Molecular Todo 1-2 PDF

UNIVERSIDAD NACIONAL SAN LUIS GONZAGA DE ICA
ESCUELA DE BIOLOGIA
BIOLOGIA MOLECULAR
La replicación del ADN
Dr. Juan C. Tantaleán Vásquez
Esta presentación se ha elaborado con el aportes de diversos autores y no tiene fines de lucro. Se
Dr. Antonio Barbadilla
agradece su contribución a la enseñanza de la Biología Molecular
1
LA REPLICACION DEL ADN
Es un proceso natural, complejo y ordenado mediante el cual se

hacen copias idénticas del ADN para garantizar la conservación y
transmisión de la información genética.
LA REPLICACION DEL ADN EUCARIONTE: EN EL CICLO
CELULAR
El ciclo celular es un conjunto de procesos que realiza una célula

para duplicar su material genético y segregarlo en dos células hijas
idénticas.
Fases:
•Fase G1
•Fase S Interfase
•Fase G2
•Fase M Mitosis
El ADN se replica en la Fase S.

CARACTERISTICAS DE LA REPLICACIÓN
1. Es semiconservativa.
Cada cadena sirve de molde para una nueva cadena
Experimento de
M. Meselson y
F . Stahl
2. Es bidireccional.
Se inicia en un origen de replicación y procede en sentido 5’-3’
En procariontes es unifocal En eucariontes es multifocal

( un solo origen de replicación) ( varios orígenes de replicación)
3. Es asimétrica
 Una hebra se sintetiza de manera continua (cadena adelantada)
 La otra hebra se sintetiza de manera discontínua (cadena retrasada).
ENZIMAS EN LA REPLICACIÓN DEL DNA
1. DNA polimerasas:
Procarionte Eucarionte
Polimerasa
I II III (Replicasa) Replicasa
Polimerización 5’ 3’ + + + +
Actividad exonucleasa
5’ 3’ + - +
3’ 5’ + + +
Subunidades , , , , , , , , , , , 
, 
Función Reparación Reparación Síntesis de
del DNA del DNA nuevas cadenas
dañado dañado de DNA
DNA polimerasa I: actividad exonucleasa
DNA polimerasa III: actividad polimerasa
Subunidad  de la DNA polimerasa de procarionte
La subunidad 
forma una
“tenaza” que se
une alrededor del
DNA
ADN polimerasa en eucariontes:
Función de las subunidades
Subunidad     
Iniciaría la Repara el Replica el DNA Alarga ambas Polimeriza el

Función
polimerización DNA mitocondrial cadenas DNA
2. RNA polimerasa (primasa).
Sintetiza el RNA iniciador o partidor: segmento corto que proporciona
los extremos 3’-OH libres.
3. Las topoisomerasas.
Tipos:
I: libera la tensión durante el desenrollamiento del DNA
II (DNA girasa): produce superhélices negativas del DNA
Modelo:
Incremento de tensión
por el desenrollamiento
en una cuerda
Modelo del mecanismo de acción de la DNA girasa
4. Helicasas
Tipo I (Proteína Rep) desenrolla la molécula de DNA
progenitora, requiere ATP.
Tipo II: se une al molde de hebra rezagada en el
primosoma.
La helicasa
rompe los
enlaces de H
5. DNA ligasas
Catalizan la formación de enlaces fosfodiester entre los
polinucleótidos preformados.
Requieren ATP
Interviene en:
• Unión de los fragmentos de Okasaki
• Reparación del ADN dañado
6. Proteínas de unión a hebra simple (SSB)

Mantiene separas y en posición rígida las hebras del DNA
Requerimientos para la replicación in vitro del DNA
Se necesita:
 Una plantilla o molde (hebra del ADN),
 Un partidor o “primer - d(NMP)n
 ADN polimerasa
 Cuatro desoxiribonucleótidos trifosfatos (dNTP)
 Magnesio (Mg2+)
PROCESO DE REPLICACION DE ADN
REPLICACIÓN DEL ADN EN PROCARIONTES
 El ADN procarionte es circular

 ADN de hebra doble
 Al replicarse se forman las estructuras 
 Es unifocal (un solo origen de replicación)
El inicio de la replicación en procariontes: el OriC
Elongación de las hebra: adelantada y rezagada
Fragmnento de
Okasaki
Mecanismo de la replicación de ADN
en procariontes:
Replicación del ADN en eucariontes
REPLICACION DEL ADN EUCARIONTE
Elongación de la hebra adelantada y rezagada en eucariontes
Diferencias entre replicación de DNA de procariotas y
eucariotas
Procarionte Eucarionte
Tamaño pequeño grande
ADN Polimerasas menos compleja mas compleja
Número de orígenes unifocal multifocal

Longitud del partidor -50 Nucleótidos 9 Nucleótidos
Coloca el partidor Primosoma Primasa
Fragmento de Okazaki 1000-2000 pb 100-200 pb
Veloc. de replicación 1000 pb/min 100-250 pb/min

Fin
Esta presentación tiene aportes de diversos autores. Se agradece su contribución a la enseñanza de la

Biología Molecular y no se ha elaborado con fines de lucro
ESCUELA DE BIOLOGIA
BIOLOGIA MOLECULAR
Reparación del ADN
Dr. Antonio Barbadilla
1
Reparación del DNA
CORRECCIÓN DE ERRORES
 Las copias del ADN deben ser identicas.

 Actividad de los replisomas ( ADN polimerasas + enzimas
correctoras )
 Métodos de corrección:
a) Actividad autocorrectora de la ADN polimerasa
b) Actividad correctora posreplicativa
- Metilación de GATC con desfase
- Actuación de endonucleasas
- La ADN polimerasa I rellena los “vacios o gaps”
Tipos de daño al ADN
I. Mecanismos endógenos:
1. Pérdida de bases tipo purinas por ruptura espontánea

del enlace con el azúcar 5000/día/célula humana.
2. Desaminación espontánea de citosinas y adeninas
produce uracilo e hipoxantina.
3. Moléculas con oxígenos reactivos atacan los anillos de
las bases nitrogenadas.
4. La ADN polimerasa puede incorporar bases
equivocadas en la replicación.
5. Errores en la replicación o recombinación provocan
fracturas en el ADN.
Despurinación y Desaminación
Sitio apurínico
Sitio apurínico
Otras desaminaciones
(menos frecuentes)
A  Hipoxantina
G  Xantina 4
Fig 5-47 .- Biología Molecular de la Célula 4ª ed., Alberts y col.
Desaminación de
bases
adenina hipoxantina
guanina xantina
citosina uracilo 5-metil citosina timina
no hay desaminación
5
timina
Mutaciones producidas por despurinación
Deleción de 1 par
de bases (Ej. AT)
Azúcar despurinado
(A)
6
Oxidación de bases
 El metabolismo celular expone el DNA a los efectos perjudiciales de las

especies reactivas de oxígeno (ROS: O2-., HO., H2O2), subproductos
naturales del metabolismo oxidativo.
 Se conocen más de 100 modificaciones oxidativas diferentes en el DNA.

p. Ej.: G puede oxidarse a 8-oxoguanina
 oxoG puede aparearse con C o con A.
 Si oxoG se con A se produce

una TRANSVERSIÓN.
TRANSVERSIÓN: mutación
puntual producida por la
sustitución de una purina por
una pirimidina o al revés.
G C  T =A
7
Alquilación de bases
 Agentes alquilantes
Puede aparearse con C o T,

produciendo transversiones
 La alquilación de la posición N7 de un nucleótido de purina, hace

que su enlace glucosídico sea susceptible a la hidrólisis y lleve a la
pérdida de la base: despurinación
NRH 8
II. Mecanismos exógenos
1. Radiaciones ionizantes: rayos

gamma y rayos X causan
rupturas en la doble hélice
2. Luz UV causa la formación de los
dímeros de pirimidina (timina)
3. Agentes químicos ambientales
como alquilantes y otros forman
aductos con las bases del ADN:
hidrocarburos, productos
naturales como las aflatoxinas.
Reparación de dímeros de pirimidinas
Los rayos UV causan dímeros de timina en el DNA y es reparado

por la enzima fotoliasa en presencia de luz.
La radiación UV produce dímeros de timina
 La luz UV une de forma

covalente dos residuos de
timina adyacentes en una
hebra cadena de DNA,
formando ciclobutano
 Los dímeros de timina

producen una distorsión local
del DNA
 Con menos frecuencia se

pueden formar otros dímeros
de pirimidinas
T-T > T-C, C-T > C-C

11
Mecanismos de reparación del DNA
• Escisión de la región dañada seguida de remplazamiento preciso

 Escisión de base
 Escisión de nucleótidos
• Reparación de errores de replicación
a) Desapareamientos (“mismatch repair”)
b) Translesión (“by-pass”)
• Reparación de roturas de doble cadena
a) Unión de extremos no-homólogos
b) Unión de extremos homólogos: recombinación homóloga
NRH 12
G
Reparación por escisión de base
C
El sistema de reparación por
G Despurinación de G
escisión de base repara los
daños en el DNA producidos
por despurinación de bases, a
C
partir de AP endonucleasa
Fig 5-50 .- Biología Molecular de la Célula 4ª ed., Alberts y col. (modificada)

NRH C 13
Reparación del DNA por
escisión de nucleótidos
Reparación por escisión de nucleótido
De forma general este sistema implica:
• Detección del daño: mecanismo de

“escaneo”
• Actividad Endonucleasa (escinucleasa)
• DNA helicasa
• Sistema de replicación: DNA polimerasa y

DNA ligasa
NRH 15
Reparación por escisión de nucleótido
Comparación en E. Coli y en humanos
Función E. Coli Humanos

Escaneo DNA UvrA XPA, XPC; RPA
Nucleasa: UvrB, UvrC XPF, XPG

ESCINUCLEASA
Helicasa UvrD XPB, XPD
Sistema de DNApol I/DNApol II; DNApol d/e; ligasa

replicación ligasa
NRH 16
Reparación de desapareamientos post-replicativos (MMR)
¿Cómo se reconoce la cadena dañada?

El sistema tiene que distinguir la base errónea en la cadena hija, sin
afectar a la cadena molde
Sistema MMR
La cadena hija permanece sin metilar en las secuencias GATC varios

minutos después de su síntesis Fig 14-29 .- Genes VII., Lewis.
NRH 17
Reparación de desapareamientos
 Comparación de los sistemas enzimáticos en E. Coli y en humanos
Función E. Coli Humanos

Escaneo DNA MutS hMSH2-hMSH6
Reparación de MutL hMLH1-PMS1, PMS2

errores MutH (endonucleasa) MED1 (endonucleasa)
MutU (UvrD helicasa)
Sistema de DNApol III; ligasa DNApol d/e; ligasa

replicación
NRH 18
Reparación de roturas de doble cadena
Las roturas de doble cadena son potencialmente letales
Causas de rotura de doble hebra

• Radiaciones ionizantes
(rayos g, rayos X)
• Especies de oxígeno reactivas
• Quimioterápicos (bleomicina)
NRH 19
Unión de extremos homólogos:
recombinación homóloga
ATM: proteína quinasa

activada por rotura de
cadena doble
RAD51: conduce el
apareamiento de DNA
homólogos e invasión de
cadenas
Un filamento nucleoproteíco
busca la secuencia homóloga
de DNA doble sobre la
cromátida hermana
NRH 20
21
Fin
ESCUELA DE BIOLOGIA
BIOLOGIA MOLECULAR
TRANSCRIPCIÓN
La transcripción
Proceso de síntesis de ARN (transcrito) a partir

de una hebra molde de ADN.
Transcripción :
“trans” = pasar de uno a otro
“scribere” = escribir
Características de la transcripción
 La cadena de RNA crece en sentido

5’ 3’.
 Catalizada por la enzima RNA
polimerasa.
 Utiliza como sustratos NTPs.
 Requiere cofactor Mg2+ o Mn2+
 Es asimétrica: solo una hebra del
DNA se transcribe.
 La formación de una molécula de
RNA se inicia en un nucleótido ATP
o GTP.
Semejanzas con la replicación:
- Sustrato: nucleósidos trifosfato.
- Crecimiento dirigido por molde en dirección 5’ 3’.
- 3 fases: iniciación, elongación y terminación.
Diferencias con la replicación:

- Se transcribe una pequeña fracción de todo el material
genético.
- Sólo se transcribe una hebra molde de DNA.
- No requiere partidores (primers).
Síntesis de ARNm
Unidad de
transcripción
Transcrito
primario
La transcripción en procariontes
Organización policistrónica: un transcrito puede

corresponder a varios genes
LA RNA polimerasa
- Un único tipo.
- Holoenzima de 5 subunidades: ’

a) Núcleo de la enzima: ’
(capacidad de sintetizar RNA)
.  : iniciación de la transcripción,
interacción proteínas reguladoras
. ’ : es el centro catalítico.
b)  : selecciona la hebra adecuada y
reconoce promotores.
70: reconoce promotores de
mantenimiento celular.
CARACTERISTICAS DE LA ARN POLIMERASA
1. Desenrollar y enrollar el DNA

2. Contener las dos cadenas del DNA y el RNA naciente
3. Catalizar la adición de los ribonucleótidos a la cadena naciente de
RNA
4. Ajustarse a las dificultades que encuentra en su progreso cortando el
RNA creciente y recomenzando la síntesis del RNA con la ayuda de
algunos factores adicionales.
1. Punto de desenrollamiento
2. Sitio para la cadena
codificadora del DNA
3. Sitio para la cadena molde
del DNA
4. Sitio de unión del RNA
5. Sitio catalítico
6. Punto de enrollamiento
RNA polimerasa de E. coli
Núcleo de la Subunidad
enzima
2’ 2’ + 
holoenzyme core polymerase sigma factor
Representación esquemática del RNA polimerasa de E. coli
 Requiere molde DNA.

 Desenrolla DNA al frente
 Enrolla DNA en la espalda
 Procesividad elevada.
 Frec. de error baja (10-5).
El promotor
- Sitio de unión de la RNA

polimerasa
- Secuencias conservadas: –10
(TATAAT) y –35 (TTGACA) en
bacterias 1
Inicio de la
transcripción
Región río arriba Región río abajo

Secuencias nucleotídicas conservadas en los promotores
de algunos genes de Escherichia coli
Pasos de la transcripción
1. Inicio:
• Complejo binario cerrado: interacción
holoenzima-promotor.
• Desnaturalización DNA: complejo binario
abierto.
• Se incrementa la afinidad de la unión.
• Incorporación del primer nt: pppG o pppA
• Formación del complejo ternario.
• Existen ciclos abortivos de la iniciación:
punto crítico de 9 pb.
• Si se supera la síntesis de 9 nt, la
iniciación es un éxito y se produce la
elongación.
• Frecuencia : 1 iniciación/s
2. Elongación:
3. Terminación :
Independiente del
factor 
· Ricos en G-C
· Formación horquilla
estructura secundaria
· Residuos U al 3’
· Híbridos oligo (U) y oligo

(A) Apareamiento no es
estable.
Dependiente del factor Rho
 Proteína Rho se une a la cadena de RNA.
 Se desliza a lo largo del RNA.

 La síntesis se detiene en la secuencia
de terminación.
 Rho alcanza la polimerasa .
 Actividad helicasa con hidrólisis de ATP:
separación del híbrido RNA-DNA.
 Los ribosomas pueden interferir con la
actividad de rho.
Transcripción en eucariontes
 Es compleja.
 Existen varias RNA polimerasas
 Cada RNA polimerasa tiene entre 8 y 14 subunidades.
 Las RNA polimerasas requieren de factores de transcripción.
 Los factores de transcripción seleccionan los genes a transcribir.
 El RNA transcrito se poliadenila en su extremo 3’ y se forma una
caperuza en el 5’.
 Los intrones del preRNAm se eliminan por corte y empalme, que a
veces es alternativo.
RNA POLIMERASAS EUCARIONTES
PROMOTORES EUCARIONTES
Para la transcripción por la RNA pol II

Inicio de la transcripción :
Complejo preinicial: Participación de los factores de transcripción:

. Basales: se unen a secuencia TATA (promotor)
. Específicos: se unen a secuencias llamadas acentuadoras “enhancer”.
Ensamblaje del complejo de la RNA polimerasa II
Inicio y elongación de la
transcripción
Elongación en eucariontes.
Rol del dominio carboxiterminal
Inhibidores de la transcripción
+ Acridina
N
H
Sar Sar
L-Pro L-meVal L-Pro L-meVal
D-Val O D-Val O
L-Thr L-Thr
Actinomicina D O C C O
N NH2
O O
CH3 CH3
EL RNA
Características y funciones
1. Reactividad química:
El RNA, al tener el grupo 2’-OH, es mucho más

reactivo químicamente que el DNA y puede ser
completamente hidrolizado por un álcali.
2. Estructura tridimensional
Las formas en doble hélice del RNA adoptan la

configuración A (en lugar de la B, propia del DNA).
3. En el RNA existen bases no comunes:
4. Tamaño molecular
El RNA es de menor tamaño que el DNA.
5. RNA como material genético

Algunos virus tienen como material genético el RNA.
Entre éstos los retrovirus y rotavirus.
6. RNA como enzima
Algunos RNA son capaces

de catalizar reacciones químicas
del mismo modo que las enzimas:
son las ribozimas
Participan en el procesado
del RNA transcrito primario
y en la formación de enlace
peptídico en la síntesis de
proteínas.
Ribozima
hammerhead
TIPOS DE RNA
Los distintos tipos de RNA permiten la expresión fenotípica del

DNA:
 Como elemento estructural básico de las partículas encargadas

de llevar a cabo la síntesis proteica, los ribosomas: RNA
ribosómico o rRNA
 Como molécula que activa a los aminoácidos para poder ser

incorporados en una nueva proteína: RNA de transferencia o
tRNA
 Como mensaje genético que determina la secuencia de

aminoácidos en la síntesis de proteína: RNA mensajero o
mRNA
 Con proteínas, forma complejos que son usados en el proceso de

ARN en las células eucarióticas (no se encuentra en las células
procarióticas) : ARN nuclear pequeño o ARN np.
RNA ribosómico o rRNA
• Es un componente de los RIBOSOMAS (partículas ribonucleares

citoplasmáticas compuesta por rRNA y proteínas).
• En los ribosomas existen diferentes tamaños de rRNA.
• Los genes de rRNA se emplean para la identificación de los

organismos.
• El rRNA constituye el 75% del RNA total.

Componentes de los ribosomas
Procariontes y cloroplastos: 70S

Eucariontes: 80S
Mitocondrias: 50S
S: unidades Svedverg
(sedimentación)
Estructura:
• Primaria : es una sola hebra y sufre metilación (en
eucariontes en 2’-OH adenosina y en procariontes en 5-
metilcitosina).
Metilación de la estructura primaria del RNA

Estructura secundaria del rRNA
Formas en tallo y buclés del

rRNA.
El apareamiento de bases en los

tallos es responsable de la
estructura secundaria
buclé
tallo
RNA transferencia o tRNA
Transporta los aminoácidos durante la síntesis

de proteínas.
Los tRNA se designan según el aminoácido con

el cual se activa.
Valil-tRNA (tRNAVal): un tRNA activado con

valina
Los tRNA distintos que se activan con un mismo

aminoácido se llaman isoaceptores.
Estructura secundaria del tRNA
-
O O
P O
- H
O N
O N
H
N
H2C N N
O H
OH
-
O O
P H H
-
N
O
O
H2 C
N
N
O
C
O
-
O O OH
H H
P N
-
O
O N
H2 C N O
C
O
-
O O OH H
H N
P
-
O N
H2 C
O N
N N
A
O
H O OH
H3N C C
R O
Unión del aminoácido al

extremo 3’ del tRNA
Estructura terciaria del tRNA
3’
5’
Extremo
aceptor
Lazo TYC
Lazo
variable
Lazo
anticodón
tRNA
3’
5’
5’
A mRNA
U
G
I C
anticodón C codón
3’
RNA mensajero o mRNA
• Contiene una secuencia continua de nucleótidos que codifica un

polipéptido específico.
• Se encuentran en el citoplasma.
• Se unen a ribosomas para ser traducidos.
• Es inestable.
• En eucariontes deriva del RNA heterogéneo nuclear (RNAhn) y

llevan regiones no codificantes, los intrones.
RNA pequeños nucleares
• Presentes en eucariontes.
• Forman complejos con proteínas: snRNP (small nuclear ribonucleo
protein).
• Longitud entre 90 a 300 nt
• Intervienen en el procesamiento del RNA (splicing)
• En la enfermedad autoinmune llamada “lupus eritematoso
diseminado” se producen anticuerpos contra las proteínas y en
ocasiones contra los RNA de snRNP.
FIN
“UNIVERSIDAD NACIONAL SAN LUIS GONZAGA” DE ICA
ESCUELA DE BIOLOGIA
 TRANSCRIPCION INVERSA
 CODIGO GENETICO
 MODIFICACIONES POST
TRANSCRIPCIONALES
Orientación y nomenclatura de las hebras en
relación a la transcripción
(5)’ CGCTATAGCG (3’)  hebra codificante del ADN

(3’) GCGATATCGC (5’)  hebra molde del ADN
(5’) CGCUAUAGCG (3’)  transcrito de RNA

¿Qué hebra de la doble hélice es la
codificante?
Depende de cada gen, no es un

propiedad del cromosoma.
Orientación de la transcripción
Orientación de la transcripción
El “dogma” central revisado
El "dogma central"
o Admite excepciones.
o Temin descubrió la enzimaTranscriptasa
inversa capaz de sintetizar ADN copiando la
información contenida en un ARN.
TRANSCRIPCIÓN INVERSA
En virus de animales:
Retrovirus.
Se sintetiza DNA a partir de
un RNA molde.
Actividad de la enzima
Transcriptasa reversa.
El DNA formado se integra
en el genoma del huésped
(provirus).
EL CODIGO GENETICO
“ Clave para lectura del mensaje genetico” … en el RNAm.
• Es universal: lo utilizan casi todos los seres vivos conocidos. Solo

existen algunas excepciones en unos pocos tripletes en bacterias y
en el genoma mitocondrial.
• No es ambiguo: cada triplete tiene su propio significado
• Todos los tripletes tienen sentido: codifican un aminoácido o

indican terminación de lectura.
• Es “degenerado”: hay varios tripletes para un mismo aminoácido,

es decir hay codones sinónimos.
• Es unidireccional: los tripletes se leen en el sentido 5´-3´.

EL CODIGO GENETICO
Tercera letra
Siglas de los
aminoácidos
07_21_nucl_sequence .jpg
07_22_readingframes.jpg
MODIFICACIONES POST TRANSCRIPCIONALES
ADN Eucarionte
1. Síntesis del Cap.
Modificación química del extremo 5’ del Pre RNAm

5’ – ppPuN........... 3’
Se adiciona un nucleótido GTP y se metila.
Estructura del Cap:

2. Poliadenilación
- Modificación
del extremo 3’ .
- Adición de una
cola de poli (A)
Poli(A)polimerasa.
3. Edición de Intrones (Splicing)
hnRNA en mRNA
•Exones - secuencias codificantes

•Intrones- secuen. no codificantes
Interviene el edisoma o espliceosoma
snRNA + Proteínas
Regla GU-AG
07_16_RNA_chain .jpg
Formation of lariat
07_17_spliceosome.jpg
Splicing cycle
RNA de interferencia
RNA interference
Transporte nuclear
• El núcleo contiene el DNA y es sitio de la transcripción
y del procesamiento del RNA.
• El citoplasma es sitio de la traducción.
• El transporte a través de la
envoltura nuclear es por los poros
nucleares que son numerosos.
• El núcleo es separado de citoplasma por la envoltura
nuclear (biomembrana doble)
• RNAs deben dejar el núcleo.
• Algunas proteínas se deben incorporar al núcleo.
Poros en la envoltura celular

Fin
ESCUELA DE BIOLOGIA
TRADUCCION: Proceso de
síntesis de proteínas
PARTICIPAN EN LA TRADUCCION:
1. El ARN mensajero: contiene la información cifrada en codones de
nucleótidos
a) bacterias ; b) eucariotas
2. Los ribosomas: realizan la “lectura” del ARNm y sintetizan la
proteína
3. El ARN de transferencia: transporta los aminoácidos hacia el ribosoma y el
ARNm
1°. Se sitúa cerca del sitio de acción con el ARNm. Existe alrededor, ATP y el
aminoácido que se unirá al péptido que se está codificando.
2°. Toma la forma de “Trébol” con tres asas, la central tiene el anticodón que es
complementario al codón y porta el respectivo aminoácido.
3°. El anticodón se une al ARNm y se lleva a cabo la traducción con la actividad del
ARNr.
ETAPAS DE LA TRADUCCIÓN
a) INICIACION
b) ELONGACION
c) TERMINACION
a. Iniciación.
Unión de la mRNA (secuencia Shine-Dalgarno) a la subunidad pequeña del

ribosoma (extremo 3’ rRNA 16S).
mRNA
5’ UAAGGAGG AUG 3’
AUUCCUCC
3’ 16S rRNA
5’
Aminoacilación del tRNA: actividad de la aminoacil tRNA sintetasa
El aminoácido activado se transfiere a un tRNA por una sintetasa :

Aminoacil-AMP + tRNA ↔ Aminoacil- tRNA + AMP
La iniciación en procariontes
En eucariotas
Modelo de Kozak:
Los factores de iniciación
en eucariontes: eIF
b. Alargamiento o elongación.
La síntesis de la cadena polipeptídica

Sitios funcionales en el ribosoma
Modelo de elongación
**
Formación del enlace peptídico
• Reacción central de la síntesis proteíca.

• La actividad peptidiltransferasa está en el RNAr 23S.
• El centro catalítico es conservado.
• La translocación ocurre después del enlace peptídico
c. Terminación.
Codones de terminación UAA, UGA, UAG

Qué es un codón de
terminación ?
ATP Asociado con la unión del cap y desenrrollamiento de
RNAm
Algunos antibióticos actúan a nivel de síntesis de proteínas.
MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES
Para que la proteína La proteína para

sea funcional sufre ser funcional sufre
modificaciones modificacciones
1. Plegamiento de proteínas: formación de estructuras secundarias
y terciarias
Conformación activa de la proteína por la enzima

disulfuro isomerasa
2. Modificación química de los aminoácidos: cambios químicos en
las proteínas
Adición de grupos acetilo, metilo, fosfato, oxidrilo y

carboxilo.
Glicosilación:
Unión de un Carbohidrato + Proteína = Glicoproteína

2 a 20% de oligosacáridos (glicanos)
Acilación:
Adición de ácidos grasos a las proteínas.

Formación de enlaces éster Serina y treonina.
Tioéster cisteína.
3. Ruptura proteolítica
A partir de una poliproteína - Ruptura - forman segmentos

activos y no activos.
LOCALIZACIÓN DE LAS PROTEINAS
Destino de las proteínas:
1. Citosol: proteínas citosólicas

(centros catalíticos)
2. Macromoléculas: centriolos,
filamentos.
3. Núcleo: provienen del citosol.
4. Organelas: mitocondrias y
cloroplastos.
5. Sistema retículo endotelial: RE,
Ap. de Golgi., endosomas y
lisosomas.
6. Exterior de la célula.
Lodish, 2012 Fig 17.1
El retículo endotelial
en el procesamiento y sorting de proteínas
La vía secretoria
RE rugoso AG Vesículas secretorias Exterior celular
TRANSLOCACIÓN DE LAS PROTEÍNAS
Inserción o paso a través de una membrana.

TIPOS DE TRANSLOCACION
1. Post-traduccional 2. Co-traduccional
Las secuencia señal
a. Características de la secuencia N-
terminal:
 No es parte de la proteína.
 “Presenta” la proteína a la
membrana.
 Permite el ingreso de proteínas a
organelas y al retículo
endoplásmico.
b. Características de la secuencia C –
terminal:
 Permite el regreso de la proteína
al Aparato de Golgi y al
retículo endoplásmico.
1. Translocación Post-traduccional
- Las proteínas del citosol penetran a

organelas.
- Este proceso necesita ATP.
- Ingreso de la proteína depende del contacto
de la secuencia líder con receptores.
Secuencias de captación – orientación de las proteínas mitocondriales
Receptores para el transporte a través de las
membranas mitocondriales: Translocasas de membrana
TOM : membrana externa, consta de 9

proteínas.
TIM: membrana interna, forma dos
complejos.
 No interactúan directamente.
 Ambas proporcionan:
• Canal para la translocación
• Reconoce secuencias N – terminal.
• Unión de la proteína con chaperonas
en la matriz.
Proteína precursora que se orienta hacia la matriz mitocondrial

2. Translocación Co - traduccional
 Ribosomas se asocian al retículo endoplasmático (RE).

 Proteínas sintetizadas pasan directamente al RE.
 Dirigida por una secuencia señal. ( N-terminal 15 – 30 aas.)
 Presenta una Partícula de Reconocimiento Señal (SRP) :
( ARN 11S y 7S y proteínas.)
 Algunas proteínas requieren de TRAM (estimular la translocación)
 Sec 61. (Proteína transmenbrana)
Funciones de la SRP:
1. Se une a la secuencia señal de la proteína naciente y
detiene la traducción.
2. Se une al receptor de la membrana y continua la
traducción.
Vía secretora de síntesis
(co – traduccional)

Como se dirigen las proteínas al RE?
Los péptidos señales son secuencias cortas( 16-30 aa) que contienen
un aa cargado seguido por un grupo de 6-12 aas hidrofóbicos. Estos
aas hidrofóbicos serían esenciales para la unión a un receptor
presente en la membrana del RE
Pasos de la translocación Co - traduccional:
• Reconocimiento de la secuencia señal.
• SRP queda unida al receptor de SRP, ribosoma se une a membrana.
• La secuencia líder penetra a la membrana.
• Proteína pasa a través de la membrana, se elimina líder.
• Proteína queda en el interior del RE, ribosoma libera del RNAm.
El complejo ribosoma+RNAm+péptido señal +SRP no continua la síntesis de
proteínas hasta que el SRP se une a la membrana del RER

Secreción de las proteínas por las membranas:
Paso de las proteínas es a

través de una región
transmembrana
Proteínas transmembranas
Clasificación de las proteínas según su topología
Tipos I,II y III comprende las proteínas de un único paso.

Tipo I: PS se cliva, N-term en el lumen, el C-term en citosol.
Tipo II: No PS que se clive, N-term en citosol, C-term en el lumen.
Tipo III: misma orientación que I pero sin PS clivable
Tipo IV :Proteínas multipaso numerosos segmentos transmembrana

Transporte a través de la envoltura nuclear:
 Núcleo consta de dos membranas.

 Presenta aberturas llamadas Complejos del poro nuclear
 Transporte entre núcleo y citoplasma en dos
direcciones.
Vías de exportación e importación nucleares

Forma de los Poros:
. Simetría octagonal.
. El paso por los poros se limitan por el tamaño:
< 5000 daltons ( iones, nucleotidos, otros)
5 – 50 kDa, proteínas tráfico es por transporte pasivo.
> 50 kDa, paso es por transporte activo
Las proteínas solubles y de mb recien sintetizadas
sufren cinco modificaciones importantes antes de
alcanzar su destino final.
1. Formación de puentes disulfuro
2. Plegamiento y control de calidad
3. Adición y procesamiento de
carbohidratos
4. Proteólisis específica
5. Oligomerización
LAS PROTEINAS CHAPERONAS:
• Algunas proteínas maduran en forma espontánea

desnaturalizan renaturalizan (autoensamblaje)
• Las que no pueden autoensamblarse necesitan de chaperonas.
Chaperonas: Proteínas mediadoras en el ensamblaje de una proteína

. Actúan impidiendo la formación de estructuras incorrectas.
. Proteínas mantienen su estado no plegado Pasa a través de la membrana
estado plegado
Grupos de Chaperonas:
a. Sistema “Heat shock protein” (Hsp).
- Actúan sobre proteínas recién sintetizadas.
- En el transporte de las proteínas .
- En la desnaturalización.
b. Sistema Chaperonina: Hsp 60 y Hsp 10

Función:
1. Influir en el plegamiento de las proteínas.
2. Ayuda a su renaturalización o a su eliminación.
4. En la formación de estructuras oligoméricas.
5. Transporte de las proteínas a través de las membranas
ESTADO PLEGADO
PASA A TRAVÉS DE LA MEMBRANA
PROTEÍNAS EN ESTADO NO
PLEGADO
Degradación de las proteínas
 Por proteasas:
1. Procesamiento para generar proteínas maduras.
2. Separación de la secuencia señal.
3. Rompimiento de enzimas citosólica.
 Por lisosomas:
Degradan las proteínas que llegan a la célula.
 Por proteosomas: (complejo de proteasas)

1. Degradación en masa de proteínas.
2. Proteínas mal plegadas.
3. Degrada proteínas que interfieren en el ciclo celular.
Degradación de una proteína:
1. La proteína se marca con Ubiquitina (E1).

(mediante enlace covalente).
2. Llegada de otras ubiquitinas ( poliubiquitinas).
3. Ingreso del complejo E1- proteína al
proteosoma.
4. Degradación de la proteína en peptidos.
FIN
LEWIN B. 2012. Genes X. Edit. MARBAN

LODISH, H., A. BERK, S. L. ZIPURSKY, P. MATSUDAIRA, D. BALTIMORE Y J.
DARNELL. 2012. Biología Celular y Molecular 4ta ed. Edit. Medica Panamericana
http://www.ub.es/biocel/wbc/biocel/pdf/t-11_rer_05-06.pdf
FIN
• LEWIN B. 2012. Genes X. Edit. MARBAN

• LODISH, H., A. BERK, S. L. ZIPURSKY, P. MATSUDAIRA, D. BALTIMORE Y J.
• Smith, C. y E. Wood 1998 Biología Molecular y Biotecnología Edit. Addison - Wesley
Iberoamericana. Estados Unidos.
http://grupos.unican.es/asignaturabioquimica/documentos/Isabel/Tema14.pdf
• http://www.ub.es/biocel/wbc/biocel/pdf/t-11_rer_05-06.pdf
ESCUELA DE BIOLOGIA
LOCALIZACIÓN DE PROTEINAS
Dr. Juan C. Tantaleán V.

Destino de las proteínas:
1. Citosol: proteínas citosólicas

(centros catalíticos)
2. Macromoléculas: centriolos,
filamentos.
3. Núcleo: provienen del citosol.
4. Organelas: mitocondrias y
cloroplastos.
5. Sistema retículo endotelial: RE,
Ap. de Golgi., endosomas y
lisosomas.
6. Exterior de la célula.
Sistema del Retículo endotelial
Retículo endoplasmático
El RE en el procesamiento y sorting de proteínas
Vía secretoria
RE rugoso AG Vesículas secretorias Exterior celular
TRANSLOCACIÓN DE LAS PROTEÍNAS
Inserción o paso a través de una membrana.

TIPOS DE TRANSLOCACION
1. Post-traduccional 2. Co-traduccional
Las secuencia señal
a. Características de la secuencia N-
terminal:
 No es parte de la proteína.
 “Presenta” la proteína a la
membrana.
 Permite el ingreso de proteínas a
organelas y al retículo
endoplásmico.
b. Características de la secuencia C –
terminal:
 Permite el regreso de la proteína
al Aparato de Golgi y al
retículo endoplásmico.
1. Translocación Post-traduccional
- Las proteínas del citosol penetran a

organelas.
- Este proceso necesita ATP.
- Ingreso de la proteína depende del contacto
de la secuencia líder con receptores.
Secuencias de captación – orientación de las proteínas mitocondriales
Receptores para el transporte a través de las
membranas mitocondriales: Translocasas de membrana
TOM : membrana externa, consta de 9

proteínas.
TIM: membrana interna, forma dos
complejos.
 No interactúan directamente.
 Ambas proporcionan:
• Canal para la translocación
• Reconoce secuencias N – terminal.
• Unión de la proteína con chaperonas
en la matriz.
Proteína precursora que se orienta hacia la matriz mitocondrial

2. Translocación Co - traduccional
 Ribosomas se asocian al retículo endoplasmático (RE).

 Proteínas sintetizadas pasan directamente al RE.
 Dirigida por una secuencia señal. ( N-terminal 15 – 30 aas.)
 Presenta una Partícula de Reconocimiento Señal (SRP) :
( ARN 11S y 7S y proteínas.)
 Algunas proteínas requieren de TRAM (estimular la translocación)
 Sec 61. (Proteína transmenbrana)
Funciones de la SRP:
1. Se une a la secuencia señal de la proteína naciente y
detiene la traducción.
2. Se une al receptor de la membrana y continua la
traducción.
Vía secretora de síntesis
(co – traduccional)

Como se dirigen las proteínas al RE?
Los péptidos señales son secuencias cortas( 16-30 aa) que contienen
un aa cargado seguido por un grupo de 6-12 aas hidrofóbicos. Estos
aas hidrofóbicos serían esenciales para la unión a un receptor
presente en la membrana del RE
Pasos de la translocación Co - traduccional:
• Reconocimiento de la secuencia señal.
• SRP queda unida al receptor de SRP, ribosoma se une a membrana.
• La secuencia líder penetra a la membrana.
• Proteína pasa a través de la membrana, se elimina líder.
• Proteína queda en el interior del RE, ribosoma libera del RNAm.
El complejo ribosoma+RNAm+péptido señal +SRP no continua la síntesis de
proteínas hasta que el SRP se une a la membrana del RER

Secreción de las proteínas por las membranas:
Paso de las proteínas es a

través de una región
transmembrana
Proteínas transmembranas
Clasificación de las proteínas según su topología
Tipos I,II y III comprende las proteínas de un único paso.

Tipo I: PS se cliva, N-term en el lumen, el C-term en citosol.
Tipo II: No PS que se clive, N-term en citosol, C-term en el lumen.
Tipo III: misma orientación que I pero sin PS clivable
Tipo IV :Proteínas multipaso numerosos segmentos transmembrana

Transporte a través de la envoltura nuclear:
 Núcleo consta de dos membranas.

 Presenta aberturas llamadas Complejos del poro nuclear
 Transporte entre núcleo y citoplasma en dos
direcciones.
Vías de exportación e importación nucleares

Forma de los Poros:
. Simetría octagonal.
. El paso por los poros se limitan por el tamaño:
< 5000 daltons ( iones, nucleotidos, otros)
5 – 50 kDa, proteínas tráfico es por transporte pasivo.
> 50 kDa, paso es por transporte activo
Las proteínas solubles y de mb recien sintetizadas
sufren cinco modificaciones importantes antes de
alcanzar su destino final.
1. Formación de puentes disulfuro
2. Plegamiento y control de calidad
3. Adición y procesamiento de
carbohidratos
4. Proteólisis específica
5. Oligomerización
LAS PROTEINAS CHAPERONAS:
• Algunas proteínas maduran en forma espontánea

desnaturalizan renaturalizan (autoensamblaje)
• Las que no pueden autoensamblarse necesitan de chaperonas.
Chaperonas: Proteínas mediadoras en el ensamblaje de una proteína

. Actúan impidiendo la formación de estructuras incorrectas.
. Proteínas mantienen su estado no plegado Pasa a través de la membrana
estado plegado
Grupos de Chaperonas:
a. Sistema “Heat shock protein” (Hsp).
- Actúan sobre proteínas recién sintetizadas.
- En el transporte de las proteínas .
- En la desnaturalización.
b. Sistema Chaperonina: Hsp 60 y Hsp 10

Función:
1. Influir en el plegamiento de las proteínas.
2. Ayuda a su renaturalización o a su eliminación.
4. En la formación de estructuras oligoméricas.
5. Transporte de las proteínas a través de las membranas
ESTADO PLEGADO
PASA A TRAVÉS DE LA MEMBRANA
PROTEÍNAS EN ESTADO NO
PLEGADO
Degradación de las proteínas
 Por proteasas:
1. Procesamiento para generar proteínas maduras.
2. Separación de la secuencia señal.
3. Rompimiento de enzimas citosólica.
 Por lisosomas:
Degradan las proteínas que llegan a la célula.
 Por proteosomas: (complejo de proteasas)

1. Degradación en masa de proteínas.
2. Proteínas mal plegadas.
3. Degrada proteínas que interfieren en el ciclo celular.
Degradación de una proteína:
1. La proteína se marca con Ubiquitina (E1).

(mediante enlace covalente).
2. Llegada de otras ubiquitinas ( poliubiquitinas).
3. Ingreso del complejo E1- proteína al
proteosoma.
4. Degradación de la proteína en peptidos.
FIN
LEWIN B. 2012. Genes X. Edit. MARBAN

LODISH, H., A. BERK, S. L. ZIPURSKY, P. MATSUDAIRA, D. BALTIMORE Y J.
http://www.ub.es/biocel/wbc/biocel/pdf/t-11_rer_05-06.pdf
BIOLOGIA MOLECULAR
REGULACION DE LA
EXPRESION GENICA
“…todos los genes de un organismo no se expresan

constantemente…EXISTEN CONTROLES EN LA
EXPRESION GENICA”

EL CONTEXTO GENETICO EN EUCARIONTES
Gen monocistrónico: unidad funcional que genera ARNm de un solo gen. En

eucariontes incluyen exónes e intrones.
1 GEN = Información para una proteína

NIVELES DE REGULACION DE LA EXPRESION GENICA EN EUCARIONTES
“…todos los genes de un

organismo no se expresan
constantemente…EXISTEN
CONTROLES EN LA
EXPRESION DE LOS
GENES”
Las células utilizan sus

potencialidades genéticas
según sus requerimientos
metabólicos y exigencias
ambientales.
EL CONTEXTO GENETICO EN BACTERIAS
Genes policistrónicos : organización génica que genera ARNm que

corresponde a varios genes.
EXPRESION DE GENES POLICISTRONICOS EN EL OPERON LACTOSA
Promotor
MODELO DE REGULACIÓN A NIVEL TRANSCRIPCIONAL EN BACTERIAS
 Operón: unidad génica funcional policitrónica bacteriana. Incluye genes

estructurales, una región promotora, una región operadora y un gen regulador.
 Operón inducible: operón en el cual la presencia de una sustancia promueve la

transcripción de los genes estructurales.
 Operón represible: operón cuya transcripción se suprime o ploquea en

presencia de una moléculas correpresora.
 Promotor: secuencia en el ADN a la cual se une la enzima RNA
polimerasa antes de iniciar la transcripción.
 Operador: secuencia en el ADN donde se unen los represores.
 Gen estructural: gen que codifica para enzima de una vía metabólica.
 Gen regulador: gen que codifica una proteína reguldora.
 Represor: proteína reguladora de expresión génica que al unirse al

DNA inhibe la transcripción. Ejerce un control negativo.
 Activador: proteína reguladora de expresión génica que se une al

DNA y promueve la transcripción. Ejerce un control positivo.
 Inductor: molécula que modifica al represor y así facilita la

transcripción.
 Expresión constitutiva: expresión génica constante sin mecanismo de

regulación.
ELEMENTOS ESTRUCTURALES EN LA REGULACION GENICA
Operator
P O
REGULADORES DE LA TRANSCRIPCION
 Proteínas que se unen al DNA en secuencias específicas.

 Proteínas represoras: inhiben la transcripción.
 Proteínas activadoras: activan la transcripción.
 La mayoría de proteínas reguladoras son multiméricas y se unen al
DNA a través del motivo estructural hélice-vuelta-hélice.
 Hélice de reconocimiento: se sitúa en el surco principal del DNA y
contacta específicamente con las bases del DNA.
 Hélice de fijación: interacciona sin especificidad con el armazón
azúcar-fosfato.
El modelo del operón de Jacob y Monod (1961)
Varios genes estructurales que se expresan bajo un mismo

mecanismo de regulación.
EL OPERON LACTOSA
Sistema bacteriano para el catabolismo de la lactosa (glucosa-galactosa)
Contexto genético del Operón Lactosa.
Gen regulador: expresa una proteína represora (LacI)

Promotores
Operador: secuencia de unión de LacI
Genes estructurales: lacZ, lacY y lacA
Operon Lactosa: en Escherichia coli
• Se sintetizan 3 enzimas:
1. β-galactosidasa: degrada lactosa y se forma glucosa y

galactosa.cataliza también la isomerización de lactosa a alolactosa
2. Lactosa permeasa: trasporta la lactosa a la célula
3. Transacetilasa: función no completamente conocida.
La molécula inductora es alolactosa (no lactosa misma)

REGION REGULADORA DEL OPERON LACTOSA
El operon lac tiene dos controles
NEGATIVO Represor lacI
POSITIVO Proteína CAP

ACTIVIDAD DE LacI
SIN LACTOSA
CON LACTOSA
Inducción mediante IPTG (Isopropil--tiogalactósido)
Inducción mediante análogos:

 Modifican al represor
 Estables
 No metabolizables
REPRESION POR CATABOLITO
CAP
IPTG
ACTIVACION DE LA TRANSCRIPCION
POR EL COMPLEJO cAMP-CAP
EL OPERÓN TRIPTOFANO
REGULACION DE LA EXPRESION DEL OPERON trp
Aporrepresor + correpresor = Holorrepresor

( TrpR ) ( triptofano )
ESTRUCTURAS EN LA ATENUACIÓN
ESTRUCTURAS
EN TALLOS Y
BUCLES
La estructura 3-4 produce

terminación de la transcripción
tipo Rho independiente
FIN
http://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/15regulacion.htm
UNIVERSIDAD NACIONAL SAN LUIS
GONZAGA DE ICA
BIOLOGIA MOLECULAR I
SECUENCIAMIENTO DEL ADN

SECUENCIAMIENTO DEL ADN
Determinación del orden exacto de los nucleótidos de un

fragmento de ADN o del genoma de un organismo.
Genoma: información genética total de un organismo.

ADN:
 cromosómico
 mitocondrial
 plasmidial
 plastidial
Tipos de secuenciamiento de ADN.
Métodos clásicos
Secuenciamiento químico:
Allan M. Maxam – Walter Gilbert (1970)
 Hasta 500 pb.
 Se usa marcación radiactiva con 32P en extremo 5’del DNA.
 Degradación química en distintos nucleótidos específicos:
DMS (G), Ac. Fórmico (A+G), Hidrazina (C+T), (C),.

4 sets: G, A+G, C+T y C
 Se separan los fragmentos mediante electroforesis.
 Lectura de los geles mediante autoradiografía.
 Análisis de gel de secuencia: lectura G y C directa, A+G se
considera A cuando no se duplica en G y T+C se considera T
cuando no se duplica en C.
Secuenciamiento de ADN según Maxam - Gilbert
1. DMS (G)
2. Ac. Fórmico (A+G)
3. Hidrazina (C+T)
4. Hidrazina (C)
Secuenciamiento enzimático:
Método de F. Sanger o de secuencia dideoxi
• Se basa en la síntesis in vitro de DNA.
• Usa DNA monocatenario como molde (a ser secuenciado)
• Uso de didesoxinucleótidos trifosfatos (ddNTP)
• Se emplea un partidor con marca radiactiva en extremo 5’
• ADN Polimerasa
• La incorporación de ddNTP inhibe la polimerización y se generan
fragmentos.
• Resolución de fragmentos en geles de secuencia.
• Autoradiografía.
• Determinación de la secuencia mediante la
lectura de abajo hacia arriba
Secuenciamiento por
método de Sanger
Secuenciación automatizada: fluorescente
• DNA molde o templado

• Didesoxinucleótidos con marca fluorescente
• Partidores de secuencia o del vector
• DNA Polimerasa (Thermo Sequenase II)
• Resolución de fragmentos por electroforesis
capilar
• Lectura por emisión de rayos laser
• Almacenamiento y análisis de información
computarizada.
• Generación de cromatogramas
Cromatogramas
CECS 694-02 Introduction to Bioinformatics University of Louisville Spring 2003 Dr. Eric Rouchka
AUTOMATIZACIÓN DEL MÉTODO SANGER
ATTGC A
Capillary
Liquid
polymer
…..
Laser
Heat plate -
Beam
splitter Sequencing
Window reaction
Detectors
+
Alineamiento de “contics” desordenados
Alineamiento de “contics” ordenados
Ensamble
Pirosecuenciación
Is a simple and robust technique that sequences by synthesis. Using

a short PCR product as a template, bases are added systematically
and incorporated into a replicating DNA strand. Pyrosequencing
utilizes a series of enzymatic reactions to detect pyrophosphate that
is released during base incorporation and uses the detection data to
establish the sequence of the template strand.
Step 1
A sequencing primer is hybridized to a single-stranded PCR amplicon that
serves as a template, and incubated with the enzymes, DNA polymerase, ATP
sulfurylase, luciferase, and apyrase as well as the substrates, adenosine 5'
phosphosulfate (APS), and luciferin.
Step 2
The first deoxribonucleotide triphosphate (dNTP) is added to the reaction.
DNA polymerase catalyzes the incorporation of the deoxyribo-nucleotide
triphosphate into the DNA strand, if it is complementary to the base in the
template strand. Each incorporation event is accompanied by release of
pyrophosphate (PPi) in a quantity equimolar to the amount of incorporated
nucleotide.
Step 3
ATP sulfurylase converts PPi to ATP in the presence of adenosine 5'
phosphosulfate (APS). This ATP drives the luciferase-mediated conversion of
luciferin to oxyluciferin that generates visible light in amounts that are proportional
to the amount of ATP. The light produced in the luciferase-catalyzed reaction is
detected by a charge coupled device (CCD) chip and seen as a peak in the raw
data output (Pyrogram). The height of each peak (light signal) is proportional to the
number of nucleotides incorporated.
Step 4
Apyrase, a nucleotide-degrading enzyme, continuously degrades unincorporated
nucleotides and ATP. When degradation is complete, another nucleotide is added.
Step 5
Addition of dNTPs is performed sequentially. It should be noted that

deoxyadenosine alfa-thio triphosphate (dATP·S) is used as a substitute for the
natural deoxyadenosine triphosphate (dATP) since it is efficiently used by the
DNA polymerase, but not recognized by the luciferase. As the process continues,
the complementary DNA strand is built up and the nucleotide sequence is
determined from the signal peaks in the Pyrogram trace.
Secuenciación por flujo de iones
(ion torrent)
Genomas secuenciados
Genomas secuenciados están almacenados en bases de datos:

Gen Bank: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
EMBL:http://www.ebi.ac.uk/
DDBJ:http://www.ddbj.nig.ac.jp/
TDB:http://www.tigr.org/
BIOINFORMATICA y
LA ERA POST-GENOMICA
BIOINFORMATICA
DEFINICIONES
Tecnología de la información aplicada a la gestión y

análisis de datos biológicos.
En los Proyectos Genoma: manipulación computacional y
análisis de datos de secuencias biológicas (DNA o
proteínas).
Se incluye manipulación y análisis de datos de
estructuras tridimensionales (3D).
Biología
Química Física
BIOINFORMATICA
Matemática Estadística
Informática
Centros de Secuenciación
Cromatogramas
Software para producir secuencia: Phred, ABI, Sax.

Genomas secuenciados
Organismo Tamaño genoma (pb) Seq completada
Bacteriófago fX174 5386 1982

Haemophilus influenzae 1´830.138 1995
Saccharomyces cerevisiae 12 x 106 1996
Caenorhabditis elegans 95.5 x 106 1998
Arabidopsis thaliana 1.17 x 108 1999
Drosophila melanogaster 1.8 x 108 1999
Homo sapiens 3.3 x 109 2000
Objetivos básicos
 Comprender la organización de la vida
 Conocer la función de los genes y sus alteraciones
 Describir detalladamente a las familias de proteínas esenciales
y específicas.
 Entender como actúa la evolución en los genomas.
 Determinar qué genes son esenciales para crear un organismo
viable
 Conocer que familias de proteínas son universales y cuales son
específicas.
 Conocer como actúa la evolución sobre los genomas.
ACTIVIDADES EN LA ERA POSTGENÓMICA
 Conocer los genoma, transcriptomas, proteomas.

 Hacer anotaciones genómicas: conocer contexto genético
 Comparar secuencias de ADN: conservación y función gémica
 Predecir la función de las proteínas: similitud de secuencias
 Diseñar mutaciones: partidores para alterar secuencias de DNA
 Modelar moleculas: estructuras 3D de moléculas biológicas
 Hacer análisis funcional: variación de la expresión génica
 Comprender los procesos bioquímicos y vías metabólicas
 Análisis filogenéticos según secuencias de ADN: origen y variabilidad
 Producir proteínas recombinantes: vacunas, alimentos
 Terapia génica: recuperación de función de secuencias alteradas
ANALISIS IN SILICO
HERRAMIENTAS ON LINE
ANALISIS FUNCIONAL
MÉTODOS DE PREDICCIÓN DE FUNCION
El objetivo: definir la función de cada uno de los genes de un genoma

y de las proteínas que codifican es uno de los aspectos más
importantes del proceso de anotación de un genoma.
Tres métodos de predicción:
 Comparación en base a similitud.
 Conservación del orden génico o sintenia.
 Análisis de las secuencias de aminoácidos de las proteínas.

Fuentes de genomas
nucleotide AF533655
BLASTP 2.2.6 [Apr-09-2003]
Reference: Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schäffer,
Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), "Gapped
BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs",
Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. RID: 1057278412-025338-20476
Query= (399 letters)
Database: All non-redundant GenBank CDS

translations+PDB+SwissProt+PIR+PRF
1,463,011 sequences; 469,658,079 total letters
If you have any problems or questions with the results of this search
please refer to the BLAST FAQs
Taxonomy reports
Score E
Sequences producing significant alignments: (bits) Value
gb|AAN04033.1| cysteine desulfurase [Geobacillus stearother... 798 0.0

ref|NP_633541.1| Cysteine desulfurase [Methanosarcina mazei... 256 6e-67
ref|NP_615209.1| NifS protein [Methanosarcina acetivorans s... 248 2e-64
ref|NP_276505.1| nifS protein [Methanothermobacter thermaut... 247 2e-64
ref|NP_465936.1| similar to aminotransferase [Listeria mono... 238 1e-61
ref|NP_577893.1| nifS protein [Pyrococcus furiosus DSM 3638... 238 2e-61
ref|NP_125925.1| NIFS PROTEIN [Pyrococcus abyssi] >gi|13431... 238 2e-61
ref|NP_471838.1| similar to aminotransferase [Listeria inno... 236 7e-61
ref|NP_624185.1| Selenocysteine lyase [Thermoanaerobacter t... 228 2e-58
ref|NP_834652.1| Cysteine desulfhydrase [Bacillus cereus AT... 221 2e-56
Bioinformática
Región promotora de iscS de G. stearothermophilus V
.........550 gtttaagcggccatgaagcaccctacataatgcagaacaaccagttggtgt
601 taaaaccgggaatggcattcaccgttgaaccgggaatttacttaccaggtaagggcggtg
661 tccggatcgaagacaatattgtgattacggaaaatggatttatcaatttgatgtcctatc
-35 rbs -10
721 acaaagacctgatcacgctctagggagggagaagcaatgaatcttgaacaaataagaaaa
M N L E Q I R K 8
781 gataccccgcttcataaaaaatattcctatataaataccgctgcagcttccccgccaccg
D T P L H K K Y S Y I N T A A A S P P P 28
841 cagcaagttgtcgatgcaatgaccgattacctgcaaaaaacagccagtttgggcccatac
Q Q V V D A M T D Y L Q K T A S L G P Y 48
901 ttgcctgcgtttcgcaaagagatatatgcaaaggtcgatgaaattcgcggaaaagtggca
L P A F R K E I Y A K V D E I R G K V A 68
961 gaatttataggtgcaagttcc 981 ...
E F I G A S S 75 ...
Neural network promoter prediction:

Score Promoter Sequence
0.97 CAATATTGTGATTACGGAAAATGGATTTATCAATTTGATGTCCTATCACA
http://www.fruitfly.org/cgi-bin/seq_tools/promoter.pl
Estructura secundaria del extremo carboxilo
terminal de IscS
290 300 310 320 330 340 350
| | | | | | |
IscS
YAWAIGIESIYQRVKDLTEYTVKQLSTIPGISIYGPEDIKNRLAIIPFNVKGLTPERITEFLEENHIIIE
DPM hhhhecehceehhehchchccehcccccccccccccccchchhheecccccccccchhhhhhhhhheeeh
DSC hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhccccccccccccccccceeeeeecccccccchhhhhhccceeee
GOR4 hhhhhchhhhhhhhcccccccccccccccceeeccccchhhhhhhhccccccccccchhhhhhhchhhhh
HNNC hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhehhhhccccceeeccccccccceeeeeecccccchhhhhhhhhccheeeh
PHD hhhhhchhhhhhhhhhhhhhhhhhhhccccceeecccccccccceeeeeeccccchhhhhhhhhcceeee
Predator hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhccccccccccccccchhhhhhccccccccccchhhhhhhhhheeeee
SIMPA96 hhhhchhhhhhhhhhhhhhhhhhhhcccccceeecccchhhhheeecccccccchhhhhhhhhcceeeee
SOPM hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhctttttceeecccccctheeeeeeeettccchhhhhhhhhtteeee
Sec.Cons. hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh?cccccceecccccc?chheee??ccccccchhhhhhhhhcheeee
360 370 380 390

| | | |
IscS
AGTFMANTMLQQYRINKMARFSPHYFNTKEEIERAVDLIKTLIRKEGQQ
DPM hcchhhchhhhhchhchhhhcccccccchhhhhhhhhhehchehhhccc
DSC ccccccchhhhhhcccccceeeeecccchhhhhhhhhhhhhhhhhhccc
GOR4 hchhhhhhhhhhhhhhhhhccccccccchhhhhhhhhhhhhhhhcccee
HNNC hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhcccccccchhhhhhhhhhhhhhhhhcccc
PHD cccccccccccccccceeeeeeeecccchhhhhhhhhhhhhhhhhhccc
Predator cccccchhhhhhhhhhhhhcccccccchhhhhhhhhhhhhhhhhhhccc
SIMPA96 cccchhhhhhhhhhhhhhhcccccccchhhhhhhhhhhhhhhhhhcccc
SOPM tthhhhhhhhhhhhhhhhhtcccccccchhhhhhhhhhhhhhhhtttcc
Sec.Cons. ccc?hhhhhhhhhhhhhhhccccccccchhhhhhhhhhhhhhhhhhccc
http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_seccons.html
Modelo molecular de IscS
BIOLOGIA MOLECULAR
INTRODUCCION A LA
INGENIERIA GENETICA
TECNOLOGÍA DE ADN RECOMBINANTE
Dr. Juan C. Tantaleán

HERRAMIENTAS EN INGENIERIA GENETICA
A. VECTORES DE ADN
Son “vehículos” para conducir o transportar secuencias de DNA hacia
el interior de una célula.
Entre ellos: plasmidios, bacteriófagos, cosmidios, cromosomas
artificiales.
I. PLASMIDIOS:
· Moléculas circulares de DNA extracromosomal
de 1 a 250 kb, se autorreplican.
· Se encuentran en bacterias (1 a varios cientos) y
en levaduras.
· Algunos codifican genes de resistencia a metales
a antibióticos, toxinas, rutas metabólicas.
· Pueden transportar insertos de 5 kb en promedio.
LOS PLASMIDIOS COMO VECTORES
 Tamaño pequeño de 3 kb.
 Carecer del gen mob. ( conjugación)
 Origen de replicación: OriC
 Deben expresar marcadores fenotípicos o de selección.
 Secuencias de DNA que pueden ser sustituidas por DNA exógeno.
 Llevar sitios de restricción o policlonaje (polilinker).
TIPOS DE PLÁSMIDOS
a. P. Vectores:
- Poseen sitios simples de corte por ER.
- Marcadores de selección.
- Son utilizados para un amplio rango de huéspedes.
Vectores de clonamiento: pBR322, pSK+, pUC18.
Vectores de expresión: pET21.
b. P. Replicativos:
- Plásmidos naturales.
- Bajo número de copias.
- Baja capacidad de clonamiento.
Ejm: pRK290.
c. P. Movilizables:
- Se trasladan utilizando el aparato conjugativo de otros plásmidos.
Ejm: RP1, RP2, RP4
e. P. Conjugativos:
- Tienen capacidad de transferirse de una célula a otra.
Ejem: pF (K-12), pTi
- Parecidos a F : Poseen resistencia a fármacos.
Ejm: R 100.
GRUPOS DE INCOMPATIBILIDAD EN LOS PLASMIDIOS (Inc)
Dos plasmidios que no pueden coexistir en una misma célula

porque comparten el mismo mecanismo de control de la
replicación
NUMERO DE PLASMIDIOS EN UNA CELULA
 Alto número de copias

 Bajo número de copias
II.BACTERIOFAGOS O FAGOS
• El fago Lambda .
• DNA de doble cadena, lineal.
• Tamaño de 48.5 kb.
• Recibe tamaños de insertos de 18 a 25 kb.
• Poseen sitios de reconocimiento donde se
inserta el DNA exógeno.
• El empaquetamiento se realiza in vitro.
• F Fago  + DNA foráneo
OTROS BACTERIOFAGOS:
o Bacteriófago M13. su replicación no produce lisis a la bacteria.

- inconveniente que sólo permiten la secuenciación en una única
dirección.
III. LOS COSMIDIOS.
• Plasmidio + secuencia cos del Fago  = COSMIDO

• Tamaño de 5 kb.
• Creados para clonar fragmentos largos de DNA.
• Recibe tamaño de insertos entre 40 y 45 kb.
IV. VECTORES DE ULTIMA GENERACIÓN.
Llevan insertos grandes de DNA ( > 50 kb).
Entre ellos:
 Cromosomas artificiales de levaduras ( YAC)
(llevan insertos de > 200 kb).
 Cromosomas artificiales de bacterias ( BAC),
(> 300 kb)
 Cromosomas artificiales de P1 (PACs), (>
350 kb). Puede producir deleciones en el DNA
exógeno.
B. CORTE DEL ADN EN SECUENCIAS ESPECIFICAS.
USO DE ENZIMAS (ENDONUCLEASAS) DE RESTRICCIÓN (ER)

Llamadas endodesoxiribonucleasas.
 Reconocen y cortan secuencias específicas en el DNA (4 a 8 pb).
 Se encuentra en bacterias (eubacterias y arqueobacterias).
 Se nombran de acuerdo a la especie de donde proviene y nº romano para
 distinguir enzimas diferentes.
CLASIFICACIÓN DE LAS ER
CLASE I:
- no cortan en los sitios de reconocimiento, sino a una distancia de
varios nucleótidos.
- Expresadas por tres genes.
- Funciones: cortar el DNA y modificar el DNA.
- Requiere de iones de Mg, ATP y SAM
CLASE III : Expresados por dos genes y sus funciones son semejantes a
la clase I.
CLASE II:
- Reconocen y cortan el DNA en secuencias específicas.
- El sistema de restricción- modificación es expresado por dos genes diferentes y
expresan dos enzimas.
a. Las ER clase II:
Cortan ambas tiras del DNA.
Requiere de iones de Mg.
b. Metiltransferasa clase II: produce modificación del DNA en forma
independiente.
RECONOCIMIENTO DE SECUENCIAS DE ADN POR LAS ER.
PALINDROMO: secuencia de caracteres que se lee lo mismo de derecha a izquierda y al

contrario.
Secuencias palindrómicas: secuencias del DNA con un eje de simetría repetitivo:

Ejm:
Eco RI CORTE ESCALONADO 5’ .............G AA T T C.........3’
Y EXTREMOS COHESIVOS 3’ ........... C T T A A G........5’
CORTE
Hpa I CON EXTREMOS ROMOS 5’ .............GTT AA C ..........3’
3’ ............. CAA TTG ...…...5’
ACTIVIDAD DE LAS ER DE LA CLASE II
a. UNIDAD DE ENZIMA:
Cantidad de enzima que digiere 1 ug de DNA en 1 hora a 37 ºC.
a. PARÁMETROS DE REACCIÓN:
Temperatura (el óptimo corresponde a la Tº del organismo), pH y
fuerza iónica.
FACTORES QUE AFECTAN LA ESPECIFICIDAD DE LAS ER DE LA

CLASE II.
1. Secuencia de reconocimiento en el ADN.

2. Posición del sitio de corte en la secuencia.
3. Influencia de la metilación en las secuencias de reconocimiento.
Otros factores que afectan la actividad de las ER:
• Contenido de Guanina/Citosina y distribución de las bases.

• Tamaño del DNA y secuencia de corte.
• Longitud y composición de las bases.
• Posición de los sitios de corte.
• Estructura terciaria del DNA.
• Modificación del DNA y ataque por enzimas.
Mapa de restricción de pBR322
USOS DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCION
1. Uso en marcadores moleculares o variabilidad genética .
2. Evidenciar defectos genéticos o alteraciones de secuencias.
3. Taxonomía: Ver relaciones filogenéticos.
5. Preparación de ADN recombinante.

UNION DE FRAGMENTOS
DE RESTRICCION
EXTREMOS COMPATIBLES
Corte con la misma enzima.
UNION DE FRAGMENTOS CORTADOS CON
UNA ENZIMA DE RESTRICCION
FIN
UNIVERSIDAD NACINAL SAN LUIS GONZAGA DE ICA
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS
ESCUELA DE BIOLOGIA
IDENTIFICACION DE ACIDOS NUCLEICOS
Técnicas de hibridación
 Southern blot
Northern blot
Dr. Juan C. Tantaleán

Qué es el Blotting?
 Blots son técnicas de transferencia de DNA , RNA

y proteínas sobre un soporte de manera que
puedan ser separados, a menudo se usa
electroforesis.
 Southern blot se usa para transferir DNA
 Northern blot para transferir RNA y
 Western blot para transferir PROTEINAS.

TIPOS DE TECNICAS DE BLOTTING
Blotting technique
Southern Blot Northern Blot Western blot

It is used to detect DNA. It is used to detect RNA. It is used to detect protein.
IDENTIFICACION DE ACIDOS NUCLEICOS
Ubicación de secuencias nucleotídicas específicas : ADN o ARN
HIBRIDACION
• Apareamiento complementario de bases entre dos ácidos

nucleicos de hebra simple  producto de hebra doble.
DNA/DNA
DNA
RNA/RNA
RNA
DNA/RNA
Dos hebras simples aparean si son complemenarias

DESNATURALIZACION Y RENATURALIZACION DEL ADN
1. DESNATURALIZACION:
Separación de las 2 hebras del ADN por ruptura de los enlaces
de H.
Factores desnaturalizantes:
• Por pH > 13
• Por temperatura 90 - 100 ºC
• Interferencia de puentes de H: Formamida, urea
fromaldehido
2. RENATURALIZACION O HIBRIDACION DEL DNA
Recuperación del estado de 2 hebras por unión complementaria.
Condición renaturalizante:
• 55 - 65 ºC
A < temperatura < especificidad de renaturalización
Desnaturalización y renaturalización
Doble hebra Hebra simple Doble hebra

Factor Condición de
desnaturalizante renaturalización
Unión de secuencias
complementarias
Formación de enlaces de H
entre pares: AT y GC
FACTORES QUE AFECTAN LA ESTABILIDAD DE LA
HIBRIDACION ENTRE ACIDOS NUCLEICOS
 Porcentaje de pares GC v/s pares AT

 Grado de complementariedad entre hebras
 Largo de las hebras de polinucleótidos
 Concentración de sales en la solución de hibridación
 Temperatura de reacción de hibridación
 Concentración de formamida en la solución de hibridación
Efecto del porcentaje de GC en la desnaturalización
del ADN
Temperatura de “melting” (Tm): o de desnaturalización
Temperatura requerida para

lograr la separación de la
doble hebra.
HIBRIDACION DE ACIDOS NUCLEICOS CON SONDAS
Sondas: son hebras simples de DNA o RNA de 5 a más de 1000
nucleótidos, complementarias a secuencias nucleotídicas específicas.
Para su diseño se requiere conocer la secuencia nucleotídica a la cual
debe unirse.
HIBRIDACION CON SONDAS DE ARN
Aplicaciones de la hibridación con sondas
Identificación de Identificación de ADN viral

secuencias de ADN
Métodos de hibridación de ácidos nucleicos
• Métodos
 En fase líquida
 En soporte sólido: nylon, nitrocelulosa, PVDF (difluoruro de
polivinilideno), etc. marcas comerciales: Immobilon
 In situ: uso de sondas fluorescente en células o cromosomas.
• Etapas:
 Desnaturalización de la muestra
 Aplicación de sonda monocatenaria
 Condiciones de hibridación
 Detección de la sonda
TECNICAS DE HIBRIDACION DE ACIDOS NUCLEICOS.
SOUTHERN BLOT: Edward M. NORTHERN BLOT: Hibridación

Southern, 1975. Hibridación de de secuencias de ARN
secuencias de ADN
SOUTHERN BLOTTING
 Profesor Bioquímico Sir Edwin

Southern desarrolló el método
en 1975.
 Southern ganó el premio
Lasker por investigación en
Clinical Medical Research por
el método de detección de
secuencias específicas de DNA .
Esto lo realizó en la Universidad
de Edinburgh .
 La técnica se conoce como
'Southern blotting'
Professor Sir Edwin Southern

SOUTHERN BLOT: Hibridación de DNA
• Identificar una secuencia de ADN.

• Ubicación de genes.
• Identificación de organismos.
• Caracterización molecular.
Procedimiento.
 Corte del ADN genómico con enzimas de restricción

 Separación electroforética de fragmentos de ADN en gel de
agarosa.
 Transferencia del ADN del gel hacia una membrana de
nitrocelulosa o nylon.
 Hibridación mediante una sonda específica con marca
radiactiva (RNA, cDNA, oligonucleótido).
 Autoradiografía.
Electroforesis de ADN en
gel de agarosa
Transferencia hacia
membrana de nitrocelulosa
o nylon
Southern blot: identificación de ADN
Esquema de Southern Blot
Esquema de aplicación de Southern Blot
NORTHERN BLOT: Hibridación de RNA
• Permite detectar la presencia de un transcrito (ARN). Primer nivel de

expresión.
• Proporciona información de su tamaño y procesamiento.
Procedimiento
 Extracción de ARN (total o mensajero), purificar.
 Separación de ARN mediante electroforesis en gel de agarosa.
 Transferencia del ARN del gel hacia una membrana de
nitrocelulosa o nylon.
 Hibridación mediante una sonda específica con marca radiactiva
(RNA, cDNA, oligonucleótido).
 Autoradiografía.
Esquema de Northern blot
Esquema de Northern blot
FIN
PRACTICA
Discusión de las técnicas

Southern Blot y Northern Blot
SEPARACION
ELECTROFORETICA
DE FRAGMENTOS
DE ADN
TRANSFERENCIA
HACIA UNA
MEMBRANA DE
NYLON
AUTORADIOGRAFIA
SOUTHERN BLOT
IDENTIFICACION
DE DNA
NORTHERN BLOT: Identificación de RNA
1. Extracción del RNA 4. Generación de una sonda marcada

dATP
dGTP
dTTP
dCTP
pGEM-T
2. Electroforesis del RNA
5. Hibridación
6. Autoradiografía
3. Transferencia a membrana
AMPLIFICACION DE ADN:
Reacción en cadena de la ADN
polimerasa (PCR)

PCR: Polimerase chain reaction
1. Kary Mullis (1983) ..... Premio nobel de química

en 1993
2. Base: Amplificación in vitro de secuencias
específicas de DNA.
DNA
PCR
Muchas
moléculas
(molécula sencilla) amplificación
AMPLIFICACIÓN DE UN SEGMENTO DE ADN
El proceso, se controla con la temperatura
Desnaturalización Hibridización Extensión de 2do Ciclo

94-95°C 50-60ºC la cadena 94-95ºC
72ºC 50 - 60ºC
72ºC
Primer Ciclo
Si se repite el ciclo, se obtienen cuatro copias
Los múltiples ciclos generan un incremento
exponencial en el número de copias de ADN
Componentes esenciales en el proceso
standard de PCR
• ADN polimerasa termoestable
• Oligonucleotidos iniciadores (“primers”)
• Desoxiribonucleótidos trifosfatados (dNTPs)
• Cationes divalentes (Mg++)
• Buffer (para mantener el pH)
• ADN molde (Templado)
Reacción:
• DNA templado
• Partidores o Primers
• Nucleótidos dNTP
Aceite
• (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)
mineral
• Buffer o tampón, Mg++
• Taq Polimerasa (termoestable)
1: desnaturalización; 2: annealing; 3: extensión
Temp. 95
ºC 72 1
3
60
2
Tiempo (min)
El ciclo de PCR
 Desnaturalización – 94 - 95°C por 45 segundos si G+C < 55%
 Hibridización (Annealing) – temperatura calculada para cada par de
primers
demasiado alta = poco o nada de producto
demasiado baja = annealing no específico = productos incorrectos
 Extensión - a temperatura óptima de la ADN polimerasa utilizada
ej.: 72°C para Taq
Taq : 2000 pb/min
A partir del 3er ciclo se produce ADN de longitud deseada ( producto
principal).
Número de ciclos
- >25 ciclos para amplificar un gen de copia única a partir de ADN
genómico DNA.
- algunos componentes limitantes > 30 ciclos (si inicio = 105 moléculas)
a. ADN molde (templado)
• Puede ser DNA de hebra simple o doble.

• ADN circular y cerrado es levemente menos
efectivo que el ADN lineal
• Usualmente se utilizan varios miles de copias,
ej:
1 µg de humano
10 ng de levadura
1 ng de bacteriano
1 pg of plasmídico
• Se puede amplificar a partir de una sola
molécula de ADN molde, pero las condiciones
deben estar muy optimizadas
b. ADN polimerasas termoestables
• Sintetizan ADN dependiente del ADN templado.

• Estabilidad: Taq: 9 min at 97°C, Pwo >2 hr a 100°C
• Fidelidad: Taq: baja, Pfu: alta
• Actividad transferasa terminal: en el extremo 3´, ej.
Taq agrega una A al exremo 3´, si en el extremo hay una C
Pwo y Tli generan extremos romos.
• Cantidad usada = 5 x 1012 moleculas (1.5 unidades)
• La más común = Taq ADN polimerasa
Taq : Thermus aquaticus,
Pwo : Pyrococcus woesei,
Pfu : Pyrococcus furiosus,
Tli : Thermococcus littoralis
c. Oligonucleótidos iniciadores (primers)
• Se conoce su secuencia
• Es el factor más importante para la eficiencia y la
especificidad del proceso
• Deben estar presentes en exceso (1013 = 30 ciclos, 1 kb)
• Requieren de un diseño cuidadoso
• Reglas de diseño:
(a) longitud = 18-25
(b) Contenido de G+C entre 40-60%

(c) Evitar las secuencias repetidas
5’-NNNNNNNNNNNNNTATA-3’ 5’-NNNNNNNNTATA-3’
5’-NNNNNNNNNNNNNTATA-3’ 3’-ATATNNNNNNNN-5’
3´ repetido
5´ 3´ PCR
3´ 5´
5´ 3´
3´ 5´
Dímero de primer
5´-TATANNNNNNNNNNNNN-3´ 5´-TATANNNNNNNN-3´
5´-TATANNNNNNNNNNNNN-3´ 3´-NNNNNNNNATAT-5´
5´ repetido
5´ 3´ PCR
3´ 5´
5´ 3´
3´ 5´
no hay extensión
5’-NNNNNNNNNNNGCATGC-3’ 5’-NNNNNNNNNNNGCA
5’-NNNNNNNNNNNNNNNNN-3’ 3’-CGT
Formación de horquillas
5´ PCR
3´
5´
3´ 5´ 3´
Productos de PCR no deseados

Variantes de la PCR
• Colony PCR: uso de colonias como fuente de DNA

• Multiplex PCR: uso de varios partidores
• Nested PCR: PCR en 2 etapas
• RT- PCR: obtención de cDNA
• Real time PCR
APLICACIONES DE PCR
 Diagnóstico y detección de patógenos
 Clonamiento molecular
 Mutagénesis.
 Caracterización molecular.
 Identificación de mutaciones.
 Medicina forense.
 Otros
Amplificación de genes mediante PCR
Kb St 1 2
23
2,2
1,3
1,1
1200 pb
0,6
CLONACION DE GENES EN VECTORES T-A
A-3’ T-3'
3’-A 3'-T
Producto de PCR
Vector con cola-T
usando Taq
ligamiento
A
T-3'
A 3'-T
Ligamiento con extremo adhesivo de 1 base = 50 veces mejor

que ligamiento con extremos romos
MUTAGENESIS POR DELECION Digestiones NdeI/HindIII
de plasmidos recombinantes
Mutaciones en iscS: deleciones por

PCR del extremo 3’ St 1 2 3 4 5 St
Pb
1200 5’ 3’
1107 5’ 3’
5’ 3’
1047
5’ 3’
987
Aa
NH2 COOH 399
NH2
COOH 369
NH2
COOH
349
NH2 COOH 329 St: estandar; 1. pET21b; 2, pET1200;

3, pET1200-90; 4, pET1200-150; 5, pET1200-210
Mutagenesis con PCR- extension solapada
Primer F Primer mutagénico directo (forward)
Dos 1ros Primer R

primer mutagénico inverso (reverse)
PCRs
separadas
X
remover primers, desnaturalizar y re-hibridizar
2do PCR
x
PCR: Amplificados para la generación de mutantes puntuales
St 1 2 3 4 5
Kb
1300
iscS (1217 pb)

1100
1000
800 667 pb
600
592 pb
400
FIN
Biología Molecular
CLONAMIENTO DEL DNA Y

PRODUCCION DE PROTEINAS RECOMBINANTES
Clonamiento de DNA
 Inserción de una secuencia nucleotídica en un vector.

 La clonación de un fragmento de ADN consiste en la obtención
de muchas copias idénticas de dicho fragmento.
 Proteínas homólogas: proteínas del mismo organismo
 Proteínas heterólogas: proteínas de diferente organismo
 Vectores de clonamiento: permiten insertar secuencias de DNA

(pBluescript, pBR322, pTOPO, pGEMT)
 Vectores de expresión: permiten sobreexpresar los genes clonados
(pET-21a-d, pBAC)
 Huéspedes de clonamiento: células que portan un vector de
clonamiento con un gen clonado.
 Huéspedes de expresión: células que pueden sobreexpresar un gen
clonado en un vector de expresión.
Vectores de clonamiento
pBR322
Clonación directa de
DNA procarionte
El vector y el DNA se
cortan con la misma enzima
de restricción
Las ER pueden generar:
- extremos cohesivos.
- extremos romos.
Tres productos de la
actividad de la ligasa:
Vector - Vector
Segmento - Segmento
Vector - Segmento
1. ADN
2. Fragmentos
3. Vector
4. Huésped
5. Transformación
6. C. no transformada
7. C. transformada
8. Clon recombinante
9. Multiplicación
Clonamiento en
un plasmidio
Selección por resistencia

a antibiótico
Clonamiento de productos de PCR
utilizando vectores tipo pTOPO, pGEMT
El producto de PCR es clonado en el vector que porta la enzima

topoisomerasa
1. Se obtiene el producto de PCR y el vector TOPO
2. Se mezcla 1 ul de producto de PCR y 1 ul de vector.
3. Se incuba 5 min a temperatura ambiente.
4. Se transforman células competentes.
CLONAMIENTO DE ADN EUCARIONTE
Se requiere obtener cDNA a partir de RNAm
-Uso de partidor con secuencia poliT

- generación de híbrido (DNA/RNA)
con la enzima transcriptasa reversa
- hidrólisis alcalina del RNAm.
-La DNA polimerasa I recupera la
doble hebra del DNA.
Clonamiento de ADN en el vector YAC
TRANSFORMACIÓN CELULAR
Ingreso de DNA foráneo en una célula huésped

Tipos de transformación:
Química: uso de células quimiocompetentes con CaCl2
Electorporación: uso de células electrocompetentes
Biobalística.
Biobalística.
Producción de proteínas recombinantes
Se requiere:
 Vectores de expresión. Permiten la sobreexpresión de los
genes clonados bajo un promotor regulado (Lac).
Ejemplo: pET21
 Huéspedes de expresión. Célulasque permiten la
sobreexpresión de un gen en un huésped de expresión.
Ejemplo: E.coli JM109 (DE3)

Los vectores de expresión: pET-21
Los genes clonados en el plasmidio pET21 pueden ser sobreexpresados por

inducción de la RNA polimerasa del fago T7 con IPTG
El sitio de clonamiento múltiple o

“Polilinker”
Se encuentra bajo un promotor reconocido

por la RNApol inducible del fago T7.
El gen de la RNApol de T7 se encuentra

clonado en el genoma de E. coli
JM109(DE3) bajo un promotor Lac
Sobreexpresión de proteínas recombinantes
en huéspedes bacterianos
pLac PolT7
pT7 gen de
interés
LacI
Proteínas de
interés
Proteínas de interés que son producidas en
huéspedes heterólogos
Enzimas
Hormonas
Factores de coagulación
Antígenos para vacunas
Toxinas
PRACTICA
Sobreproducción y purificación de proteínas

recombinantes
RECUPERACION DE PRODUCTOS
BIOTECNOLOGICOS
PROCEDIMIENTO
1. Separación mecánica de células
2. Ruptura de células
3. Extracción
4. Fraccionamiento preliminar
5. Purificación de alta resolución
Uso de la cromatografía en la purificación de proteínas
Separación de compuestos en base a las diferencias de su

afinidad por una fase estacionaria y una móvil.
http://www4.ujaen.es/~pedrajas/cromatografia%20practicas.swf
St 1 2 3
kDa
150
66
45
29
12,4
Gel de poliacrilamida-SDS. Purificación de proteína de 45 kDa

FIN
Biología Molecular
CLONAMIENTO DEL DNA Y

PRODUCCION DE PROTEINAS RECOMBINANTES
Clonamiento de DNA
 Inserción de una secuencia nucleotídica en un vector.

 La clonación de un fragmento de ADN consiste en la obtención
de muchas copias idénticas de dicho fragmento.
 Proteínas homólogas: proteínas del mismo organismo
 Proteínas heterólogas: proteínas de diferente organismo
 Vectores de clonamiento: permiten insertar secuencias de DNA

(pBluescript, pBR322, pTOPO, pGEMT)
 Vectores de expresión: permiten sobreexpresar los genes clonados
(pET-21a-d, pBAC)
 Huéspedes de clonamiento: células que portan un vector de
clonamiento con un gen clonado.
 Huéspedes de expresión: células que pueden sobreexpresar un gen
clonado en un vector de expresión.
Vectores de clonamiento
pBR322
Clonación directa de
DNA procarionte
El vector y el DNA se
cortan con la misma enzima
de restricción
Las ER pueden generar:
- extremos cohesivos.
- extremos romos.
Tres productos de la
actividad de la ligasa:
Vector - Vector
Segmento - Segmento
Vector - Segmento
1. ADN
2. Fragmentos
3. Vector
4. Huésped
5. Transformación
6. C. no transformada
7. C. transformada
8. Clon recombinante
9. Multiplicación
Clonamiento en
un plasmidio
Selección por resistencia

a antibiótico
Clonamiento de productos de PCR
utilizando vectores tipo pTOPO, pGEMT
El producto de PCR es clonado en el vector que porta la enzima

topoisomerasa
1. Se obtiene el producto de PCR y el vector TOPO
2. Se mezcla 1 ul de producto de PCR y 1 ul de vector.
3. Se incuba 5 min a temperatura ambiente.
4. Se transforman células competentes.
CLONAMIENTO DE ADN EUCARIONTE
Se requiere obtener cDNA a partir de RNAm
-Uso de partidor con secuencia poliT

- generación de híbrido (DNA/RNA)
con la enzima transcriptasa reversa
- hidrólisis alcalina del RNAm.
-La DNA polimerasa I recupera la
doble hebra del DNA.
Clonamiento de ADN en el vector YAC
TRANSFORMACIÓN CELULAR
Ingreso de DNA foráneo en una célula huésped

Tipos de transformación:
Química: uso de células quimiocompetentes con CaCl2
Electorporación: uso de células electrocompetentes
Biobalística.
Biobalística.
Producción de proteínas recombinantes
Se requiere:
 Vectores de expresión. Permiten la sobreexpresión de los
genes clonados bajo un promotor regulado (Lac).
Ejemplo: pET21
 Huéspedes de expresión. Célulasque permiten la
sobreexpresión de un gen en un huésped de expresión.
Ejemplo: E.coli JM109 (DE3)

Los vectores de expresión: pET-21
Los genes clonados en el plasmidio pET21 pueden ser sobreexpresados por

inducción de la RNA polimerasa del fago T7 con IPTG
El sitio de clonamiento múltiple o

“Polilinker”
Se encuentra bajo un promotor reconocido

por la RNApol inducible del fago T7.
El gen de la RNApol de T7 se encuentra

clonado en el genoma de E. coli
JM109(DE3) bajo un promotor Lac
Sobreexpresión de proteínas recombinantes
en huéspedes bacterianos
pLac PolT7
pT7 gen de
interés
LacI
Proteínas de
interés
Proteínas de interés que son producidas en
huéspedes heterólogos
Enzimas
Hormonas
Factores de coagulación
Antígenos para vacunas
Toxinas
PRACTICA
Sobreproducción y purificación de proteínas

recombinantes
RECUPERACION DE PRODUCTOS
BIOTECNOLOGICOS
PROCEDIMIENTO
1. Separación mecánica de células
2. Ruptura de células
3. Extracción
4. Fraccionamiento preliminar
5. Purificación de alta resolución
Uso de la cromatografía en la purificación de proteínas
Separación de compuestos en base a las diferencias de su

afinidad por una fase estacionaria y una móvil.
http://www4.ujaen.es/~pedrajas/cromatografia%20practicas.swf
St 1 2 3
kDa
150
66
45
29
12,4
Gel de poliacrilamida-SDS. Purificación de proteína de 45 kDa

FIN
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS
ESCUELA DE BIOLOGIA
MUTACIÓN
Es un cambio espontáneo o inducido de la secuencia de ADN, el
cual es permanente y heredado.
Las mutaciones ocurren a través del tiempo
Expresión de las mutaciones
 En organismos haploides, las mutaciones son de carácter

dominante.
 En organismos diploides, las mutaciones pueden ser
dominantes o recesivas (sus efectos se expresan cuando
los dos genes alelos se alteran dando una situación
homocigótica).
Tipos de mutaciones
I. Según la célula afectada:

Mutación somática y mutación germinal
II. Según la amplitud de la alteración:

Mutación génica y mutación cromosómica
III. Según el origen de la alteración:

Mutación espontánea y mutación inducida
I. Mutación somática y mutación germinal
Mutaciones somáticas: los cambios ocurren en las células
somáticas, no se transmiten a otras generaciones.
Mutaciones en las líneas germinales: ocurren en las células

germinales (huevos o esperma) y se transmiten de una
generación a la siguiente.
Células somáticas Células germinales

II. Mutación génicas y mutación cromosómicas
Mutaciones génicas: son aquellas que afectan a un gen

particular.
Ejem. La anemia falciforme puede ser ocasionada por un cambio

en un solo gen.
Mutaciones cromosómicas: son anomalías en el número o

estructura de los cromosomas.
La frecuencia de estas asciende a 1 de cada 200 recién nacidos
vivos.
Ejem. El síndrome de Down: se produce por trisomía del
cromosoma 21.
ADN
mutado
Fig. 11.2
Mutaciones genómicas
Trisomía 21 síndrome de Down
MUTACIÓN GENETICAS: A NIVEL DEL DNA
:
Mutaciones puntuales: ocurren por un cambios de una base o
par de bases
1. Transición: cambios T C ó C T
A G ó G A
2. Transversión: cambios T ó C A ó G
A ó G T ó C
3. Inserción: Adiciona una base al DNA
4. Deleción u omisión: suprime una base

Las inserciones y deleciones generan desplazamiento del
marco de lectura
MUTACIÓN TAC GGA C TA ATA GTA

POR MARCO DE
INSERCION LECTURA
ALTERADO
INSERCION
DNA TAC GGA TAA TAG TAT

NORMAL MARCO DE
LECTURA
NORMAL
A DELECION
MUTACIÓN
POR TAC GGT AAT AGT ATC
DELECION MARCO DE
LECTURA
ALTERADO
Mutación en sitios multiples: cambios a más de una base.

Pueden ocurrir deleciones o inserciones.
Mutaciones puntuales
MUTACIONES A NIVEL CROMOSOMAL
Deleciones cromosómicas
• Deleción terminal
• Deleción intersticial
Amplificaciones cromosómicas
• Amplificación in situ
• Generación de pequeños duplicados
Reorganizaciones cromosómicas
• Translocación cromosómica
• Inversión cromosómica
Deleciones cromosómicas
Deleción Chromosome Deleción

normal
Terminal humano intersticial
Amplificación cromosómica
Amplification Normal Double Minute Homogeneously

in situ Human Chromosomes Staining Region
Chromosome (HSR)
III. Mutación espontánea y mutación inducida
• Mutación espontánea: La variabilidad genética producida en

las poblaciones naturales se debe a posibles errores
ocurridos a escala molecular, Ejemplo, en la replicación del
ADN, tautomerización, desaminación, etc.
• Mutación inducida: producidas directa o indirectamente,

con intención o sin ella, por intervención humana. Ejm.
mutagénesis
MUTACIÓN INDUCIDA
• Un mutágeno es un agente físico o químico que

altera la información genética de un organismo y
ello incrementa la frecuencia de mutaciones por
encima del nivel natural.
• La frecuencia normal de mutación en el ser

humano es de 1 por cada millón de gametos.
A.- MUTÁGENOS QUÍMICOS:
1. Análogos de bases:
Estructuras similares (análogos) a bases.
5 – bromouracilo Timina
Causan : Tautomerización y apareamiento erróneo.
2. Agentes desaminantes y alquilantes:

Modifican grupos laterales de bases.
Desaminantes: Ejm. Ác. nitroso.

Adenina hipoxantina Citosina
NH2
Citosina Uracilo Adenina
Alquilantes: Ejm. Oxido de etileno, entre otros.

3. Mutágenos que provocan desplazamiento de
marco de lectura:
Acridina : induce inserciones o deleciones.
B.- RADIACIONES:
Rayos UV, gama y X ; emisiones  y 
Luz ultravioleta: de longitud de onda de 260 nm, es la de

absorción máxima del DNA y produce formación de dímeros
de pirimidina.
FOTOREACTIVACION: En presencia de luz se activa la
enzima FOTOLIASA
Para  la mutación evitar la fotorreactivación.

ELEMENTOS GENETICOS TRANSPONIBLES
Secuencias de ADN que tienen la propiedad de cambiar
de posición dentro del genoma.
TRANSPOSONES EN BACTERIAS
Existen dos tipos de elementos genéticos móviles:
Tipos:
Transposón simple, Secuencia de Inserción o Elemento de Inserción (IS): contienen
una secuencia central con información para la transposasa y en los extremos una
secuencia repetida en orden inverso no necesariamente idéntica, aunque muy
parecida. Cuando se integra aparece una repetición directa de la secuencia diana
(5-12 pb).
Transposón compuesto (Tn): contienen un elemento de inserción
(IS) en cada extremo en orden directo o inverso y una región
central con información de otro tipo. Por ejemplo, factores de
resistencia (RTF), en la zona central para resistencia a antibióticos
(cloranfenicol, kanamicina, tetraciclina, etc.).
DISEÑO DE MUTACIONES:
MUTAGENESIS
FINES
 Verificar la función de los genes.
• Uso de cassets de mutagénesis: inserciones
 Cambiar las características de las proteínas.
• Cambio de aminoácidos: mutación sitio dirigida.
• Proteínas truncas: deleciones
• Proteínas de fusión: unión de secuencias
diferentes.
Uso de cassets de mutagénesis: insersiones
Fusión de proteínas
QUE SIGNIFICAN LAS MUTACIONES ?
Cómo afectan los genes a la salud?
De donde vienen y a donde van las mutaciones…?
 Podemos heredar mutaciones genéticas.

 Podemos adquirir mutaciones genéticas durante nuestra vida.
 Podemos tener una base genética que nos predispone a ciertas
enfermedades.
APORTES DE LA MUTACIONES:
 Variación genética.
 Evolución.
 Adaptación a las condiciones ambientales.
FIN
Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica
BIOLOGIA MOLECULAR
BIOLOGIA MOLECULAR DEL CANCER
Y TERAPIA GENICA
Dr. Juan C. Tantaleán Vásquez

BIOLOGIA MOLECULAR DEL CANCER
El ciclo celular es regulado
MITOSIS
G2 G1
INTERFASE
La alteración del comportamiento del ciclo celular

conlleva a una proliferación no controlada de las células
Cáncer
Enfermedades que pueden afectar a

cualquier parte del organismo. Llamadoas
tumores malignos o neoplasias malignas.
Característica del cáncer:

Metástasis: multiplicación rápida de
células anormales, se extienden más allá de
sus límites habituales y pueden invadir
partes adyacentes del cuerpo o propagarse
a otros órganos, proceso conocido como.
Las metástasis son la principal causa de

muerte por cáncer.
Tumores benignos.
No son cancerosos. Generalmente se
pueden extirpar. En la mayoría de
los casos, no vuelven a crecer. Las
células de los tumores benignos no
se diseminan a otros tejidos o partes
del cuerpo.
Tumores malignos.
Son cancerosos. Las células en estos
tumores pueden invadir el tejido a
su alrededor y diseminarse a otros
órganos del cuerpo (metástasis).
El cáncer es la principal causa de muerte a escala mundial. Se le
atribuyen 8,2 millones de defunciones ocurridas en todo el mundo en
2012.
Principales tipos de cáncer:
 pulmonar (1,59 millones de defunciones);

 hepático (745 000 defunciones);
 gástrico (723 000 defunciones);
 colorrectal (694 000) defunciones;
 mamario (521 000 defunciones);
 cáncer de esófago (400 000 defunciones).
CARACTERISTICAS DE LAS CELULAS CANCEROSAS
 Multiplicación en ausencia de estimulantes de crecimiento.

 No responden a la apoptosis: muerte celular programada.
 Hacen metástasis: diseminación de células cancerosas por el cuerpo,
formación de zonas de crecimiento secundarias.
 Invaden tejidos: acción proteolítica a través de la lámina basal.
 Tumores primarios y secundarios requieren angiogénesis.
 Células de cultivos celulares pueden transformarse con DNA de
células cancerosas.
 La mayoría de mutaciones que originan cáncer se dan en células
somáticas y no en células germinativas
 Células cancerosas se originan por lo general de células madre y de
otras células proliferativas.
Causas ambientales del cancer
Causas ambientales del cancer
Factores ambientales asociados a

cancer:
• Virus oncogénicos
• Consumo de cigarrillos
• Alimentación con agentes
conservantes
• Radiación
• Agentes químicos industriales
• Contaminación
LOS GENES Y EL CÁNCER
• Los cambios en la información genética de la célula provocados por
substancias químicas, radiación, virus y herencia contribuyen al
desarrollo del cáncer.
Tipos de genes que pueden mutar y causar cancer
• Genes supresores de tumores,

oncosupresores
• Oncogenes
• Genes de reparación de DNA
• Gen de la telomerasa
• Gen de la proteína p53
ONCOGÉNES
• Los oncogenes son los genes cuya

PRESENCIA en cierta forma o cuya
sobre-actividad, o ambas, puede
estimular el desarrollo del cáncer.
GÉNES DE SUPRESIÓN TUMORAL:

ONCOSUPRESORES
• Son genes normales cuya AUSENCIA o

su falta de funcionamiento puede
causar el cáncer. Entre los más
estudiados se encuentran las proteínas
p53 y pRb.
Protooncogenes y genes oncosupresores
Protooncogenes: genes normales del control de proliferación

celular que pueden convertirse en oncogenes.
Oncogen: generan productos que inducen células cancerosas
Genes oncosupresores: supresores de tumores
factor
Protooncogen oncogen
inductor
oncosupresor células cancerosas

Activación de proto-oncogenes
Carácter genético
• Mutaciones dominantes con ganancia de función: protooncogenes
• Mutaciones recesivas con pérdida de función: oncosupresores
• Protooncogenes: factores de crecimiento, transductores de señal, factores de

transcripción ( Ejem. Ras es transductor de señal).
• Oncogen: v-src del virus del sarcoma de Rous
La transformación de las células ocurre en varias etapas
Origen de un cáncer
El desarrollo de cáncer requiere varias mutaciones:
Células normales
Activación de oncogen ras
Pérdida de APC, DCC, p53
Células tumoral
Modelo de
cáncer
colorectal
Deleted in colon cancer (DCC)
APC (adenomatous polyposis coli)

GÉNES DE REPARACIÓN DE DNA
• Codifican proteínas cuya

función normal es
corregir errores que
surgen cuando las
células duplican su DNA
antes de dividirse.
p53
Puede provocar el suicidio de células (apoptosis), detiene el
crecimiento y la división de las células que han sufrido daño en su
ADN.
 Suppresses progression through the cell cycle in response

to DNA damage
 Initiates apoptosis if the damage to the cell is severe
 Acts as a tumour suppressor
 Is a transcription factor and once activated, it represses
transcription of one set of genes (several of which are
involved in stimulating cell growth) while stimulating
expression of other genes involved in cell cycle control
Role of pRB in regulating cell division.
pRB – (Retinoblastoma protein) Se encarga

de regular el paso de células desde la etapa
G1 del ciclo celular a la fase S, durante la
cual ocurre la síntesis de DNA
PREDISPOSICIÓN HEREDITARIA AL CÁNCER
• Gen hereditario dominante: descendiente de un progenitor afectado

tiene un riesgo del 50% de heredar la predisposición al desarrollo de
cáncer.
GENE THERAPY
Gene therapy is a technique for correcting defective genes

responsible for disease development.
• A normal gene may be inserted into a nonspecific location

within the genome to replace a nonfunctional gene.
• An abnormal gene could be swapped for a normal gene
through homologous recombination.
• The abnormal gene could be repaired through selective
reverse mutation, which returns the gene to its normal
function.
•The regulation of a particular gene could be altered.
METODOS DE TRANSFERENCIA DE GENES TERAPEUTICOS
Fisicos Químicos Virales Otros
Microinyección Fosfato calcico Retrovirus Oligonucleotidos

antisentido
Electroporación Liposomas Adenovirus Marcaje celular
Microproyectiles Policationes Parvovirus Ribozimas
Inyección directa Derivados de Cromosomas

de ADN virus vaccinia artificiales
humanos
CARACTERISTICAS DE UN VECTOR IDEAL
• Facilitar la entrega del gen terapéutico a la célula.

• Permitir la expresión del gen con eficacia.
• Debe ser seguro para el paciente y su entorno.
• Proteger el ADN de interés, no causar desordenes.
• No ser reconocido por el sistema inmunitario.
• Ser destinado con especificidad celular posible a un
órgano o tejido.
VECTORES VIRALES
acción de un vírus
asociado a terapia génica
Modo de acción de un virus.

Introducción de genes modificados:
Ex-vivo
In-vivo
Westernblot.
Técnica para identificar y localizar proteínas en base
a la capacidad de unirse a anticuerpos específicos
 Separación de proteínas en gel de poliacrilamida

 Electrotransferencia a una membrana de nitrocelulosa.
 La membrana se incuba con un anticuerpo especifico que
reconozca la proteína de interés.
 Se revela la reacción.
Electrotransferencia
Fundamento de
la técnica
Westernbloth
Esquema de Westernblot
FIN
DEL CURSO
GRACIAS...

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UNIVERSIDAD NACIONAL SAN LUIS GONZAGA DE ICA

La replicación del ADN

Dr. Juan C. Tantaleán Vásquez

Es un proceso natural, complejo y ordenado mediante el cual se

El ciclo celular es un conjunto de procesos que realiza una célula

El ADN se replica en la Fase S.

En procariontes es unifocal En eucariontes es multifocal

Iniciaría la Repara el Replica el DNA Alarga ambas Polimeriza el

6. Proteínas de unión a hebra simple (SSB)

 El ADN procarionte es circular

Tamaño pequeño grande

ADN Polimerasas menos compleja mas compleja

Número de orígenes unifocal multifocal

Coloca el partidor Primosoma Primasa

Fragmento de Okazaki 1000-2000 pb 100-200 pb

Veloc. de replicación 1000 pb/min 100-250 pb/min

Esta presentación tiene aportes de diversos autores. Se agradece su contribución a la enseñanza de la

Reparación del ADN

Dr. Antonio Barbadilla

 Las copias del ADN deben ser identicas.

1. Pérdida de bases tipo purinas por ruptura espontánea

citosina uracilo 5-metil citosina timina

Fig 5-49 .- Biología Molecular de la Célula 4ª ed., Alberts y col.

 El metabolismo celular expone el DNA a los efectos perjudiciales de las

 Se conocen más de 100 modificaciones oxidativas diferentes en el DNA.

 Si oxoG se con A se produce

Puede aparearse con C o T,

 La alquilación de la posición N7 de un nucleótido de purina, hace

1. Radiaciones ionizantes: rayos

Los rayos UV causan dímeros de timina en el DNA y es reparado

 La luz UV une de forma

 Los dímeros de timina

 Con menos frecuencia se

Fig 5-48 .- Biología Molecular de la Célula 4ª ed., Alberts y col.

• Escisión de la región dañada seguida de remplazamiento preciso

Fig 5-50 .- Biología Molecular de la Célula 4ª ed., Alberts y col. (modificada)

De forma general este sistema implica:

• Detección del daño: mecanismo de

• Actividad Endonucleasa (escinucleasa)

• Sistema de replicación: DNA polimerasa y

Fig 5-50 .- Biología Molecular de la Célula 4ª ed., Alberts y col.

Comparación en E. Coli y en humanos

Función E. Coli Humanos

Nucleasa: UvrB, UvrC XPF, XPG

Sistema de DNApol I/DNApol II; DNApol d/e; ligasa

¿Cómo se reconoce la cadena dañada?

La cadena hija permanece sin metilar en las secuencias GATC varios

 Comparación de los sistemas enzimáticos en E. Coli y en humanos

Función E. Coli Humanos

Reparación de MutL hMLH1-PMS1, PMS2

Sistema de DNApol III; ligasa DNApol d/e; ligasa

Las roturas de doble cadena son potencialmente letales

Causas de rotura de doble hebra

ATM: proteína quinasa

Proceso de síntesis de ARN (transcrito) a partir

 La cadena de RNA crece en sentido

Diferencias con la replicación:

Organización policistrónica: un transcrito puede

- Holoenzima de 5 subunidades: ’

1. Desenrollar y enrollar el DNA

 Requiere molde DNA.

- Sitio de unión de la RNA

Región río arriba Región río abajo