localizar constituyentes qumico de las clulas. los corte finos de una clula
se tratan con anticuerpos marcado con ferritina. La combinacin de este anticuerpo con el
antgeno en la clula producir una entidad en la imagen con el microscopio electrnico.
Localizacin de enzima en cortes ultrafinos: para localizar enzima en los cortes finos
se aplican mtodos de coloracin especficos. Estas tcnicas sirven para depositar en el

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tejido pequeas partculas densas como el producto final de una reaccin qumica
controlada. la estructura clular fina y la actividad enzimtica tienen que sobre vivir a la
preparacin y coloracin de los especmenes y, asimismo, en los sitios activos debe
depositarse suficiente producto final para que se haga visible. Los tejidos fijados en formol
retiene una alta proporcin de su actividad enzimtica de 24 horas. algunas sales
metlicas se precipitan como resultado de la actividad y son excelentes para la
microscopia. La mayora de estas tcnicas se basan en la formacin de sales de plomo
insoluble .
Autorradiografia: es un mtodo citoqumico en el que se estudia la localizacin de los
constituyentes qumicos de los tejidos registrando la posicin del material radiactivo
incorporado en la muestra. Un espcimen fino que contiene material radiactivo se cubre
con una capa delgada de emulsin fotogrfica y se guarda en la oscuridad durante
semanas o meses. La radiacin ionizaste

emitida durante la descomposicin de la

sustancia radiactiva produce imgenes latentes en la emulsin y despus del revelado la

imagen tiene aspecto de granos de plata en el microscopio electrnico.

Preparaciones para examen con el microscopio de campo luminoso.

A fin de proporcionar un material adecuado para el examen microscpico se sigue
dos tcnicas generales.
Una de ellas es la suspencin de organismos en un lquido.
Y la otra hace uso de pelculas o frotes desecados, fijos y teidos de la muestra.
Las tcnicas del montaje hmedo y de la gota pendiente: las preparaciones de gota
pendiente y hmeda hacen posible examinar los microorganismos en condiciones de vida
normal suspensos en un lquido. Las preparaciones hmedas se hacen vertiendo una
gota del lquido que contienen los organismos en una lmina portaobjetos y se cubre con
un cubreobjetos. La preparacin debe bordearse con parafina una sustancia similar y
sellar as el espacio entre el portaobjetos y el cobre objetos.
En las preparaciones de gota pendiente se coloca una gota de la suspensin bacteriana
en el centro de un portaobjetos excavado. Las preparaciones en gota pendiente son
preferibles en las situaciones siguientes.
1. La morfologa de las bacterias en espiral se altera mucho cuando se disecan o se
tien; deben, por lo tanto, examinarse en estado vivo. Las preparaciones hmedas se

16
examinan al microscopio en campo oscuro que da un contraste muy definido entre el
microorganismo y el campo oscuro.
2. Cuando las bacterias se observan para determinar si son o no mvil es obvio que
tienen que estar suspensas en un medio lquido en el que puedan moverse libremente en
el caso de ser mvil.
3. Para observar los cambios citolgicos que ocurren durante la divisin hay que
observar los microorganismos en estado vivo.
4. Por este mtodo se observan fcilmente algunas inclusiones celulares como vacuolas
y materias grasas.
Cuando se observan preparaciones hmedas en campo luminoso es de suma importancia
gradual debidamente la fuente de la luz. La intensidad de la luz se puede disminuir con
filtros de densidad neutra. La microscopia de campo oscuro y de contraste ofrece
ventajas, para examinar las preparaciones sin teir.
Frotes fijos o teidos: para observar las caractersticas morfolgicas de las bacterias,
las preparaciones fijas y teidas son las que usan con mayor frecuencia. Las ventajas son
que:
a) las clulas son visibles ms claramente despus de teidas.
b) En las preparaciones teidas las diferencias entre clulas de especie se demuestran
mediante soluciones colorantes apropiados (tincin diferencial o selectiva).
Los pasos esenciales en la preparacin de un frote fijo o teido son :
a)

hacer el frote o pelcula.

b)

La fijacin.

c)

La aplicacin de una o ms soluciones colorantes.

Coloracin microbiolgicas : para teir los microorganismos se dispone de un gran

nmero de compuestos orgnicos coloreados (colorantes), estos compuestos son un
tanto complejos en cuanto a su estructura molecular, se pueden clasificar en grupos como
colorantes de trifenil-metano, colorantes de oxacina y colorante de tiacina.
Una clasificacin ms prctica para el citlogo es de acuerdo con el comportamiento
qumico del colorante, es decir, cido, bsico y neutro. Un colorante cido (o aninico) es
aqul donde la balanza de la carga sobre el ion colorante es negativo ; un colorante
bsico (o catinico) es aquel donde la carga llevada por ion colorante es positiva. Un
colorante neutro es una sal compuesta de un colorante cido y un colorante bsico.

17
En le proceso de la tincin supone una reaccin de intercambio de iones entre el
colorante y los sitios activos de la superficie o del interior de la clula. Los iones teidos
del colorante reemplazan a otros iones en los componentes celulares.
Coloracin simple: la coloracin de las bacterias por la aplicacin de una solucin
colorante simple en preparaciones fijas o teidas se conoce como coloracin simple. El
frote fijo se inunda con la solucin colorante durante un perodo establecido, despus de
lo cual el colorante se arrastra con agua y la lmina se seca con papel secante.
Coloracin diferencial: los procedimientos de coloracin que ponen de manifiesto
diferencias entre las clulas bacterianas se conocen como tcnica de coloracin
diferencial.
Coloracin de gram: esta tcnica diferencial es una de las de uso ms comn en
microbiologa. En este procedimiento, el frote bacteriano teido se somete a las
soluciones siguientes:
a)

Cristal violeta

b)

Solucin de yodo, alcohol.

c)

Y safranina otra solucin colorante de contraste conveniente.

Las bacterias sometidas al mtodo de gram pertenecen a dos grupo:bacterias gram

positivas que retienen el cristal violeta y a parecen color violeta profundo; las bacterias
gram negativas que pierden el cristal violeta y por el contraste de la safranina aparecen
rojas.(tabla 4.2 coloracin de gram)
Soluciones

aplicadas Gram positivas

Gram negativas

por su orden
Cristal violeta

Las bacterias se tien en Las bacterias se tien en

Solucin yodo yodurada

violeta
violeta
Complejo CV-1 se forma Complejo CV-i se forma
dentro de las bacterias, dentro de las bacterias,
las bacterias permanecen las bacterias permanecen

Alcohol

violeta.
violeta.
Las paredes celulares de Extraccin de lpidos de
deshidratan,

hay las

paredes

retraccin de los poros, la aumento

de

celulares,
porosidad,

permeabilidad disminuye, CV-I sale de la bacteria.

18
el CV-i no puede salir y
Safranina

queda violeta.
Las
bacterias
afectadas

no Las bacterias toman este

permanecen colorante y se tien de

violeta.

rojo.

Las bacterias gramnegativas contienen un porcentaje ms alto de lpidos que las

bacterias grampositivas. Las paredes celulares de las bacterias gramnegativas son
tambin ms delgadas que las de las grampositivas.
Las bacterias grampositivas difieren de las gramnegativas en otras caractersticas aparte
de la tincin. Las grampositivas son, por lo general, ms susceptibles a la penicilina y
menos a la desintegracin por mtodos mecnicos o exposicin a algunas enzima que las
gramnegativas. Las bacterias gramnegativas constituyen un grupo ms susceptible a
otros antibiticos.
Mtodo de tincin de cidorresistencia: otro procedimiento de coloracin diferencial es
la tincin para acidorresistencia. La preparacin bacteriana fijada se somete a las
soluciones siguiente:
1. Fushina fenicada (calentada).
2. cido alcohol.
3. Azul de metileno.
Las bacterias teidas por este mtodo se clasifican como acidorresistentes si retiene la
fushina fenicada y aparecen rojas.
Mtodo de giemsa: este mtodo tiene utilidad sobre todo para poner de manifiesto las
ricketsias localizadas dentro de la clula huspedes. Estos organismos adquieren una
coloracin diferencial y se ven dentro del citoplasma de la clula husped. La coloracin
de giemsa se emplea tambin para teir frotes de sangre en el examen para protozoos.
Coloracin para descubrir estructuras celulares: para observar estructuras dentro o en
el exterior de la pared celular bacteriana se dispone de mtodos especiales de tincin. El
principio en que se basa estos mtodos de coloracin diferencial es en gran medida el
mismo que el de las tinciones de gram y de Ziehl-Neelsen; se trata de manifestar un
grado de afinidad para el colorante diferente al resto de la clula.

19
Tincin negativa: Una tcnica por el cual las clulas sin teir se hacen visibles en una
pelcula oscura es la llamada tincin negativa. En la practica, la suspencin bacteriana
se mezcla con una tinta china o con nigrisina y despus se extiende como una pelcula
delgada a lo largo de una lmina portaobjetos y se deja secar.
2.4.3.

Preservacin de medios para la observacin

Mtodos de preservacin: a fin de desarrollar condiciones propias para la preservacin

se ha realizado un considerable nmero de investigaciones. No todas las especies
responden de manera similar a los procesos y condiciones especficas, lo que significa
que lo que se ha aprendido para un cultivo puede ser aplicable para otro. El mtodo de
preservacin y mantenimiento conserve las caractersticas de las especies como fueron
en el momento de la preservacin.
Resiembra peridica a medio frescos: los cultivos de bacterias se pueden mantener en
tubos medio en los que han sido cultivados mediante pasos peridicos a medios frescos.
Los intervalos en que se hace la resiembra varan con el tipo de microorganismos.
Preservacin de cultivos con una capa de aceite mineral: muchas bacterias se
preservan bien cubriendo el agar en que estn creciendo con aceite mineral Estel. Par
cultivos con agar inclinado el aceite deber cubrir ms o menos 1.5 cm del pico del agar
inclinado. El mantenimiento de la viabilidad bajo este tratamiento varan segn la especie
de bacteria pero generalmente es cuestin de aos; algunas especies se han conservado
bien durante 15 o 20 aos. Este mtodo tiene la ventaja particular de que se puede tomar
algo del desarrollo bacteriano que est abajo del aceite con un asa de siembra.
Preservacin de cultivos por secado rpido en congelacin (liofilizacin): la
liofilizacin es el procedimiento ms eficaz para la preservacin de cultivos. En este
procedimiento las clulas se secan rpidamente, mientras son congeladas, mediante las
siguiente etapas:
1. La suspensin de clulas se pone en pequeos frascos que se sumergen en una
mezcla de hielo seco y alcohol.
2. Los frascos se conectan inmediatamente a una lnea de alto vaco.
3. Una vez que se termino el secado cada caja se sella bajo condiciones de vaco.
2.5.

Caractersticas para la identificacin

20
2.5.1. Morfolgicas
PRINCIPALES CARACTERISTICAS DE LOS MICROORGANISMOS
Para proceder a identificar y clasificar a un microorganismo, deben
determinarse, con cierto grado de presin, las caractersticas del mismo. Entre ellas, las
principales son las siguientes:
1. caractersticas de cultivos: las sustancias nutritivas necesarias para el desarrollo
y las condiciones fsicas de un medio que lo favorezca.
2. Caractersticas morfolgicas: el tamao de las clulas, su forma de agrupacin,
diferenciacin en tintura e identificacin de estructuras.
3. Caractersticas metablicas: la bioqumica es la manera por la cual los
microorganismos llevan acabo los procesos qumico biolgicos.
4. Caractersticas de la composicin qumica: la identificacin de las principales
caractersticas de los componentes qumicos de la clula.
5. Caractersticas antigenicas: la deteccin de componentes celulares especiales
(qumicos) que dan pruebas de similitud entre las especies.
6. Caractersticas

genticas:

el

anlisis

de

la

composicin

del

cido

desoxirribonucleico (DNA) as como la determinacin de la reaccin que ocurre

entre material DNA a partir de diferentes microorganismos.
Caractersticas morfolgicas de los filamentos
Observando a gran aumento tenemos que buscar las caractersticas morfolgicas que
distinguen a los diferentes filamentos tales como:

Ramificaciones: verdadera o falsa

Movilidad: si o no
Forma del filamento: recto, ligeramente curvado, torcido, cadena irregular de
clulas, irregularmente enrollados, miceliar.
Color del filamento: transparente, medio, oscuro
Situacin del filamento: en el interior del flculo, saliendo hacia el licor exterior, libre
en el licor
Crecimiento epiftico: no, si (cuantificar si mucho o poco)
Vaina: si, no
Septos celulares: si, no
Indentaciones: si, no
Dimensiones del filamento
Forma de las clulas: cuadradas, rectangulares, ovales, tonel, discoide, extremos
redondeados, esfricas, no observables
Dimensiones de las clulas
Granulos de azufre: in situ y tras la prueba del azufre
Presencia de rosetas, gonidios, etc

Para ayudar en la identificacin morfolgica de los filamentos se realizan una serie de

tinciones tales como:

21

Tincin de Gram: positiva, negativa, variable

Tincin de Neisser: para el filamento positiva o negativa, y en ese caso puede
haber grnulos positivos
Tincin de PHB
Tincin de vainas
DETERMINACION DEL TAMAO DE UN MICROORGANISMO
(caracterstica morfolgica)

A pesar del desarrollo de tcnicas moleculares de identificacin de microorganismos, en

taxonoma es fundamental determinar el tamao de stos, ya que en la descripcin de un
microorganismo debe indicarse su tamao y/o el de sus estructuras.
Para llevar a cabo mediciones microscpicas se debe proceder a calibrar el microscopio
ptico respectivo mediante el uso de un micrmetro objetivo y un micrmetro ocular.
El micrmetro objetivo es un portaobjeto que generalmente tiene una escala grabada de 2
mm de largo, dividida en 200 partes, de manera que cada divisin corresponde a 0,01 mm
o 10 m. Esta escala permite valorar la escala del micrmetro ocular para cada objetivo
del microscopio.
El micrmetro ocular se caracteriza por ser un disco de vidrio que posee una escala
arbitraria dividida en partes iguales. El valor de cada una de estas divisiones se calcula
con el micrmetro objetivo.
Para conocer el valor de cada divisin del micrmetro ocular, con los diferentes objetivos
del microscopio, se hacen coincidir exactamente las dos escalas de modo que queden
paralelas. Se cuenta el nmero de divisiones del micrmetro objetivo que corresponde a
cierto nmero de divisiones del micrmetro ocular.
Ejemplo: 10 divisiones del micrmetro objetivo corresponden a 20 divisiones del
micrmetro ocular, y si cada divisin del micrmetro objetivo es igual a 10 m, tenemos
que:
1 divisin del m. ocular = 100/20= 5 m
Las coincidencias de las divisiones pueden realizarse por superposicin, pero ello no es
conveniente cuando se trata de un objetivo de gran aumento. Conviene en este caso,
hacerlo en la parte lateral.
Si sustituimos el micrmetro objetivo por una preparacin en que se encuentra el
microorganismo o estructura de ste y si ste ocupa 4 divisiones del micrmetro ocular, su
tamao ser de 20 m (ejemplo anterior).
Es importante sealar que en un microscopio se debe determinar el valor del micrmetro
ocular para cada objetivo de ste. Esta operacin se realiza una sola vez, de esta forma al
realizar una medicin, slo se requiere colocar el micrmetro ocular, verificar el nmero de
divisiones que ocupa el objeto y multiplicar luego por el valor previamente determinado.
2.5.2. BIOQUMICAS

22
CARACTERISTICAS BIOQUIMICAS DE LAS BACTERIAS
Adems de las caractersticas morfolgicas, tintoriales, cultivo y otras, las
caractersticas bioqumicas son importantes y a veces esenciales en la identificacin y
descripcin de una bacteria.
A continuacin se describen algunas pruebas para determinar caractersticas
bioqumicas de algunas bacterias.
1. Citocromo oxidasa. Existen especies bacterianas que poseen el "citocromo C" dentro
de la cadena respiratoria. La presencia o ausencia de este citocromo en bacterias es una
caracterstica fisiolgica muy utilizada en taxonoma. Esta prueba se denomina
corrientemente como oxidasa y consiste en tomar con la punta de un asa una pequea
cantidad de cultivo bacteriano de 24-48 horas de edad y transferirlo a un trozo de papel
filtro previamente embebido en n,n-dimetil p-fenilendiamina, sta es rpidamente
transformada a un producto oxidado de color prpura dentro de 30 segundos en presencia
de citocromo oxidasa. Se debe tener la precaucin de no utilizar un asa con su punta
oxidada para evitar as una reaccin falsa.
Esta prueba se puede utilizar para diferenciar bacterias del gnero Pseudomonas, donde
generalmente las fitopatgenas son negativas (Ej. P. syringae pv. syringae) mientras que
las saprfitas son positivas al test de la citocromo oxidasa (Ej. Pseudomonas fluorescens).
2. Catalasa. La determinacin de la actividad cataltica debido a la presencia de catalasa,
se determina sumergiendo la punta de un asa una pequea cantidad de cultivo bacteriano
de 24-48 horas de edad en perxido de hidrgeno (H 2O2) al 3%. La liberacin de O2 indica
la presencia de catalasa.
H2O2 + catalasa = H2O + O2
Como ejemplo de una bacteria catalasa positiva se puede sealar Staphylococcus
epidermidis y de una negativa a Streptococcus lactis.
3. IMVIC. Las bacterias pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae, pueden
identificarse a travs de una serie de pruebas bioqumicas, que permiten determinar la
presencia o ausencia de ciertas enzimas y a veces incluso permiten determinar la

23
existencia de una secuencia metablica. Con este fin se han desarrollado diversos
esquemas de clasificacin, uno de los ms conocidos y utilizados corresponde al IMVIC
que se desarroll para clasificar especies de la familia antes mencionada y
correspondientes al grupo de bacterias coliformes (bacterias aerbicas o anaerbicas
facultativas, Gram(-), bacilares, no esporgenas que producen cido y gas durante la
fermentacin de la lactosa). Consiste en las siguientes pruebas:
a) Indol (I). consiste en cultivar la especie en estudio en un caldo rico en triptofano;
despus de 24-48 horas de crecimiento se determina la presencia de indol con reactivos
especficos como P-dimetil-aminobenzaldehido (reactivo de Kovack) el que adquiere un
color rojo en presencia de indol.
b) Rojo de metilo (M). El rojo de metilo es un indicador de pH. Acta entre pH 4,2 y 6,3
variando desde rojo (pH 4,2) a amarillo (pH 6,3). Por lo tanto, permite determinar la
formacin de cidos que se producen durante la fermentacin de un carbohidrato. El rojo
de metilo se prepara con 0,1 g de este reactivo en 300 ml de alcohol etlico y se diluye en
500 ml de agua.
c) Voges-Proskauer (VI). Permite determinar la formacin de acetil metil carbinol, el que
es un producto intermediario de la fermentacin que conduce a la formacin de 2,3
butanodiol y que caracteriza a ciertas especies de las Enterobacteriaceae.
d) Agar-citrato (C). Determina si el organismo bacteriano en cuestin se desarrolla o no
en un medio mineral que contiene citrato como nica fuente de carbono.
Cuadro 3. Medios de cultivo, reactivos y caractersticas de las reacciones del IMVIC.
Pruebas
Indol

Medio de cultivo
Caldo 523

Reactivos a usar
Reaccin positiva
1
ml
reactivo Color rojo
Kovack* al medio

Rojo de Metilo

Caldo peptonado

cultivo
5 ml cultivo

Color rojo

5 gotas rojo de
Voges- Proskauer

Agar- citrato

Caldo peptonado

Agar-citrato

metilo
1 ml cultivo

Color rojo

0,6 ml naftol 5%

luego de 5-10 min

0,2 ml KOH 40%

Ninguno

Desarrollo

24
(tubos)

acompaado

de

cambio de color
* 75 ml n-alcohol amlico, 25 ml cido clorhdrido concentrado y 5 g p-dimetil
aminobenzaldehido.
Las especies tipo del grupo coliforme son Escherichia coli y Enterobacter
aerogenes. E. coli es un habitante normal del intestino del hombre y animales; en cambio
E. aerogenes se presenta con mayor frecuencia en los vegetales y sus semillas, por ello
no indica obligadamente contaminacin fecal, pero s sospechas, ya que tambin se
encuentra en las heces del hombre y animales. Ambas especies tienen caractersticas
morfolgicas y de cultivo muy semejantes, por ello es necesario recurrir a las pruebas
bioqumicas antes mencionadas para su identificacin (IMVIC).
Cuadro 4. Test de IMVIC para diferenciar entre Escherichia coli y Enterobacter
aerogenes.
Bacteria
Escherichia coli
Enterobacter

I
+
-

M
+
-

VI
+

C
+

aerogenes

Antes de realizar el IMVIC y con el objeto de determinar la presencia de bacterias

coliformes en una muestra de agua por ejemplo; se procede a investigar la fermentacin
de la lactosa con produccin de gas. Para lo cual se inocula con la muestra de agua un
tubo con caldo lactosado y se incuba a 37C por 24-48 horas. Si no se produce gas el
resultado es negativo y por ende no existira contaminacin fecal; si se produce gas
podra tratarse de contaminacin fecal. Si el resultado es positivo se procede a confirmar
la presencia de bacterias coliformes; para ello se siembra a partir del tubo con caldo
lactosado positivo, en un medio diferencial o indicador. El medio ms utilizado para
reconocer las colonias de E. coli es el agar-eosina-azul de metileno (EAM), que contiene
peptona, lactosa y los colorantes eosina y azul de metileno.
En dicho medio se inhibe el crecimiento de otras bacterias, pero no el de las
coliformes (stas desarrollan colonias tpicas). E. coli: colonias grandes, oscuras, negroazuladas, centro casi negro, con brillo metlico verdoso causado por la luz reflejada.

25
Enterobacter: colonias grandes, rosado plido, mucosas, centro oscuro sin brillo
metlico.
La presencia de estas bacterias confirman la existencia de bacterias coliformes en la
muestra y la prueba definitiva se obtiene con el IMVIC.
4. Hidrlisis de la gelatina
Para determinar si un microorganismo causa proteolisis de la gelatina, se inocula
un tubo de gelatina nutritiva con el microorganismo en cuestin. El cultivo se incuba a la
temperatura deseada por el tiempo necesario y despus se deposita por 10 minutos en un
bao con agua fra. Si la gelatina permanece lquida despus de este paso, significa que
ha sido hidrolizada (Fig. 24).
La gelatina nutritiva se prepara con: 10 g de peptona, 5 g de extracto de carne y 120 g de
gelatina en 1 litro de agua destilada. Se distribuye en tubos y se esteriliza en autoclave
por 20 minutos. Los tubos se enfran y se mantienen a 20C por 2 das para verificar su
esterilidad.
Un ejemplo positivo de bacteria que lica la gelatina es Proteus vulgaris, mientras que uno
negativo es E. coli.
5. Fermentacin de carbohidratos
Una amplia gama de carbohidratos es fermentada por las bacterias y esta
fermentacin es caracterstica de ciertas especies, gneros u otros grupos taxonmicos.
Por ello la fermentacin de un carbohidrato por un microorganismo en particular ayuda a
su identificacin.
La fermentacin se puede determinar por inoculacin de un microorganismos en un tubo
con caldo nutritivo ms el carbohidrato y un tubo Durham (Fig. 28).
El medio de cultivo caldo dextrosa rojo de fenol (pH 7,4), se prepara con los
siguientes reactivos: tripticasa 10 g, NaCl 5 g, glucosa 0,5 g, rojo de fenol 0,018 g, H2O
destilada 1 litro. Con esta frmula se pueden utilizar otros carbohidratos que reemplacen a
la glucosa, ejemplo: lactosa o maltosa (al 0,5%).
Debido a que los productos usuales de la fermentacin de carbohidratos son: cido, o
cido y gas; el indicador revelar la produccin de cido y el tubo invertido atrapar el gas
producido. En este caso, el indicador es el rojo de fenol (pH 6,8-8,4) que toma el color
amarillo cuando es cido.

26
Los tubos inoculados se incuban a 35C por 48 horas.
6. Fluorescencia
La produccin de un pigmento fluorescente que difunde al medio de cultivo, es
caracterstico de muchas especies del gnero Pseudomonas (P. fluorescens, P. syringae),
el cual lo forman dependiendo de la composicin del medio de cultivo en el cual crecen.
Un ejemplo de una bacteria que no produce este pigmento es Escherichia coli.
El medio ms adecuado para realizar esta prueba es el medio B de King (20 g de
proteasa peptona, 1,5 g de K 2HPO4; 1,5 g de MgSO 4 x 7 H2O; 10 ml de glicerol, 15 g de
agar y 1 litro de H2O destilada; pH 7,2).
Despus de sembrar, las placas de Petri se incuban por 1-5 das a una temperatura de
20-25C, luego se examinan en una pieza oscura bajo una lmpara ultravioleta. Si se
observa fluorescencia verde-azulada la reaccin es positiva.
7. Actividad pectoltica
Ciertas bacterias fitopatgenas como algunas pertene-cientes al gnero Erwinia (E.
carotovora subsp. carotovora y E. c. subsp. atroseptica) poseen actividad pectoltica
produciendo pudriciones hmedas en los tejidos que atacan.
La prueba de actividad pectoltica se realiza con tubrculos de papas sanos y bien
lavados; stos se desinfectan pasndolos por algunos segundos en alcohol y luego a
travs de la llama del mechero. Con un bistur previamente flameado, se cortan rodajas
de 7-8 mm de grosor y se depositan en una placa de Petri estril tapizada con papel
absorbente; a continuacin con un sacabocados o un bistur, se hace una herida de 3-4
mm de profundidad en el centro de la rodaja. Luego se deposita la bacteria sobre esta
herida (con la punta de un asa o una suspensin con pipeta Pasteur). A continuacin se
humedece el papel absorbente con agua destilada estril.
Es muy importante dejar un testigo sin inocular, para verificarel efecto de la flora
endgena normal del tubrculo. Este testigo debera permanecer sin pudricin por lo
menos dentro de las 24-48 horas siguientes, a no ser que la flora endgena sea muy
significativa.
La reaccin positiva se manifiesta por una pudricin dentro de las 24 horas
despus de la inoculacin e incubacin y se debe a la presencia de enzimas pectolticas
presentes en la bacteria.
8. Reduccin del azul de metileno

27
Este test se utiliza para determinar la calidad de la leche a travs de la actividad
reductora de las bacterias. Mientras mayor sea el nmero de bacterias presentes en la
leche, mayor ser el consumo de oxgeno por respiracin y consecuentemente mayor la
decoloracin del azul de metileno.
Sobre la base del tiempo de decoloracin, la leche puede clasificarse en:
a) Excelente : no decolorada en 8 horas.
b) Buena : decolorada en menos de 8 horas pero en ms de 6.
c) Regular : decolorada en menos de 6 horas pero en ms de 2.
d) Pobre : decolorada en menos de 2 horas.
La prueba se realiza colocando 1 ml de una solucin de azul de metileno (5 mg de
azul de metileno (DAB) por ml de H2O destilada estril; la solucin debe prepararse el
mismo da y protegerse de la luz) en un tubo de ensayo con 10 ml de la leche problema.
Se mezcla bien e inmediatamente se incuba a 37C protegida de la luz. Si no se dispone
de bao Mara, los tubos deben precalentarse en agua a 37C.
En la lectura de los resultados no debe tomarse en cuenta el tercio superior del tubo ya
que el azul de metileno reducido, vuelve a colorearse de azul (se reoxida) por la accin
del oxgeno atmosfrico.
9. Reduccin de nitratos y desnitrificacin Este mtodo es cuantitativo para determinar
nitritos y consiste en inocular un caldo de cultivo suplementado con 0,1% de KNO3 y
0,17% de agar (para darle una consistencia semi-slida y promover condiciones semianaerbicas).
Para la inoculacin, se mezcla suavemente el inculo con el medio de cultivo y stos
deben examinarse peridicamente durante el perodo de incubacin con el fin de detectar
la formacin de burbujas, las cuales evidencian en forma presuntiva desnitrificacin. Los
cultivos controles sin nitrato no deben presentar burbujas de gas y no deberan dar un
resultado positivo al test de nitritos.
Para detectar la capacidad de reducir el nitrato a nitrito, se debe sacar 0,1 ml de
cultivos de diferentes tiempos de incubacin y agregar 2 ml de los siguientes reactivos:
Solucin A

28
N-(1-naftil)-etilendiamino dihidroclorado (cuidado con su manejo ya que es cancergeno)
0,02 g
Solucin de HCl 1,5 N 100,00 ml
Disolver por calor suave bajo una campana.
Solucin B
Acido sulfanlico 1,0 g
Solucin de HCl 1,5 N 100,0 ml
Disolver suavemente por calor.
Se mezclan volmenes iguales de las soluciones A y B en el mismo momento de
realizar el test.
Posteriormente, se debe agregar agua hasta obtener un volumen final de 4 ml y
dejar por 15 minutos para que se desarrolle el color.
Se puede estimar la intensidad del color rojo prpura visualmente basado en una escala
de 0-5 (sta tambin puede determinarse mediante espectrofotmetro a 540 nm). La
acumulacin de nitrito con el aumento de la edad del cultivo indica la reduccin de nitrato
a nitrito, mientras que una formacin inicial de nitrito seguida por una disminucin en su
nivel, indica que la bacteria posee una capacidad de produccin de nitritos a largo plazo.
Si es que no se desarrolla el color rojo, se recomienda agregar 5 mg/ml de polvo de zinc a
la mezcla. Si el nitrato en el medio no se ha reducido, el zinc lo reducir qumicamente y
aparecer un color rojo. Si el color rojo no aparece, el microorganismo ha reducido todo el
nitrato y probablemente ha ocurrido desnitrificacin. En este caso si es que se hubiera
realizado un examen del cultivo ms temprano en el tiempo, ste habra dado una
reaccin positiva para nitritos.
Es necesario recordar que el polvo de zinc puede inactivarse despus de un
perodo largo de almacenamiento; por lo tanto, su capacidad de reducir nitrato a nitrito
debe revisarse peridicamente en un medio inoculado.
Algunos ejemplos de bacterias que se pueden utilizar en este test son:
Pseudomonas aeruginosa (desnitrificacin) y Escherichia coli (nitrato a nitrito negativo).

2.5.3. ANTIGNICAS
APROXIMACIN PROTEMICA PARA LA IDENTIFICACIN DE ANTGENOS DE
MICROORGANISMOS PATGENOS
La electroforesis bidimensional de alta resolucin combinada con westernblotting con sueroslksnlnkldfe de enfermos es una herramienta muy til para la
deteccin de antgenos de Candida albicans que inducen la formacin de anticuerpos en

29
pacientes con candidiasis sistmica. Esta estrategia se puede aplicar a otras especies
patgenas.

Fig. 1: Microfotografa electrnica de levaduras e hifas de Candida albicans.

Mediante electroforesis bidimensional es posible separar mezclas complejas de
protenas, segn su carga y su peso molecular. Dichas protenas se pueden enfrentar a
sueros de enfermos con candidiasis sistmica para detectar los antgenos
inmunodominantes. La identificacin de los antgenos se puede realizar por diferentes
tcnicas: inmunoblot con anticuerpos especficos, secuenciacin amino terminal y
espectrometra de masas. Mediante este ltimo procedimiento se puede obtener la huella
peptdica de la protena (MALDI-TOF) y buscarla en las bases de datos. Si la protena
no se identifica de esta forma o no se encuentra en las bases de datos hay que proceder
a la fragmentacin de pptidos para obtener secuencias internas de la protena a
identificar (nanospray-MS/MS).

Fig. 2: Estrategia para la identificacin de antgenos por espectrometra de masas.

Las principales ventajas que se desprenden de la estrategia descrita para la identificacin
de antgenos de Candida albicans son:
Utilizacin de alguno/s de los antgenos inmunodominantes para el desarrollo de
un mtodo de diagnstico para las candidiasis sistmicas, rpido y especfico.

30

Los tests imnunolgicos que existen en la actualidad para el diagnstico de estas

infecciones presentan una baja especificidad y/o sensibilidad, y adems fallan en la
discriminacin entre colonizacin e infeccin por este microorganismo.
Posibilidad de desarrollar vacunas mediante el empleo de antgenos protectores.
Monitorizacin de la evolucin de la infeccin en los pacientes con candidiasis
sistmica, en funcin de las diferencias de expresin antignica que muestren.
Posibilidad de identificacin de nuevas dianas para el desarrollo de antifngicos
eficaces frente a este hongo oportunista.

2.5.4. Moleculares
Mtodos moleculares en microbiologa aplicada
Estudio de los fundamentos bsicos de los mtodos basados en tecnologa de DNA
recombinante, Biologa Molecular y Tecnologa Genmica y sus posibles aplicaciones al
diagnstico de infecciones microbianas, a la deteccin de contaminantes microbianos en
alimentos, a estudios epidemiolgicos y de evolucin microbiana, y a la resolucin de
problemas relacionados con la explotacin industrial de microorganismos.
1.A. Anlisis del polimorfismo de ADN
1.B. Secuenciacin
1.C. Reaccin en cadena de la Polimerasa (PCR)
1. Mtodos moleculares
1.A. Anlisis del polimorfismo de AD
1. Enzimas de restriccin Describe las endonucleasas de restriccin y cmo actan
cortando el ADN.
2. Diagnstico de laboratorio en medicina legal Tpico caso de medicina legal o
forense, en la que se han encontrado clulas sobre la victima que permite identificar al
sospechoso.
3. Diagnstico de laboratorio de una enfermedad gentica Se trata de diagnosticar en
4 pacientes (Pt1, Pt2, Pt3 y Pt4) la existencia o no de anemia falciforme mediante la
presencia o ausencia en su ADN del gen codificador de la hemoglobina S comparandolo
con el ADN de anemia falciforme (SS) (hemoglobina S) y el ADN de hemoglobina normal
(WW)
4. Investigacin epidemiolgica buscando poder comprobar el origen comn o la
relacin de unas cepas de bacterias Tpico caso de investigacin epidemiolgica
buscando poder comprobar el origen comn o la relacin de unas cepas de bacterias
5. Identificacin gentica de especies de pescado
1.B. Secuenciacin
6. Identificacin de microorganismos de muestras ambientales Microorganismos
aislados del suelo en los que se quiere determinar el gnero al que pertenecen. Se parte
del ADN ribosmico 16S para obtener la secuencia y la identificacin.
7. Identificacin de microorganismos de muestras agua Similar al anterior pero con
dos bacterias desconocidas diferentes .
8.Identificacin mediante secuenciacin del ADN y consulta a bases de datos de
secuencias Se trata de secuenciar un fragmento de ADN, mediante secuenciacin
automtica e ir a consultar a las Bases de Datos de genes a qu microorganismo
corresponde.

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1.C. Reaccin en cadena de la Polimerasa (PCR)
9.Identificacin de las subespecies de Clavibacter michiganensis mediante PCR
Identificacin de las subespecies de Clavibacter michiganensis mediante PCR, utilizando
diversos "primers" y comprobacin mediante electroforesis de agarosa del tamao
molecular del segmento amplificado.
10. Diagnstico de laboratorio de una infeccin por Mycobacterium tuberculosis
Tpico caso de diagnstico mediante el laboratorio de una infeccin. En este caso, de una
infeccin por Mycobacterium tuberculosis, detectando un fragmento del ADN de dicha
bacteria, utilizando dos "primers" y comprobacin mediante electroforesis en agarosa del
tamao molecular del segmento amplificado.
11. Deteccin en aguas de bebida de patgenos: Cryptosporidium parvum Utilizacin
de la tcnica de PCR para la deteccin en aguas de bebida del patgeno emergente
Cryptosporidium parvum, responsable del 30% de los brotes de gastroenteritis producidos
en la actualidad en los paises desarrollados.
12.Deteccin de virus entricos en muestras de agua Utilizacin de la tcnica de PCR
para la deteccin en aguas de bebida de virus entricos.
13.Deteccin de virus norwalk en muestras de agua Utilizacin de la tcnica de PCR
para la deteccin en aguas de bebida de virus Norwalk.
14. Screening y confirmacin de vegetales genticamente modificados mediante
PCR Utilizacin de la tcnica de PCR para la deteccin genes que indican que ese
alimento vegetal ha sido modificado genticamente
Mtodos moleculares para la deteccin de bacterias productoras de aminas
bigenas.
A partir de bacterias productoras de aminas bigenas se han caracterizado
molecularmente genes que codifican las protenas responsables de la sntesis de
histamina, tiramina y putrescina (histidina-, tirosina- y ornitina-descarboxilasas,
respectivamente). La identificacin de estos genes ha permitido el diseo de
oligonucletidos para la deteccin de bacterias productoras de aminas bigenas mediante
PCR (patente de invencin n 200402314). El desarrollo de estos mtodos es
especialmente til para la seleccin de cultivos iniciadores apropiados en la industria
alimentaria.