Marcadores moleculares

En la actualidad, en otros países, para contrarrestar esas limitaciones se han empleado

marcadores moleculares, que son fragmentos de ADN que pueden corresponder o no a un rasgo
genético que se expresa (gen), y pueden usarse con dos fines: identificación genética de los
hongos y localización de genes que determinan características cuantitativas. En relación con el
primer objetivo, los marcadores moleculares son capaces de detectar la existencia de hongos
patógenos en muestras clínicas y ambientales, y diferenciar entre especies y variedades dentro de
un mismo género; esto se realiza en el ADN y proporciona el perfil genético preciso de cada
organismo estudiado, “DNA fingerprinting”.

El segundo objetivo intenta localizar alelos o genes específicos, o putativos, que determinen
características fenotípicas del hongo

ADN nuclear (nADN) En eucariontes, la mayor parte de la información genética se encuentra

contenida en el núcleo de la célula. El nADN se encuentra empaquetado y asociado a proteínas
histonas, conformando los cromosomas. El nADN contiene regiones únicas −de una sola copia− y
no únicas −duplicadas o regiones repetitivas (Stansfield, 1992). Se considera que los organismos
diploides tienen dos copias de cada región genética (locus) en los pares homólogos de los
cromosomas, llamadas alelos, sin tener en cuenta si contienen regiones codificantes (exones) o no
codificantes (intrones o regiones intergénicas).

ADN de cloroplasto (clADN) En los organismos fotosintéticos con cloroplastos existe un ADN
típicamente bacteriano circular, de 120 a 200 kb (Brown et al. 1979), con intrones y exones que se
considera muy conservado, ya que se trata fundamentalmente del mismo genoma desde las
hepáticas hasta las plantas superiores. Cada cloroplasto contiene varias regiones nucleotídicas,
cada una con 8 a 10 moléculas de ADN. Un organismo unicelular como Euglena puede contener de
40 a 50 cloroplastos, por lo que la celula entera puede contener más de 500 copias del genoma del
cloroplasto (Stansfield, 1992). ADN mitocondrial (mtADN) El genoma mitocondrial (mtADN) tiene
un tamaño de 15 a 17 kb (Brown et al. 1979) y su longitud varía considerablemente entre especies:
20 micrómetros en Neurospora; 25 micrómetros en levaduras; 30 micrómetros en plantas
superiores; 5 micrómetros en algunos animales metazoarios (multicelulares). Se considera que la
mayoría del mtADN de hongos y plantas no codifica, ya que el mtARN contiene intrones. El mtARN
de animales carece de intrones y 544 Las herramientas moleculares se transcribe como ARN
policistrónico que se parte en ARN monocistrónico antes de la traducción (Stansfield, 1992). Las
moléculas de cloroplasto y mitocondria son especialmente importantes para trazar historias
filogeográficas y de estructura poblacional genética estrechamente relacionada al linaje, porque
son de herencia uniparental y no recombinan. También nos permiten inferir cambios demográficos
y de dispersión entre especies (Dirienzo y Wilson, 1991). ADN ribosomal (RADN) El rADN puede
encontrarse en mitocondrias, cloroplasto y núcleo. Contiene la información para el ARN que
conforma los ribosomas, por lo que es información que se transcribe pero no se traduce. El rADN
se presenta en repeticiones tándem y está formado por tres subunidades altamente conservadas
(18 rADN, 5.8 rADN y 28 rADN), separadas por dos espaciadores con elevadas tasas de sustitución
(ITS1 e ITS2). Estas repeticiones en tandém se encuentran conservadas a lo largo de todo un
genoma y evolucionan concertadamente, lo que se atribuye a eventos recombinatorios como
entrecruzamiento desigual y conversión génica. Estas secuencias, por la baja tasa de sustitución
que presentan, son extremadamente útiles en el planteamiento de hipótesis de relaciones
filogenéticas de taxa con tiempos de divergencia muy antiguos (Hills et al., 1991).
Isoenzimas/aloenzimas Las isoenzimas fueron originalmente definidas como formas moleculares
múltiples de las enzimas que tienen funciones idénticas o similares y están presentes en el mismo
individuo (Market y Moller, 1959). Las isoenzimas pueden presentar varias formas alélicas,
conocidas como aloenzimas (Prakash et al., 1969). En su mayoría son selectivamente neutras y se
utilizan como marcadores hereditarios para cuantificar las frecuencias alélicas y genotípicas de los
individuos, que son los estimadores básicos de la composición genética de una población. En
estudios de genética las isoenzimas fueron usadas desde 1966, cuantificando la variación genética
en poblaciones humanas y de Drosophila y un poco más tarde en estudios de plantas superiores
(Harris, 1966; Johnson et al., 1966; Hubby y Lewontin, 1966; figura 1). La aplicación de las
isoenzimas está dirigida a la cuantificación de heterocigosis, diversidad genética, diferenciación
genética y otras medidas de variación genética intra e interpoblacional. También han sido
aplicadas exitosamente Breve revisión de los marcadores moleculares 545 para evaluar y entender
aspectos de biología evolutiva como los sistemas de reproducción y patrones de fecundación
cruzada, relaciones entre fenotipo y ambiente, filogenias, endemismo, diversidad en plantas
clonales y apomícticas e interacciones planta-animal (Pérez-Nasser y Piñero, 1997) (véanse los
capítulos 6 y 7 de este libro). Por ejemplo, en el estudio de los sistemas reproductivos de plantas
las aloenzimas tienen las siguientes ventajas: 1) son expresadas codominantemente, por lo que los
genotipos homócigos y heterócigos pueden ser distinguidos con mucha precisión, y es poco
probable que afecten el comportamiento del polinizador; 2) muchos de sus loci son polimórficos,
casi cualquier especie presenta al menos uno o dos; 3) probablemente no están sujetas a fuertes
fuerzas selectivas, por lo que se consideran buenos marcadores (Brown et al. 1989); 4) la técnica
es barata en comparación con otras. Por otro lado, presentan algunas limitaciones: revelan poca
variación y la técnica es muy laboriosa, requiere de mucho tiempo y entrenamiento y, sobre todo,
es poco reproducible entre laboratorios. En la electroforesis de enzimas se utilizan cuatro métodos
principales: a) gel de almidón (horizontal y vertical); b) gel de poliacrilamida; c) gel de agarosa y d)
gel de acetato de celulosa. La electroforesis horizontal en geles de almidón sigue siendo la
preferida, ya que es relativamente barata, de fácil manipulación, buena resolución, no es tóxica y
se puede analizar de forma rápida la variación para uno o varios loci. Para un locus dado, el
número de bandas varía entre individuos homócigos y heterócigos (figura 1) y también varía en
función de la estructura cuaternaria de la enzima; si es monomérica los individuos homócigos
representan una sola banda y los heterócigos presentan dos bandas; si es una enzima dimérica, los
heterócigos presentan tres bandas (dos homodímeros de los padres y un producto adicional de
movilidad intermedia); en las enzimas tetraméricas se observan 5 bandas en los individuos
heterócigos.

RAPDs Los RAPDs (polimorfismos de ADN amplificados al azar) son marcadores que amplifican
aleatoriamente segmentos de ADN en una gran variedad de especies. Los RAPDs se basan en la
probabilidad estadística de que se presenten sitios complementarios al oligonucleótido de 10
pares de bases (pb) a lo largo del genoma. El polimorfismo de las bandas entre los individuos se
debe a cambios en la secuencia de los nucleótidos en los sitios de acoplamiento del 546 Las
herramientas moleculares oligonucleótido y por inserción o deleción de los fragmentos en estos
sitios (Williams et al., 1990; figura 2). Estos marcadores son dominantes, es decir, no pueden
discernir los homócigos dominantes de los heterócigos para un segmento particular (Whitkus et
al., 1994; Backeljau et al., 1995), por lo que la estimación de las frecuencias alélicas se debe hacer
de manera indirecta, asumiendo equilibrio de HardyWeinberg (Aagaard et al., 1998). Los RAPDs
son útiles en la elaboración de mapas genéticos, en el estudio de parentesco y en el análisis de la
estructura poblacional, ya que ayudan a estimar tamaño efectivo, aislamiento reproductivo y
niveles de fecundación cruzada (Otero et al., 1997; Parker et al., 1998; véanse también los
capítulos 2, 3 y 6 de este libro). Dado el gran polimorfismo que detectan una de sus mejores
aplicaciones es la identificación genética de individuos, que incluye casos de clones, híbridos
somáticos y mutantes. Otra aplicación paralela es la detección de uniformidad genética con un
marcador eficiente y rápido, lo cual puede ser útil en la determinación de estabilidad en
programas de reforestación (Otero et al., 1997). Figura 1. Patrones de la fosfoglucosa isomerasa
para ecotipos de arroz rojo y variedades de arroz en gel de almidón de papa agarosa al 12% (foto
de Ortiz et al., 2002) Breve revisión de los marcadores moleculares 547 Entre las principales
ventajas de los RAPDs esta que amplifican regiones tanto codificantes del ADN como las no
codificantes y revelan niveles de variación más altos que los RFLPs e isoenzimas (Williams et al.,
1990; Lynch y Milligan, 1994; Otero et al., 1997; Russell et al., 1997; Parker et al., 1998); es una
técnica relativamente fácil que no necesita conocimiento previo de la secuencia de ADN, no
requiere la construcción o el mantenimiento de una librería genómica, el número de loci que
puede ser examinado es ilimitado y no requiere pruebas radiactivas (Reiter et al., 1992; Whitkus et
al. 1994). Sin embargo los problemas prácticos detectados con los RAPDs son la presencia de
bandas “erróneas” (artefactos), la reproducibilidad de los resultados y la comigración de bandas.
Asimismo, muchos de los alelos raros presentes en las poblaciones estudiadas con RAPDs no son
detectados o pueden ser mal interpretados (Zhivotovsky, 1999). Por otro lado, como los loci son
dominantes, los RAPDs dan menos información genética por locus que los marcadores
codominantes. Al analizar los datos obtenidos con RAPDs se deben tener en cuenta dos supuestos:
1) cada uno de los marcadores representa un locus mendeliano en el cual el marcador visible, el
alelo dominante, está en equilibrio de HardyWeinberg con un alelo recesivo y 2) los alelos
marcados para diferentes loci no migran a la misma posición en el gel (Lynch y Milligan, 1994).
Figura 2. Patrones de bandeo con RAPDs en Ferocactus robustus en gel de agarosa y tinción con
bromuro de etidio (foto de Israel Carrillo). 548

Las herramientas moleculares Microsatélites Los microsatélites o secuencias simples repetidas

(SSRs; Litt y Luty, 1989) son secuencias de ADN formadas de 1 a 4 pares de bases, por ejemplo
mononucleótidos (TT)n , dinucleótidos (AT)n , o tetranucleótidos (AAGG)n . Estos loci se
encuentran en regiones codificantes y no codificantes del ADN y es probable que se formen por
eventos de rompimiento que generan polimorfismos con valores superiores al 90% (Armour et al.,
1994; Coltman et al., 1996; Gupta et al., 1996; figura 3). Los microsatélites de ADN nuclear han
sido detectados en múltiples grupos de plantas y animales, y han sido utilizados
fundamentalmente para estudios de variación genética intra e interespecífica (Edwars et al., 1991;
Armour et al., 1993; Devey et al., 1996; Queller et al., 1993; Weight y Bentzen, 1994), análisis de
linajes (Queller et al., 1993) y de sistemas reproductivos (Awadalla y Ritland, 1997).
Recientemente se han encontrado microsatélites en algunos organelos citoplasmáticos, como el
cloroplasto (SSRc; Powell et al., 1995a, b; Vendramín et al., 1996; figura 3 ) y la mitocondria (SSRm;
Soranzo et al., 1998) lo que ha enriquecido la fuente de estudios evolutivos, ya que estos
organelos son heredados uniparentalmente y no están sujetos a recombinación, por lo que los
cambios acumulados que observamos en las poblaciones se deben sólo a los procesos de
mutación y demográficos (Echt et al., 1998). Esto permite contestar preguntas evolutivas muy
puntuales relacionadas con el monitoreo del flujo genético, introgresión (Vendramin et al., 1998),
análisis de paternidad (McCracken et al., 1999), para hacer inferencias de parámetros
demográficos y para determinar patrones evolutivos de los procesos históricos del origen de
especies, formas o razas (Golstein et al., 1996). Los microsatélites han tomado ventaja sobre otros
marcadores genéticos como los AFLPs, RAPDs, RFLPs, debido a que: i) tienen el más alto grado de
polimorfismo; ii) segregan de manera mendeliana y son codominantes; iii) la presencia de un solo
locus genético por microsatélite hace que la lectura de las bandas sea clara y fácil de interpretar y
iv) son selectivamente neutros (Golstein y Pollock, 1994; Vendramin et al., 1996). Además, para
trabajar con SRR es necesario conocer la secuencia de la región a analizar para contar con primers
específicos que amplifiquen la región repetitiva (el microsatélite) responsable de la variación
observada, que además es homóloga para diferentes especies o incluso géneros (Golstein et al.,
1996). Esto es, los microsatélites son específicos para ciertos grupos de especies y Breve revisión
de los marcadores moleculares 549 homólogos entre sí (Vendramin et al., 1996), lo que permite
hacer estudios comparativos entre especies o géneros de un mismo grupo. Por otra parte, se han
realizado estimaciones de las tasas de mutación de estas regiones y se ha llegado a la conclusión
de que los microsatélite del ADN nuclear tienen tasas de mutación de 1x 10 -3 a 1x 10 -6
(Wiessenbach et al., 1992; Weber y Wong, 1993), más altas que las que se presentan en el ADN de
cloroplasto las cuales según Provan et al. (1999) son de 3.2-7.9 x 10-5. Conocer las tasas de
mutación nos brinda una base importante para realizar análisis robustos de la genealogía de las
poblaciones que nos hablen acerca de la historia evolutiva de las especies, ventaja muy
importante sobre otros marcadores genéticos. Otra ventaja que presenta el uso de microsatélites
con relación al uso de secuencias, es que la mutación es homogénea: en la mayoría de los SSR las
mutaciones son de un paso (una unidad repetitiva) siguiendo el modelo mutacional SSM de Ohta y
Kimura (1973). Sin embargo el número de mutaciones varía si se trata de diferentes tipos de
microsatélites, por ejemplo, Golstein et al. (1995b) mencionan que las mutaciones de repeticiones
formadas por dinucleótidos o trinucleótidos son de dos pasos o incluso de múltiples pasos, lo que
ha sido confirmado por estudios en trinucleótidos. Por ejemplo, en el humano el microsatélite
formado por las repeticiones CAG − asociado con un desorden neurológico−, puede mutar de
pocos a cientos de alelos (Ashley y Warren 1995). Sin embargo este comportamiento asimétrico
del tamaño de las mutaciones de SSR ha sido raramente reportado. Al ser los microsatélites
altamente polimórficos, pueden ser ventajosos con relación al uso de secuencias, aunque la
variación del ADN nuclear debe analizarse con precaución, ya que pudo haberse generado por
duplicaciones o por la presencia de familias multigénicas (Rieseberg,1991), que generan un alto
grado de homogeneidad dentro y entre especies, proceso conocido como evolución concertada.
Estos fenómenos pueden distorsionar la historia evolutiva de los organismos en estudio y
confundir las relaciones filogenéticas (Rieseberg et al., 1991b). Es decir, se pueden presentar
aparentes reticulaciones o escenarios de hibridización introgresiva. Finalmente, los microsatélites
han sido utilizados para hacer reconstrucciones de árboles de genes con base en la teoría de
coalescencia (véase el capítulo 4 de este libro). Los fragmentos son separados en geles de
acrilamida y son visualizados con nitrato de plata o radioactividad. 550

Las herramientas moleculares ISSRs Es un marcador molecular conocido como secuencias

repetidas intersimples. Esta es una técnica relativamente nueva y es similar a los RAPDs, excepto
que en los ISSRs el primer es un di ó trinucleotido repetido (Culler y Wolfe, 2001 véase el capítulo
19 de este libro). Los dos métodos que se utilizan en la electroforesis de ISSRs son: a) gel de
agarosa visualizado con bromuro de etidio, y b) geles de acrilamida teñidos con nitrato de plata.
Las bandas que se obtienen con este marcador van de 100 a 2000 pb. La variación alélica en los
ISSRs consiste de la presencia o ausencia de los productos amplificados. Comparada con los
primers de los RAPDs las secuencias de los ISSRs es usualmente larga lo que resulta en una mayor
reproductibilidad de las bandas. Figura 3. Patrones del microsatélite Pt63718 de cloroplasto en
Pinus strobiformis en gel de acrilamida al 6% y tinción con nitrato de plata (foto de Alejandra
Moreno Letelier) Breve revisión de los marcadores moleculares 551 Los ISSRs han sido utilizado en
especies cultivadas desde 1994, pero sólo recientemente se han utilizado en estudios de la
variación poblacional en especies silvestres (Wolfe y Liston, 1998; Wolfe et al. 1998 a,b). Hasta la
fecha sólo existen algunos estudios donde se ha comparado directamente la variación genética,
incluyendo estimaciones de la tasa de fecundación cruzada (que tradicionalmente se estima con
marcadores codominantes) y se ha utilizado esta técnica en especies donde la variación
poblacional con enzimas es pequeña o no existe. Dada la alta variación genética entre individuos
de una misma población, sería recomendable utilizar estos marcadores para análisis de
paternidad. Entre las ventajas principales de los ISSRs es que tienen un gran número de bandas
polimorficas. En un estudio realizado en Viola pubescens una planta cleistogamica se reportó una
gran variación genética. A nivel de especie, el 100% de los loci fueron polimorficos aún cuando los
primers (se utilizaron tres) fueron seleccionados al azar. Dentro de cada población cerca del 71%
de 83 loci fueron polimorficos (Culley y Wolfe 2001). Además es una técnica relativamente fácil de
montar, altamente repetible y ya existen primers universales para plantas. Figura 4. Patrones de
ISSRs en Opuntia rastrera en gel de agarosa al 1.5% y tinción con bromuro de etidio (foto de Lucia
Plasencia) 552 Las herramientas moleculares Por otro lado las limitaciones de los ISSRs son: que
las bandas son leídas como marcadores dominantes, es decir cuando tenemos la presencia de la
banda no se sabe si el individuo es homócigo dominante o herócigo, que la diversidad genética
está basada considerando que cada banda representa un locus con dos alelos y que el alelo
dominante esta en equilibrio de HardyWeinberg con un alelo recesivo y por último que es una
técnica relativamente cara, ya que involucra el uso de geles de poliacrilamida y para su
visualización nitrato de plata. RFLPs

El análisis de polimorfismos de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLPs) fue el primer

marcador de ADN utilizado por biólogos poblacionales (Parker et al., 1998). Este método expresa
diferencias específicas del ADN que fueron reconocidas por enzimas de restricción particulares
(endonucleasas). Cada una de las endonucleasas (de origen bacteriano), reconoce y corta
solamente una secuencia específica de bases nitrogenadas en el ADN, siempre y cuando éstas no
estén protegidas (metiladas). Por consiguiente cualquier ADN que no esté metilado puede ser
reconocido y cortado en fragmentos de longitud definida; y cualquier mutación dentro de esos
sitios, podría cambiar el patrón del fragmento y permitir que se detecte un RFLP al comparar dos o
más genomas (Valadez y Kahl, 2000). Para detectar RFLPs hay dos técnicas: southern blots e
hibridización, y PCR. Southern blots e hibridización Es necesario en primer lugar aislar el ADN del
organismo de interés (véase el capítulo 15 de este libro, purificarlo y cortarlo con una o más
endonucleasas de restricción. Los fragmentos resultantes se separan en geles de agarosa por
electroforesis y se transfieren a una membrana que puede ser de nylon o de nitrocelulosa
(southern blotting). La subsecuente hibridación con una sonda marcada y detección con
autorradiografía, luminografía o quimioluminiscencia hará visible un fragmento de ADN específico,
que puede ser comparado con el fragmento resultante de otros genomas tratados de la misma
forma (Parket et al., 1998). La sonda marcada se obtiene de fragmentos de ADN nuclear, de
organelos o bien de ADN complementario, también denominado ADN copia (ADNc) que es una
molécula de una sola hilera producida en el laboratorio usando mRNA como molde y transcripción
reversa (véase el capítulo 15 de este Breve revisión de los marcadores moleculares 553 libro). Para
el caso de obtenerla a partir de ADN nuclear, se requiere construir una biblioteca genómica
mediante el aislamiento, restricción y clonación del ADN en un vector apropiado (Valadez y Kahl,
2000), que se explica a continuación. Las bibliotecas de ADN son colecciones de vectores
recombinantes, que cuentan con secuencias de ADN insertadas. La figura 5 muestra la
construcción de una biblioteca de ADNc en el vector lambda gt10. En la figura se puede observar
cómo, mediante ADN transcriptasas, polimerasas o ligasas se construye un fragmento de ADN (el
de interés) y se inserta en el fago a utilizar (parte A de la figura); una vez obtenido el fago se
procede a infectar una colonia de E. coli en una caja de Petri. Cada infección producirá una placa
característica en la caja de Petri (en una caja de Petri de 150 mm pueden caber 50 mil placas). Una
vez que las placas se han formado se coloca un filtro de nitrocelulosa en contacto con las colonias
de la caja de Petri. El ADN transferido al filtro es desnaturalizado y fijado en el filtro mediante el
uso de luz ultravioleta. De esta forma el filtro puede ser hibridizado con una sonda radiactiva de
ADNc de interés y sometido a autorradiografia; una mancha en la autorradiografia permitirá
identificar la placa de la caja de Petri que contiene el fago con el ADN de interés. El fago puede
entonces ser extraído del agar de la caja de Petri y reinfectar a E. coli. La repetición de este
proceso de separación de un fago recombinante, permite clonar el ADN que contiene el fago. Este
proceso ha permitido desarrollar bibliotecas de ADN de diferentes tejidos. RFLP-PCR El segundo
método que se utiliza para la técnica de RFLPs es la PCR. Los RFLPs son causados por rearreglos del
ADN, tales como pérdidas, inserciones o sustituciones de secuencias o nucleótidos únicos, lo que
genera una ganancia o pérdida de sitios de restricción. Esto es detectado a través de diferencias en
el peso molecular de los fragmentos homólogos de restricción del ADN genómico (figura 6). Con el
producto amplificado de PCR se realiza una digestión con diferentes enzimas de restricción. Los
fragmentos resultantes de la digestión son separados por electroforesis en geles de agarosa
teñidos con bromuro de etidio o con acrilamida teñidos con nitrato de plata (Karl et al., 1992); este
método es más barato y rápido que el anterior. Los RFLPs generalmente se han utilizado para
construir mapas genéticos, para la clonación de genes basados en mapas y para ayudar a resolver
problemas taxonómicos o filogenéticos. 554 Las herramientas moleculares El grado de
polimorfismo detectado con esta técnica difiere ampliamente entre las especies dependiendo de
la sonda utilizada. Entre las principales desventajas que presenta está el requerimiento de grandes
cantidades de ADN de buena calidad para la detección de loci de copias únicas, además requiere
de muchas manipulaciones y solamente se detecta una fracción de la variabilidad de secuencias
existentes en el genoma, es decir, su información es limitada. AFLPs Los AFLPs (polimorfismos de
longitud de los fragmentos amplificados) son una técnica que combina la digestión de dos enzimas
de restricción, generalmente Mse I que reconoce y corta 4 pb y Eco RI que reconoce y corta 6 pb
dentro de una secuencia, con la unión de secuencias específicas al nucleótido ligado a los
extremos de los fragmentos de restricción y dosADN nuclear (nADN) En eucariontes, la mayor
parte de la información genética se encuentra contenida en el núcleo de la célula. El nADN se
encuentra empaquetado y asociado a proteínas histonas, conformando los cromosomas. El nADN
contiene regiones únicas −de una sola copia− y no únicas −duplicadas o regiones repetitivas
(Stansfield, 1992). Se considera que los organismos diploides tienen dos copias de cada región
genética (locus) en los pares homólogos de los cromosomas, llamadas alelos, sin tener en cuenta si
contienen regiones codificantes (exones) o no codificantes (intrones o regiones intergénicas). ADN
de cloroplasto (clADN) En los organismos fotosintéticos con cloroplastos existe un ADN
típicamente bacteriano circular, de 120 a 200 kb (Brown et al. 1979), con intrones y exones que se
considera muy conservado, ya que se trata fundamentalmente del mismo genoma desde las
hepáticas hasta las plantas superiores. Cada cloroplasto contiene varias regiones nucleotídicas,
cada una con 8 a 10 moléculas de ADN. Un organismo unicelular como Euglena puede contener de
40 a 50 cloroplastos, por lo que la celula entera puede contener más de 500 copias del genoma del
cloroplasto (Stansfield, 1992). ADN mitocondrial (mtADN) El genoma mitocondrial (mtADN) tiene
un tamaño de 15 a 17 kb (Brown et al. 1979) y su longitud varía considerablemente entre especies:
20 micrómetros en Neurospora; 25 micrómetros en levaduras; 30 micrómetros en plantas
superiores; 5 micrómetros en algunos animales metazoarios (multicelulares). Se considera que la
mayoría del mtADN de hongos y plantas no codifica, ya que el mtARN contiene intrones. El mtARN
de animales carece de intrones y 544 Las herramientas moleculares se transcribe como ARN
policistrónico que se parte en ARN monocistrónico antes de la traducción (Stansfield, 1992). Las
moléculas de cloroplasto y mitocondria son especialmente importantes para trazar historias
filogeográficas y de estructura poblacional genética estrechamente relacionada al linaje, porque
son de herencia uniparental y no recombinan. También nos permiten inferir cambios demográficos
y de dispersión entre especies (Dirienzo y Wilson, 1991). ADN ribosomal (RADN) El rADN puede
encontrarse en mitocondrias, cloroplasto y núcleo. Contiene la información para el ARN que
conforma los ribosomas, por lo que es información que se transcribe pero no se traduce. El rADN
se presenta en repeticiones tándem y está formado por tres subunidades altamente conservadas
(18 rADN, 5.8 rADN y 28 rADN), separadas por dos espaciadores con elevadas tasas de sustitución
(ITS1 e ITS2). Estas repeticiones en tandém se encuentran conservadas a lo largo de todo un
genoma y evolucionan concertadamente, lo que se atribuye a eventos recombinatorios como
entrecruzamiento desigual y conversión génica. Estas secuencias, por la baja tasa de sustitución
que presentan, son extremadamente útiles en el planteamiento de hipótesis de relaciones
filogenéticas de taxa con tiempos de divergencia muy antiguos (Hills et al., 1991).
Isoenzimas/aloenzimas Las isoenzimas fueron originalmente definidas como formas moleculares
múltiples de las enzimas que tienen funciones idénticas o similares y están presentes en el mismo
individuo (Market y Moller, 1959). Las isoenzimas pueden presentar varias formas alélicas,
conocidas como aloenzimas (Prakash et al., 1969). En su mayoría son selectivamente neutras y se
utilizan como marcadores hereditarios para cuantificar las frecuencias alélicas y genotípicas de los
individuos, que son los estimadores básicos de la composición genética de una población. En
estudios de genética las isoenzimas fueron usadas desde 1966, cuantificando la variación genética
en poblaciones humanas y de Drosophila y un poco más tarde en estudios de plantas superiores
(Harris, 1966; Johnson et al., 1966; Hubby y Lewontin, 1966; figura 1). La aplicación de las
isoenzimas está dirigida a la cuantificación de heterocigosis, diversidad genética, diferenciación
genética y otras medidas de variación genética intra e interpoblacional. También han sido
aplicadas exitosamente Breve revisión de los marcadores moleculares 545 para evaluar y entender
aspectos de biología evolutiva como los sistemas de reproducción y patrones de fecundación
cruzada, relaciones entre fenotipo y ambiente, filogenias, endemismo, diversidad en plantas
clonales y apomícticas e interacciones planta-animal (Pérez-Nasser y Piñero, 1997) (véanse los
capítulos 6 y 7 de este libro). Por ejemplo, en el estudio de los sistemas reproductivos de plantas
las aloenzimas tienen las siguientes ventajas: 1) son expresadas codominantemente, por lo que los
genotipos homócigos y heterócigos pueden ser distinguidos con mucha precisión, y es poco
probable que afecten el comportamiento del polinizador; 2) muchos de sus loci son polimórficos,
casi cualquier especie presenta al menos uno o dos; 3) probablemente no están sujetas a fuertes
fuerzas selectivas, por lo que se consideran buenos marcadores (Brown et al. 1989); 4) la técnica
es barata en comparación con otras. Por otro lado, presentan algunas limitaciones: revelan poca
variación y la técnica es muy laboriosa, requiere de mucho tiempo y entrenamiento y, sobre todo,
es poco reproducible entre laboratorios. En la electroforesis de enzimas se utilizan cuatro métodos
principales: a) gel de almidón (horizontal y vertical); b) gel de poliacrilamida; c) gel de agarosa y d)
gel de acetato de celulosa. La electroforesis horizontal en geles de almidón sigue siendo la
preferida, ya que es relativamente barata, de fácil manipulación, buena resolución, no es tóxica y
se puede analizar de forma rápida la variación para uno o varios loci. Para un locus dado, el
número de bandas varía entre individuos homócigos y heterócigos (figura 1) y también varía en
función de la estructura cuaternaria de la enzima; si es monomérica los individuos homócigos
representan una sola banda y los heterócigos presentan dos bandas; si es una enzima dimérica, los
heterócigos presentan tres bandas (dos homodímeros de los padres y un producto adicional de
movilidad intermedia); en las enzimas tetraméricas se observan 5 bandas en los individuos
heterócigos. RAPDs Los RAPDs (polimorfismos de ADN amplificados al azar) son marcadores que
amplifican aleatoriamente segmentos de ADN en una gran variedad de especies. Los RAPDs se
basan en la probabilidad estadística de que se presenten sitios complementarios al oligonucleótido
de 10 pares de bases (pb) a lo largo del genoma. El polimorfismo de las bandas entre los individuos
se debe a cambios en la secuencia de los nucleótidos en los sitios de acoplamiento del 546 Las
herramientas moleculares oligonucleótido y por inserción o deleción de los fragmentos en estos
sitios (Williams et al., 1990; figura 2). Estos marcadores son dominantes, es decir, no pueden
discernir los homócigos dominantes de los heterócigos para un segmento particular (Whitkus et
al., 1994; Backeljau et al., 1995), por lo que la estimación de las frecuencias alélicas se debe hacer
de manera indirecta, asumiendo equilibrio de HardyWeinberg (Aagaard et al., 1998). Los RAPDs
son útiles en la elaboración de mapas genéticos, en el estudio de parentesco y en el análisis de la
estructura poblacional, ya que ayudan a estimar tamaño efectivo, aislamiento reproductivo y
niveles de fecundación cruzada (Otero et al., 1997; Parker et al., 1998; véanse también los
capítulos 2, 3 y 6 de este libro). Dado el gran polimorfismo que detectan una de sus mejores
aplicaciones es la identificación genética de individuos, que incluye casos de clones, híbridos
somáticos y mutantes. Otra aplicación paralela es la detección de uniformidad genética con un
marcador eficiente y rápido, lo cual puede ser útil en la determinación de estabilidad en
programas de reforestación (Otero et al., 1997). Figura 1. Patrones de la fosfoglucosa isomerasa
para ecotipos de arroz rojo y variedades de arroz en gel de almidón de papa agarosa al 12% (foto
de Ortiz et al., 2002) Breve revisión de los marcadores moleculares 547 Entre las principales
ventajas de los RAPDs esta que amplifican regiones tanto codificantes del ADN como las no
codificantes y revelan niveles de variación más altos que los RFLPs e isoenzimas (Williams et al.,
1990; Lynch y Milligan, 1994; Otero et al., 1997; Russell et al., 1997; Parker et al., 1998); es una
técnica relativamente fácil que no necesita conocimiento previo de la secuencia de ADN, no
requiere la construcción o el mantenimiento de una librería genómica, el número de loci que
puede ser examinado es ilimitado y no requiere pruebas radiactivas (Reiter et al., 1992; Whitkus et
al. 1994). Sin embargo los problemas prácticos detectados con los RAPDs son la presencia de
bandas “erróneas” (artefactos), la reproducibilidad de los resultados y la comigración de bandas.
Asimismo, muchos de los alelos raros presentes en las poblaciones estudiadas con RAPDs no son
detectados o pueden ser mal interpretados (Zhivotovsky, 1999). Por otro lado, como los loci son
dominantes, los RAPDs dan menos información genética por locus que los marcadores
codominantes. Al analizar los datos obtenidos con RAPDs se deben tener en cuenta dos supuestos:
1) cada uno de los marcadores representa un locus mendeliano en el cual el marcador visible, el
alelo dominante, está en equilibrio de HardyWeinberg con un alelo recesivo y 2) los alelos
marcados para diferentes loci no migran a la misma posición en el gel (Lynch y Milligan, 1994).
Figura 2. Patrones de bandeo con RAPDs en Ferocactus robustus en gel de agarosa y tinción con
bromuro de etidio (foto de Israel Carrillo). 548 Las herramientas moleculares Microsatélites Los
microsatélites o secuencias simples repetidas (SSRs; Litt y Luty, 1989) son secuencias de ADN
formadas de 1 a 4 pares de bases, por ejemplo mononucleótidos (TT)n , dinucleótidos (AT)n , o
tetranucleótidos (AAGG)n . Estos loci se encuentran en regiones codificantes y no codificantes del
ADN y es probable que se formen por eventos de rompimiento que generan polimorfismos con
valores superiores al 90% (Armour et al., 1994; Coltman et al., 1996; Gupta et al., 1996; figura 3).
Los microsatélites de ADN nuclear han sido detectados en múltiples grupos de plantas y animales,
y han sido utilizados fundamentalmente para estudios de variación genética intra e interespecífica
(Edwars et al., 1991; Armour et al., 1993; Devey et al., 1996; Queller et al., 1993; Weight y
Bentzen, 1994), análisis de linajes (Queller et al., 1993) y de sistemas reproductivos (Awadalla y
Ritland, 1997). Recientemente se han encontrado microsatélites en algunos organelos
citoplasmáticos, como el cloroplasto (SSRc; Powell et al., 1995a, b; Vendramín et al., 1996; figura 3
) y la mitocondria (SSRm; Soranzo et al., 1998) lo que ha enriquecido la fuente de estudios
evolutivos, ya que estos organelos son heredados uniparentalmente y no están sujetos a
recombinación, por lo que los cambios acumulados que observamos en las poblaciones se deben
sólo a los procesos de mutación y demográficos (Echt et al., 1998). Esto permite contestar
preguntas evolutivas muy puntuales relacionadas con el monitoreo del flujo genético, introgresión
(Vendramin et al., 1998), análisis de paternidad (McCracken et al., 1999), para hacer inferencias de
parámetros demográficos y para determinar patrones evolutivos de los procesos históricos del
origen de especies, formas o razas (Golstein et al., 1996). Los microsatélites han tomado ventaja
sobre otros marcadores genéticos como los AFLPs, RAPDs, RFLPs, debido a que: i) tienen el más
alto grado de polimorfismo; ii) segregan de manera mendeliana y son codominantes; iii) la
presencia de un solo locus genético por microsatélite hace que la lectura de las bandas sea clara y
fácil de interpretar y iv) son selectivamente neutros (Golstein y Pollock, 1994; Vendramin et al.,
1996). Además, para trabajar con SRR es necesario conocer la secuencia de la región a analizar
para contar con primers específicos que amplifiquen la región repetitiva (el microsatélite)
responsable de la variación observada, que además es homóloga para diferentes especies o
incluso géneros (Golstein et al., 1996). Esto es, los microsatélites son específicos para ciertos
grupos de especies y Breve revisión de los marcadores moleculares 549 homólogos entre sí
(Vendramin et al., 1996), lo que permite hacer estudios comparativos entre especies o géneros de
un mismo grupo. Por otra parte, se han realizado estimaciones de las tasas de mutación de estas
regiones y se ha llegado a la conclusión de que los microsatélite del ADN nuclear tienen tasas de
mutación de 1x 10 -3 a 1x 10 -6 (Wiessenbach et al., 1992; Weber y Wong, 1993), más altas que las
que se presentan en el ADN de cloroplasto las cuales según Provan et al. (1999) son de 3.2-7.9 x
10-5. Conocer las tasas de mutación nos brinda una base importante para realizar análisis robustos
de la genealogía de las poblaciones que nos hablen acerca de la historia evolutiva de las especies,
ventaja muy importante sobre otros marcadores genéticos. Otra ventaja que presenta el uso de
microsatélites con relación al uso de secuencias, es que la mutación es homogénea: en la mayoría
de los SSR las mutaciones son de un paso (una unidad repetitiva) siguiendo el modelo mutacional
SSM de Ohta y Kimura (1973). Sin embargo el número de mutaciones varía si se trata de diferentes
tipos de microsatélites, por ejemplo, Golstein et al. (1995b) mencionan que las mutaciones de
repeticiones formadas por dinucleótidos o trinucleótidos son de dos pasos o incluso de múltiples
pasos, lo que ha sido confirmado por estudios en trinucleótidos. Por ejemplo, en el humano el
microsatélite formado por las repeticiones CAG − asociado con un desorden neurológico−, puede
mutar de pocos a cientos de alelos (Ashley y Warren 1995). Sin embargo este comportamiento
asimétrico del tamaño de las mutaciones de SSR ha sido raramente reportado. Al ser los
microsatélites altamente polimórficos, pueden ser ventajosos con relación al uso de secuencias,
aunque la variación del ADN nuclear debe analizarse con precaución, ya que pudo haberse
generado por duplicaciones o por la presencia de familias multigénicas (Rieseberg,1991), que
generan un alto grado de homogeneidad dentro y entre especies, proceso conocido como
evolución concertada. Estos fenómenos pueden distorsionar la historia evolutiva de los
organismos en estudio y confundir las relaciones filogenéticas (Rieseberg et al., 1991b). Es decir, se
pueden presentar aparentes reticulaciones o escenarios de hibridización introgresiva. Finalmente,
los microsatélites han sido utilizados para hacer reconstrucciones de árboles de genes con base en
la teoría de coalescencia (véase el capítulo 4 de este libro). Los fragmentos son separados en geles
de acrilamida y son visualizados con nitrato de plata o radioactividad. 550 Las herramientas
moleculares ISSRs Es un marcador molecular conocido como secuencias repetidas intersimples.
Esta es una técnica relativamente nueva y es similar a los RAPDs, excepto que en los ISSRs el
primer es un di ó trinucleotido repetido (Culler y Wolfe, 2001 véase el capítulo 19 de este libro).
Los dos métodos que se utilizan en la electroforesis de ISSRs son: a) gel de agarosa visualizado con
bromuro de etidio, y b) geles de acrilamida teñidos con nitrato de plata. Las bandas que se
obtienen con este marcador van de 100 a 2000 pb. La variación alélica en los ISSRs consiste de la
presencia o ausencia de los productos amplificados. Comparada con los primers de los RAPDs las
secuencias de los ISSRs es usualmente larga lo que resulta en una mayor reproductibilidad de las
bandas. Figura 3. Patrones del microsatélite Pt63718 de cloroplasto en Pinus strobiformis en gel de
acrilamida al 6% y tinción con nitrato de plata (foto de Alejandra Moreno Letelier) Breve revisión
de los marcadores moleculares 551 Los ISSRs han sido utilizado en especies cultivadas desde 1994,
pero sólo recientemente se han utilizado en estudios de la variación poblacional en especies
silvestres (Wolfe y Liston, 1998; Wolfe et al. 1998 a,b). Hasta la fecha sólo existen algunos estudios
donde se ha comparado directamente la variación genética, incluyendo estimaciones de la tasa de
fecundación cruzada (que tradicionalmente se estima con marcadores codominantes) y se ha
utilizado esta técnica en especies donde la variación poblacional con enzimas es pequeña o no
existe. Dada la alta variación genética entre individuos de una misma población, sería
recomendable utilizar estos marcadores para análisis de paternidad. Entre las ventajas principales
de los ISSRs es que tienen un gran número de bandas polimorficas. En un estudio realizado en
Viola pubescens una planta cleistogamica se reportó una gran variación genética. A nivel de
especie, el 100% de los loci fueron polimorficos aún cuando los primers (se utilizaron tres) fueron
seleccionados al azar. Dentro de cada población cerca del 71% de 83 loci fueron polimorficos
(Culley y Wolfe 2001). Además es una técnica relativamente fácil de montar, altamente repetible y
ya existen primers universales para plantas. Figura 4. Patrones de ISSRs en Opuntia rastrera en gel
de agarosa al 1.5% y tinción con bromuro de etidio (foto de Lucia Plasencia) 552 Las herramientas
moleculares Por otro lado las limitaciones de los ISSRs son: que las bandas son leídas como
marcadores dominantes, es decir cuando tenemos la presencia de la banda no se sabe si el
individuo es homócigo dominante o herócigo, que la diversidad genética está basada
considerando que cada banda representa un locus con dos alelos y que el alelo dominante esta en
equilibrio de HardyWeinberg con un alelo recesivo y por último que es una técnica relativamente
cara, ya que involucra el uso de geles de poliacrilamida y para su visualización nitrato de plata.
RFLPs El análisis de polimorfismos de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLPs) fue el
primer marcador de ADN utilizado por biólogos poblacionales (Parker et al., 1998). Este método
expresa diferencias específicas del ADN que fueron reconocidas por enzimas de restricción
particulares (endonucleasas). Cada una de las endonucleasas (de origen bacteriano), reconoce y
corta solamente una secuencia específica de bases nitrogenadas en el ADN, siempre y cuando
éstas no estén protegidas (metiladas). Por consiguiente cualquier ADN que no esté metilado
puede ser reconocido y cortado en fragmentos de longitud definida; y cualquier mutación dentro
de esos sitios, podría cambiar el patrón del fragmento y permitir que se detecte un RFLP al
comparar dos o más genomas (Valadez y Kahl, 2000). Para detectar RFLPs hay dos técnicas:
southern blots e hibridización, y PCR. Southern blots e hibridización Es necesario en primer lugar
aislar el ADN del organismo de interés (véase el capítulo 15 de este libro, purificarlo y cortarlo con
una o más endonucleasas de restricción. Los fragmentos resultantes se separan en geles de
agarosa por electroforesis y se transfieren a una membrana que puede ser de nylon o de
nitrocelulosa (southern blotting). La subsecuente hibridación con una sonda marcada y detección
con autorradiografía, luminografía o quimioluminiscencia hará visible un fragmento de ADN
específico, que puede ser comparado con el fragmento resultante de otros genomas tratados de la
misma forma (Parket et al., 1998). La sonda marcada se obtiene de fragmentos de ADN nuclear, de
organelos o bien de ADN complementario, también denominado ADN copia (ADNc) que es una
molécula de una sola hilera producida en el laboratorio usando mRNA como molde y transcripción
reversa (véase el capítulo 15 de este Breve revisión de los marcadores moleculares 553 libro). Para
el caso de obtenerla a partir de ADN nuclear, se requiere construir una biblioteca genómica
mediante el aislamiento, restricción y clonación del ADN en un vector apropiado (Valadez y Kahl,
2000), que se explica a continuación. Las bibliotecas de ADN son colecciones de vectores
recombinantes, que cuentan con secuencias de ADN insertadas. La figura 5 muestra la
construcción de una biblioteca de ADNc en el vector lambda gt10. En la figura se puede observar
cómo, mediante ADN transcriptasas, polimerasas o ligasas se construye un fragmento de ADN (el
de interés) y se inserta en el fago a utilizar (parte A de la figura); una vez obtenido el fago se
procede a infectar una colonia de E. coli en una caja de Petri. Cada infección producirá una placa
característica en la caja de Petri (en una caja de Petri de 150 mm pueden caber 50 mil placas). Una
vez que las placas se han formado se coloca un filtro de nitrocelulosa en contacto con las colonias
de la caja de Petri. El ADN transferido al filtro es desnaturalizado y fijado en el filtro mediante el
uso de luz ultravioleta. De esta forma el filtro puede ser hibridizado con una sonda radiactiva de
ADNc de interés y sometido a autorradiografia; una mancha en la autorradiografia permitirá
identificar la placa de la caja de Petri que contiene el fago con el ADN de interés. El fago puede
entonces ser extraído del agar de la caja de Petri y reinfectar a E. coli. La repetición de este
proceso de separación de un fago recombinante, permite clonar el ADN que contiene el fago. Este
proceso ha permitido desarrollar bibliotecas de ADN de diferentes tejidos. RFLP-PCR El segundo
método que se utiliza para la técnica de RFLPs es la PCR. Los RFLPs son causados por rearreglos del
ADN, tales como pérdidas, inserciones o sustituciones de secuencias o nucleótidos únicos, lo que
genera una ganancia o pérdida de sitios de restricción. Esto es detectado a través de diferencias en
el peso molecular de los fragmentos homólogos de restricción del ADN genómico (figura 6). Con el
producto amplificado de PCR se realiza una digestión con diferentes enzimas de restricción. Los
fragmentos resultantes de la digestión son separados por electroforesis en geles de agarosa
teñidos con bromuro de etidio o con acrilamida teñidos con nitrato de plata (Karl et al., 1992); este
método es más barato y rápido que el anterior. Los RFLPs generalmente se han utilizado para
construir mapas genéticos, para la clonación de genes basados en mapas y para ayudar a resolver
problemas taxonómicos o filogenéticos. 554 Las herramientas moleculares El grado de
polimorfismo detectado con esta técnica difiere ampliamente entre las especies dependiendo de
la sonda utilizada. Entre las principales desventajas que presenta está el requerimiento de grandes
cantidades de ADN de buena calidad para la detección de loci de copias únicas, además requiere
de muchas manipulaciones y solamente se detecta una fracción de la variabilidad de secuencias
existentes en el genoma, es decir, su información es limitada. AFLPs Los AFLPs (polimorfismos de
longitud de los fragmentos amplificados) son una técnica que combina la digestión de dos enzimas
de restricción, generalmente Mse I que reconoce y corta 4 pb y Eco RI que reconoce y corta 6 pb
dentro de una secuencia, con la unión de secuencias específicas al nucleótido ligado a los
extremos de los fragmentos de restricción y dos