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LA SECUENCIA DE ADN A AMPLIFICAR (ITS1) La biologa y gentica molecular es el campo de la biologa que estudia la estructura y funcin de los genes

a nivel molecular, empleando conjuntamente los mtodos de las dos disciplinas. El desarrollo de estas disciplinas de la biologa, ha sido posible gracias a la aparicin de tcnicas que permiten abordar el anlisis y la manipulacin del ADN como antes no era posible. Entre la tcnicas que constituyen la tecnologa del ADN esta el mtodo de obtencin de fragmentos especficos (como enzimas de restriccin) que permiten el aislamiento y manipulacin del ADN; los mtodos de obtencin de copias mltiples del mismo fragmento de ADN (Clonacin o PCR: Reaccin en Cadena de la Polimerasa); la identificacin de fragmentos especficos de ADN o ARN y la determinacin del orden exacto de los nucletidos en una regin de ADN. Un rea importante dentro de la gentica molecular es el uso de la informacin molecular para determinar los patrones de descendencia y por lo tanto, la correcta clasificacin cientfica de los organismos, lo que se denomina sistemtica molecular. Las secuencias de ADN capaces de otorgarnos informacin respecto del parentesco entre los organismos, deben cumplir ciertos requisitos: a) estar presentes en todos los organismos vivos, b) tener un origen en comn (ser homologas) y c) haber evolucionado muy lentamente (ser altamente conservadas). Los genes del ARNr, que codifican para las partes de ARN de los ribosomas, se ajustan a estos requisitos y son los favoritos de la mayora de los sistemticos moleculares, en particular de aquellos que trabajan con hongos y plantas. Para el estudio de los organismos (molecular y genticamente) el empleo de tcnicas que abordan el ADN es muy importante, en especial si se desea conocer un fragmento en especfico y su secuencia. Uno de los estudios que se pueden realizar para la identificacin de especies y su comparacin es mediante el empleo de regiones ITS, (debido a su sigla en ingls Internal Transcribed Spacer - espaciadores internos transcritos) como marcadores, que varan entre cada especie. Para conocer que son las regiones ITS es necesario enfocarse en primera en los ribosomas, estas son estructuras celulares en donde el ARNm es traducido a protenas, los ribosomas estn compuestos de RNA (rRNA) y protenas ribosmicas, conocidas como ribonucleoprotenas. Adems, cada ribosoma est formado por dos subunidades (mayor y menor). Su estructura, tanto en organismos procariontes como eucariontes, es similar y su tamao se mide por unidades S (Svedberg), que corresponde a medidas o velocidad de sedimentacin de las partculas. Asimismo, difieren estos organismos en la composicin de bases del rRNA. Los procariontes constan de 70S constituidos de una subunidad pequea de 30S y otra de 50S. La subunidad 50S est formada por 34 protenas y 2 tipos de molculas de rRNA: 5S Y 23S (5S rRNA y 23S rRNA). La subunidad 30S consiste de 21 protenas y un RNA ribosmico de 16S (18S rRNA) (Snchez 2003; Paniagua et al. 2003). Los eucariontes tienen 80S con una subunidad de 40S y otra de 60S. La subunidad menor de 40S est formada por 33 protenas y un RNA ribosmico de 18S

(18S rRNA). La subunidad de 60S consiste de 49 protenas y 3 tipos de molculas de rRNA: 5S, 5.8S y 28S (5S rRNA, 5.8S rRNA y 28S rRNA) (Snchez 2003; Paniagua et al. 2003). En la mayora de los organismos eucariontes la secuencia de DNA que codifica al rRNA, es conocida como rDNA. Adems, el rDNA est organizado como una unidad que se repite en tandem (una tras otra) en el genoma. Cada unidad repetida consiste de tres genes de rRNA: el gen que codifica para el 18S rRNA, el gen para 5.8S rRNA y el gen para 28S rRNA. Adems, en cada unidad, los genes estn separados por dos secuencias espaciadoras internas nucleotdicas de 250 a 300 nucletidos, denominadas ITS1 e ITS2. Estas secuencias ITS aunque son transcritas, no son codificantes. Adems, cada unidad de rDNA se encuentra separada por un espaciador intergnico, IGS (Inter Genic Spacer) o espaciador no transcrito (NTS), con 2 regiones no codificadoras, los espaciadores externos transcritos (ETS1 y ETS2). Mientras la secuencia de los genes ribosomales es muy conservada entre las especies, las secuencias para las regiones espaciadoras no codificantes, ITS e IGS, pueden variar sustancialmente aun entre las especies cercanamente relacionadas debido a que cambian rpidamente y pueden ser tiles para la comparacin de especies dentro de un gnero o dentro de una especie (Stouthamer 2007). La razn de esta variacin es que durante la evolucin del genoma las regiones ITS van acumulando cambios que indican variacin intragenmica til a nivel inter e intraespecfico. Por este motivo, las regiones espaciadoras internas de transcripcin surgen como un concepto de la Biologa Molecular para la tipificacin gentica de organismos. Como se conoce ahora, las secuencias que constituyen las regiones ITS estn presente entre los rDNA 18S y 28S y para saber esta organizacin partiremos de la idea de que todos los organismos eucariontes tienen dos regiones ITS: ITS1 e ITS2 y para conocer la estructura de los genes se necesita identificar la localizacin de ambos ITS. Se sabe que el ITS1 se ubica entre el gen que codifica el rRNA de 18S y el gen que codifica al rRNA de 5.8S. Mientras que el ITS2 se encuentra entre los genes de los rRNA de 5.8S y 28S. Con esto obtenemos que cada repeticin consiste de una regin transcrita que comprende un espaciador externo transcrito 5 (ETS), seguido por el gen para 18s rRNA, un espaciador ITS1, un gen para 5.8s rRNA, un segundo espaciador ITS2, el gen 28s rRNA y finalmente una regin ETS 3 (Corts 2003). Cada unidad transcrita est separada por un espaciador intergnico (IGS) (Soltis 1999). (Figura 1).

Fig. 1 Organizacin de los genes ribosomales y localizacin de las regiones ITS Aunque existen muchas copias de las repeticiones ribosomales por genoma nuclear, las secuencias de los 18s, 5.8s y 28s generalmente son todas idnticas dentro de un individuo, sin embargo, de acuerdo a sus caractersticas, en las regiones ITS, pueden existir varias secuencias diferentes dentro de un individuo (Stouthamer 2007). Generalmente las diferencias son pequeas pero esta condicin imposibilita la secuenciacin directa de las regiones ITS. Otra de las caractersticas de las regiones ITS es que sus copias frecuentemente difieren en el nmero de repeticiones de microsatlites (SSR secuencia de nucletidos repetidos en tandem) encontrados en sus secuencias. Esto ocasiona que las secuencias difieran en un par de bases, las cuales van de menos de 300 a ms de 1000 (Stouthamer 2007). Debido a que los espaciadores internos transcritos (ITS1 e ITS2) difieren en tamao entre especies, pueden ser usados como marcadores moleculares (de regin nuclear). Para esto, se necesita amplificar sus regiones con primers especficos seguido de la tcnica de PCR y determinar el tamao del producto sobre un gel. Como marcadores moleculares podemos usarlos para diferenciar especies, ya que las regiones ITS evolucionan rpidamente (Soltis 1999) es decir, mutaciones puntuales, lo que los hace variables entre especies. Por eso, estos marcadores moleculares ofrecen una buena alternativa para caracterizar molecularmente y genticamente poblaciones de especies, (Karp 2001) de forma rpida y relativamente econmica. Mediante el uso de dos cebadores, partidores o primers especficos (oligonucletidos que inician la sntesis de DNA in vitro), llamados ITS1 e ITS4 (marcados en color rojo - Figura 1) se puede amplificar la regin comprendida entre ITS1, 5.8S rDNA e ITS2. Tambin mediante la tcnica que se conoce como RFLP-ITS, o PCR-RFLP, es posible caracterizar por RFLP (Polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restriccin: marcadores moleculares) la regin ITS de un organismo para lo cual deberemos extraer el ADN del mismo y luego amplificar la regin mediante la tcnica de PCR para cortarla (enlaces fosfodister) con una o varias enzimas de restriccin y finalmente determinar el tamao del producto sobre un gel. Con estas tcnicas, se han identificado y comparado especies como hongos (levaduras, royas), parsitos, peces, crustceos, etc.

Cabe mencionar que muchos investigadores han secuenciado las regiones correspondientes al rDNA y la informacin obtenida se ha incorporado en las bases de datos de secuencias nucleotdicas de dominio pblico. Para conocer algunas utilidades de las regiones ITS y su importancia, es necesario mencionar algunos estudios que lo fundamentan: Una de las investigaciones que se realizaron con la utilizacin de las regiones ITS, fue con las especies de cepas de Monascus, para la determinacin de relaciones filogenticas (Park et al. 2004); tambin utilizando genes de tubulina. Estas regiones fueron amplificadas por PCR y secuenciadas y de acuerdo a los resultados se organiz un rbol filogentico en donde las especies fueron colocadas en sus clados correspondientes. Adems se evalu la coherencia de las relaciones filogenticas moleculares postulado por diferentes marcadores moleculares relacionados con diferentes funciones biolgicas. Para llevar a cabo la amplificacin se utilizaron primers como ITS1 e ITS4 para ITS y dos primers en direccin 5 y 3 para los genes de de tubulina. Los resultados demostraron una incongruencia entre algunas especies con los dos marcadores moleculares utilizados, esto se debe a que las regiones ITS presentan a menudo delecciones e inserciones. Por eso se sugiere que la clasificacin filogentica con informacin de secuencia ITS debe realizarse con cautela. Otra de las investigaciones que se han realizado con las regiones ITS es la Identificacin de los taxones en el gnero Beta (Shen et al. 1998). En el cual utilizaron las secuencias de las regiones ITS de la remolacha y cebadores especficos adems del mtodo del PCR. Al presentar diferencias en las regiones ITS, permite la identificacin de especies de remolacha, y son ms adecuados para la comparacin de los taxa estrechamente relacionados, adems, est claro que las diferencias en la secuencia de ITS son muy frecuentemente encontradas entre las especies. Los primers que utilizaron fueron ITS5, ITS4 y ITS2. Adems emplearon otros primers como el universal ITS4 y se disearon otros primers especficos (para diferenciar entre una especie y otra) debido a la presencia de inserciones y delecciones en las regiones ITS. Las secuencias estudiadas variaron en su nmero de pares de bases que va de 238 a 242 pb. Se recomienda incluir enzimas de restriccin ya que se puede obtener la amplificacin y visualizar el polimorfismo. La PCR ha sido efectiva y se puede utilizar para otro tipo de plantas como el algodn y el sorgo. Tambin se llev a cabo un estudio realizado con levaduras mdicamente importantes (Chen et al. 2001) en el cual se prob la hiptesis de que la ITS1 contiene alelos diagnosticalmente tiles. Mediante PCR se distinguieron 19 especies por ITS1, comparadas con las 16 especies distinguidas usando ITS2. Sin embargo la combinacin de ambos permiti la identificacin de 30 especies. Junto con las 53 nuevas especies de alelos especficos de diagnstico identificados, estos datos proporcionaron 2 medidas importantes para la utilidad de diagnstico de las secuencias ITS1 para la identificacin de levaduras mdicamente importantes.

Se reanalizaron anlisis filogenticos basadas en las secuencias ITS que mostraron una topologa general similar a rboles basados en 26S del rRNA. Los anlisis de los polimorfismos de ITS pueden identificar de manera confiable 40 especies de levaduras clnicamente significativas y que la capacidad para identificar potencialmente nuevas especies patgenas mediante el uso de esa base de datos tiene promesas significantes. Se muestra la utilidad de las secuencias de ITS para distinguir entre especies de levaduras relacionadas cercanamente y tambin la relevancia de estas secuencias para establecer relaciones entre taxa relativamente lejanos. Otro caso del empleo de las regiones ITS se ve reflejado en el estudio sobre algas del gnero Macrocystis (Coyer et al. 2001). Aqu se usaron las regiones ITS1 e ITS2 para examinar las relaciones entre Macrocystis y varios gneros de Laminariales, 4 especies de Macrocystis (M.integrifolia, M.angustifolia, M.laevis y M.pyrifera) y 3 mltiples clones de varios individuos. Y fundamentaron que los individuos del hemisferio sur formaron un clado apoyado fuertemente y moderadamente, respectivamente, cuando las secuencias ITS1 e ITS2 fueron analizadas separadamente; mientras que los individuos del hemisferio norte fueron ms diversos y mostraron clados parafilticos, los individuos del hemisferio sur fueron menos diversos y formaron clados monofilticos. Para llegar a esto primero llevaron a cabo las amplificaciones de ambas regiones (ITS1 e ITS2) usando CsCl y primers complementarios al gen 18S y 5.8S. Las secuencias ITS1 e ITS2 fueron tratadas independientemente porque cada una fue clonada por separado de un individuo y porque cada una puede evolucionar a diferentes tasas. Llevaron a cabo anlisis de los datos, las primeras secuencias alineadas fueron analizadas con ModelTest 2.1. Al final obtuvieron 35 secuencias ITS1 e ITS2 para 24 individuos Macrocystis. Las regiones promedio ITS1 e ITS2 obtuvieron 289 y 378 bases en longitud, respectivamente. La diferencia entre las secuencias fue casi dos veces ms alta para ITS1 (2.2%) contra 1.4% de ITS2, esto sugiere una gran diversidad y un ritmo bastante rpido de evolucin en la regin ITS1. Con el anlisis de ambas regiones se demostr que Pelagophycus es el taxn hermano de Macrocystis. Tambin las secuencias ITS sugieren una dispersin reciente del gnero del hemisferio norte al sur, estn sometidos a las perturbaciones del ambiente. Por lo tanto las secuencias ITS en las algas marinas pueden revelar a una escala local, los patrones de los cambios de la poblacin debido a los cambios ambientales, as como a escala mundial los patrones de especiacin y biogeografa. Estos fueron algunos ejemplos de la utilidad de ITS, aunque existe una infinidad de casos, principalmente en hongos. Como punto importante cabe sealar que en la actualidad existen bases de datos pblicas de secuencias de ADN (ej. GenBank) en las cuales se encuentran depositadas, entre otras, las secuencias correspondientes a la regin ITS de muchos de los organismos vivos conocidos. De este modo, obteniendo la secuencia de esta regin de un organismo incgnita es posible en muchos casos identificarlo mediante el alineamiento y comparacin nucletido a nucletido con secuencias equivalentes de la base de datos.

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