Zumaya Álvarez Diana Laura 4PM1 26/06/23

CRISPR Correction of Duchenne Muscular Dystrophy

Introducción
Las distrofias musculares son un grupo de desórdenes progresivos no
inflamatorios que afectan a las fibras musculares.

Gracias a nuevas técnicas de biología molecular se ha descrito que la

base genética de la distrofia muscular es un defecto en la codificación
de la distrofina, una proteína del músculo esquelético.

Clínicamente, lo anterior se manifiesta como debilidad y

pseudohipertrofia que aparece en dirección proximo-distal. La
disminución de la fuerza con el tiempo afecta a la deambulación del
paciente y, eventualmente, a la función cardiopulmonar. Así mismo,
con el tiempo aparecen contracturas estructurales de los tejidos
blandos y deformidades de la columna vertebral por la mala postura.
El pie equino varo empieza como una deformidad dinámica flexible
que con el tiempo se vuelve rígida y también impide la deambulación
normal y uso adecuado de traslado.

Cuando el paciente es inmovilizado en silla de ruedas, tiende a desarrollar peores contracturas, osteopenia y escoliosis rápidamente
progresiva. Esta afectación en la densidad ósea puede dar lugar a fracturas de los huesos largos o vértebras.

Fisiopatología

La distrofina y otras glicoproteínas asociadas son importantes

para la estabilidad del sarcolema. El gen de la distrofina se
encuentra en el brazo corto del cromosoma X cerca del locus
p21. Aunque esta proteína solo se forma parte de 0.002% de
las proteínas del músculo estríado, la falta de la misma lleva a
inestabilidad de los enlaces en la matriz extracelular, con
filtración progresiva de componentes del líquido extracelular;
esto lleva a altos niveles de CPK.

Características y metodología del estudio

El estudio surge desde la premisa de que en fechas recientes se ha planteado el uso de la edición genética para remover
permanentemente las mutaciones que ocasionan la distrofia muscular. El artículo revisa el progreso reciente en esta rama, la cual
en un principio se propone como una muy buena opción para evitar todas aquellas limitaciones que con el tiempo aparecen.

Se hace mención de CRISPR, un sistema de inmunidad bacteriana en el que los segmentos de ADN viral se incorporan dentro del
genoma y posteriormente transcriben RNA que puede coopersr con la endonucleasa Cas9 para reconocer futuros patógenos
virales y mediar su destrucción. Este complejo sistema se ha adaptado para que pueda ser una herramienta con la cual editar el
genoma del organismo.
 CRISPR tiene dos componentes: Una sola guía RNA y una endonucleasa Cas9 que se obtiene de S. pyogenes y que corta ADN
adyacente a NAG o NGG.

La edición génica puede ocurrir en cualquiera de las tres vías
dependiendo del estado proliferativo de la célula, la presencia o
ausencia de una plantilla de DNA exógeno y la presencia de
homólogos. Por lo tanto, CRISPR actuará de diferente manera
dependiendo de cada característica de la célula por separado.
Diferentes características de la enfermedad de Duchenne
pueden usarse como blanco terapéutico cuando hablamos de
edición génica. Hoy en día se conocen muchas de las
mutaciones responsables de la falta parcial o total de la
distrofina, por lo que puede ser posible en el futuro eliminarlas
mediante esta técnica.

Edición de las mutaciones de la distrofina en células madre derivadas de pacientes con disrofia muscular
El descubrimiento de las células madre inducidas ha transformado la percepción sobre la enfermedad, ya que provee una plataforma
para la experimentación con nuevas terapias y estrategias en modelos humanos. Diferentes tipos de células como las mononucleares
de sangre periférica pueden reprogramarse para formar células madre y sus derivados. Usar esta clase de modelos tiene como
ventaja la capacidad pluripotente indefinida que, en comparación con otros modelos (principalmente animales), no existe.

Los pasos que explican cómo se realiza la edición genética utilizando el sistema CRISPR son los siguientes:

Identificación del objetivo Corte del ADN

Se selecciona la secuencia de ADN Una vez que el complejo Cas9-sgRNA
que se desea editar se une al objetivo y reconoce el PAM,
la enzima Cas9 cota el ADN en una
ubicación específica

Diseño de sgRNA
Se diseña una molécula de RNA guía Reparación del ADN
simple que es complementaria a la Después del corte de ADN, se inicia un proceso
secuencia objetivo en el genoma de reparación. El tipo de reparación depende
de las circunstancias celulares

L S

A) Reparación dirigida por homología B) Unión de extremos no homólogos

Si se proporciona en ADN exógeno como
Asociación de Cas9 con sgRNA
plantilla de reparación y la célula está en estado
La enzima Cas9 se asocia con la
de proliferación, la vía HDR se activa. La región
molécula de sgRNA y forma un
objetivo se reemplaza por el ADN exógeno
complejo Cas9-sgRNA
según la secuencia de la plantilla.
En ausencia de una plantilla exógena de
ADN, la vía NHEJ repara el corte de ADN de
manera imprecisa, lo que puede resultar en
inserciones o deleciones. Esta reparación
imprecisa puede ser útil para introducir
cambios específicos en el ADN

Reconocimiento del objetivo v

El complejo Cas9-sgRNA se une a la Resultado de la edición

secuencia objetivo en el ADN y Dependiendo del tipo de reparación, se
escanea la secuencia para encontrar pueden obtener diferentes resultados en la
un motivo adyacente al protospacer o secuencia de ADN objetivo. La edición génica
PAM. Para la Cas9 de Streptococcus mediante CRISPR puede permitir la corrección
pyogenes el PAM es NAG o NGG de mutaciones.
 Corrección de mutaciones in vivo mediante edición génica con CRISPR/CAS9

Modelos animales de distrofia muscular
Hasta el día de hoy se han utilizado más de 60 modelos
animales, entre ellos de perros y ratones, para conocer más
acerca de los mecanismos fisiopatológicos de la enfermedad y
desarrollar nuevas estrategias terapéuticas. El más usado ha
sido el ratón mdx, el cual posee una mutación en el exón 23
que lleva a la pérdida de la expresión de la disfrofina. Aunque
es una buena representación de lo que llega a ocurrir en
humanos, estos modelos animales no se comparan con los
pacientes afectados por la distrofia muscular, quienes tienen
hasta 75% menos de esperanza de vida.
Estrategias de edición génica mediadas por CRISPR
Se ha comprobado que la edición del genoma con CRISPR corrige
permanentemente mutaciones y restaura la función de la
distrofina en modelos con ratones. Lo anterior sugiere que la
tecnología de CRISPR tiene un potencial enorme para corregir
diferentes mutaciones existentes en la distrofia muscular, y entre
estas encontramos: corrección de deleciones, omisión de exón,
reencuadre de exones, choque de exones, edición de base.

PRÓXIMOS DESAFÍOS
A pesar de todas las posibles ventajas que tiene la edición génica como estrategia terapéutica para la distrofia muscular, no deja
de ser un abordaje experimental en etapas tempranas de desarrollo, por lo que hay mucho desconocimiento y desafíos
potenciales. Quizás el principal objetivo es hacer más eficiente la distribución corporal de todos los componentes de la edición
génica a todos los grupos musculares y al corazón. También queda por ver si la edición génica permite mantener la expresión de
la distrofina a largo plazo. Quizás esto se vea más reflejado en el músculo esquelético, en el cual debemos asumir que no se
podrán rescatar todas las fibras musculares y que seguramente se fusionarán con nuevas células satélite.

También hay muchas consideraciones inmunológicas que debemos tomar en cuenta con respecto a la restauración de la expresión
de la distrofina. Como toda proteína bacteriana, Cas9 puede desencadenar una reacción inmune que, al menos en los estudios
más recientes, no ha sido del todo significativa. La posibilidad de un rechazo inmune a la nueva proteína también está presente.

Referencia:

Min, Y., Bassel-Duby, R., & Olson, E. N. (2019). CRISPR Correction of Duchenne Muscular Dystrophy. Annual Review of
Medicine, 70(1), 239-255. https://doi.org/10.1146/annurev-med-081117-010451