Factor de impacto 37.

205
Estructura crio-EM de ABE8e en un estado unido
a sustrato.
• Representación de la desanimación de
adenosina de ADN guiada por ARN en células.
B) Mecanismo de la desanimación de adenosina de ARNt
catalizada por TadA de E. coli
 Arquitectura de dominio de cuatro generaciones de ABE que
codifican WT TadA, evolucionó TadA7.10 (TadA *, amarillo),o
TadA8e evolucionado (TadA *, rojo) N-terminal unido a SpCas9.
Cinética de desaminación de ADN bicatenario de rotación única de los RNP de ABE dirigidos medidos utilizandods DNA que contiene una sola adenina.

Se representa gráficamente la fracción de dsDNA desaminado en función del tiempo y ajustado a una ecuación exponencial monofásica.

Las tasas de desaminación aparente extraídas de

ABE7.10 (negro),
miniABEmax (naranja)
• Mecanismo de inhibición de desaminación de
adenosina por 8Az que imita la reacción de
desaminación de adenosina intermedio y terminal.
La estructura crio-EM de 3,2 Å de resolución del SpCas9-ABE8e complejo.
Las subunidades están coloreadas como sigue:
SpCas9(gris)
sgRNA (púrpura)
TS (verde azulado)
NTS (azul)
dímero TadA-8e, (Rojo y rosa)
Las distancias directas entre el Cas9 El terminalN
ABE8e es una enzima de recambio múltiple con una amplia
ventana de edición.
• Topología monocatenaria del NTS (diagrama,
azul) acoplado con el Dominio TadA8e
(superficie, rojo).
 Representación esquemática de ABE8e RNPComplejo R-loop que actúa sobre el
sustrato trans-ssDNA o trans-dsDNA radiomarcado que contiene una sola adenina.
(Derecha) Un gel representativo que muestra ABE8e RNP en Desaminación de
recambio único en estado de bucle R de ssDNA y dsDNA radio marcadosa lo largo del
tiempo (min) en trans.
 Cinética de rotación única de ABE8e RNP medida usando dsDNA (desaminación en cis) o ssDNA
(desaminación en trans) que contiene una sola adenina. La fracción de ADN desaminado.

Representada como una función del tiempo y ajustada a una sola ecuación exponencial.

Ensayo de desaminación de ADN en condiciones de recambio múltiple utilizando ABE8e RNP y

sustrato de ssDNA (trans) o dsDNA (cis). Número de rotación (una proporción de la
concentración de ADN desaminado y la concentración total de ABE8e) se trazó en función del
tiempo.
Gel que representa la cinética de un solo recambio de ABE0, ABE7.10,
miniABEmax y ABE8e medido usando dsDNA (cis) que contiene múltiples
adeninas.
Los ensayos fueron realizado en tres réplicas independientes y puntos de
tiempo para el ABE0. Los ensayos ABE7.10 y miniABEmax se realizaron a las 0,
1, 3, 8, 24 y 32 horas; para ABE8e, se tomaron a los 0, 1, 5, 10, 20, 60 y 180
min.
Informes rápidos de cinética ABE8e sobre un nuevo paso en el objetivo de SpCas9 vía
de búsqueda. Se muestra un modelo para el mecanismo de búsqueda de destino
SpCas9.
La interacción apo-Cas9-dsDNA es una colisión aleatoria; Cas9 unido a gRNA se prepara para una
búsqueda de destino, que se inicia mediante la interacción aleatoria con el ADN, seguido de la
difusión unidireccional (NTS-3 ′ a 5 ′) Cas9 RNP a lo largo dsDNA (para ~ 27 pb) en busca de PAM
y una rápida disociación del ADN a menos que Se encuentra PAM.

Una vez que Cas9 RNP encuentra PAM, su tiempo de residencia en el ADN aumenta y desenrolla
los primeros nucleótidos adyacentes a PAM para sonda para la complementariedad del ARN
guía. Se inicia Cas9 RNP en los sitios de destino correctos una formación de bucle R a través del
desenrollamiento secuencial
 Gel que representacinética de recambio único de apo-ABE8e que actúa sobre ssDNA (trans) o
dsDNA(trans), de ABE8e RNP programado con ssDNA desaminadora de sgRNA dirigido(trans) o
dsDNA (cis), y de ABE8e RNP programado con sgRNA no dirigidodesaminar ssDNA (trans) o
dsDNA (trans). Los puntos de tiempo se tomaron en 0, 1,10 y 60 min.

Gel que representa la cinética de un solo recambio de apo-ABE8e,RNP dirigido a ABE8e y RNP no
dirigido a ABE8e que actúan sobre dsDNA quecarece de una secuencia PAM. Se tomaron puntos
de tiempo a los 0, 1, 10 y 60 min.Las concentraciones de ABE RNP fueron 1 mM y las
concentraciones de ADN fueron 1 nM.
Mecanismo de especificidad del sustrato ABE8e. (A) Superposición de TadA-8e(rojo) y TadA-WT
(amarillo) que muestran la disposición alterada de la hélice a5.
Superposición de TadA-8e (rojo) y TadA-WT (amarillo) que
muestran la disposición alterada de la hélice a5
Cinética de recambio único de ABE8e y cuatro variantes de ABE8e usando dsDNA(que
contiene una sola adenosina en el NTS).
Sitio activo de TadA-8e que muestra el NTS (palos, azul) entrando en el TadA-8ebolsillo
de unión al sustrato (superficie, rojo) con el residuo desprendido R111 e Y149
mostrado como palos (marrón).

Bolsillo del sitio activo de TadA-8e (superficie, rojo) con evolución los residuos F84 y V106 se
muestran como barras (blancas). El tRNA U de E. coli (33) se muestra en amarillo.
 Cinética de desaminación de ARN de recambio único de los cuatro ABE programados dirigiendo el ARNg, usando el ARNhp como
sustrato que contiene un solo adenina.

Cinética de rotación única de los cuatro ABE programados con ARNsg dirigido (tabla
S2)utilizando ssRNA como sustrato que contiene una sola adenina.
 Resultado
• Nuestros resultados demuestran cómo el
editor de bases desarrollado en laboratorio
ABE8e logra una rápida desaminación del
ADN.
 Conclusiones
• Por sustituciones cerca del centro activo, TadA-8e efectivamente remodela e
induce el ajuste de estructuras estructuralmente flexibles ssDNA en un bolsillo
estrecho de unión al sustrato.

• La estructura de ABE8e también demostró que el dominio TadA-8e (y

probablemente el de Tad7.10 no interactúa específicamente con SpCas9,
sugiriendo que la compatibilidad más amplia de Cas-efector de TadA-8e (15) se
deriva de la rápida cinética de desaminación.

• Además, ABE8e's La desaminación acelerada del ADN sugirió una fusión transitoria
previamente no observada de ADN que puede ocurrir durante la vigilancia de
dsDNA por SpCas9.
 Referencias
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