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Segunda parte

Obtencin del colorante de la semilla de achiote (Bixa orellana) utilizando


microorganismos celulolticos

Achiote (Bixa orellana) seeds colorant extraction using cellulolytic microorganisms

Hernndez Gonzlez Mara1, Tirado Gallegos Juan Manuel1, Ilin Anna2, Lpez Trujillo
Ramiro1, Rebolloso Padilla Oscar No1, Ruelas Chacn Xchitl1.

Resumen
El presente estudio se llevo a cabo con la finalidad de extraer el colorante bixina,
presente en la semilla del achiote, ampliamente utilizado por la industria alimentaria,
mediante un tratamiento que ofrezca adems de buenos rendimientos, un producto libre
de componentes txicos. El proceso se basa en el uso de microorganismos productores de
celulasas, capaces de degradar la pared celular de las semillas donde se encuentra el
pigmento para facilitar su liberacin en un medio acuoso, obtenindose rendimientos del
81%, mayores a los ofrecidos por extraccin acuosa y ligeramente menores que los
obtenidos con tratamiento cido-base, cuestionados por la comunidad Europea,
obtenindose una pasta que muestra picos en el intervalo de los 1600 cm- 1 representativo
de los grupos carbonilos caractersticos de la estructura de la bixina.
Palabras clave: Bixina, achiote, microorganismos celulolticos.

Abstract

This assay was carried out to extract bixine, a colorant attached to achiote seeds,
widely used in food industry, by a method which may offer besides good yields, a toxin
free product. The process is based on the use of cellulolytic microorganisms able to
degrade the seeds cellular wall, where the pigment is attached, in order to facilitate the
pigments liberation in a watery medium. 81% of the pigment was recovered, this
percentage is higher than the one offered by the aqueous treatment and lower than the
one offered by the acid-basic procedure, not well accepted by the European community.
The final paste obtained showed peaks near to 1600 cm- 1 representative of the carbonyl
groups characteristic of the bixine structure.
Key words: Bixine, achiote, cellulolytic microorganisms

Introduccin

El color de los alimentos es un atributo que tiene mucho peso dentro del juicio del
consumidor, este puede llegar a ser determinante para que un comestible sea aceptado o
rechazado. (Badui, 1993). La industria alimentaria utiliza una serie de sustancias , mejor
conocidas como aditivos; que tienen como funcin primordial impartir alguna coloracin
en particular o simplemente resaltar la que por la naturaleza tienen las materias primas o,
en su caso, de los procesos tecnolgicos en la coloracin del producto final.
Los aditivos que son utilizados como sustancias colorantes pueden ser obtenidos
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1 Universidad Autnoma Agraria Antonio Narro, 2 Universidad Autnoma de Coahuila

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por sntesis qumica en la industria (colorantes sintticos) o provenir de fuentes naturales
como los vegetales (colorantes o pigmentos naturales). En los ltimos tiempos los
colorantes sintticos han sido cuestionados debido a sus efectos toxicolgicos, inclusive
algunos han sido eliminados de algunas legislaciones. Lo anterior aunado a la tendencia
que tienen los consumidores, sobre todo en los pases desarrollados, a consumir alimentos
con un mnimo o nulo contenido de sustancias sintticas; ello ha provocado que el uso de
colorantes naturales vaya en aumento y sustituyendo a los sintticos (Salas, 2003).
Para abastecer la creciente demanda de colorantes naturales sin problemas de
legislacin, se procede a la extraccin de los pigmentos presentes en los tejidos vegetales
o animales por medio de diferentes mtodos, cada uno presenta sus limitantes y ventajas.
El colorante obtenido de las semillas de achiote (Bixa orellana), esta compuesto en
su mayora por el carotenoide bixina, que se utiliza en la industria lctica, crnica,
condimentara, cosmtica, farmacutica, etc.; es un colorante natural exento de
certificacin. La extraccin ms rudimentaria se basa en un lavado con agua en ebullicin y
a escala industrial se ha implementado un proceso de extraccin alcalino que es de fcil
aplicacin, pero que tiene el inconveniente de que el producto final contiene al mximo
30 a 40% de pigmentos (Vzquez, 2001).
Las posibilidades de incrementar el rendimiento y la pureza del colorante obtenido
del achiote siguen siendo tema de estudio, se debe buscar un mtodo de extraccin de
fcil aplicacin, que eleve el grado de rendimiento, dando como resultado un extracto
exento o con un mnimo de impurezas qumicas, que disminuya los riesgos que implica al
consumidor el uso de solventes o los tratamientos cido alcalinos.

Metodologa experimental

Se trabaj con semillas enteras de achiote procedentes del estado de Chiapas, adquiridas
en un mercado del municipio de Acala. Las semillas fueron mantenidas en envases plsticos y
almacenados en condiciones de oscuridad.
Para los objetivos de la investigacin, se procedi a realizar anlisis de ceniza,
humedad, grasa, fibra cruda, celulosa, lignina y bixina. Todas las determinaciones se
realizaron en base a los mtodos establecidos por la AOAC en 1980, excepto las de
celulosa, lignina, y fibra que se hicieron de acuerdo a Vansoest, et al. (1968), y la de bixina
se realiz de acuerdo a las normas oficiales mexicanas.
Una vez efectuada la caracterizacin de la semilla se procedi a seleccionar e identificar y
seleccionar cepas fngicas con probada actividad celuloltica.
Se evaluaron 7 cepas, las cuales fueron proporcionadas por la Facultad de Ciencias
Qumicas de la Universidad Autnoma de Coahuila, en funcin a la produccin de celulasas.
Los hongos fueron viabilizados en un medio lquido y posteriormente inoculados
en placas de agar carboximelticelulosa (CMC). Despus de 7 das de incubacin a 28C se
evalu su actividad sobre la celulosa aplicando la tcnica del rojo congo de acuerdo con los
lineamientos propuestos por Ilin (2002). De esta etapa se logr seleccionar tres cepas
para su posterior caracterizacin.

La caracterizacin de las cepas se realiz observando los microorganismos tanto


macroscpica como microscpicamente, mediante anlisis de morfologa, esporulacin y

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asimilacin de nutrientes. Todos los anlisis fueron realizados de acuerdo a los
lineamientos propuestos por Barnett et al., (1987) y Romero (1993).
Una vez seleccionadas e identificadas las cepas fngicas se procedi a establecer
un proceso fermentativo aerbico en medio acuoso, el cual contena 0.6 g. de NaNO 3, 0.1
g. de KH2PO4, 0.1 g. de MgSO4, 0.1 g de KCl y 0.02 g. de K 2SO4 y 2.0 g. de semillas de
achiote, como nica fuente de carbono en 200 ml de Buffer a pH de 5, 3 y 7 preparado de
acuerdo a la tcnica propuesta por Lynch et al (1987). Posteriormente se inocul cada
unidad experimental con un inculo que contena 2,000,000 de esporas/ml., y se mantuvo
en baos Mara para el control de la temperatura a 25, 30 y 35 C, durante 144 hrs.
Durante este tiempo se monitore la formacin de azcares totales y reductores, los
primeros se determinaron de acuerdo a los lineamientos propuestos por Dubois (1956)
con fenol sulfrico, los azcares reductores se analizaron de acuerdo con Miller (1959).
Terminado el proceso de biocatlisis, cada sistema fue esterilizado en autoclave,
para detener el crecimiento y actividad fngica. Despus del proceso de esterilizacin se
recuper el colorante mediante tratamientos en medio acuoso por calentamiento,
prensado y filtrado, hasta obtener la mayor cantidad de colorante posible.
El material obtenido en las operaciones antes citadas, fue sometido a un
proceso final de evaporacin en horno a una temperatura entre 60-65C hasta la
eliminacin completa de la humedad residual. La determinacin del rendimiento se
realiz por anlisis gravimtrico.
Los datos arrojados por el anlisis gravimtrico fueron sometidos a un anlisis de
varianza factorial con p>0.05, esto, para determinar las condiciones que ofrecen una
mayor liberacin de colorante.
A fin de determinar la pureza del extracto recuperado, se procedi a aplicar un
anlisis por espectroscopia infrarroja (IR) a los extractos obtenidos, mediante la
preparacin de la pastilla de KBr con la muestra del colorante en polvo y se analiza en un
espectrofotmetro Perkin Elmer.

Resultados y discusin

Los resultados arrojados por el anlisis qumico efectuado a la semilla muestran


1.4% de bixina, 1.61% de humedad, 9.74% de celulosa, 3.76% de lignina, 16.9% de fibra
cruda, 3.51% de cenizas y 4.52% de grasa, Se puede observar que el menor componente
de la semilla utilizada en la presente investigacin fue el agua, esto se traduce en un
elevado contenido de materia seca que se caracteriza por su alto contenido en fibras, por
lo cual la semilla pude funcionar en el proceso de Biocatlisis como una fuente de carbono
caracterizada por fibras que pueden ser desdobladas por complejos enzimticos presentes
en organismos como los hongos.
Los resultados obtenidos aplicando la tcnica del rojo congo, para seleccionar la
cepa con mayor actividad celuloltica, fueron sometidos a un anlisis de varianza con una
p<0.05; esto con la finalidad de elegir con mayor seguridad cual o cuales microorganismo
son los que ms se adecuan a la investigacin. Los resultados del anlisis se reportan en el
cuadro nmero 1, como las medias analizadas por la prueba de t-Student (p<0.05).

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Cuadro 1. Resultados de rojo congo analizados mediante t-Student (p<0.05)

CEPA PROMEDIOS DE MNIMOS CUADRADOS


Cepa 7 A 3,90 cm.
Cepa 5 B 3,40 cm.
Cepa 2 B C 3,23 cm.
Cepa 8 C D 3,10 cm.
Cepa 1 C D 3,05 cm.
Cepa 4 D 2,91 cm.
Cepa 3 E 2,63 cm.
Cepa 9 E 2,43 cm.

El anlisis de medias permite concluir que la cepa con mayor produccin de


celulasas es la cepa 7, ya que en el anlisis estadstico fue la mejor, existiendo diferencia
significativa con el resto. Por otro lado, la cepa 5 y la cepa 2 resultaron estadsticamente
iguales, presentando menor actividad que la cepa 7, pero mayor que el resto de las cepas.
Las cepas 7 y 5 fueron identificadas como genero Aspergillus ssp. y la 2 como una
mezcla entre Aspergillus y Penicilium por lo cual solo las dos primeras fueron probadas en
el proceso de biocatlisis.
Finalmente fue posible establecer que las mejores condiciones para degradar la
pared celular de la semilla del achiote fue la interaccin presentada entre la cepa 7 a pH 7
y temperatura de 35C, ya que as se manifest en el monitoreo de azcares el cual
mostraba constante formacin y consumo de los mismos a diferencia de las dems
interacciones.
En la figura 1 se pueden observar los pesos de pasta de achiote obtenidos despus
de terminado el tiempo en cada tratamiento. Se observa que la cepa 7 ofrece los mayores
rendimientos bajo todas las condiciones de trabajo.

Figura 1. Pasta colorante obtenida para cada tratamiento .

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De la misma manera que en el anlisis de varianza, se observa que la interaccin
que ofrece el mayor rendimiento es cepa 7, pH 7 y temperatura de 35C, presentando 1.2
g de extracto colorante, los cuales contienen 0.022 g de bixina total obtenidos a partir de
una muestra de 2 g; por lo que se espera que de 100 g de semilla se obtengan 1.13 g de
bixina lo que representa el 80.7 % de extraccin ya que la semilla contiene 1.4 g de bixina
por 100 g de semilla como se cit anteriormente.
En la figura 2 se muestra un espectro infrarrojo (IR) para la pasta colorante
recuperada, destacndose un pico sobresaliente cercano a 1600 cm -1, el cual es
representativo de los grupos carbonilos, as como un pico en el intervalo de los 1700 a
1880 cm-1 aproximadamente, representativo de los dobles enlaces presentes en las
estructuras orgnicas, caractersticas de la bixina.
105.2
100
715.39
1974.96
825.88
90
879.51

80 m 'b' esporas

70
2927.12
1266.98 772.05
%T
60
3271.00

1373.24
50 1598.96

40

30 1048.10

25.0
4000.0 3000 2000 1500 1000 600.0
cm-1

Figura 2 Espectro de Infrarrojo para pasta obtenida.

Conclusiones

En los resultados obtenidos se observ que el mayor constituyente de de la semilla


de achiote (Bixa orellana) son las fibras, a las cuales se encuentra adherido el pigmento de
inters.
De las cepas evaluadas, la que present mayor actividad celuloltca, de acuerdo a la
tcnica del rojo congo, fue la designada como 7, identificada como Aspergillus, lo cual fue
confirmado al monitorear la formacin y consumo de azcares totales y reductores
presentando un comportamiento tpico para este tipo de hongos excretando la enzima al
medio para obtener carbohidratos simples y asimilarlos constantemente.
Fue posible establecer que las condiciones para el ptimo desarrollo fngico, con
su consecuente efectividad en la degradacin de la materia en cuestin para facilitar la
liberacin del pigmento, fueron de pH 7 y temperatura de 35C, para la cepa 7 identificada
como Aspergillus spp. Antes citado.
Comparando los procesos usando las otras cepas estudiadas y sin inculo, el
tratamiento con Aspergillus result un 30% mas efectivo que los antes mencionados.
Las condiciones antes citadas ofrecen un rendimiento de extraccin de bixina de
hasta un 80 % comparado a lo obtenido con agua, e inferior al reportado utilizando los
mtodos alcalinos, sin contener los residuos qumicos txicos que se presentan en dicha
extraccin, cuestionados recientemente por la unin Europea.

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Literatura citada

AOAC. 1980. Oficial Methods of Anlisis of the Association of Official Alytical Chemists. Thirteenth edition.
353 p.
Badui, D. S. 1993. Qumica de los alimentos. Addison Wesley Longman de Mxico, S. A. DE C. V. Mxico D. F.,
Mxico.
Dubois, M., Guilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A. and Smith, F. 1956. Colorimetric meted for
determination of sugars and related substances. Anal. Chem. 28:530.
Ilin A. 2002. Manual de Prcticas de crdito 1 Introduccin a la Biotecnologa U. A. de C. 38 p.
Lynch, M. J. R., S. S. Mellor, D. L. Spare, D. P. Inwood, H. M. J. 1987. Mtodos de Laboratorio. 2 ed. Vol 2. Ed.
Nueva editorial interamericana. Mxico, D. F. pp. 1446-1447.
Salas, G. L. 2003. Educacin Alimentaria, manual indispensable en educacin para la salud. Ed. Trillas.
Mxico, D. F. pp. 97.
Vansoest, P. J. y Wine, R. H.1968. Determinacin de fibra por el mtodo cido detergente/ determinacin de
lignina, celulosa y silicio por el mtodo de permanganato. J. Anal. Chem. 51: 780 p
Vzquez, H. C. 2001. Estudio preliminar de la degradacin de bixina en polvo en los diferentes tipos de
empaques y temperaturas establecidas. Tesis ING. Instituto Tecnolgico de Villahermosa. Villahermosa,
Tabasco, Mxico.

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