FITOPATOLOGIA

UNIDAD 2
DIAGNOSTICO
BÍOTICAS ABÍOTICAS
 DIAGNÓSTICO
El diagnóstico incluye la identificación del problema, el alcance del problema, la importancia y la
magnitud del problema, el método de control a emplear, y la demanda de investigación y costo-
beneficio

ETIOLOGIA (Causas)
LA OBSERVACIÓN PRIMARIA (Síntomas y Signos)
Identificación
Confirmación
ESTUDIOS EPIDEMIOLÓGICOS
CUANTIFICACIÓN
Xo
r
t

GENOTIPOS

ESTRATEGIAS CONTROL SUSTENTABLES

 DIAGNÓSTICO
ETIOLOGIA (Causas)
1. Diagnóstico presuntivo
2. Diagnóstico de confirmación
2.1 Diagnóstico tradicional
2.2 Diagnóstico molecular
¿Que debemos saber?
1. OBSERVACIÓN “IN SITU”. (PATÓGENO/ AMBIENTAL).
2. INFORMACIÓN SOBRE EL CULTIVO (VARIEDAD, ORIGEN, SEMILLA, EDAD, FENOLOGIA).
3. INFORMACIÓN AGRONÓMICA (SUELO, FERTILIZACIÓN, RIEGO).
4. INFORMACIÓN METEOROLÓGICA (T°, LLUVIA, HELADAS, HUMEDAD, TORMENTAS...)
5. ¿DIAGNÓSTICOS ANTERIORES?.
6. OTRAS PLAGAS Y ENFERMEDADES.
7. OBSERVACIONES GENERALES.

Sin una identificación adecuada de la enfermedad, Las medidas de manejo serían una pérdida de
tiempo y dinero y podrían aumentar las pérdidas de plantas. Por esta razón, un diagnóstico
correcto es vital.
 PASOS A SEGUIR PARA UN DIAGNOSTICO CORRECTO
Es importante mantener una mente abierta hasta que todos los hechos relacionados con el problema
hayan sido recabados. Debe considerarse la posibilidad de que múltiples factores pueden ser la causa del
problema.

 Identificación correcta de las plantas. La identificación de las plantas afectadas es uno de los primeros pasos en
el diagnóstico de sus enfermedades. Se deben tomar en cuenta tanto el nombre común como el nombre científico de
la planta, es importante saber el nombre de la variedad o cultivar, cuando sea posible.
 Reconozca la apariencia de una planta sana. Es importante saber cómo luce una planta normal de las especies de
plantas que usted esté investigando.
 Infórmese del manejo del cultivo (Bitácora). Es importante conocer fechas, formas, frecuencia y duración de
todas las prácticas culturales hechas al cultivo. En caso de aplicación de agroquímicos es importante nombre del
producto, dosis, fecha y forma de aplicación.
 Es deseable:
 Conocer la historia del lote; especialmente evaluar la eventual presencia de microorganismos u otros agentes
patogénicos.
 Estar familiarizado con el cultivo afectado.
 Conocer los ambientes aéreos y edáficos locales.
 Conocer los patógenos descritos en el área y sus posibles huéspedes.
 Conocer las enfermedades de los cultivos en la zona.
 Conocer las características agronómicas del cultivo afectado y las peculiaridades del manejo local.
 Diagnóstico presuntivo de una enfermedad
Este proceso consiste en determinar primeramente si la enfermedad es ocasionada por
un patógeno o por un factor ambiental.

Si las plantas manifiestan síntomas característicos de una enfermedad y se observan los
signos del patógeno, resulta prácticamente fácil para una persona con cierto grado de
experiencia determinar no sólo si la enfermedad es ocasionada por un patógeno o un
factor ambiental, sino también por cuál de ellos. En algunos casos, su detección e
identificación puede lograrse a simple vista.

En las enfermedades infecciosas la presencia activa de patógenos en la superficie de una

planta (signos), podría indicar que probablemente son la causa de la enfermedad.

Se deben comparar los síntomas mostrados por la planta enferma con los incluidos
en manuales especializados o en libros como por ejemplo la serie de compendios de
la Sociedad Americana de Fitopatología. Esto permite reducir la gama de
posibilidades y ayuda a determinar las causas de las enfermedades.

Si se trata de un patógeno que ya está reportado causando enfermedad en ese

cultivo (consultar los índices de hospedantes, que son libros que incluyen las
enfermedades que se sabe atacan a plantas hospederas específicas) puede ser
relativamente fácil identificarlo utilizando las referencias bibliográficas.
 PASOS A SEGUIR PARA UN DIAGNÓSTICO CORRECTO
Distribución de los síntomas en la planta y en el campo. Anote la
distribución de los síntomas. Busque patrones

DISTRIBUCIÓN
DEL PROBLEMA
EN LA PLANTA

EN HOJAS NUEVAS
EN HOJAS VIEJAS
Distribución asimétrica en la misma planta
Distribución de síntomas en el campo o invernadero

EN FOCOS EN FILAS
Distribución de síntomas en el campo
Distribución de síntomas en el campo
Descripción detallada de los síntomas
 TOMA DE MUESTRAS
Criterios para elegir muestra

•Representativa del problema

•Diferentes etapas de la enfermedad
•Abundante
Diagnóstico de confirmación de una enfermedad
Tradicional
Si no hay patógenos en la superficie de las plantas enfermas, será necesario buscar
entonces síntomas adicionales y en especial buscar a los patógenos que se
encuentren dentro de la planta enferma.

Por lo común, esos patógenos están en los límites de los tejidos infectados, en los
tejidos vasculares, en la base de la planta y en las raíces o sobre ellas.

Sin embargo, en la mayoría de los casos, para hacer un diagnóstico acertado, es

necesario hacer un examen detallado de los síntomas, así como colocar trozos de
tejido enfermo en medio de cultivo para que desarrolle el patógeno y lograr su
identificación.

Diagnóstico microscópico, que consiste en la observación de la estructuras del

microorganismo fitopatógeno. Esta observación puede ser directamente al
microscopio de luz, para el caso de las bacterias, hongos, nemátodos o en el uso de
microscopía electrónica para identificar a los virus.

Para el diagnóstico de los hongos se necesita la formación de estructuras

reproductivas, como esporas o conidios y cuando se trata de las bacterias, el proceso
de identificación debe complementarse con pruebas bioquímicas.
Se debe de considerar que con bastante frecuencia, una planta puede ser atacada por dos o más
patógenos de la misma clase o de distintas, que pueden provocarle uno o varios síntomas de
enfermedad.
El aspecto más importante de esta situación es la comprobación de la presencia de otro(s)
patógeno(s). Cuando esto se ha logrado, se lleva acabo el diagnóstico de la(s) enfermedad(es) y la
identificación del(los) patógeno(s) de acuerdo a las descripciones para cada tipo de patógeno.

Sin embargo, en caso de que el patógeno represente la causa de la enfermedad, pero que no
existan registros anteriores que apoyen esa suposición, tendrán que considerarse llevar acabo los
Postulados de Koch para comprobar la hipótesis de que el patógeno es la causa de esa enfermedad.
 PASOS A SEGUIR PARA UN DIAGNOSTICO CORRECTO

Toma de muestras

Planteamiento
de hipótesis

Estudio del problema

CONTROL Prueba de hipótesis

Aceptación o
Observación en campo
replanteo de hipótesis

Cuando se tenga la certeza de que el patógeno es la causa de la enfermedad, podrá considerarse

entonces que ha concluido la primera parte del diagnóstico.
Estudio del problema
 Estudio del problema
TEST DE FLUJO
Exudado bacteriano
emanando de un corte
de un tallo de tomate
infectado con Ralstonia
solanacearum

Se utiliza en
afecciones vasculares,
nos permite discriminar
entre hongos y
bacterias

CAMARA HUMEDA
Es una técnica que nos permite
inducir la aparición del signo.
Diagnóstico de confirmación de una enfermedad
Tradicional

Unidades taxonómicas

Dominio
Orden
Familia
Género
Especie
Sub-especie
Cepa
 Diagnóstico de confirmación de una enfermedad
Tradicional

Taxonomía Clásica
Hongos:
Estudios morfológicos y culturales:

Aspecto de la colonia, coloración

 Forma del conidióforo

Conidios: forma, tamaño, color, presencia de tabiques (septos)

Presencia de clamidosporas, ubicación

Estudios fenotípicos:

- Crecimiento a diferentes temperaturas

- Resistencia a fungicidas
- Producción de metabolitos

La microscopía óptica y electrónica

El empleo de estas técnicas se limita solamente a la observación directa de las estructuras del patógeno en cuestión.
 Diagnóstico de confirmación de una enfermedad
Tradicional
Bacterias:
- Análisis morfológicos
• Oval o esférica (cocos)
• Cilíndrica o de bastón (bacilos)
• Espiral o helicoidal (espirilos)
Análisis bioquímicos Esquema simplificado para la
identificación de bacterias
fitopatógenas a nivel de Género
Medios selectivos.
1. Medios selectivos basados en las posibilidades de las bacterias de utilizar sustratos específicos. La
presencia o ausencia de crecimiento y el color de las colonias son importantes.

2. Medios selectivos basados en la tolerancia del patógeno a cierto número de antibióticos, fungicidas,
bactericidas que los microorganismos saprófitos no toleran o no soportan en determinadas
concentraciones.
 Diagnóstico de confirmación de una enfermedad
Virus: Tradicional

Forma (microscopio electrónico)

Virus del mosaico del tabaco Virus del enanismo del arroz

Síntomas en plantas indicadoras

Síntomas en huésped

Taxonomía Clásica Limitantes

 Resultados no son concluyentes
 Sujeto a cierta subjetividad
 Personal entrenado
 Tiempo requerido alto
 Diagnóstico de confirmación de una enfermedad

PASOS A SEGUIR PARA UN DIAGNÓSTICO CORRECTO

COMPROBACIÓN DE HIPÓTESIS

POSTULADOS DE KOCH (1881)

1. El microorganismo debe estar presente en todos los casos de la enfermedad y la

enfermedad no debe presentarse sin que el microorganismo esté presente o haya estado
presente.
2. El microorganismo debe ser aislado del hospedero enfermo y obtenerse en cultivo puro en
el laboratorio.
3. La enfermedad específica debe reproducirse cuando un cultivo puro del microorganismo
se inocula a un hospedero susceptible sano.
4. El microorganismo debe ser recuperable de nuevo a partir del hospedero infectado
experimentalmente.
 PASOS A SEGUIR PARA UN DIAGNÓSTICO CORRECTO
POSTULADOS DE KOCH (1881)

3. Inoculación del
1. Asociación patógeno-huésped
patógeno

2. Aislamiento del patógeno 4. Re-aislamiento del patógeno

Diagnóstico de confirmación de patógenos
Molecular
 Diagnóstico de confirmación de patógenos
Molecular

Técnicas de diagnóstico basadas en

BIOLOGÍA MOLECULAR
- Serología
Analiza las proteínas

- Hibridación y PCR
Analiza el ADN o ARN
Técnicas Moleculares
Se basan en el análisis del ADN o ARN

¿Quiénes pueden ser analizados?

Todos los fitopatógenos que contengan ADN o ARN

- Hongos
- Bacterias y Fitoplasmas
- Virus y Viroides
- Nemátodos
 Diagnóstico de confirmación de patógenos
Molecular
Técnicas serológicas
El uso de inmunoensayos en la detección de patógenos de plantas ha sido rutinario en los últimos años,
especialmente en virus (Clark, 1981 y Millar, 1988).
 Diagnóstico de confirmación de patógenos
Molecular
Entre los inmunoensayos más usados están:

Método por aglutinación: Consiste en hacer reaccionar cantidades equivalentes de los reactantes
(Ag y Ac). La formación de gránulos aglutinados o agregados indican una reacción positiva. Las
reacciones de aglutinación son menos específicas pues tienen la desventaja de depender
grandemente de los factores físico químicos, tales como, concentración de electrolitos, pH,
temperatura y el tiempo.

Método por precipitación: Pueden ser en medios líquidos o en geles. Estos métodos han demostrado
tener una notable eficacia para individualizar y purificar los antígenos dotados de diferencias
particulares. La unión del Ag y Ac se traduce por la formación de un precipitado insoluble con la
condición que los reactivos se encuentren a concentración equivalente.

Método del látex: Está basado en la prueba de aglutinación. Los Ac son adheridos a partículas de látex.
Al enfrentarse el látex sensibilizado con el Ag específico se produce la agregación entre estas esferas y
los Ag. Esta prueba ha sido usada principalmente en Virología, en Bacteriología técnica ha sido usada con
éxito para detectar Clavibacter michiganense subps sepedonicum y Ralstonia solanacearum en papa y
Xanthomonas albilineans en caña. El método es de 100 a 1000 veces más sensible que una aglutinación
normal, la reacción aparece más rápida, generalmente no es necesario el microscopio para observar la
reacción, se necesita muy poco inmuno suero, no requiere la clarificación de la savia.
 Diagnóstico de confirmación de patógenos
Molecular
Técnica de Inmunofluorescencia: Esta técnica se basa en la conjugación de anticuerpos
específicos con moléculas teñidas con productos, ejemplo, la fluoresceína, que produce un color
verde amarillento. Es muy sensible para identificar bacterias fitopatógenas y útil para analizar un
gran número de muestras. La técnica de inmunofluorescencia permite identificar un antígeno con
la ayuda de un inmuno suero conocido, e investigar y titular un anticuerpo con la ayuda de un
antígeno conocido.

Técnica inmunoenzimática ELISA: El ensayo se basa en la interacción específica de un antígeno

(patógeno) y un anticuerpo (proteínas inmunoglobulinas producidas en un vertebrado superior,
usualmente conejos). La reacción se visualiza a través de la acción de un conjugado enzima-
anticuerpo sobre un sustrato. Es un método rápido de gran sensibilidad, especificidad y bajo costo,
que supera a muchas técnicas de diagnóstico empleadas con anterioridad.

La técnica ELISA con sándwich de doble anticuerpo es una de las más empleadas, en este caso el
antígeno es ubicado entre dos anticuerpos específicos, el de captura y el de marcaje, este último
está conjugado a una enzima y puede cuantificarse en el espectrofotómetro. Esta técnica es de
gran utilidad en la detección de patógenos de mezclas complejas, tales como, suelo, extractos de
plantas.

Existen diferentes variantes de la técnica de ELISA, todas

basadas en el mismo principio. El tipo de técnica y anticuerpo a
emplear dependerá del objetivo de la aplicación (campo,
laboratorio), tipo de muestra (suelo, agua tejido) y nivel de
sensibilidad y rapidez requerida.
 Diagnóstico de confirmación de patógenos
Molecular
Las técnicas de inmuno detección han sido usadas en la detección de microorganismos fitopatógenos,
principalmente virus y bacterias y en menor escala para hongos. Las técnicas serológicas ELISA-
Inmunofluorescencia además de ser métodos muy confiables y sensibilidad moderada tiene la ventaja de
poder asimilar gran cantidad de muestras en algunas horas y los resultados positivos y sospechosos se
confirman mediante la prueba de patogenicidad.

METODOS MOLECULARES DE ADN

¿Cómo se analiza el ADN?

Mediante PCR (Reacción en cadena de la Polimerasa)

- Análisis de genes o regiones específicas
- Análisis de todo el genoma

Mediante hibridación
- Utilización de sondas
 Diagnóstico de confirmación de patógenos
Molecular
¿Que es la PCR?
Consiste en amplificar
muchas veces una región del
ADN o ARN
95ºC 40-60ºC 72ºC

PCR:
- ADN molde
- Primer (cebador)
- Enzima
- Nucleotidos sueltos (A, T, C, G)
- Buffer
- Agua

Virus y Viroides (ARN): RT-PCR

35 CICLOS = 235 = 34,000 millones de copias

Enviar a secuenciar o digerir con enzimas de restricción y clonar en un plásmido

 Diagnóstico de confirmación de patógenos
Molecular
Regiones más utilizadas para los análisis
Secuencias: primers generales

HONGOS
- Región total ITS
- β-tubulina (β-tub): proteína que forma los microtúbulos (involucrados en la multiplicación celular)
- Factor de elongación (Ef-1α): cataliza la “traducción” en la síntesis proteica
- Histona 3 (H3): proteína que interviene en la división celular
- Actina (Act): Proteina
- Calmodulina (Cal): Proteina
- IGS: espacios entre los ITS
- COX: DNA mitocondrial
- otros

BACTERIAS
- Región 16S: ARN Ribosomal de las bacterias
 Diagnóstico de confirmación de patógenos
Molecular
Iniciadores ITS
utilizados para
Identificación de
hongos.

En hongos, los amplicones se obtienen de los espacios intergénicos (ITS) que son las regiones más
divergentes de los genes ribosomales 18s y 28s. Los iniciadores fueron los diseñados por White et al.
en 1990, conocidos como ITS 1/ITS 4 los cuales amplifican la región total ITS (ITS1-ITS2, incluyendo el
gen 5.8S)

White TJ, Bruns T, Lee S, Taylor J (1990). Amplification and direct sequencing of
fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: PCR Protocols: a guide to methods
and applications. (Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ, White TJ, eds). Academic Press,
New York, USA: 315–322.
Iniciadores 16S
utilizados para
Identificación de
bacterias.

En bacterias, los amplicones se obtienen del ARN ribosomal 16s. Los genes que lo codifican
son conocidos como genes del ARNr 16s, y se utilizan para la reconstrucción de filogenias
debido a sus bajas tasas de evolución. Los iniciadores fueron los diseñados por Herlemann et
al, en el 2011, los cuales, además de contar con sitios de unión altamente conservados en la
secuencia del gen 16s rRNA, amplifica las regiones hipervariables V3/V4 que en la mayoría de
los casos contienen la máxima heterogeneidad de nucleótidos y permiten el mayor poder de
discriminación entre individuos.
Herlemann D. P. R., Labrenz M., Jurgens K., Bertilsson S., Waniek J. J., Andersson A.
F. (2011). Transitions in bacterial communities along the 2000 km salinity gradient of
the Baltic Sea. ISME J. 5 1571–1579. 10.1038/ismej.2011.41
Diagnóstico de confirmación de patógenos
Molecular
 Diagnóstico de confirmación de patógenos
Molecular
¿Que se hace con las secuencias?

1) Compararlas con bases de datos (genbank, otros)

2) Análisis filogenéticos
Diagnóstico de confirmación de patógenos
Molecular
Diagnóstico de confirmación de patógenos
Molecular
 Diagnóstico de confirmación de patógenos
Molecular
PRIMERS ESPECÍFICOS:
- Análisis de genes o regiones específicas
- primers específicos
- Específicamente amplifican determinado género, especie, patovar, etc.
- Se diseñan en regiones dónde hay variabilidad entre especies

Ejemplo: Identificación mediante primers específicos de Colletotrichum gloeosporioides y C.

acutatum causantes de la “podredumbre amarga” en manzano

Diseño de primers específicos: Región ITS (ITS1, 5.8S, ITS2)

C. acutatum
CaInt-2
C. gloeosporioides
CgInt
Identificación mediante primers específicos
 Diagnóstico de confirmación de patógenos
Molecular
Identificación mediante primers específicos de Colletotrichum gloeosporioides y C. acutatum
 Diagnóstico de confirmación de patógenos
Molecular
Aplicaciones avanzadas con primers específicos
Diagnóstico de confirmación de patógenos
Molecular
 Diagnóstico de confirmación de patógenos
Molecular
Transcriptasa reversa Es un PCR a partir de ARN, del cual se obtiene una copia de ADN
Se utiliza en virus de ARN
Diagnóstico de confirmación de patógenos
Molecular
 Diagnóstico de confirmación de patógenos
Molecular

Mediante hibridación
- Utilización de sondas

¿Qué es una sonda?

Son moléculas de ADN de cadena sencilla marcadas mediante radiación (P32) o
agentes químicos (digoxigenina, biotina, otros) con el fin de ser utilizadas para la
detección de secuencias complementarias de DNA o RNA

Sondas:
- Son de relativamente pequeño tamaño (100 a 1000 bases)
- Se diseñan para específicamente detectar determinado género, especie, etc.

Se utilizan mucho para el diagnóstico de Virus y Viroides

 Diagnóstico de confirmación de patógenos
Molecular

Técnicas:
- Southern blot: detecta ADN
- Northen blot: detecta ARN
- Dot blot: detecta ADN o ARN
- Slot-blot: detecta ADN o ARN
Diagnóstico de confirmación de patógenos
Molecular
Diagnóstico de confirmación de patógenos
Molecular
Metagenómica de suelo Hongos y Bacterias
Ventajas y desventajas
de las técnicas
moleculares de
diagnóstico
 Diagnóstico de confirmación de patógenos
Molecular

Técnicas de Diagnóstico
mas utilizadas en algunos
microrganismos.
En el diagnóstico fitosanitario se utilizan técnicas convencionales y moleculares, de tal forma
que dependiendo del tipo de organismo, se definirá la técnica apropiada

Técnicas utilizadas para el diagnóstico fitosanitario.

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