Manual de Prácticas Lab. 4o. Sem. 2022

UNIVERSIDAD AUTONOMA DE
QUERETARO
FACULTAD DE MEDICINA
Departamento de Investigación Biomédica
MANUAL DE PRÁCTICAS Y GUÍA

METODOLÓGICA
DE LA MATERIA DE PARASITOLOGIA
4º. Semestre.
Grupos 1 y 2
Titular de la Materia: Dra. Ma. Elena Villagrán Herrera

Docente-Investigador VII/VII
SNI-1, PRODEP.
Creado: Enero del 2013

Revisado, modificado y actualizado: Enero del 2022
Colaboradores:
Dra. Angélica Godínez Oviedo. Responsable del Laboratorio de
Microbiología. Fac. de Medicina. Universidad Autónoma de Querétaro.
Dr. José Antonio de Diego Cabrera. Titular de Parasitología y Medicina
Tropical. Fac. Medicina. Universidad Autónoma de Madrid. España.
Contenido
Introducción al Diagnóstico Parasitológico.
Tema 1.- Coprología parasitaria: Toma de muestras, conservación, examen

macroscopico, tinción y montaje de formas parasitarias macroscópicas.
Toma de muestras
Conservación de las muestras
Examen macroscopio
Fijación, tinción y montaje de formas parasitarias macroscópicas.
Tema 2.- Coprología parasitaria II.- Examen directo, técnicas de concentración.

Examen directo
Técnicas de sedimentación
Técnicas de Flotación
Técnicas difásicas
Tema 3.- Coprología parasitaria III.- Tinción de frotis fecales

Tricrómico
Hematoxilina
Negro clorazol
Giemsa-Suárez Peregrin
Tinciones especiales para coccidios
Tricrómico modificado para microsporidios
Tema 4.- Técnicas especiales de Enterovius vermicularis. Método de Kato.

Metodos migratorios. Métodos cuantitativos. Corprocultivos.
Diagnóstico de Enterovius vermicularis
Método de Kato
Métodos migratorios
Métodos cuantitativos
Coprocultivo.
Tema 5.- Técnicas Hematológicas: Examen directo, gota gruesa,frotis de sangre,

técnicas de concentración.
Examen directo
Gota gruesa y frotis de sangre
Tinción de Giemsa
Tinción de Wright
Procedimientos de concentración
Tema 6.- Diagnóstico de parásitos genitourinarios.

Schistosoma haematobium
Trichomonas vaginalis
___________________________________________________________________ 2
Dra. Ma. Elena Villagrán Herrera. Manual de Prácticas de Parasitología Clínica Diagnóstica.
Tema 7.- Examen de otros fluídos corporales, aspirados y tejidos. Cultivo e
inoculación animal.
Examen de esputo
Examen de Líquido Cefalorraquídeo
Examen de aspirados
Examen de Tejidos
Cultivos
Inoculación animal
Tema 8.- Pautas para el diagnostico de las principales protozoosis humanas.

Toxoplasmosis
Leishmaniasis
Tripanosomiasis
Paludismo
Amebiasis
Giardiasis
Tema 9.- Pautas para el diagnóstico de las principales helmintiasis humanas

Fasciolosis
Esquistosomosis
Hidatidosis
Cisticercosis
Filariosis
Triquinosis
Toxocariosis
PRACTICAS:
 1.- Presentación y entrega de material, Manual de Practicas y Normas

reglamentarias de laboratorio.
 2.- Microscopía. Observación de parásitos microscópicos y macroscópicos, vectores
y algunos animales vesicantes.
 3.- Parásitos intestinales y urogenitales
 4.- Parasitosis hemáticas y tisulares.
 5.- Amebas y amebiasis.
 6.- Flagelados y ciliados intestinales.
 7.- Coccidiosis y Microsporidiosis.
 8.- Leishmaniasis y Tripanosomiasis.
 9.- Paludismo.
 10 y 11.- Geohelmintiasis.
 12 y 13.- Nematodos tisulares y Filariasis.
 14 y 15.- Céstodosis intestinales y tisulares.
 16.- Tremátodosis intestinales, pulmonares, hepáticos y sanguíneas.
 17.- Miasis.
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ANEXO I
Claves taxonómicas...
Clave de identificación de nematodos adultos
Clave de identificación de L3 en coprocultivos humanos
Clave de escólex y estróbilo de cestodos
Clave de anillos grávidos de cestodos
Clave de identificación de trematodos
Clave de identificación de huevos de helmintos
Clave de identificación protozoos ( quistes)
Clave de larvas productoras de miasis entéricas.
ANEXO II
Principales técnicas parasitarias
ANEXO III
Reactivos y medios de cultivo
ANEXO IV
Diagnóstico de laboratorio de las parasitosis intestinales y urogenitales
BIBLIOGRAFÍA.
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INTRODUCCIÓN AL DIAGNÓSTICO PARASITOLÓGICO
La salud pública puede considerarse como un buen funcionamiento de mecanismos

que mantienen el bienestar físico y psíquico del individuo y todo aquello que interfiera con
este buen funcionamiento va a provocar cambios y alteraciones que, en definitiva, llevan a
la pérdida de salud o enfermedad.
Las causas pueden ser variadas y entre ellas está la presencia en el organismo de
otros seres vivos que viven a sus expensas y alteran la homeostasis, poniendo en marcha
toda una serie de mecanismos defensivos que, a su vez, pueden potenciar las alteraciones
del medio interno. Es a este grupo de procesos al que se conoce como enfermedades
infecciosas y dentro de ellas se distinguen las causadas por microbios (virus, bacterias y
hongos) y por parásitos (protozoos, helmintos y artrópodos. Al organismo patógeno que
provoca la enfermedad se le conoce como ¡Agente etiológico” de a misma y si se trata de
un parásito en proceso al que da lugar se conoce como “Enfermedad parasitaria”.
El parasitismo es un hecho biológico que comprende las interacciones entre parásito
y hospedador y estas pueden ser, lógicamente de distinto grado. Si son suaves y poco
agresivo el resultado será de convivencia pacífica sin manifestaciones de alteración
(parasitismo), mientras que en el otro extremo, la presencia del parásito provocará la
aparición de enfermedad (parasitósis). Por tanto, la enfermedad parasitaria no se define
como la presencia del parásito e el hospedador sino como la aparición de enfermedad
debida a la presencia de un parásito.
Basándose en los conceptos anteriores se distinguen dos situaciones:

 Parasitismo, donde la presencia del parásito perse no provoca la aparición de
enfermedad
 Parasitosis, donde la presencia del parásito provoca la aparición de enfermedad. Dentro
de estas parasitósis hay, a su vez, dos situaciones a expensas de las cuales se dividen en:
-Primarias.- La sola presencia del parásito provoca la aparición de la enfermedad.
-Secundarias.- Además de la presencia del parásito son necesarias otros factores
( nutricionales, inmunológicos, otros procesos patológicos, genéticos, ambientales etc.,
para que se produzca la enfermedad.
Por tanto, la identificación de un parásito en muestras procedentes de una persona

no supone, de modo obligatorio, que sea el causante de la enfermedad cuyo origen se está
investigando.
Cuando se produce una enfermedad las alteraciones del medio interno se
manifiestan mediante los signos y síntomas: los primeros son cuantificables y objetivos
como fiebre, sudoración, la tos etc., mientras que los segundos son subjetivos, como
malestar decaimiento, etc. El primer paso en el diagnóstico (diagnóstico clínico o
presunción), es la certeza o sospecha, en función de los signos y síntomas, de una
enfermedad concreta. Pero la sintomatología no es exacta, pues unas veces se manifiesta
con signos exclusivos para una enfermedad concreta (patognomónico), mientras que otras
lo hace con sintomatología sugestiva o sospechosa de varias enfermedades y a veces, el
conjunto de signos y síntomas no es específico sino común a patologías de muy distintos
orígenes (síndromes. En el caso de las enfermedades parasitarias el diagnóstico presuntivo
tiene que confirmarse mediante el diagnóstico de laboratorio, el cuál confirmará o
descartará el diagnóstico inicial.
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Uno de los problemas de la Parasitología Clínica es la gran diferencia que existe
entre los distintos parásitos, tanto desde el punto de vista biológico (intracelulares,
extracelulares, multiplicación dentro del hospedador, fuera del hospedador, etc.) como de
complejidad estructural (protozoos, metazoos) y de ciclo biológico. Semejante complejidad
debe corresponderse con distinta susceptibilidad a los quimioterápicos, por lo que la
identificación del parásito es el previo paso y necesario a la implantación del tratamiento,
no existiendo la posibilidad de aplicar un tratamiento provisional a expensas de antibióticos
de amplio espectro como en las infecciones bacterianas.
Clásicamente se han estudiado las parasitosis en función de su distribución

geográfica lo que, incluso dio origen al nacimiento y consolidación de la Medicina
Tropical. Este enfoque es consecuencia del hecho de que ciertos parásitos solo se
encuentran en determinadas localizaciones y que por tanto, cada país tiene determinados
parásitos y no otros. Por otra parte, ciertos países han erradicado una serie de
enfermedades, como ocurrió en España con el paludismo con los años cincuenta y se
considera que están libres de ellas. Pero esta división territorial está desapareciendo a pasos
agigantados en función de las nuevas condiciones sociológicas y de los transportes en la
sociedad, que llevan a las personas de un País a viajar y volver de excursiones turísticas o
desplazamientos laborales a zonas tropicales o endémicas en periodos de pocos días. La
consecuencia inmediata es la importación de parásitos a zonas teóricamente libres de ellos,
y lo más importante a la dificultad de reconocer e identificar patógenos con los que el
personal sanitario no está familiarizado ni entrenados.
Otra consideración importante en parasitología es la aparición de los denominados

parásitos emergentes, así como los parásitos oportunistas, que vienen periódicamente a
sobresaltar el ánimo de los que piensan que “todo ya está visto”. Una parte importante
corresponde a nuevas parasitosis que cobran relevancia inusitada, sobre todo por cambios
culturales que afectan directamente a hábitos alimenticios, higiénicos, sanitarios, o a nuevas
situaciones como pueda ser el SIDA. Por ello, parásitos que hace apenas 10 o 20 años eran
prácticamente desconocidos en parasitología humana, hoy están causando graves y
abundantes problemas de salud; entre ellos podriamos citar a microsporidios, Ciclospora,
Cryptosporidium, Pneumosystis, Anisakis, etc., y para muchos de los cuáles no existen, por
supuesto, ni buenos métodos de diagnóstico ni tratamientos eficaces.
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DIAGNOSTICO DIRECTO (Morfológico)
Parece evidente que el mejor método para diagnosticar una parasitosis es

encontrar al parásito sospechoso. Para ello se debe conocer la localización normal en el
hospedador (para utilizarla muestra adecuada), su ciclo biológico (para saber en que forma
o formas se encuentra), su morfología (para reconocerlo), etc. Además se debe establecer el
diagnóstico diferencial entre aquellos parásitos que no son patógenos (se comportan como
comensales) y los que si lo son y que a veces presentan grandes similitudes morfológicas.
Este enfoque es el que se conoce como diagnostico directo o morfológico.
En las parasitosis existe una fase prepatente (en la que todavía no aparecen las
formas de eliminación parasitarias) y una patente (se eliminan las formas de diseminación)
y otra postpatente (las formas de eliminación disminuyen hasta desaparecer. Esto
condiciona el diagnóstico morfológico pues solo será fiable durante la fase patente. Además
hay veces en las que el parásito no presenta formas de eliminación en el hombre (o éstas
son intermitentes y heterogéneas), se localiza en lugares de difícil acceso de los que hay
que tomar las muestras mediante técnicas invasivas, pasan a través de la placenta durante
la gestación, etc. En estos casos hay que cambiar la estrategia y realizar otro tipo de
diagnóstico que, de modo indirecto, nos confirme o descarte la presencia del parásito.
DIAGNOSTICO INDIRECTO (Inmunológico).
Cuando resulta difícil el hallazgo e identificación morfológica de los parásitos o de

sus formas de eliminación y hay que recurrir a investigar la respuesta del sistema
inmunitario frente a ellos. Esta respuesta presenta, entre otras características, la de ser
específica por lo que sus productos deben reaccionar, teóricamente, con el parásito que lo
indujo su formación. Basándose en ello se han desarrollado una serie de técnicas que
permiten investigar de forma indirecta, la presencia de los parásitos en el hospedador.
Hay que destacar que este tipo de pruebas no sustituye al diagnóstico morfológico
(si encontramos el parásito o a sus formas de eliminación el diagnóstico ya está hecho),
pero en muchos casos, lo complementa (por ejem, en las cepas de Giardia duodenalis que
eliminan los quistes de forma intermitente) o permite realizarlo cuando no hay formas de
eliminación y el parásito en cuestión exige una toma de muestra difícil y traumática ( por
ejem. Punción ganglionar para Toxoplasma gondii, punción esternal para Leishmania
infantun, etc.). Otra de las aplicaciones del inmunodiagnóstico es el campo
epidemiológico, donde su capacidad de automatización permite el procesamiento de un
número elevado de muestras en tiempo limitado.
Frente a una posible parasitosis se puede plantear la investigación de la respuesta
mediada por anticuerpos, tanto en suero como en secreciones, para lo cuál debe enfrentarse
la muestra con el antígeno parasitario correspondiente. Pero los anticuerpos específicos no-
solo están libres en el suero sino también circular unidos a los anticuerpos específicos no-
solo están libres en el suero sino también circulan unidos a los antígenos solubles en forma
de inmunocomplejos, por lo que la detección de los mismos (inespecífica o específica)
constituye otra estrategia en el inmunodiagnóstico.
Los parásitos en el hospedador producen sustancias que pasan a recubrirlos,
formando parte del glucocaliz y que en ocasiones se liberan y constituyen los denominados
antígenos de excresión/secreción (ES) o antígenos solubles; estos antígenos pueden
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investigarse en el suero, donde se encuentran libres formando parte de los
inmunocomplejos. La positividad es el marcador de la presencia del parásito y su cantidad
un indicador del número y de la actividad metabólica de los mismos. Pueden determinarse
utilizando anticuerpos específicos que reaccionan in vitro con ellos y la tendencia actual se
inclina por detección mediante el uso de anticuerpos monoclonales (mAb) específico como
reactivo.
También puede plantearse la exploración de la inmunidad mediada por células, ya que los
linfocitos T presentan memoria específica del antígeno, y cuando son estimulados por éste,
producen una serie de citoquinas con acción biológica conocidaí( inducen proliferación
linfocitaria y durante ella, la formación detectable de linfoblastos; Inhiben la capacidad de
desplazamiento de los macrófagos, etc.) o que pueden detectarse directamente (producción
de cito quinas tales como IL-2 y IFN, etc.) In vivo se estudia mediante las reacciones de
hipersensibilidad retardada tales como la reacción de Montenegro e las leishmaniosis.
Las técnicas de inmunodiagnóstico pueden dividirse en cuatro grandes grupos.

1. -Detección de anticuerpos específicos
2. - Detección de inmunocomplejos circulares
3. - Detección de antígenos solubles
4. - Exploración de la inmunidad mediada por células.
Detección de anticuerpos específicos
En función de los isotipos (clases) de anticuerpos que se producen en la respuesta

existen una serie de técnicas que utilizan algunas de sus propiedades fisicoquímicas o
biológicas, por lo que hay un panel de pruebas (cada una con sus ventajas e inconvenientes)
entre las que habrá que elegir para su uso aquella que cumpla al máximo en cada caso con
los criterios de especificidad ( ausencia de reacciones cruzadas), y sensibilidad ( capacidad
de detectar cantidades mínimas de anticuerpos. Dentro de este grupo heterogéneo de
determinaciones las que se utilizan con más frecuencia en el inmunodiagnóstico
parasitológico son las siguientes:
Reacciones de Precipitación.
En el medio líquido (Heidelberger y Kendall)
En medio sólido
Inmunodifusión radial ( Manzini)
Doble difusión (Ouchterlony)
Inmunoelectroforesis
Electroinmunodifusión (Laurell)
Contrainmunoelectroforesis
Microprecipitación (larvaria, circunoval, etc.)
Reacciones de Aglutinación.
Aglutinación directa (se emplea al parásito como antígeno)
Aglutinación indirecta (se emplean antígenos solubles del parásito unidos a partículas o
células.
De partículas sensibilizadas (carbón, látex, etc.
De hematíes sensibilizados (Hemoaglutinación indirecta.
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Reacciones de fijación del complemento
Reacciones con antisueros marcados.
Inmunofluorescencia (IF)
Directa
Indirecta
Microscópica (IFI)
Fluoroinmunoanalisis (FIA)
Enzimoinmunoanalisis (EIA).
E.L.I.S.A. directo
E.L.I.S.A. Indirecto (Sándwich
E.L.I.S.A. estreptavidina-biotina
Radioinmunoensayo (RIA).
Ejemplo De Diagnóstico en Schistosoma

El requisito previo para el control de la parasitósis es la disponibilidad de métodos
que permitan el diagnóstico correcto. La utilidad de tales métodos no es solo las personas
que viven en las zonas endémicas sino también para viajeros y turistas, donde el número de
personas que vuelven infectadas sigue en aumento.
Diagnostico directo.
Él diagnóstico tradicional es la detección de huevos en heces y orina, efectuándose
el diagnóstico específico sobre la base de la morfología de tales huevos. Hay variantes de
estas técnicas, pero las más usadas para la detección de huevos de S. Mansoni y S.
Japonicum en heces son las que se basan en el método de frotis grueso de Kato-Katz. En el
caso de S. Haematobium el método de elección es la filtración de orina a través de
Millipore o Nucleopore.
Se admite ampliamente, y cada vez más que estos métodos directos carecen de
seguridad y sensibilidad. Entre los factores que contribuyen al problema están las grandes
variaciones día a día en el número de huevos en el mismo paciente y la distribución
inconstante de los huevos en las excretas.
Otros factores pueden ser el desequilibrio de seco, la existencia de helmintos inmaduros,
lesiones patológicas importantes en los tejidos del hospedador, la dependencia inmune de
los huevos para su excreción y la cantidad y consistencia de las heces excretadas que está
influida, a su vez por la alimentación y el tamaño corporal. En el caso de la orina los
gusanos pueden sobrevivir tras la inhibición inmunológica de la fecundidad.
Los errores debidos a la falta de sensibilidad seguramente aumenta mucho en las
infecciones ligeras, como ocurre en las áreas de poca prevalencia o en las fases iniciales o
finales de la infección. Esto es particularmente importante en zonas donde la intensidad y
prevalencia de la esquistosiomiasis se está reduciendo por la eficacia de las medidas de
control. En el caso de la esquistosomiasis importadas por viajeros es probable que el
número de huevos sea bajo e incluso nulo, ya que la exposición a las cercanías en las aguas
contaminadas ha debido ser relativamente limitada.
El diagnóstico directo tiene la ventaja de ser barato, necesitar poca instrumentación
y personal no muy especializado. El problema de la sensibilidad puede compensarse
aumentando el tamaño y/o número de muestras analizadas y también recurriendo a la
biopsia, pero en este caso se trata de una técnica agresiva, cara y que precisa personal
especializado. En los estudios epidemiológicos está comprobado que si se hace una sola
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determinación la prevalencia obtenida será inferior a la que se detecta con cinco
determinaciones en un 20%.
Detección de anticuerpos circulantes.
Los esquistosomas excretan o secretan antígenos que pueden ser útiles para el
diagnóstico. Se encontró uno que procede de las células epiteliales del ciego del adulto y
que en la electroforesis m igra hacia el ánodo y que se ha denominado CAA( antigeno
anódico circulante. Posteriormente se ha identificado otro antígeno en el suero y orina de
animales de experimentación que migra hacia el ´ cátodo (CCA. Ambos antígenos son
proteoglicanos ( su estructura sola está parcialmente elucidada) y se han producido varios
monoclonales frente a ellos. Una característica importante es que no son específicos de
especie y los anticuerpos producidos reaccionan frente a cualquiera que sea la especie
productora de antígeno.
Aunque no distingue entre especies, el diagnóstico mediante la detección de estos

antígenos es relativamente específico y da pocos falsos positivos tanto en zonas endémicas
como no endémicas. En el caso de S. Mansoni la sensibilidad de la detección de CAA por
ELISA de captura es la misma que la de un análisis fecal correspondiendo la cantidad
mínima a una tasa de excreción de 10 huevos por gramo de heces. Si se analizan en paralelo
CAA y CCA aumenta el rendimiento. En los pacientes con esquistosomiasis
hepatoesplénica pueden presentarse niveles más altos de CCA que en los de enfermedad
intestinal, mientras que tales diferencias no se presentan en CAA.
Una ventaja sobre la detección de anticuerpos es que ambos antígenos pueden

determinarse en orina ( muestra menos invasiva que la de sangre. Su presencia es un mejor
indicador de infección activa y permite monitorizar la eficacia de los tratamientos. Pero a
diferencia de la detección de anticuerpos, le muestra precisa un tratamiento previo.
Detección de anticuerpos.
Una de las críticas más frecuentes que se hace a la determinación de anticuerpos es

que, debido a ser una evidencia indirecta, el resultado no refleja con seguridad la presencia
de una infección activa, al contrario de lo que ocurre con la detección de huevos o el
antígeno circulante en sangre y orina. Otro defecto que se le achaca a su poca utilidad para
monitorizar la eficacia de la quimioterapia, mientras que el recuento de huevos y la
concentración de los antígenos circulantes disminuyen con relativa rapidez tras la misma.
Sin embargo, la monitorización de la quimioterapia mediante la detección de
anticuerpos puede mejorarse mediante el uso de antígeno purificados o discriminando los
isotipos de anticuerpos. Por ejemplo, los anticuerpos frente al antígeno CEF6 (un antígeno
semipurificado del homogenizado de huevos) disminuyen con mayor rapidez que los
anticuerpos frente a SEA (homogenizado de huevos de S. Mansoni) tras la quimioterapia.
Otros trabajos muestran que la disminución de excreción de huevos y la disminución de las
concentraciones de antígenos circulantes se asocian con una caída sustancial de los títulos
de anticuerpos anti-SEA de la subclase IgG da una correlación significativa entre titulo de
anticuerpos e intensidad de la infección.
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Otro problema de la detección de anticuerpos es su aparente falta de especificidad
pues, sobre todo en estudios epidemiológicos, se encuentran anticuerpos con relativa
frecuencia sin la evidencia parasitologica concomitante de infestación. Se sabe que
efectivamente, la especificidad de la detección de anticuerpos tiende a ser menor en zonas
endémicas de esquistosomiasis humana que en las no endémicas pero también se sabe
ahora que el método parasitológico directo de referencia tiene una falta importante de
sensibilidad. Por otra parte, la detección de antígeno no parece tener más sensibilidad que
el método de referencia y en poblaciones con prevalencia e intensidad bajas es incluso
menos sensible.
En ciertas circunstancias por tanto, la presencia de anticuerpos específicos frente a
esquistosomas es el indicador más sensible de la infección. Esto se debe a que, a diferencia
de la detección de huevos y del antígeno circulante, la detección de anticuerpos explota la
amplificación de la señal inherente a la respuesta inmune. ,
La detección de anticuerpos también permite distinguir entre infecciones patentes
por las distintas especies de esquistosomas, obteniéndose los mejores resultados con los
antígenos microsomales de adultos en inmunoblots. Esto no pueden hacerse mediante los
antígenos circulantes pues todos ellos reaccionan con el mismo monoclonal.
Conclusión
Tras el examen de las ventajas y desventajas de los métodos directos
(parasitológicos, indirectos(detección de antígenos circulantes y de anticuerpos), se
concluye que todos ellos presentan problemas y que hay métodos satisfactorios para
distinguir entre infección o enfermedad, o entre las formas de la enfermedad. Si se confirma
que la aparente falta de especificidad de los métodos de detección de anticuerpos
(comparados con el método parasitológico), es en realidad, un reflejo de su detección de
anticuerpos ( comparados con el método parasitológico) es, en realidad, un reflejo de su
mayor sensibilidad, esta determinación puede transformarse en el método de elección.
NUEVAS TENDENCIAS EN LA DETECCIÓN DE INFECCIONES PRIMARIAS

RECIENTES.
La detección de anticuerpos de la clase IgM para el diagnóstico de la fase aguda de

infecciones por virus, bacterias y parásitos presenta una serie de limitaciones, y con
frecuencia no es posible distinguir de forma inequívoca entre infección primaria,
reinfección o reactivación. Además en ciertas infecciones se produce una estimulación
clonal de los linfocitos B que lleva a la producción sostenida de IgM.
En las infecciones humanas, la Ig M aparece a las dos semanas, mientras que la IgG
aparece más tarde y alcanza su máximo a los dos meses, aprox. , Dé la infección. Los
anticuerpos IgA pueden detectarse rápidamente tras algunas infecciones y su nivel
disminuye paulatinamente entre los 2 y 9 meses postinfección. La detección de IgM e Ig A
específicas de modo simultaneo indica mejor una fase aguda en estos casos.
Sabemos que los anticuerpos IgG sufren durante la respuesta, el proceso denominado
“maduración de la afinidad” mediante el cuál mejoran paulatinamente la fuerza de su unión
con el antígeno. La fuerza total de las uniones antígeno-anticuerpo se conocen como
afinidad funcional o avidez. Esta maduración de la afinidad de los anticuerpos IgG es
pequeña al principio y aumenta durante las semanas y meses posteriores 8 1 a 7 meses. Esta
maduración es inversamente proporcional a la dosis del antígeno por lo que durante las
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primeras ases de la infección (cuando están presentes dosis altas de antígeno) se producen
anticuerpos de baja avidez.
En la medida de la avidez se usan los métodos de inmunodiagnóstico habituales
pero en los que se añade un agente desnaturalizante capaz de romper las uniones antígeno-
anticuerpo débiles (baja avidez) pero no las fuertes (alta avidez. Entre las sustancias
desnaturalizantes se pueden utilizar: dietilamina (que es inactiva a pH fisiológico),
tiocianato potásico, guanina y urea. La sustancia desnaturalizante puede incluirse en la
dilución del suero (métodos de dilución) o aplicarse tras la formación del complejo
antígeno-anticuerpo (métodos de elusión).Como agente desnaturalizante y si la reducción
del título es igual o mayor del 50% la muestra se considera positiva para IgG de baja
avidez. El problema de ésta técnico es su baja sensibilidad, por lo que solo puede utilizarse
en muestras con títulos de anticuerpos IgG altos. En cuanto a la normalización de la avidez
parece variar entre los 75 y 90 días.
En conclusión, en las infecciones primarias la mayoría de los anticuerpos IgG

tienen baja la avidez para el antígeno, mientras en las infecciones antiguas o en las
reinfecciones los anticuerpos IgG tienen avidez alta.
TÉCNICAS DE ADN APLICADAS AL DIAGNOSTICA DE LAS

ENFERMEDADES PARASITARIAS.
Las principales características que definen un buen diagnóstico son la especificidad,

sensibilidad y reproducibilidad. Los ensayos basados en las técnicas de
enzimoinmunoenzayo y anticuerpos monoclonales, junto con las técnicas de biología
molecular, reúnen los requisitos mencionados. En el terreno del inmunodiagnóstico, la
introducción de anticuerpos monoclonales de antígenos recombinantes o la restricción de
isotipos de inmunoglobulinas han supuesto una revolución en la detección serológica de las
parasitósis.
Por otro lado las técnicas del ADN recombinante unifican estos criterios. La falta de
respuesta humoral a los parásitos en situaciones de inmunodepresión es un claro ejemplo de
una situación clínica que requiere de una nueva metodología diagnóstica. Pero para que un
nuevo método de detección tenga futuro y aplicación, además de las tres características
mencionadas de ser fácil de realizar, de bajo coste y practicable en condiciones de campo.
El uso de ADN (reacción en cadena de la polimerasa) conjugan alguno de estos requisitos.
El clonamiento en plásmidos y otros vectores permite la obtención de grandes cantidades
de una sonda, abaratando su coste.
Las técnicas más comunes aplicadas al diagnóstico y caracterización son las
siguientes:
Polimorfismo en el tamaño de fragmentos de restricción (RFLP.El ADN puede

cortarse en fragmentos por lugares de restricción, mediante la utilización de endonucleasas
de restricción. Dichas enzimas reconocen secuencias específicas en la doble cadena de
ADN, generalmente de 4 a 6 pares de bases(pb), cortando la molécula siempre que
encuentran las secuencias diana. Se define como mapa de resctricción el conjunto de
fragmentos de ADN producidos por una enzima. La diferencia en los mapas de restricción
de dos individuos es lo que se conoce como RFLP; dichas diferencias no tienen
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normalmente repercusión en los fenotipos de los individuos y afectan a los fragmentos de
ADN repetidos.
Estos patrones polimorficos esquizodermos pueden detectarse directamente en geles
de agarosa o poliacrilamida o bien se pueden hibridar con sondas (souther-blot). Los
estudios de RFLP han servido para diferencias especies parásitas, así como punto de partida
para el aislamiento de sondas de interés diagnóstico.
2. °- Sondas de ácidos nucleicos.

La utilización de sondas de ácidos nucleicos ha supuesto un gran avance en el
terreno diagnóstico. Las dos cadenas de al molécula de ADN pueden ser separadas
(desnaturalización) o unidas (hibridación) variando la temperatura. Esto permite utilizar
una cadena sencilla(sonda), marcada para la detección de una cadena sencilla y
complementaria del parásito, mediante la hibridación de ambas.
El punto de partida es la búsqueda de secuencias invariables y repetidas del parásito,
a fin de establecer la correspondiente sonda y conseguir una buen intensidad de hibridación.
En el diagnóstico parasitario se ha preparado sondas a partir de ADN genómico, de
fragmentos de ADN repetidos en tándem, de ADN del kinetoplasto y de ADN ribosómico.
Existe una variedad de técnicas de hibridación:

1. - Hibridación in situ. Se fijan los parásitos obtenidos de cultivo a portaobjetos
mediante calor, para someterlos a una posterior desnaturalización y deshidratación, antes de
la hibridación con sondas y visualización microscópica, lo que implica unos 600 aumentos
adicionales. Con este método se respeta la morfología del parásito, lo que ayuda a la
identificación microscópica. Se puede usar material de biopsias.
2. - Hibridación en machas (Dot-blot. Es una técnica de hibridación sobre filtros de
nitrocelulosa o nylon, en los que se ha depositado el ADN purificado o los parásitos de
cultivo.
3. - Hibridación por contacto. Similar a la anterior, en la que el material de una
biopsia se aplica por contacto sobre la nitrocelulosa para seguir la secuencia de la
hibridación habitual. Requiere de una sonda muy sensible, capaz de detectar los pocos
parásitos presentes.
4. - Hibridación por aplastamiento. Es una variedad del método anterior, que se
realiza por aplastamiento de los insectos vectores, o gusanos parásitos sobre filtros de
nitrocelulosa. Permite conocer el porcentaje de insectos parasitados en la naturaleza,
evitando el tedioso trabajo de disección si en un mismo filtro se aplastan decenas de
insectos.
3°. - Amplificación de ADN o ARN mediante reacción en cadena de la Polimerasa.

(PCR).
La técnica permite, a partir de una cantidad mínima de ADN o ARN amplificar
fragmentos de unos 100 a 400 pb, utilizando iniciadores de secuencia que se unan a la
región diana a amplificar. Un ciclo de PCR consiste en la desnaturalización térmica del
ADN, unión de los iniciadores al ADN diana a una temperatura más baja y síntesis del
ADN utilizando una ADN polimerasa. La enzima más utilizada es la Taq polimerasa,
estable a altas temperaturas, lo que se permite realizar 30-40 ciclos, sin tener que añadir
nueva enzima después de cada desnaturalización térmica.
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Ya existen iniciadores comercialmente disponibles para el diagnóstico de los
principales parásitos. Mediante PCR se pueden detectar el ADN de unos pocos incluso de
un único parásito con una gran especificidad, en muchos tipos de muestras, como tejidos,
esputo, LCR, sangre, orina, heces. La mezcla de reacción, que debe ser optimizada para
cada par de cebadores, así como la programación adecuada del termociclador, asegurarán la
producción de un número suficiente de copias del ADN diana, que permita su visualización
directa sobre el gel teñido.
Existen métodos de detección basados en la PCR para la mayoría de los parásitos:
Entamoeba, Giardia, Leishmania, microsporidios, Naegleria, Trichomonas, Plasmodium,
Toxoplasma, Onchoccerca, etc.
De las técnicas mencionadas, la PCR es la que ofrece mayor sensibilidad y
especificidad, con la única limitación de que requiere personal e instalaciones adecuadas.
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TEMA 1
COPROLOGÍA PARASITARIA 1
Toma de muestras, conservación, examen microscópico, fijación, tinción y montaje de

formas parasitarias microscópicas.
El análisis coprológico persigue la detección e identificación de los parásitos

intestinales o de otra lozalización, cuyas formas se encuentran en las heces. En una muestra
fecal pueden observarse protozoos (trofozoitos, quistes, ooquistes, esporas), helmintos
(huevos,larvas, ocasionalmente adultos enteros o segmentos) y larvas de moscas; algunos
de los más comunes se citan a continuación:
PROTOZOOS
Giardia intestinalis
Chilomastix mesnilii
Retortamonas intestinalis
Enteromonas hominis
Pentatrichomonas hominis
Dientamoeba fragilis
Entamoeba histolytica/E. dispar
Entamoeba coli
Endolimax nana
Iodamoeba butschlii
Balantidium coli
Cryptosporidium oarvum
Isospora belli
Cyclospora cayetanensis
Microsporidios
HELMINTOS
Trichuris trichura Schistosoma mansoni
Strongyloides stercolaris Schistosoma japonicum
Aacaris lumbricoides Schistosoma mekongi
Ancylostoma duodenale Fasciola hepática
Necatoe americanus Fasciolopsis buski
Dicrocoelicum dendriticum
Taenia solium Paragonimus spp.
Taenia Saginata Clonorchis spp
Dipylidium caninum Metagonimus sp
Diphyllobothrium latum Heterophyes sp
Los resultados de un análisis coprológico dependerán de la obtención de muestras

adecuadas y del correcto procesamiento de las mismas. Debe tenerse en cuenta que no
existe una técnica universal idónea para todos los posibles parásitos que podemos
encontrar; cada uno se identifica de forma óptima con una técnica particular.
TOMA DE MUESTRAS
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Recomendaciones al paciente.
Algunos alimentos dificultan el análisis coprológico y, por lo tanto, deben de
evitarse; este es el caso de las legumbres, de los tomates y pimientos con piel, o de frutas
como los higos y fresas.
En algunos casos se recomienda una dieta blanda (pescado blanco, lácteos, huevos, arroz y
confituras) durante tres días, antes de la toma de muestra.
Por otra parte, ciertos tratamientos-sales de bario y bismuto, aceite mineral,
antidiarreicos no absorbibles, antibióticos y antimalaricos-invalidan el análisis
parasitoscopico. Después de la administración de estos compuestos, los parásitos pueden
no ser recuperables durante varios días. La toma de muestra debe retrasarse 5/7- 10/14
días.
Número de muestras.
Una muestra única negativa carece de significación: las muestras únicas sólo son
válidas cuando son positivas y exclusivamente para los parásitos que muestran. No existe
un criterio universal sobre el número de muestras que deben examinarse, normalmente, se
recomienda el examen de tres muestras, dos procedentes de deposiciones normales y una
obtenida tras la administración de un laxante suave (esto último está contraindicado en
casos de diarrea), obtenidas en días alternos en un plazo de 10 días.
Cuando se sospecha de giardiosis y las tres primeras muestras son negativas, se
recomienda examinar res muestras más, obtenidas a intervalos de una semana. Ante la
sospecha de una amebosis intestinal, se recomienda el examen de 6 muestras, obtenidas en
un plazo de 14 días; así se asegura el diagnóstico en el 90% de los casos.
Cantidad.
Generalmente se recomienda, en el caso de heces formes, una muestra que tenga
aproximadamente el tamaño de una nuez grande (20-40 gr); en el caso de heces líquidas,
una cantidad equivalente a 5-6 cucharadas soperas. A veces puede ser conveniente disponer
de una deposición completa.
Seguridad
Toda muestra biológica- fuente potencial de material infeccioso-debe manipularse
con cuidado, en áreas específicas, utilizando los materiales adecuados y debe eliminarse
correctamente (tras destruir por calor o tratamiento químico-los posibles agentes
infecciosos.
Toma de la muestra / posibilidad de examen.

Algunas formas parasitarias se deterioran rápidamente tras la evacuación, haciendo
difícil su diagnóstico. Por ello, lo ideal sería que la muestra se recogiese en el propio
laboratorio y se examinase lo antes posible:
Heces líquidas en los 30 minutos siguientes a la defecación

Heces blandas en la primera hora
Heces formen en el transcurso del día.
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Obviamente esto no puede ser posible y es por ello que la muestra debe de
preservarse-en ningún caso se debe de congelar o incubarse-recurriendo al uso de
soluciones fijadoras, que pueden ser fijadores simples o mezclas fijadoras, que conserven
las posibles formas parasitarias en las heces.
Recipientes/Etiquetado
Se recomienda el uso de recipientes de plástico transparente, desechables, de boca
ancha, limpios y secos, de cierre hermético. El uso de uno o varios (sin o con
determinados fijadores) dependerá de los casos y de la disponibilidad de cada laboratorio.
En el recipiente que se recoja la muestra deben figurar los siguientes datos: nombre
del paciente ( o código), fecha y hora de la recogida.
CONSERVACIÓN DE LAS MUESTRAS
Como se ha indicado previamente, el examen de las muestras fecales no puede

realizarse habitualmente tras la emisión, por lo que la muestra ( toda o en parte) debe
preservarse con soluciones fijadoras. Las distintas alternativas, con sus ventajas e
inconvenientes, se exponen a continuación.
Fijador de Schaudinn.
Contiene cloruro de mercurio, etanol, glicerina y ácido acético.Se utiliza para
muestras fecales y de la superficie de la mucosa intestinal.
Ventajas Desventajas
Preserva trofozoitos y quistes de protozoos Escaso poder adhesivo con muestras líquidas y
Permite la realización de tinciones permanentes (peor mucoides
que el PVA) No es aconsejable para procedimientos de
concentración
Contiene cloruro de mercurio (tóxico)
Alcohol polivinílico (PVA).

Fijador de Schaudinn más PVA. Puede obtenerse líquido (comercializado) o
prepararse añadiendo PVA en polvo al fijador anterior.El PVA es una resina plástica (se
recomienda que se tenga hidrólisis alta y viscosidad baja o media), que actua como
adhesivo (la muestra se extiende y adhiere al portaobjetos)
-Permite la realización de tinciones - Contiene cloruro de mercurio
permanentes,idóneo para trofozoitos y quistes - Difícil de preparar
-Permite la realización de técnicas de concentración - No permite la realización de pruebas de
(formol/eter) inmunodiagnóstico
Vida media alta en contenedores sellados - Los quistes de Giardia, huevos de Trichuris
y ooquistes de Isospora no se concentran tan
fácilmente como en las muestras formoladas.
- Las larvas de Strongyloides se deterioran.
- Una vez abierto y distribuido en viales
pequeños su vida media es más corta.
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SAF
Contiene acetato sódico, ácido acético glacial,formol y agua.Preserva
trofozoitos,quistes,ooquistes, esporas de microsporidios y larvas.
-Permite realizar técnicas de concentración ( -Tinciones permanentes difíciles de realizar.

formol/eter -Pobre capacidad adhesiva; se recomienda el uso de
-Pueden realizarse tinciones permanentes ( con el portaobjetos tapizados con albúmina ( albúmina de
sedimento concentrado-véase inconvenientes. Mayer)
-El sedimento concentrado puede utilizarse en -Tinción con hematoxilina férrica mejor que con
métodos de inmunodiagnóstico tricromico.
-No contiene mercurio
-Es fácil de preparar
-Vida media larga
Formol
Diluido en agua o sol. Salina. Preserva quistes de protozoos (formol al 5%) y
huevos y larvas de helmintos (formol al 10%).
-Apto para procedimientos de concentración -No preserva trofozoitos
-El sedimento concentrado puede utilizarse en -No permite la realización de tinciones
pruebas de inmunodiagnóstico permanentes
-Fácil de preparar
-Vida media larga.
MYF
Contiene tintura de mertiolato (Lilly), yodo y formol. Preserva y tiñe. De uso común
en estudios de campo.
-Fácil de preparar -Aunque se ha descrito un método de concentración
específico para heces fijadas con MYF, sus resultados
-Vida media larga no son siempre satisfactorios
-Tinciones permanentes difícil, requiere portaobjetos
tapizados con adhesivo
Azida Sódica.
-Permite la realización de tinciones permanentes -Muy tóxico, debe de manipularse con mucho
-Apto para procedimientos de concentración cuidado.
EXAMEN MACROSCOPICO
La muestra se examina directamente para determinar:

 La consistencia de las heces
 Presencia de mucus y sangre
 Presencia de formas parasitarias macroscópicas
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Consistencia de las heces
La consistencia de las heces (grado y humedad) nos orienta sobre la probabilidad de
encontrar unas formas parasitarias u otras, y consecuentemente sobre la necesidad de
proceder a un análisis inmediato o al uso de determinados conservantes.
FORMES SEMIFORMES BLANDAS LIQUIDAS
En heces liquidas será más probable encontrar trofozoitos y menos probable el

hallazgo de quistes.
Los ooquistes de los coccidios y las esporas de los microsporidios pueden
encontrarse en todo tipo de heces; probablemente habrá más ooquistes en heces líquidas.
Los huevos y las larvas de los helmintos pueden hallarse en todo tipo de muestras fecales,
aunque pueden ser más difíciles de encontrar en heces líquidas (factor de dilución.
Presencia de moco y sangre

El examen macroscópico puede revelar la presencia de mucus, material gelatinoso,
transparente u opaco, no refringente, infiltrado de células y coagulable con acético. Su
presencia denota irritación del colon. La presencia de sangre, de color rojo oscuro cuando
procede de la parte superior del tracto gastrointestinal, o rojo brillante de áreas más bajas,
puede deberse a causas muy diferentes y siempre debe señalarse.
las heces diarreicas con mucus y sangre pueden deberse a una amebosis intestinal y
deben examinarse inmediatamente o preservarse de modo adecuado para su posterior
estudio.
Formas parasitarias macroscópicas.

En las heces pueden encontrarse formas parasitarias (anillos de tenia, adultos de
Enterobius, etc.), que son eliminados habitualmente por esta vía o que son expulsadas tras
un tratamiento.
Ante esta situación podemos optar por mezclar la muestra fecal con un fijador o por
separar y limpiar los organismos y después fijarlos. Esta última opción es más conveniente
para asegurar la correcta conservación de los parásitos.
Búsqueda de formas parasitarias macroscópicas.

 Mezclar la muestra con solución salina ( mortero/ agitador magnético)
 Dejar sedimentar 30 minutos, decantar, resuspender en sol. Salina
 Repetir el paso anterior hasta que el sobrenadante sea claro
 Repetir el sedimento final en placas de Petri y examinarlo sobre un fondo
oscuro y sobre un fondo blanco.
Las formas parasitarias se recogen con una aguja enmanganada o unas pinzas, se lavan con
solución salina y se fijan.
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FIJACIÓN, TINCION Y MONTAJE DE FORMAS PARASITARIAS
MACROSCOPICAS.
NEMATODOS
El nematodo, tras el lavado con solución salina, se introduce en el fijador (en
algunos casos, si trabajamos con larvas, se recomienda la inmersión previa en agua a 60-
63°C y la rápida transferencia al fijador. Los fijadores mas utilizados son las siguientes:
-Alcohol-glisecerina
Alcohol de 70% con un 5 % (v/v) de glicerina, en caliente (60-63°C; en él pueden
mantenerse indefinidamente. La glicerina evita la deshidratación de los Hermes, en el caso
de que el alcohol se evapore.
-FAA (alcohol-formol-acético.
También en caliente. Tras la fijación (varias horas o una noche) conviene conservar
en alcohol-glicerina.
-Acido acético glacial
Sin diluir. Recomendado para los nematodos más pequeños. Se usa al 1-2% para
nematodos grandes, por ejem. Para Áscaris lumbricoides (no se recomiendan
concentraciones mayores, ya que las diferencias en presión osmótica pueden causar la
rotura de los vermes); 24 horas en esta solución, después almacenar en formol al 10%.
Los nematodos son normalmente transparentados con glicerina o lactofenol

(lactofenol de Amann), de este modo puede observarse su morfología interna. Los
ejemplares conservados en formol, alcohol o AFA pueden transferirse al portaobjetos sobre
el que se han depositado unas gotas de lactofenol. Los órganos internos se hacen visibles en
30 minutos o menos. Después del estudio el nematodo se transfiere a alcohol. Si deseamos
conservarlo durante mucho tiempo, se lavará varias veces con alcohol de 70% antes de
preservarlo en alcohol-glicerina .Otra posibilidad es añadir al lactofenol azul de algodón
para teñir.
La mayoría de los nematodos pequeños pueden montarse en glicerina-gelatina como
preparaciones semipermanentes. El uso de resinas como medio de montaje permanente,
aunque posible, produce frecuentemente resultados insatisfactorios (colapso y distorsión
debido al proceso de deshidratación).
CESTODOS
Los cestodos pueden ser eliminados enteros tras la administración de un tenífugo o
encontrase anillos en las heces o en la ropa. Tanto los anillos como la muestra entera deben
ser enviados al laboratorio para su estudio.
Primero se debe de lavar en solución salina. La relajación no es necesaria
normalmente (nos permitiría conseguir la evaginación del rostelo).
Para la fijación, especialmente en el caso de cestodos grandes, se recomienda
colocar el ejemplar entre dos portaobjetos, que se sujetan con unas gozase pueden utilizar
los siguientes fijadores:
-AFA
En caliente (60-63°C), Para una conservación prolongada se debe transferir a
alcohol de 70%.
-Formol al 10% tamponado, en caliente (60-63°C).
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Los fijadores ácidos disuelven los corpúsculos calcáreos del tegumento.Si se desea observar
estos elementos se recomienda el uso de fijadores no ácidos o tamponados.
El estudio de los cestodos se realiza por los siguientes métodos.
-Inyección de tinta china. Se inyecta tinta china a través del poro genital o por el eje central
del útero. Se dispone entre dos portas y se examina. Es una técnica difícil.
-Aclaramiento con lactofenol en estufa y posterior observación.
-Montaje directo en EUPARAL( medio de montaje permanente,miscible en alcohol. Se
sacan los proglótidos del alcohol de 70% y se pasan por una batería de alcoholes, para su
deshidratación-alcohol de 80°, 95° y 100°. De éste último se transfiere a una porta con
EUPARAL y se coloca él cubre. El anillo se aclarará aproximadamente en tres horas.
-Tinciones.La mas utilizada para platelmintos es la de carmin, que se detalla a
continuación.
Carmin clorhídrico alcoholico.

 El platelminto previamente fijado en alcohol del 70° se introduce en el colorante
(12-24 horas.
 Se transfiere a alcohol clorhídrico al 2% hasta que el color de los tejidos
superficiales de la muestra se aclare, pero los órganos internos queden bien
coloreados. La decoloración puede requerir minutos u horas y deberá controlarse
cuidadosamente.
 Se lava en alcohol de 70%
 Se pasa por una batería de alcoholes, 85°, 90°, 96°, absoluto, 15 min en cada uno de
ellos (deshidratación.
 Se introduce en alcohol/ xilol al 50% y xilol hasta su aclaración.
 Montaje en bálsamo de Canadá o DPX.
NOTA:
Algunos autores recomiendan, tras la decoloración y lavado en alcohol de 70°, colocar la muestra en alcohol de 70° con una o dos
gotas de una solución acuosa saturada de carbonato o bicarbonato sódico ,durante 30-60 minutos, para neutralizar el ácido y
evitar que las muestras se sigan decolorando después del montaje
TREMATODOS.
Los trematodos se recogen y se lavan con solución salina. Dado que poseen una
fuerte musculatura, antes de proceder a la fijación conviene realizar un paso de relajación;
para ello, los ejemplares vivos deben colocarse en solución salina, agua fría o en agua o
solución salina con unas gotas de mentol disuelto en alcohol de 95°, durante 30 minutos o
varias horas, con refrigeración.
Para la fijación se recomienda FAA en caliente (60-63°C. Sí el trematodo es de gran
tamaño debe colocarse entre dos portaobjetos. Para su conservación prolongada se debe de
transferir a alcohol de 70°. No se recomienda el uso de formol.
La tinción más común es la de carmín antes descrita.
LARVAS DE MOSCAS
Las larvas se recogen en alcohol de 70°. Se tratan con KOH al 10% en caliente,
llevando a ebullición durante 3- 4 min, o mejor, en frío, con KOH al 25% durante 24 horas.
Después se lavan con agua para eliminar la potasa.
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Para su estudio, tras realizar un examen de la larva entera, se corta el extremo final,
con los estigmas posteriores, y se coloca sobre el portaobjetos de modo que éstos queden
expuestos al observador. El resto del cuerpo se aplasta ligeramente para eliminar todo su
contenido y se monta de perfil para la observación del aparato cefalorraquídeo y los
estigmas anteriores. El montaje se puede realizar con líquido de Hoyer PVA-lactofenol.
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TEMA 2
COPROLOGÍA PARASITARIA II:
EXAMEN DIRECTO, TÉCNICAS DE CONCENTRACIÓN.
Si exceptuamos a los adultos de cestodos y nematodos, el diagnóstico coprológico

reposa fundamentalmente en el hallazgo de trofozoitos y quistes de protozoos y de huevos y
larvas de helmintos, todos ellos de dimensiones microscópicas.
En la práctica, el examen microscópico de las heces requiere dos etapas complementarias e
insustituibles:
1.- Examen microscópico directo.

2.- Examen previo enriquecimiento por concentración.
En el primer caso, los trofozoitos de protozoos y las larvas de nematodos persisten

vivos si se realiza en condiciones precisas: isotonía y a 37°C.
En el segundo, durante el transcurso de las manipulaciones que se han de efectuar para la
concentración, las formas vegetativas de protozoos y las larvas de helmintos son destruidas
pero, en cambio, al concentrar en un volumen pequeño las formas parasitarias se facilita el
diagnóstico al tiempo que se eliminan la mayor parte de los restos fecales y bacterias.
EXAMEN DIRECTO (ver anexo)
Preparación de la muestra:
1.- Muestras mucosas o muco-sanguinolentas: tienen interés porque pueden presentar
formas vegetativas de amebas.
1.1. El examen debe efectuarse inmediatamente después de la emisión (en los 30
minutos primeros y antes de que se enfríen). Puede retrasarse unos instantes en
frascos herméticamente cerrados y a temperatura ambiente.
1.2. Realizar el examen a 37°C para mantener la movilidad de los trofozoitos,
permitiéndonos así descubrirlos más fácilmente (manteniendo la preparación sobre
una placa caliente o simplemente al calor proporcionado por la lámpara de
microscopio).
1.3. Si las heces no pueden ser examinadas en el tiempo preciso, deben fijarse
preferentemente en PVA. En este caso, la búsqueda de los trofozoitos requiere,
generalmente, una coloración de la muestra.
Nota:
En caso de resultado negativo, el examen directo debe ser completado con la preparación de un
frotis húmedo fijado y coloreado y por un cultivo.
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2.- Muestras líquidas o semilíquidas: pueden contener trofozoitos y quistes de protozoos,
huevos y larvas de helmintos.
Para los trofozoitos de amebas hay que observar las condiciones anteriores. El resto
de los trofozoitos son más resistentes y el análisis puede retrasarse unas horas.
Para que la preparación sea uniforme y lo suficientemente clara se recomienda diluir
la muestra con una gota de solución fisiológica. Evitar que la muestra rebose por los bordes
del cubreobjetos. Si esto sucediera, secar con un papel de filtro.
3.- Muestras pastosas o sólidas: pueden contener quistes de protozoos y huevos y larvas
de helmintos. No es necesario el examen urgente ni medidas especiales. La dificultad
estriba en conseguir una extensión lo suficientemente fina a la vez que rica en formas
parasitarias
Técnica: (ver anexo)

Sobre un portaobjetos limpio, se coloca una gota de solución fisiológica, se toma un
fragmento de la muestra y se homogeneiza como antes. Se recubre con un cubreobjetos y se
observa al microscopio.
Como la distribución de los parásitos en las heces no es siempre homogénea,
conviene picar con el asa de platino varios lugares de la muestra. O mejor, tomar una
pequeña porción de muestra (aproximadamente el tamaño de una nuez) y llevarla a un vaso
al que se añade solución salina; con ayuda de un agitador se homogeneiza. Se toma una
gota del homogeneizado y se observa al microscopio.
Si la preparación resulta con un exceso de agua, se elimina con papel de filtro. La
preparación debe ser lo suficientemente clara que permita la lectura de un texto a su través.
En ocasiones, es conveniente utilizar un colorante temporal para facilitar la identificación
de las formas parásitas (Bailenger. MYF)
Técnica de examen:
General para cualquier método:
1.- Se comienza con el objetivo de menor aumento.
2.- Si se observa algo sospechoso, se pasa sucesivamente a los aumentos mayores.
TÉCNICAS DE CONCENTRACIÓN
Tiene por objeto concentrar en un pequeño volumen los elementos parasitarios
inicialmente dispersos en una gran masa de heces.
1.- Métodos físicos: Sedimentación y Flotación.
Con o sin centrifugación.
2.- Métodos físico-guímicos o difásicos: comprenden siempre dos etapas:
separación de los residuos más voluminosos cuyo peso específico es netamente diferente al
de los elementos parasitarios, y una fase de concentración por sedimentación de los
elementos parasitarios ya aislados.
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MÉTODOS FÍSICOS
Se basan exclusivamente en la diferente densidad entre el material fecal y los
elementos parasitarios.
Las heces han de estar muy diluidas, tanto en un líquido de densidad inferior a los
elementos parasitarios, que se concentran en el sedimento, concentración por
sedimentación, como en un líquido más denso concentrándose, entonces, en la película que
se forma en la superficie del líquido, concentración por flotación.
Ambos métodos pueden ser espontáneos o acelerados por centrifugación. Tanto en uno
como en otro caso, las heces están diluidas en el líquido que sirve de reactivo. Los residuos
voluminosos o pesados deben ser eliminados previamente.
Operaciones previas:
1) Para una dilución correcta:
Utilizar un vaso con capacidad netamente superior al volumen de heces a tratar.
Triturar éstas con un agitador (mortero), añadiendo el líquido reactivo lentamente.
2) Eliminación de los restos voluminosos:
Pasar las heces diluidas por un colador de 10 mallas/cm2. Se suelen utilizar
coladores cónicos ("Chinos" del mercado).
Después de tamizado, el colador se enjuaga con líquido de dilución para arrastrar los
elementos parasitarios que pudieran haber quedado retenidos en las mallas. Una vez
utilizado el colador, debe lavarse al chorro y secarse en horno Pasteur, se queman
los residuos de las mallas en mechero Bunsen o se sumerge en lejía diluida.
También puede tamizarse a través de varias capas de gasa utilizando un embudo de
cristal o de plástico como soporte.
3) Eliminación de los restos pesados. El líquido que pasa a través del colador se recoge
sobre un vaso de fondo cónico y se deja reposar un minuto. Las partículas pesadas (ciertos
cristales de medicamentos, células vegetales endurecidas, alimentos etc.) se acumulan en el
fondo. El sobrenadante se trasvasa a un tubo de centrífuga.
TÉCNICAS DE SEDIMENTACIÓN
El líquido de dilución posee una densidad mayor que las partículas de alimento y
menor que los elementos parasitarios.
Ventaias: permite el tratamiento de una gran masa de heces. Técnica sencilla.
Utensilios rudimentarios.
Inconvenientes: las técnicas requieren un tiempo largo y numerosas manipulaciones
(no deberían ser utilizadas como métodos de rutina).
Son ineficaces para la búsqueda de protozoos, tanto trofozoitos como quistes.
Método de Faust e Ingalls.

 Triturar 5 g de heces en 200-300 mL de líquido reactivo (agua glicerinada).
 Tamizar por colador metálico, lavar el tamiz con el líquido reactivo.
 Dejar sedimentar una hora.
 Decantar el sobrenadante.
 Rellenar con agua gliserinada y resuspender el sedimento.
 Dejar sedimentar 45 minutos.
 Decantar el sobrenadante. Resuspender. Dejar sedimentar 30 minutos.
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 Decantar el sobrenadante y examinar el sedimento al microscopio, homogeneizado
previamente, o tomando muestras de distintas partes (superficie, centro y fondo.
Da buenos resultados para huevos de Schistosoma, Áscaris no fecundados y larvas
de Strongy/oides.
Método de Jahnes y Hodees

La técnica es igual que la anterior.
Es útil para investigar la presencia de huevos de Schistosoma.
Método de Baroody y Most

Triturar de 10 a 15 g de heces en el líquido reactivo (100 mL)
Tamizar.
Dejar sedimentar 30 segundos. Decantar el sobrenadante en un tubo de centrífuga.
Centrifugar a 1.500 r.p.m. durante 1 a 2 minutos. - Desechar el sobrenadante.
Resuspender el sedimento en el líquido de dilución.
Centrifugar de nuevo en las mismas condiciones y repetir hasta que el sobrenadante
esté claro.
Examinar el sedimento.
Es una técnica recomendada para investigar huevos de Schistosoma. Si no se ven huevos,
añadir al sedimento unas gotas (10) de agua destilada. Si hay huevos vivos eclosionan en 30
minutos y se pueden ver los miracidios a la lupa o al microscopio nadando en las capas
superiores del líquido que cubre al sedimento.
Método de van Someren modificado por Gregoire

Equipo:
Tubo de vidrio de 1 cm de diámetro y 15 cm de longitud, provisto de un tubo de goma
flexible en su extremo inferior, cerrado por una pinza de Mohr. El tubo termina en una llave
de grifo.
-Abrir la pinza de Mohr y cerrar el grifo, rellenar hasta la mitad con la sol. De trabajo,
vertiéndolo lentamente para no formar espuma.
-Triturar 4 g de heces con 36 ml de la sol. De trabajo.
-Tamizar, primero por un tamiz de malla ancha (1 mm) y luego, por un colador de malla
fina (0.35 mm).
-Verter la emulsión de heces en el tubo hasta llenarlo.
-Dejar sedimentar 20 min.
-Cerrar la pinza de Mohr, para aislar la parte inferior y abrir el grifo. Recoger las gotas que
salgan y examinarlas al microscopio.
Este método es útil para investigar la presencia de huevos de Fasciola.
TÉCNICAS DE FLOTACIÓN
En este caso, parásitos o sus formas de eliminación, tienen una densidad inferior a
la Diluido de dilución concentrándose en su superficie.
Todas las operaciones que requieren las distintas técnicas deben ser
realizadas rápidamente debido a que el líquido de dilución impregna a los huevos
y éstos, en pocos minutos, se hacen más pesados y caen al fondo.
Además alteran su morfología y es necesario tener el hábito de reconocerlos en
___________________________________________________________________ 26
tales condiciones para poder identificarlos.
Ventajas: simplicidad. Material rudimentario. Posibilidad de exámenes en
serie.
Desventajas: las heces ricas en lípidos o aceites minerales hacen difícil o
imposible la lectura de las preparaciones debido a que se concentran en su
superficie. Las larvas de helmintos y quistes de protozoos se alteran y
deforman. Los huevos operculados se alteran por los líquidos hipertónicos:
Fasciola, Fasciolopsis, botriocéfalos, etc.
Método de FulleborJl (salmuera)

Triturar aproximadamente 10 g de heces en 200 mL de salmuera.
Homogeneizar Y dejar reposar durante 45 minutos.
Tomar, con ayuda de un asa de platino, un fragmento de la película
superficial (donde se concentran los elementos parasitarios) y examinar al
microscopio.
Método de Willis (salmuera) ( ver anexo )
Triturar 2 g de heces en aproximadamente 20 mL de salmuera (la muestra

en 10 veces su volumen).
Homogeneizar Y llevar a un tubo Borrel.
Añadir líquido de dilución hasta que alcance el borde del tubo y forme un
menisco saliente.
Colocar sobre el menisco un portaobjetos desengrasado, cuidando
de no incluir burbujas en el menisco.
Dejar reposar 15 minutos. Los huevos ascienden y se adhieren al
portaobjetos.
Colocar un cubreobjetos sobre la superficie del portaobjetos que ha estado en
contacto con el líquido y examinar al microscopio. Técnica útil para los
huevos de ancilostómidos y de Hymenolepis sp.
Método de Faust (SO4Zn)

-Triturar la muestra de heces en 10 veces su volumen en agua tibia hasta conseguir
una mezcla homogénea.
-Tamizar a través de un colador metálico y recoger el líquido filtrado en un tubo de
centrífuga.
-Centrifugar a 1.500 r.p.m. durante 5 minutos. Desechar el sobrenadante. Repetir esta
operación tantas veces como sean necesarias hasta que el líquido sobrenadante sea claro.
-Recoger el sedimento y suspenderlo en el líquido de dilución. Homogeneizar por agitación
con una varilla de vidrio.
-Rellenar el tubo de centrífuga con líquido de dilución
Centrifugar durante 2 minutos a 1.500 r.p.m.
-Tomar, inmediatamente, con un asa de platino una muestra de la superficie de la película.
-Examinar la preparación al microscopio.
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Método de Faust simplificado (ver anexo)
-Diluir directamente las heces en la solución sobresaturada de sulfato de zinc. Tamizar y

recoger el filtrado sobre un tubo de centrífuga.
- Centrifugar durante dos minutos a 1.500 r.p.m.
-Recoger, inmediatamente, un fragmento de la película formada en la superficie del tubo
con un asa de platino.
-Examinar al microscopio.
Método de Janeckso y Urbanyi
- Triturar 5 g de heces en 20 - 25 mL de la solución reactiva.

- Tamizar a través de un colador metálico de 1 mm de malla y recoger el filtrado en un tubo
de centrífuga.
- Centrifugar durante 3 a 4 minutos a 2.500 r.p.m.
- Recoger inmediatamente la película o los fragmentos que flotan en la superficie con una
pipeta Pasteur .
- Examinar entre portaobjetos y cubreobjetos al microscopio.
Utilidad: huevos de Fasciola hepática, ancilostómidos, Schistosoma mansoni y larvas de
Strongyloides stercoralis. Huevos de tricocéfalos, quistes de Giardia y huevos de Taenia
sp. También sirve para los huevos de pequeños trematodos y de Ascaris.
Método de flotación en azúcar de Sheather (para Cryptosporidium).
Este procedimiento es especialmente satisfactorio para la detección de ooquistes de

Cryptosporidium en heces frescas o fijadas por formol.
- Añadir 0,5 - 1,0 g de heces formes (o 1-2 mL de heces líquidas) a un tubo de
centrífuga que contenga 7-8 mL de la solución de azúcar. Mezclar bien en el mismo
y añadir más solución de azúcar hasta unos milímetros del borde del tubo.
- Centrifugar la suspensión a 500 g, 5 minutos.
-Sin retirar el tubo de la centrifuga, tomar con un asa de platino unas gotas de la
superficie.
- Poner entre portaobjetos y cubreobjetos y examinar al microscopio.
TÉCNICAS DIFÁSICAS
Todos estos métodos derivan, con variaciones más o menos profundas, del descrito
por Telemann en 1908 y que consiste en triturar las heces con una mezcla, compuesta a
partes iguales, de éter y ácido clorhídrico concentrado para, posteriormente, tamizar la
emulsión y centrifugar. Los elementos parasitarios se concentran en el sedimento y
Telemann pensaba que era debido a la acción disolvente de los dos reactivos.
Los inconvenientes derivados de la manipulación del HCl concentrado, cuyos vapores no
están recomendados en microscopía, las alteraciones que el reactivo produce en los quistes
y en algunos huevos, han inducido a modificaciones, más o menos felices, basadas sobre un
principio común.
___________________________________________________________________ 28
Principios de los métodos difásicos:
Bailenger ha demostrado que la concentración parasitaria es consecuencia de tres

fenómenos de los que uno es fundamental: "la puesta en presencia de dos fases no
miscibles una acuosa, la otra lipófila- crea, para cada una de las partículas fecales
(parásitos, restos alimentarios, bacterias), un coeficiente de partición que les permite
orientarse en función de su equilibrio hidrófilollipófilo ". El resultado es la eliminación de
los elementos con predominancia lipófila y, en consecuencia, una concentración de las
partículas con tendencia hidrófila. Es decir, los elementos cuyo balance hidrófilo/lipófilo se
decanta a favor de los grupos hidrófilos se encuentran en la fase acuosa y se depositan en el
fondo del tubo de centrífuga. Por el contrario, si el balance es a favor de los grupos
lipófilos, el elemento queda en contacto con la capa de éter y participa en la construcción
del anillo que se forma en la interfase agua-éter.
A este mecanismo fundamental se añaden, de una parte, la acción disolvente de los
reactivos, que suprimen ciertos constituyentes fecales (principalmente lípidos) y, de otra
parte, la densidad de los parásitos superior a la de la fase acuosa.
A cada elemento parasitario corresponde un pH para el cual su concentración en el
sedimento, producto de la centrifugación, será máximo. Así, los huevos de ascáridos y de
Schistosoma mansoni sólo se concentran a partir de un pH superior a 4; los ancilostómidos,
lo mismo que las larvas de Strongyloides no se concentran a un pH de 1 ó 2. Los hechos
experimentales han permitido establecer que un pH 5 es el que, sin ser el mejor para todos
lo huevos, es el que permite la concentración del mayor número de ellos. Los huevos de
tricocéfalos no parece que sean influenciados por el pH. Ocurre lo mismo con los quistes de
amebas, aunque pueden modificar su aspecto.
Ventajas: Simplicidad y rapidez.
Inconvenientes: A partir de un volumen pequeño de heces puede conducir a resultados

falsamente negativos en los especímenes en los que el reparto de los parásitos es desigual.
Es el caso de los huevos de Schistosoma.
Precauciones a tomar en la realización de las técnicas difásicas:

Básicamente, todas las técnicas difásicas precisan las siguientes precauciones:
1.- Dilución homogénea: se obtiene triturando una parte (2 a 5 g) de heces, recogidas de
zonas distintas, en 5 a 10 partes según la consistencia de las heces del reactivo de dilución.
La homogeneidad se consigue con la ayuda de un agitador de vidrio de extremo aplanado.
El diluyente debe ser agregado lentamente y a medida que las heces se diluyen.
2.- Eliminación de los restos voluminosos o pesados:
a) Voluminosos: tamizando a través de una gasa quirúrgica o, mejor, de un colador de
mallas laxas (1 rnm).
b) Pesados: dejando sedimentar el filtrado durante lO a 60 segundos y recoger solamente el
sobrenadante en el tubo de centrífuga.
3.- Emulsión perfecta de la dilución fecal con éter: la emulsión se obtiene agitando
conjuntamente la dilución fecal y el éter en un tubo de centrífuga. Los volúmenes de ambos
componentes deben ser iguales, teniendo la precaución de dejar libre de líquido 1 cm de
___________________________________________________________________ 29
altura que es la que nos permitirá una emulsión perfecta. Tapar el tubo de centrífuga con un
tapón de goma y agitar violentamente durante 30 a 60 segundos.
En algunos casos, dependiendo de la consistencia de las heces, la emulsión se facilita con
un mayor volumen de la fase acuosa.
4.- Para centrifugar: se recomienda generalmente 1.500 a 2.000 r.p.m. durante 1 a 3
minutos.
Una vez efectuada la centrifugación, el contenido del tubo se ha repartido en cuatro capas.
a) Capa de éter cargada de grasas.
b) Capa espesa constituida por restos lipófilos (bacterias y restos
alimentarios). Cuando la dilución ha sido escasa, la capa es gruesa y
se adhiere al vidrio; Restos c) Capa acuosa
d) El sedimento en el cual se acumulan los residuos pesados y los
elementos parasitarios (huevos quistes) y que será la única parte
examinada.
5.- Aislamiento del sedimento: si la 28 capa no es ni demasiada
espesa ni adherente, es suficiente con volcar bruscamente el tubo de
centrífuga para que las tres primeras capas sean eliminadas.
Si la capa lipófila es espesa, no cae espontáneamente, se le despega
de las paredes con ayuda de una pipeta Pasteur o con un asa de
platino.
Tanto en uno como en otro caso, se deben limpiar las pare -des del
tubo con un papel de filtro y teniendo la precaución de no tocar, con
el mismo, el sedimento.
6.- Toma de la muestra del sedimento: si el sedimento es compacto se utiliza un asa de

platino; si es fluido, se emplea una pipeta Pasteur. En los sedimentos demasiados sólidos se
recomienda agregar unas gotas de solución salina 0.9% homogeneizando bien y tomar una
gota del sedimento para examinarla entre portaobjetos y cubreobjetos.
Si el sedimento contiene células de consistencia pétrea o cristales de oxalato, estos
elementos duros no permiten una aplicación perfecta del cubreobjetos sobre el portaobjetos.
En este caso, no se debe tomar la muestra del fondo del sedimento sino de la superficie del
mismo.
Con frecuencia, existen restos celulósicos y de granos de almidón que aumentan
considerablemente el volumen del sedimento a la vez que dispersan los elementos
parasitarios en una masa demasiado grande. Para solventar este problema puede recurrirse a
la técnica recomendada por Roman:
Modo de operar: el sedimento se suspende en 2.5 mL del líquido de dilución.
Centrifugar durante 1 minuto a 1.500 r.p.m. Decantar, diluir el sobrenadante en 3 ó 4 veces
su volumen en agua destilada. Centrifugar 1 ó 2 minutos a 1.500 r.p.m. Se toma una
muestra del sedimento y se examina entre portaobjetos y cubreobjetos.
Método de Rivas
- Triturar las heces en el líquido de dilución hasta conseguir una suspensión homogénea.
- Tamizar a través de un colador metálico.
- Recoger el filtrado sobre un tubo de centrífuga hasta la mitad de su capacidad.
- Completar con éter sulfúrico hasta 1 cm del borde del tubo.
___________________________________________________________________ 30
- Agitar violentamente hasta conseguir una emulsión.
- Centrifugar durante 1 minuto a 1.500 r.p.m.
- Recoger el sedimento y examinarlo al microscopio.
Es útil para investigar la presencia de quistes de Giardia, quistes de E. coli y E. histolytica.
No es muy eficaz para los huevos de helmintos.
Método de Ritchie (ver anexo)

- Diluir una parte de la muestra en 10 partes de la solución salina.
- Tamizar sobre un colador metálico.
- Recoger el filtrado sobre un tubo de centrífuga.
- Centrifugar un minuto a 1.500 r.p.m.
- Decantar el sobrenadante y resuspender el sedimento en la solución salina.
- Centrifugar en las mismas condiciones que antes.
- Repetir las operaciones hasta que el sobrenadante sea transparente.
- El sedimento se diluye en formol al 10%.
- Dejar reposar durante 5 minutos.
- Añadir 3 mL de éter sulfúrico y emulsionar por agitación.
- Centrifugar 2 minutos a 1.500 r.p.m.
Pone en evidencia los quistes de protozoos y los huevos de helmintos.
Método de Ritchie simplificado

Las heces se diluyen directamente en agua formolada (10%). Se tamiza sobre un colador
metálico. Se añade un volumen igual de éter sulfúrico y se emulsiona. Centrifugar un
minuto a 1.500 r.p.m.
Permite la concentración de los elementos parasitarios conservados en una solución
formolada. Tiene el inconveniente de que deja un sedimento muy voluminoso.
Método de Bailenger
- Diluir las heces en 10 veces su volumen de solución tampón.
- Dejar reposar durante 50 - 60 segundos.
- Tamizar sobre un colador metálico y recoger el filtrado sobre un tubo de centrífuga.
- Añadir un volumen igual de éter sulfúrico.
- Emulsionar perfectamente mediante agitación vigorosa.
- Centrifugar 1 minuto a 1.500 r.p.m.
Es uno de los métodos de elección y de rutina en un laboratorio de Análisis
Clínicos.
Método de Blagg. Schoegel. Manscoer v Khalaf (MYF)

- Mezclar una parte de la muestra en 10 partes del líquido de dilución.
- Triturar hasta conseguir una suspensión homogénea.
- Tamizar a través de un colador metálico para eliminar los residuos voluminosos. -
Recoger el filtrado sobre un tubo de centrífuga.
- Añadir 4 mL de éter sulfúrico y emulsionar vigorosamente. .- Dejar reposar durante 2
minutos.
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- Si la emulsión permanece estable:
Centrifugar durante 1 minuto a 1.500 r.p.m.
Decantar el sobrenadante.
Recoger el sedimento y examinarlo al microscopio.
- Si la emulsión no es estable:
Añadir 1 mL de agua del grifo. Agitar vigorosamente y dejar reposar para
comprobar la estabilidad de la emulsión. Si no se consigue, añadir más agua.
Conseguida la emulsión estable:
Centrifugar durante 1 minuto a 1.500 r.p.m.
Recoger el sedimento y examinarlo al microscopio.
Útil para muestras conservadas en MYF Es otra de las técnicas recomendadas.
Método de Thebauld
- Diluir 5 g de heces en 50 mL de líquido de dilución.
- Dejar reposar 1 minuto.
- Colocar la solución en una ampolla de decantación.
- Añadir un volumen igual de éter sulfúrico y emulsionar por agitación.
- Dejar reposar durante 2 minutos. Los residuos voluminosos ascienden a la capa etérea
formada
- Transvasar el líquido claro que se encuentra en el fondo de la ampolla a un tubo de
centrífuga
- Eliminar el sobrenadante.
- Resuspender el sedimento en una solución acuosa de NaBr (69g de NaBr cristalizado
en100 mL de agua destilada).
- Recoger la película superficial con ayuda de una pipeta Pasteur y examinarla al
microscopio
Método de Faust e Ingalls

- Triturar 1 g de heces en 5 mL del líquido de dilución.
- Añadir una gota de Tritón NE.
- Añadir un volumen igual de éter sulfúrico y emulsionar por agitación.
- Examinar el sedimento al microscopio.
___________________________________________________________________ 32
TEMA 3
COPROLOGÍA PARASITARIA III: TINCION DE FROTIS FECALES.
La detección y correcta identificación de muchos protozoarios intestinales

frecuentemente requerirá el examen de tinción es permanentes con el objetivo de
inmersión. Aunque un analista experimentado puede identificar ciertos organismos en un
examen directo (preparación húmeda), muchas identificaciones deben considerarse
presuntivas hasta que sean confirmadas por el examen de una tinción permanente.
Existen diversas técnicas de tinción; la elección de un método en concreto puede
depender del grado de dificultad del procedimiento o de la cantidad de tiempo necesaria
para llevarlo a cabo.
El método clásico más antiguo es el de la hematoxilina de Heidenhain, pero el trabajo de
diagnóstico de rutina se suelen seleccionar procedimientos más cortos, tales como el
tricrómico, modificaciones que emplean la hematoxilina o el negro de clorazol.
TRICROMICO.
Esta tinción fue desarrollada originalmente por Gomori para la diferenciación de
tejidos y fue adaptada por Wheatley para protozoos intestinales.
Paso 1. Realización del frotis (extensión de heces en capa fina) y fijación.
Heces frescas.
Realizar la extensión e igualmente (sin dejarla secar) colocarla en el fijador de Schaudinn.
Tiempo mínimo de fijación: 30 minutos. Los frotis así fijados deberán colocarse en
alcohol de 70° 5 minutos.
Paso 2.- Para eliminar el exceso de fijador antes de colocarse en el alcohol-yodado (1
minuto).
Paso 3, éste ultimo permite eliminar el mercurio.
Si la muestra es líquida, colocar 3-4 gotas de PVA en el portaobjetos, mezclar varias gotas
de heces con el PVA, extender la mezcla y dejare secar la preparación varias horas a 37°C o
toda la noche a temperatura ambiente. Colocar los portaobjetos en alcohol-yodado, 5 a 10
min. (paso 3).
Heces preservadas con PVA.

Tomar Una porción de las heces mezcladas con PVA y colocarlas sobre un papel filtro
durante 3 minutos para eliminar el PVA. Realizar las extensiones y dejarlas secar durante
varias horas a 37°C o durante toda la noche a temperatura ambiente. Los portaobjetos
secos pueden colocarse después en alcohol yodado, 5-10 min (paso 3).
Algunos laboratorios recomiendan los sig. pasos. 1.- Homogeneizar la mezcla de heces-
PVA y filtrar una parte a través de una gasa ,recogiendo el filtrado en un tubo de centrífuga
de 15 ml. 2.- Centrifugar (2 min a 500 g.), decantar y limpiar las paredes del tubo para
eliminar cualquier exceso de PVA. 3.- El sedimento se usa para hacer extensiones, que
serán inmediatamente teñidas (sin secar), comenzando con el paso del alcohol-yodado del
tricrómico.Los tiempos de tinción pueden reducirse a 2-4 min, y los pasos de
___________________________________________________________________ 33
deshidratación a 1 minuto cada uno. Este procedimiento, no se recomienda para muestras
muy líquidas o que contengan gran cantidad de mucus (en casos dejar secar la preparación).
Heces preservadas con SAF

- Filtrar a través de una gasa en un tubo de centrífuga
- Centrifugar (1 minuto, 500 g) y decantar
- Colocar una gota del sedimento en el porta con una gota de albúmina de Mayer
- Dejar secar (30 minutos) y pasar directamente al alcohol de 70° (Paso 4).
Paso 4. Alcohol de 70°, 5 minutos

Paso 5. Alcohol de 70° (otro contenedor), 3 minutos Paso 6. Colorante, 10 minutos
Paso 7. Etanol 90% + acético 1 %, 1-3 segundos (decoloración)
Paso 8. Etanol absoluto, sumergir varias veces (lavados para evitar una decoloración
excesiva)
Paso 9. Etanol absoluto, dos pasos de 3 minutos (en distintos contenedores)
Paso 10. Xilol 5-10 minutos
Paso 11. Xilo15-10 minutos
Paso 12. Líquido de montaje
Las preparaciones pueden mantenerse hasta 24 horas en las soluciones correspondientes a

los pasos 4,8,9 Y 10.
Observaciones:
El paso más importante para obtener una preparación bien teñida es la fijación adecuada de
la muestra. Para asegurar los mejores resultados el ácido acético del fijador de Schaudinn
debe ser agregado justo antes de usar. Tras la fijación es importante eliminar el cloruro
mercúrico residual. Esto se consigue con la mezcla de alcohol de 70° - yodo. Si el cloruro
mercúrico no se elimina se observarán en la preparación gránulos muy refringente s que
pueden impedir el hallazgo o identificación de los protozoos.
Una muestra envejecida o fijada inadecuadamente dará como resultado organismos que no
se tiñen o que toman un color rosa o rojo, sin presentar definición interna. En general los
quistes maduros requieren una fijación más larga y por lo tanto no se colorean tan bien
como los inmaduros. Las formas degeneradas o las que se han teñido poco o decolorado en
exceso pueden presentar UrP' color verde pálido.
Cuando la preparación ha sido bien fijada y correctamente teñida los detritos del fondo
aparecen de color verde y los protozoos presentarán el citoplasma de color verde azulado a
púrpura con los núcleos e inclusiones de color rojo o rojo púrpura. La diferencia de color
entre el fondo y los microorganismo s proporciona mejor contraste que la coloración con
hematoxilina.
HEMATOXILINA
Aunque el método original proporciona excelentes resultados, la mayoría de los
laboratorios que emplean una coloración hierro-hematoxilina seleccionan métodos más
breves. Existen muchas modificaciones; entre las más utilizadas se encuentran las
propuestas por Spencer-Monroe y Tompkins-Miller.
___________________________________________________________________ 34
Pueden aplicarse a:
- heces frescas (fijación con Schaudinn paso 2)
- conservadas con PV A (extensión, secado paso 3)
- conservadas con SAF (extensión sobre portas con albúmina, secado paso 4)
Procedimiento de Spencer-Monroe (algo más largo que el tricrómico; el mordiente,

compuesto que facilita una tinción determinada, en este caso sulfato ferroso amonio y
férrico amonio, incorporado a la solución de trabajo)
Paso 2. Alcohol 70°, 5 minutos
Paso 3. Alcohol yo dado 2-5 minutos
Paso 4. Alcohol 70°, 5 minutos.
Paso 5. Agua fría, en flujo continuo, 10 minutos
Paso 6. Solución hematoxilina-hierro, 4-5 minutos Paso 7. Agua fría, en flujo continuo, 10
minutos
Puede incluirse un paso de decoloración, con ácido clorhídrico al 0,5%, varios seg. y de nuevo lavar
Paso 8. Alcohol 70°, 5 minutos. Paso 9. Alcohol 70°, 5 minutos.

Paso 10. Dos pasos, de 5 minutos cada uno, por alcohol 100%
Paso 11. Dos pasos, de 5 minutos cada uno, por xileno.
Paso 12. Líquido de montaje.
Procedimiento de Tom~kins y Miller (el mordiente se utiliza en un paso separado; incluye

el uso de ácido fosfotúngstico como agente decolorante)
Paso 2. Alcohol 70°, 5 minutos

Paso 3. Alcohol yodado 2-5 minutos Paso 4. Alcohol 50°, 5 minutos.
Paso 6. Sulfato de hierro y amonio al 4% (mordiente), 5 minutos
Paso 7. Agua fría, en flujo continuo, 1 minuto
Paso 8. Solución acuosa de hematoxilina 0,5%, 2 minutos
Paso 9. Lavar en agua fría, 1 minuto
Paso 10. Acido fosfotúngstico 2%, 2-5 minutos
Paso 12. Alcohol 70° (con unas gotas de sol. acuosa saturada de carbonato de litio), 3
minutos
Paso 13. Alcohol 95°, 5 minutos.
~
Paso 14. Dos pasos, de 5 minutos cada uno, por alcohol absoluto
Paso 15. Dos pasos, de 5 minutos cada uno, por xilol
Paso 16. Líquido de montaje.
 Pueden mantenerse hasta 24 horas.
Observaciones:
___________________________________________________________________ 35
Los detritos del fondo y los microorganismos se tiñen de color azul grisáceo o
negro; los núcleos y las inclusiones celulares aparecen más oscuras que el citoplasma.
NEGRO CLORAZOL
Desarrollado por Kohn (1960). Es un método en el que fijación y tinción se
producen en un mismo paso. Recomendado para heces frescas; no para heces fijadas con
PVA porque no incluye el paso por alcohol yodado que elimina el cloruro de mercurio.
Solución colorante: Negro clorazol E, alcohol etílico, metanol, ácido acético glacial, ácido
fosfotúngstico y agua.
l. Realizar la extensión e inmediatamente sumergirla en la solución de trabajo. Teñir de

media hora a una hora
2. Lavar con agua.
3. Alcohol 96°, 10 minutos
4. Alcohol absoluto, 5 minutos 5. Xilol, 5 minutos
6. Líquido de montaje
GIEMSA-SUAREZ PEREGRIN
Tinción recomendada para trofozoitos. Requiere heces frescas.
l. Realizar la extensión con unas gotas de sol, salina. Dejar secar. 2. Fijar con metanol, 15
minutos. 3. Teñir con Giemsa 30 minutos.
TINCIONES ESPECIALES PARA COCCIDIOS

Los ooquistes de Cryptosporidium y Cyclospora pueden ser difíciles de detectar sin
tinciones especiales. Para ellos se recomienda el uso de tinciones ácido-resistente
modificadas.
Las esporas de los microsporidios son también ácido resistentes, pero su pequeño tamaño
(1- 2 m) hace la identificación muy difícil sin el uso de tinciones especiales o de
anticuerpos monoclonales.
Muestra:
-Heces frescas.
-Heces formoladas (se ha descrito pérdida de la capacidad de tinción tras largos periodos de
conservación en formol al 10%).
-Las conservadas con SAF también son aceptables; no las fijadas con PV A. Sedimento
concentrado de la muestra.
-Otras muestras: liquido duodenal, esputo, lavado bronquial, etc.
Método de Kinyoun (en frío).
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1.Extender una o dos gotas de la muestra sobre el portaobjetos y dejar secar al aire.
Es muy importante que la extensión no sea demasiado gruesa (la decoloración no
será adecuada).
2. Fijar con metanol absoluto, 1 minuto
3.Teñir con carbol fuchina de Kinyou, 5 minutos
4. Lavar con etanol al 50%, 3-5 segundos.
5. Lavar bien con agua
6. Decolorar con ácido sulfúrico al 1 % durante 2 minutos o hasta que no suelte
colorante la preparación.
7. Lavar con agua y escurrir.
8. Contrateñir con azul de metileno (Loeffler), 1 minuto
9. Lavar con agua y dejar secar al aire.
10. Examinar con objetivos secos. Para ver la morfología interna examinar con el
objetivo de inmersión.
En caliente
1. Igual
2. Colocar sobre una placa caliente (70°C), 5 minutos 3. Cubrir con carbol fuchina.
4. Con un mechero de alcohol o Bunsen calentar hasta desprendimiento de vapor (no
hervir).
5. Teñir el frotis durante 5 minutos. Si se seca añadir más colorante sin volver a calentar.
6. Lavar con agua y escurrir
7. Decolorar con ácido sulfúrico al 5%,30 segundos (los frotis gruesos pueden
requerir más tiempo). Seguir a partir del punto 7 del método anterior.
Modificación con DMSO Para heces frescas

- Tinción con fuchina (fuchina, alcohol 95°, fenol, glicerina, DMSO y agua)
- Lavar con agua.
- Decoloración-contracoloración (verde malaquita, glicerol, ácido acético glacial).
Observaciones:
Los ooquistes de Crypstosporidium e Isospora se tiñen de color rosa-rojo a purpura, sobre

un fondo azul, rosa pálido o verde. En el ooquiste de Cryptosporidium pueden ser visibles
alguno de los cuatro esporozoitos. Los ooquistes inmaduro s de Isospora se teñirán
totalmente; si están maduros se observará la pared y las esporas teñidas y un área clara
entre ellas. La tinción tiende a ser más variable en el caso de Cyclospora.
Si hay una infección intensa de microsporidios, pueden verse las pequeñas esporas, pero no
pueden diferenciarse de bacterias.
___________________________________________________________________ 37
TRICRÓMICO MODIFICADO PARA MICROSPORIDIOS
Este procedimiento se basa en el hecho de que la penetración del colorante en la

espora es muy difícil; se utilizará una cantidad de chromotrope 2R mayor (10 veces más
que en el tricrómico normal) y un tiempo de exposición mucho más largo (90 minutos).
Como colorante de contraste se utiliza verde rápido -método de Weber-, azul de anilina -
método de Ryan- o verde ligero - método de Kokoskin-; en este último método la tinción se
realiza a 50°C.
Muestra: Heces frescas, formoladas o conservadas con SAF.
Observaciones: La pared de la espora se teñirá de rosa a rojo; el interior será claro o tal vez
mostrará una raya horizontal o diagonal que representa el tubo polar. El fondo aparecerá
verde (Weber) o azul (Ryan) dependiendo del método. Bacterias, levaduras y algunos restos
se teñirán de rosa a rojo; forma y tamaño pueden ayudar en la diferenciación de los
distintos elementos. Las técnicas que emplean anticuerpos monoclonales proporcionan
resultados más sensibles y específicos.
___________________________________________________________________ 38
TEMA 4
TÉCNICAS ESPECIALES: DIAGNÓSTICO DE Enterobius vermicularis. MÉTODO
DE KATO. MÉTODOS MIGRATORIOS. MÉTODOS CUANTITATIVOS.
COPROCUL TIVOS.
DIAGNÓSTICO DE Enterobius vermicularis ( ver anexo)

Los huevos de éste nematodo rara vez se encuentran en las heces, ya que la hembra los
deposita en las márgenes perianales.
Método de la cinta adhesiva (Técnica de Graham) ver anexo.

La toma de la muestra debe hacerse por la mañana antes de que el paciente haya defecado o
efectuado limpieza alguna.
a) Con cinta de papel adhesivo más corta que el portaobjetos : Se cubre el
extremo redondeado de un tubo de ensayo con la cinta de celofán
colocando la superficie adhesiva hacia el exterior. Hacer inclinar al
paciente hacia adelante, aplicar el tubo a los márgenes del ano y no dentro
del canal anal. Se coloca la cinta de celofán, por la superficie adhesiva,
sobre un portaobjetos desengrasado y limpio apoyando fuertemente para
evitar que se formen burbujas de aire. En el momento de la observación
se puede separar la cinta y se agrega una gota de xilol entre ella y el
portaobjetos para eliminar posibles burbujas de aire y aclarar las células
epiteliales. La observación se realiza al microscopio y con un objetivo de
pocos aumentos.
b) Con cinta de papel adhesivo más larga que . el portaobjetos: Aprovechando la
mayor longitud de la cinta se despega del portaobjetos y se hace un bucle con la
misma. Se aplica a los márgenes del ano y se vuelve a colocar sobre el portaobjetos.
El resto de la técnica es igual a la anterior.
Método de la torunda vaselinada (Técnica de Markey).

Se impregna una torunda de algodón con una mezcla fundida de una parte de parafina y
seis de vaselina. Se deja enfriar y se introduce en un tubo contenedor. La toma de la
muestra se efectúa realizando varios toques con la torunda preparada sobre los márgenes
del ano. Realizada la toma, se introduce la torunda en un tubo de centrífuga conteniendo 5
ml de xilol. Pasados 2 a 3 minutos, la parafina y la vaselina se han disuelto liberando a las
formas parasitarias que quedaron adheridas. Se centrífuga a 1.200 r .p.m. durante 5
minutos. El sedimento se examina al microscopio con el objetivo de 10x.
MÉTODO DE KATO ( ver anexo )

Para la puesta en evidencia de huevos de helmintos. No sirve para protozoos. Es útil
para calcular la tasa de parasitación.
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Se cortan rectángulos de papel de celofán de 2 x 3 cm. Se impregnan durante 24 horas en el
reactivo.
Técnica: se extienden 30 a 50 mg de heces sobre un portaobjetos. Se cubre con el papel de
celofán impregnado en el reactivo. Se le da la vuelta y se presiona sobre el papel de filtro
hasta que la masa fecal cubra un área de 20 a 25 mm de diámetro. Se deja reposar durante
30 a 40 minutos a temperatura de laboratorio o lO a 15 minutos a 40 a 45°C. Observar al
microscopio.
MÉTODOS MIGRATORIOS
Se utilizan para la investigación de larvas de Strongyloides stercoralis presentes en las
heces desde la emisión y de otras larvas-uncinarias, Ternidens, Trichostrongylus- que
aparecen cuando el examen se retrasa lo suficiente para que eclosionen los huevos. Todos
ellos se basan en la afinidad de estas larvas por el agua tibia.
Método de Baermann v Brugg

Se colocan las heces sobre varias capas de gasa con las que se hace un nudo. Se
suspenden sobre un vaso que contiene agua templada (45°C) de forma que la superficie del
agua esté en contacto con las heces. El sedimento se examina al cabo de 2 ó 3 horas.
Método de Baermann v Lee

Más conveniente que el anterior cuando las heces
son consistentes.
Precisa de un equipo especial ,aunque muy simple.
Sobre el caño de un embudo de vidrio, de 12 cm de diámetro
superior, se adapta un tubo de goma cerrado por una pinza de Mohr.
Se colocan las heces sobre un colador metálico tapizado con gasa. Se
deposita el colador sobre el embudo y se añade agua tibia (45°C)
hasta que el nivel del líquido llegue a contactar con las heces. Se
mantiene durante 2 a 3 horas. Se abre la llave y se recoge el agua
sobre un tubo de centrífuga. Se centrifuga, durante 3 a 5 minutos a
1.500 r.p.m. Se decanta el sobrenadante y se buscan las larvas en el
sedimento: si es escaso, en un vidrio de reloj; si es abundante, entre
portaobjetos y cubreobjetos.
Precauciones:
a) Las heces deben ser frescas si se quiere investigar la presencia de
larvas de Strongyloides. Las heces conserva-
das a temperatura del laboratorio o en cámara fría, pueden volverse
negativas. Además, si existe una infección por uncinarias los huevos
de estos nematodos pueden continuar su desarrollo a 22°C y
eclosionar en 1 ó 2 días.
b) La cantidad mínima de heces tratada debe ser de 10 g.
c) La temperatura del agua debe conservarse a 45°C.
d) El tiempo de extracción debe ser de una hora para heces normalmente ricas en
larvas. Con heces negativas mediante otros métodos, el tiempo de extracción debe
ser de 3 horas.
___________________________________________________________________ 40
e) La duración de la centrifugación debe ser lo suficientemente larga para que las
larvas estén reunidas todas en el fondo del tubo y queden en él cuando se retira el
sobrenadante. La velocidad debe ser suficientemente lenta para no matar a las larvas.
Método de la pIaca de agar para el diagnóstico de Strongyloides stercoralis
Es una técnica reciente para el diagnóstico coprológico de la estrongiloidosis

humana. Los resultados obtenidos superan al del coprocultivo con papel de filtro.
El medio de cultivo, una vez autoclavado, se reparte a razón de 8,5 a 9 mI de medio por
cada placa Petri (12 cm de diámetro y 2,5 cm de profundidad). Se secan las placas de agar
en cajas durante 4 a 5 días a temperatura ambiente, de manera que el agua libre se evapore
(observaciones previas indican que el agua libre en el agar disminuye la viabilidad de las
larvas). Se colocan en el centro de la placa 2 ó 3 gramos de la muestra fecal (conservada en
cámara frigorífica), se tapan y se sellan mediante un adhesivo (para evitar que las larvas
puedan escapar) y se incuba a temperatura del laboratorio (26-33°C) durante 48 horas.
Las placas se observan con un estereomicroscopio a 40x, y en aquellas que son positivas (se
observan surcos en el agar producido por las larvas), se agujerea la tapa con un objeto
caliente y por el orificio se introduce formol al 0%. Se agita la placa, se recoge el formol
con una pipeta, se centrifuga y se observa el sedimento.
MÉTODOS CUANTITATIVOS
Los cálculos de la puesta diaria de huevos se han realizado para una serie de
helmintos hepáticos o intestinales. Con el conocimiento del número de huevos en una
determinada cantidad de heces podemos deducir, aunque sólo aproximadamente, la carga
parasitaria de helmintos adultos.
A pesar de la existencia de factores que hacen que varíen el número de huevos, la
información que nos proporciona sobre la infestación puede ser útil para:
1.- Apreciar, durante una encuesta epidemiológica, la intensidad de parasitación en
una población.
2.- Orientar un diagnóstico. Por ejemplo, si una anemia no va acompañada por un
número suficiente de uncinarias, éstas, no son las responsables de la misma.
3.- En las áreas endémicas, decidir si se implanta, o no, un tratamiento. En el caso
de los tricocéfalos, cuando la infestación es leve puede no ser necesaria la medicación.
4.- Seguir el resultado de un tratamiento, mediante recuentos periódicos, nos
permite evaluar su eficacia. Por lo mismo, nos permite, por comparación, comprobar la
eficacia entre tratamientos distintos.
Principios: Deben considerarse dos casos:
l.-Si los huevos del parásito son escasos en el examen directo (es lo que sucede durante los
exámenes en serie de una encuesta epidemiológica): pesar siempre la misma cantidad de
heces. Diluir y hacer una concentración por cualquiera de los métodos que se exponen más
adelante. Se examina el contenido total del sedimento y se cuenta el número de huevos
hallados. Este número se expresa por gramo de heces.
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2.-Si los huevos del parásito son abundantes (se encuentran fácilmente en el examen
directo): pesar una cantidad determinada de heces y hacer una dilución homogénea en un
volumen conocido del líquido reactivo. Contar los huevos en un determinado volumen de
esta dilución. Una simple regla de tres permite conocer el número de huevos por gramo de
heces.
En ocasiones, a pesar de lo expuesto antes, para tener una idea del número de
huevos puestos al día por el conjunto de la población parásita, se multiplica el número de
huevos por gramo por el peso de las heces emitidas en 24 horas.
Corrección de los resultados dependiendo del tipo de muestra:

Si nos atenemos al número de huevos por gramo de heces, según su consistencia, hay que
multiplicar por un factor.
Heces sólidas (duras) x 0,50
Heces semisólidas (formes) x 0,66
Heces pastosas (blandas) x 1,00
Heces semilíquidas (sueltas) x 1 .50
Heces líquidas (diarreicas) x 2,00
Aproximadamente, en las heces pastosas (coeficiente 1), la fecundidad diaria en
huevos/gramo, es la siguiente:
Ancy/ostoma duodena/e: 125 h/g. Para calcular la carga parasitaria hay que multiplicar por
dos ya que la relación entre los sexos se admite que es 1: 1. Necator americanus: 5O h/g
(x2).
Ascaris /umbricoides: 1.000 h/g(x2).
Trichuris trichiura: 75 h/g (x2).
Fasciola hepatica: 1.200 h/g.
En un adulto, con una alimentación equilibrada y un tránsito intestinal normal, la cantidad
de heces emitidas es de 100 a 15O gramos al día. Si el régimen es estrictamente
vegetariano, el peso del bolo fecal llega hasta los 200 g, en tanto que, una dieta con pocos
residuos no da más de 80 g de heces.
TÉCNICAS CUANTITATIVAS
Método de Kato-Katz
Se emplea un patrón calibrado, fabricado con cartón o plástico desechable: una lámina
rectangular (de 3x4 cm y 1,37 cm de altura) provista de un orificio circular (6 mm 0) que
contiene aproximadamente 5O mg de heces.
Las heces se pasan por una tela metálica de 0,09 mm de luz de malla. Con una espátula se
toma una porción de las heces que pasan por ella y se trasladan al orificio de la lámina de
cartón, que se dispone sobre un portaobjetos. Tras presionar la muestra fecal en el orificio,
se retira y desecha el cartón y se sigue la técnica de Kato habitual.
Se cuentan la totalidad de huevos contenidos en el rectángulo. Se hace la equivalencia a un
gramo de heces.
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Método de Kato-Miura ( ver anexo )
Pesar 50 mg de materia fecal y colocarla en un portaobjetos. Si se observan fibras o
residuos gruesos tamizar previamente la muestra.
Cubrir la muestra con un cubreobjetos de celofán ( no resistente a la humedad) previamente
remojado en una solución de verde de malaquita-glicerol.
Invertir la preparación sobre papel absorbente y presionar hasta que la muestra cubra un
diámetro de 2.0 cm también se puede presionar con un tapón de hule.
Dejar la preparación a temperatura ambiente durante una hora ó 20-30 minutos a 34-40
°C. Realizar la observación microscópica.
Contar los huevos que se encuentran en toda la preparación y multiplicar el total por 50
para obtener el número de huevos por gramo de heces.
Método de Stoll
En un Erlenmeyer graduado a 60 mI, se introducen 4 g de heces (4 mi, si las heces son

líquidas) y se añade la solución de NaOH O, IN hasta completar el volumen de 60 mi. Se
colocan 10 bolas de vidrio (de S mm de diámetro) y se tapa el Erlenmeyer. Agitar para
conseguir una homogeneización correcta (si las heces son formes, conviene dejar en
contacto una noche para su total disociación).
Inmediatamente antes de la toma, agitar el Erlenmeyer para conseguir una suspensión lo
más estable posible; con una pipeta graduada se toman 0,15 mI de la suspensión y se lleva a
un portaobjetos y se recubre con un cubreobjetos (22 x 40). Se cuentan todos los huevos
existentes en la preparación. Multiplicando por 100 el número de huevos contados, se
obtiene el número de huevos por gramo de heces.
Método de Caldwell
Con este método la lectura de los resultados es más rápida ya que la antiformina favorece la
disociación de las heces y la solución de sacarosa aumenta la estabilidad de la suspensión.
En un Erlenmeyer graduado a 40 ml, se introducen 4 gr de heces ( 4 ml si son líquidas) y se
agregan 4 ml de la solución de antiformina. Mezclar bien y dejar reposar durante una hora.
Completar hasta 40 ml con la solución de sacarosa. Agitar para homogeneizar .Se recogen
0.1 ml con una pipeta graduada y se coloca sobre un portaobjetos. Se cuenta el número de
huevos contenido en la preparación. Multiplicando por 100 el número de huevos contados,
se obtiene el número de huevos por gramo de heces
Método de la cámara de McMaster.

En un Erlenmeyer graduado a 45 ml, se
introducen 3 gr de heces y se añade el liquido de
dilución hasta completar los 45 ml. Se agita hasta
conseguir una correcta homogeneización. Se toma una
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muestra con una pipeta pasteur y se lleva a una cámara
Mc Master. Se cuentan los huevos existentes por
gramo de heces ( los cuadros de la cámara tienen 1 cm
por lado y altura entre el portaobjetos y el cubreobjetos
es de 1.5 mm. El volumen de cada cámara será por
tanto , de 0.15 ml).
COPROCULTIVO
Los coprocultivos se emplean en el diagnóstico de
algunas parasitósis intestinales. La ventaja de estas técnicas
reside en que van a permitir la multiplicación de las formas
parasitarias lo que obviamente facilitará su posterior detección
y reconocimiento, o bien el desarrollo de éstas hasta estados
que permitan una identificación específica. Estas técnicas
también pueden contemplarse como el primer paso necesario
para el aislamiento de un parásito.
COPROCULTIVO DE HELMINTOS
Cultivo fecal sobre tira de papel de filtro en tubo
Método descrito originalmente por Harada-Mori ( 1955), ha
sufrido modificaciones posteriores ( Sasa y Col., 1958; Hsieh
1963).
Procedimiento:
Extender una fina capa de heces ( de 1 a 2 mm de espesor)
sobre el centro de una tira de papel de filtro
( 1x12 cm).
Introducir la tira de papel en un tubo de centrífuga de fondo
cónico de 15 ml, conteniendo 3 a 4 ml de agua destilada, de
modo que su extremo quede sumergido en el agua
aproximadamente 1 cm.
El tubo se mantiene a 24°C-28°C, en la oscuridad durante 7 a
10 días añadiendo agua a medida que sea necesario para
mantener el nivel original.
El ascenso capilar del agua mantiene las heces húmedas y
transporta sus elementos solubles acumulándose en el borde
superior del papel formando una mancha oscura. Al alcanzar
el estado infestante, las larvas migran hacia el agua en donde
se sumergen
( algunas larvas podrían emigrar hacia el extremo
opuesto del papel, hay que tener cuidado con la manipulación).
Las larvas se retiran con ayuda de una pipeta Pasteur. Antes,podemos inmovilizarlas
introduciendo el tubo en un baño María a 55°C.
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Cultivo inclinado sobre papel de filtro en placa de Petri
Procedimiento: Sobre una tira de papel de filtro de las

mismas dimensiones que un portaobjetos, en su tercio
medio, se disponen las heces formando una película
relativamente delgada.
La tira se coloca sobre un portaobjetos inclinado
(apoyado sobre una varilla de vidrio) dentro de una
placa de Petri a la que se añade agua. La parte del
portaobjetos en contacto con el fondo debe quedar
sumergida en ella. Se cierra la placa y se mantiene a
temperatura ambiente.
A los 7 - 10 días pueden encontrarse larvas infestantes
de uncinarias y Trichostrongy/us en el agua.
COPROCUL TIVO DE PROTOZOOS
Sólo se aplica al diagnóstico de Entamoeba histo/ytica, en aquellos casos en que los

métodos más simples no se han mostrado satisfactorios. La muestra puede ser heces, mucus
o mezcla de ambos. No debe tener más de 24 horas y se recomienda un máximo de 2-3
horas.
Para el cultivo de las amebas se han descrito muchos medios, unos monofásicos y
otros bifásicos; algunos de los más utilizados se citan a continuación:
- Monofásicos: medio de Balamuth, medio TYSGM-9, medio TYI-S-33.
- Bifásicos: medio de Boeck y Drbohlav, medio de Cleveland y Collier (Endamoeba
medium, Difco ).
En general estos medios se utilizan a un pH de 7,2 a 7,6. Se les incorpora un
suplemento de almidón de arroz y opcionalmente una solución antibiótica. La temperatura
de cultivo es de 35,5 a 37°C. El examen de los cultivos se realiza a las 24 horas de la
inoculación; para ello, con una pipeta Pasteur se toma una muestra del fondo del tubo
(medio líquido) o del fondo de la fase líquida (medios bifásicos), y se examina al
microscopio. Si no se observan amebas, el cultivo se introduce de nuevo en la estufa y se
examina a las 48 horas. Entonces se realizará un subcultivo (a veces no se encuentran
amebas en el cultivo original pero los subcultivos resultan positivos)
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TEMA 5
TECNICAS HEMATOLOGICAS: EXAMEN DIRECTO, GOTA GRUESA, FROTIS

FINO, TECNICAS DE CONCENTRACION.
Dirigidas al diagnóstico de las infecciones por:

Plasmodium spp
Babesia spp.
Trypanosoma spp.
Filarias
Leishmania (aunque a veces pueden detectarse amastigotes en los monolitos de la sangre periférica, el examen
microscópico de material aspirado de la médula ósea, los gánglios linfáticos y el bazo es más sensible).
MUESTRA:
 Sangre recién extraída ( si se toma del dedo, debe dejarse fluir libremente; no
presionar para no diluir con líquidos titulares).
 Sangre con anticoagulante
 Sedimento obtenido por un procedimiento de concentración.
Ante la sospecha de un caso de paludismo, tras un primer examen negativo, se deben tomar
muestras a intervalos de 6-8 horas por al menos tres días consecutivos. Cuando se sospecha
la existencia de filariasis, es importante la hora del día a la que se recogen las muestras.
Algunas especies presentan periodicidad, se encuentran en sangre sobre todo a ciertas horas
del día ( por ejemplo, W.bancrofti-Africa tropical, Centroamérica, Sudamérica, Océano
Indico-en la noche entre las 22 y 24 horas).
EXAMEN DIRECTO.
Consiste en colocar una pequeña gota de sangre y una gota similar de solución
salina sobre un portaobjetos, mezclarlas y disponer sobre ellas un cubreobjetos. Una
cantidad de sangre excesiva dificulta la observación; si el volumen es muy pequeño, el peso
del cubre puede movilizar las formas parasitarias.
El examen directo puede revelar la presencia de microfilarias o tripanosomas, por su
motilidad y forma. Es una prueba muy sencilla pero poco sensible. Se requerirán tinciones
permanentes para la identificación específica.
GOTA GRUESA Y FROTIS FINO.

La primera permite el examen de un volumen de sangre mayor e incrementa
las posibilidades de detectar infecciones ligeras .La identificación específica,
particularmente en paludismo, es difícil.
En el frotis se observan mejor las características morfológicas y se utiliza
para la identificación específica.
GOTA GRUESA
- Colocar 2-3 pequeñas gotas de sangre sobre el portaobjetos. Con la esquina de otro
portaobjetos mediante un movimiento circular, mezclar las gotas y extenderlas en
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un área de aproximadamente 2 cm de diámetro. Mantener el movimiento circular
durante 30 segundos para impedir la formación de fibrina que podría ocultar los
parásitos tras la tinción ( esto ultimo no es necesario en el caso de que la sangre
lleve un anticoagulante).
- Dejar secar al aire, en posición horizontal, a temperatura ambiente, protegiendo la
preparación del polvo, 8-10 horas, o de un día a otro.
- Una vez seca, se provocará la lisis de los glóbulos rojos, cubriendo la preparación
con agua o directamente con la tinción en el caso del Giemsa (solución acuosa).
FROTIS FINO.
- Realizar la extensión; para ello se dispone una gota de sangre en el extremo de un
portaobjetos, apoyando en una superficie plana y firme. Un segundo portaobjetos,
formando un ángulo de 45 º con el primero, se pone en contacto con la gota y se
deja que la sangre se extienda por su borde, a continuación se desliza el segundo
portaobjetos sobre el primero.
- Dejar secar al aire.
 Es importante que los portaobjetos que se utilicen estén perfectamente limpios ( detergente) desengrasados,
alcohol 70º.
Para que la tinción sea óptima, el frotis y la gota gruesa deben realizarse en portaobjetos
distintos y utilizarse distintas concentraciones y tiempos de tinción. Sin embargo, la
realización de gota gruesa y frotis fino sobre un mismo portaobjetos es una practica
muy habitual.
TINCION.
Las mas comunes: Giemsa ( fijación, cuando se desea, independientemente).
Wright ( fija y tiñe; la gota gruesa requiere hemólisis previa).
Tinción de Giemsa.- El colorante se puede adquirir en polvo o en solución (elección

personal), en ambos casos los resultados son similares. La sol. Stock es estable por
muchos años, protegida de la humedad ( nunca se debe introducir en ella una pipeta
mojada=. La reacción de tinción es oxidativa y puede desencadenarse por el oxígeno del
agua Esta es la razón por la que la solución de trabajo, acuosa, solo tiñe bien durante el
día.
La dilución de trabajo se preparará con un tampón de fosfato, de pH 7,0-7,2 (pH 6,8
para favorecer la tinción de los gránulos de Schüffner); la dilución recomendada es 1:10
para frotis finos: para gota gruesa, diluciones de hasta 1:50.
Frotis fino
-Fijar con metanol, 1 minuto (si se prolonga, puede resultar difícil observar las
granulaciones de Schüffner o Maurer).
-Dejar secar las preparaciones al aire.
-Introducir los portas en la sol. De trabajo (dilución 1:10, 10 min ; 1:20, 20 min, etc.)
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-Lavar suavemente con agua tamponada o agua del grifo (un lavado excesivo decolora
la extensión)
-Dejar secar al aire en posición vertical.
Gota gruesa
Igual que antes, omitiendo los dos primeros pasos.
La dilución de trabajo recomendada es de 1:50 tiempo de tinción 50 min.
Tinción de Wright.
Se encuentra comercializado en forma liquida o en polvo. Es una mezcla empírica de
colorantes policromados y puede haber diferencias entre lotes. La maduración o
policromación continúa en la solución madre. Si esta se contamina con agua se
obtendrán pobres resultados.
Frotis fino.
-Colocar el portaobjetos en posición horizontal y cubrirlo con el colorante
-Contar el número de gotas necesario para cubrir la extensión. Dejarlo 1-3 minutos.
-Añadir un número igual de gotas de agua tamponada (tampón de fosfato, pH 6,6-6,8)
Mezclarnos soplando sobre la superficie del líquido.
-Al cabo de 4-8 min, desbordar el colorante con tampón fosfato ( no derramar el
colorante antes de este lavado, si se hace se deposita un precipitado sobre el
portaobjetos).
-Dejar secar al aire.
EXAMEN DE LAS PREPARACIONES.
Gota gruesa. Examen inicial con pocos aumentos para la detección de microfilarias. El
examen con objetivo de inmersión ( aprox. 100 campos) suele requerir de 5 – 10 min.
Frotis fino.- Primero se examinará la preparación con un objetivo de bajos aumentos;

Las microfilarias suelen encontrarse en número reducido y pueden pasar inadvertidas si
no se examina toda la extensión.
Suelen encontrarse en los bordes o flecos finales de la extensión. La zona final de la
preparación, mono capa de glóbulos rojos, se examinará den busca de Plasmodium o
Trypanosoma. En estas áreas la morfología y tamaño de los glóbulos rojos infectados
se aprecia mejor.
Con el objetivo de inmersión deben examinarse 200-300 campos ( si se ha
observado algo sospechoso en la gota gruesa examinar un numero de campos mayor);
normalmente se tarda entre 15 a 20 min.
OBSERVACIONES GENERALES.
-Si las preparaciones no pueden teñirse en el plazo de 48 horas, el frotis debe fijarse con
metanol y la gota gruesa se hemoliza antes de guardarse.
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-Si las extensiones se quieren conservar mucho tiempo, colocar una resina de montaje y
un cubreobjetos. Se recomienda añadir a la resina antioxidante ( 2,6-di-t-butil-p-cresol.1
por vol), para evitar la pérdida generalizada del color.
-En los sistemas automatizados no se detecta Babesia ni Plasmodium.
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TEMA 6
DIAGNOSTICO DE PARASITOS GENITOURINARIOS
Muestras de orina;
Schistosoma haematobium ( huevos)
Tricomonas vaginalis ( trofozoitos)
Wucheria bancrofti y Onchocerca volvulus (microfilarias).
Schistosoma haematobium.
Adultos en los plexos vesicales; huevos en la orina. El número de huevos presentes
en la orina varia a lo largo del día, alcanzando el nivel más alto entre las 10 y las 14 horas.
La muestra ha de recogerse entre estas horas: micción única y completa de al menos 10 ml.
La eliminación es favorecida por el ejercicio físico combinado con la ingesta de líquido
antes de la micción. Otra posibilidad es recoger la orina de 24 horas.
Métodos de búsqueda:
Sedimentación
Filtración
METODOS DE SEDIMENTACIÓN.
Menos sensible pero más barato y más sencillo.

-Agitar bien la muestra y colocarla en una copa cónica. En el caso de un volumen de
muestra pequeño ,directamente centrifugar.
-Dejar sedimentar 1 – 2 horas, retirar el sobrenadante y transferir el sedimento a un tubo de
centrífuga ya que pueden romperse los huevos y liberarse los miracidios).
-Examinar el sedimento
.
METODOS DE FILTRACIÓN.
Útil para estimaciones cuantitativas. Se utilizan filtros de membrana

( policarbonato) 12 o 20m de tamaño de poro o bien de papel (Whatman n°. 541 ó n°1),
en un soporte adecuado.
-Agitar la muestra de orina suavemente o llenar y vaciar la jeringuilla 2 veces.
-Tomar 10 ml de orina con la jeringuilla, colocar de nuevo el filtro y expulsar el aire ( así se
fuerza el paso de toda la orina y se consigue que los huevos se queden pegados al filtro).
-Extraer el filtro del soporte y colocarlo ( con la cara superior hacia arriba) en un
portaobjetos. Añadir una gota de lugol ( en pocos segundos, el colorante impregna los
huevos que se tiñen de color naranja).
-Examinar al microscopio todo el filtro. La tasa de infección se mide por el número de
huevos en cada 10 ml de orina ( si el volumen examinado es menor, realizar los cálculos
pertinentes).
Infección leve: 1-49 huevos/10 ml de orina
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Infección grave: > 50 huevos /10 ml de orina
OBSERVACIONES.
En el caso de orinas hemorrágicas, el sedimento se resuspende en ácido acético para lisar
los glóbulos rojos y se centrífuga de nuevo.
-En el caso de que la orina contenga numerosos cristales, se añade al sedimento ácido
acético, gota a gota, hasta que se aclare Finalmente se centrífuga de nuevo.
-Se recomienda el examen por un mínimo de 3-4 días antes de descartar la infección.
-Ocasionalmente pueden hallarse huevos de S. mansoni en la orina. Identificación
específica.
ESTUDIO DE LA VIABILIDAD.
La presencia de un miracidio vivo en el huevo indica una infección activa que
puede requerir tratamiento. El estudio de la viabilidad requiere muestras frescas, a las que
no se han añadido conservantes ( como tales se utilizan formol, 1 ml por cada 100 ml de
orina, o lejía común, 2 ml por cada 100 ml); se realiza:
-Observando el movimiento de los cilios de las células flamígeras
-Preparación húmeda; objetivo 40 x. Es lo más sencillo en el caso de S.
haematobium.
-Induciendo la eclosión.
Fundamentalmente para los huevos de S. mansomi y S. japonicum que se encuentran en
heces.
La eclosión se producirá, tras varias horas, al mezclar la muestra con agua sin cloro, 1/10
v/v ( el cloro mata a los miracidios).
40 – 50 g de heces + 50-100 ml solución salina
Homogeneizar y filtrar a través de dos capas de gasa.
Dejar sedimentar 1 hora, eliminar sobrenadante,
resuspender el sedimento en solución salina. Repetir
este paso dos veces.
Resuspender en agua sin cloro y disponer la mezcla en
un Erlenmeyer. Cubrirlo todo con papel de aluminio,
salvo el brazo lateral o la zona superior del cuello que
se iluminará (los miracidios tienen fototropismo
positivo). Al cabo de 1-2 horas examinar la zona
descubierta.
Filarias
Las microfilarias (mf) de Onchocerca volvulus ( mayoritariamente en piel y tejido
subcutáneo) se encuentran frecuentemente en la orina de los pacientes infectados,
particularmente después de la administración de dietilcarbamazina.
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Las microfilarias de Wuchereria bancrofti (presentes en sangre) se encuentran a
veces en la orina de pacientes con quiluria.
Detección:
Triple concentración
Filtración por membrana
Método de triple concentración:
-Muestra ( timerosal 1 ml/100 ml)

-Dejar reposar toda la noche ( dispositivo tipo Baermann)
-Recoger entre 10 y 30 ml
Centrifugar ( 400 g por 3-5 minutos)
-Eliminar el sobrenadante, resuspender en solución salina
-Centrifugar
-Examinar el sedimento.
Trichomonas vaginalis:
Único tricomonádido que habita en el tracto genitourinario del hombre. En la mujer

la localización más frecuente es la vaginal, por lo que la muestra a examinar suele ser un
exudado vaginal tomado con hisopo o torunda de algodón .El tracto urinario bajo puede ser
colonizado pero rara vez es el único lugar de la infección, por ello, salvo que existan signos
de infección urinaria, no está indicado el análisis de orina. En el varón, T. vaginalis se
encuentra mejor en el semen que en la orina o en exudados uretrales. Se recomienda el
análisis de líquido seminal fresco. Se puede examinar también un exudado uretral o el
sedimento urinario.
Muestras:
-exudado vaginal
-exudado uretral
-semen.
-Orina (primer chorro de la orina matinal) (400 g, 5 minutos)
Examen directo:
La muestra se diluye con solución salina y se examina con pocos aumentos e

iluminación reducida para observar los trofozoitos.
Tinciones permanentes:
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Papanicolau
Giemsa-Suarez Peregrin
Naranja de acridina-microscopio de fluorescencia.
Cultivo.- El método más sensible. Se utiliza medio TYM (Diamond), que contiene
tripticasa, extracto de levadura, ácido ascórbico, maltosa y cisteína (pH 6.5),
suplementando con suero y antibióticos.
Examinar a las 24 y 48 horas. No descartar hasta 7 días. Existen sistemas comercializados.
Detección de Ag.- Utilización de anticuerpos monoclonales marcados con peroxidasa

( ELISA directo) o con fluorocromo (IFI). Métodos tan sensibles como el cultivo. Permiten
obtener los resultados en unas horas.
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Manual de Prácticas Lab. 4o. Sem. 2022

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UNIVERSIDAD AUTONOMA DE

MANUAL DE PRÁCTICAS Y GUÍA

Titular de la Materia: Dra. Ma. Elena Villagrán Herrera

Creado: Enero del 2013

Introducción al Diagnóstico Parasitológico.

Tema 1.- Coprología parasitaria: Toma de muestras, conservación, examen

Tema 2.- Coprología parasitaria II.- Examen directo, técnicas de concentración.

Tema 3.- Coprología parasitaria III.- Tinción de frotis fecales

Tema 4.- Técnicas especiales de Enterovius vermicularis. Método de Kato.

Tema 5.- Técnicas Hematológicas: Examen directo, gota gruesa,frotis de sangre,

Tema 6.- Diagnóstico de parásitos genitourinarios.

Tema 8.- Pautas para el diagnostico de las principales protozoosis humanas.

Tema 9.- Pautas para el diagnóstico de las principales helmintiasis humanas

 1.- Presentación y entrega de material, Manual de Practicas y Normas

La salud pública puede considerarse como un buen funcionamiento de mecanismos

Basándose en los conceptos anteriores se distinguen dos situaciones:

Por tanto, la identificación de un parásito en muestras procedentes de una persona

Clásicamente se han estudiado las parasitosis en función de su distribución

Otra consideración importante en parasitología es la aparición de los denominados

Parece evidente que el mejor método para diagnosticar una parasitosis es

DIAGNOSTICO INDIRECTO (Inmunológico).

Cuando resulta difícil el hallazgo e identificación morfológica de los parásitos o de

Las técnicas de inmunodiagnóstico pueden dividirse en cuatro grandes grupos.

Detección de anticuerpos específicos

En función de los isotipos (clases) de anticuerpos que se producen en la respuesta

Ejemplo De Diagnóstico en Schistosoma

Detección de anticuerpos circulantes.

Aunque no distingue entre especies, el diagnóstico mediante la detección de estos

Una ventaja sobre la detección de anticuerpos es que ambos antígenos pueden

Una de las críticas más frecuentes que se hace a la determinación de anticuerpos es

NUEVAS TENDENCIAS EN LA DETECCIÓN DE INFECCIONES PRIMARIAS

La detección de anticuerpos de la clase IgM para el diagnóstico de la fase aguda de

En conclusión, en las infecciones primarias la mayoría de los anticuerpos IgG

TÉCNICAS DE ADN APLICADAS AL DIAGNOSTICA DE LAS

Las principales características que definen un buen diagnóstico son la especificidad,

Polimorfismo en el tamaño de fragmentos de restricción (RFLP.El ADN puede

2. °- Sondas de ácidos nucleicos.

Existe una variedad de técnicas de hibridación:

3°. - Amplificación de ADN o ARN mediante reacción en cadena de la Polimerasa.

Toma de muestras, conservación, examen microscópico, fijación, tinción y montaje de

El análisis coprológico persigue la detección e identificación de los parásitos

Los resultados de un análisis coprológico dependerán de la obtención de muestras

Toma de la muestra / posibilidad de examen.

Heces líquidas en los 30 minutos siguientes a la defecación

CONSERVACIÓN DE LAS MUESTRAS

Como se ha indicado previamente, el examen de las muestras fecales no puede

Alcohol polivinílico (PVA).

-Permite realizar técnicas de concentración ( -Tinciones permanentes difíciles de realizar.

La muestra se examina directamente para determinar:

FORMES SEMIFORMES BLANDAS LIQUIDAS

En heces liquidas será más probable encontrar trofozoitos y menos probable el

Presencia de moco y sangre

Formas parasitarias macroscópicas.

Búsqueda de formas parasitarias macroscópicas.

Los nematodos son normalmente transparentados con glicerina o lactofenol

Carmin clorhídrico alcoholico.

COPROLOGÍA PARASITARIA II:

EXAMEN DIRECTO, TÉCNICAS DE CONCENTRACIÓN.

Si exceptuamos a los adultos de cestodos y nematodos, el diagnóstico coprológico

1.- Examen microscópico directo.

En el primer caso, los trofozoitos de protozoos y las larvas de nematodos persisten

EXAMEN DIRECTO (ver anexo)

Técnica: (ver anexo)

Método de Faust e Ingalls.