Bioquímica - Práctica

FACULTAD DE MEDICINA HUMANA

Semestre Académico: Ciclo 2021-II

Informe N° 1: "ESPECTROFOTOMETRÍA"
OBJETIVOS

 Especificar los fundamentos de la técnica espectrofotométrica y sus

aplicaciones.
 Realizar la curva de calibración en base a los valores obtenidos.
 Determinar cuantitativamente la concentración de la solución problema.
 INTRODUCCIÓN

 En este informe de investigación explicaremos un tema muy interesante,

la espectrofotometría, que se puede definir como una técnica analítica
que se utiliza para medir la cantidad de luz que absorbe una sustancia
química, esta medida también se puede utilizar para medir la cantidad
de un producto químico en sustancias.
 Su investigación es muy importante, porque a través de la práctica,
podemos identificar compuestos a través de su espectro de absorción y
conocer la concentración de materiales o sustancias. Esto último nos
permite conocer la concentración de compuestos y rastrear el proceso
de reacciones químicas y enzimáticas, como la determinación de
enzimas y proteínas., incluido el ácido.(1)
 I. MARCO TEÓRICO

ESPECTROFOTOMETRÍA

La Espectrofotometría es una de las técnicas experimentales más utilizadas

para la detección específica de moléculas. Se basa en la relación que existe
entre la absorción de luz por parte de un compuesto y su concentración Se
caracteriza por su precisión, sensibilidad y su aplicabilidad a moléculas de
distinta naturaleza (contaminantes, biomoléculas, etc.) y estado de agregación
(sólido, líquido, gas). (2)

Constituye una de las técnicas analíticas que aprovecha la propiedad de las

sustancias químicas de absorber una determinada longitud de onda del
espectro visible o ultravioleta.(2)
La intensidad de la absorción depende de la concentración de la sustancia, ya
que esta mantiene relación directa con el número de moléculas disueltas en el
solvente. También depende de la distancia que debe recorrer el rayo de luz en
una determinada solución, debido a que cuanto mayor es el recorrido que
realiza la luz mayor será́ la posibilidad de ser absorbida por la molécula
química; finalmente depende del coeficiente de extinción, propiedad que es
inherente a la naturaleza química de la sustancia. (2)

Se expresan de una manera matemática a través de la ley de Lambert y Beer:

El método espectrofotométrico se rige por dos leyes fundamentales: Ley de

Lambert y Ley de Beer.
1.- Ley de Lambert: Esta ley establece que cuando pasa luz monocromática
por un medio homogéneo, la disminución de la intensidad del haz de luz
incidente es proporcional al espesor del medio, lo que equivale a decir que la
intensidad de la luz transmitida disminuye exponencialmente al aumentar
aritméticamente el espesor del medio absorbente. (2)

Po: Intensidad de la luz incidente.

P: Intensidad de la luz transmitida .

b: Espesor del medio absorbente.

k: Constante, cuyo valor depende de la naturaleza del soluto, de la longitud de

onda de la luz incidente, del espesor del medio absorbente y de la naturaleza
del medio.

2.- Ley de Beer: La intensidad de un haz de luz monocromática disminuye

exponencialmente al aumentar aritméticamente la concentración de la
sustancia absorbente, cuando este haz pasa a través de un medio homogéneo.

Po: Intensidad de la luz incidente.

P: Intensidad de la luz transmitida.

c: Concentración de la solución.

k: Constante, cuyo valor depende de la naturaleza del soluto, de la longitud de

onda de la luz incidente, de la concentración de la solución, y frecuentemente,
de la naturaleza del medio.(2)
Transmitancia (T): Relación entre la cantidad de luz transmitida que llega al
detector una vez que ha atravesado la muestra, It, y la cantidad de luz que
incidió́ sobre ella, Io, y se representa normalmente en tanto por ciento:

II. METODO

Nuestra guía de prácticas menciona dos métodos para calcular la

concentración de una muestra problema una utilizando el factor de
calibración y la otra usando una curva de calibración.

Materiales:

- 5 fiolas (5ml)
- Azul de metilo (10.0 mg/L)
- Agua destilada.

Procedimiento:

- Se preparó una solución de 10mg/1000ml (sabiendo entonces que existe

en cada ml 1mg de azul de metilo).
- Luego procedemos diluyendo la solución base para luego distribuirlo en
las 5 fiolas de la siguiente manera:
 Primera alícuota (1 ml)
 Segunda alícuota (2 ml)
 Tercera alícuota (3 ml)
 Cuarta alícuota (4 ml)
 Quinta alícuota (5 ml)
 Alícuota de la sustancia desconocida (D) 2.5ml
Tabla 1. Concentración:

La concentración del azul de metileno en cada uno de los tubos es (la

concentración se mantiene igual ya que aún no se diluyo con el agua
destilada):

Tubo N° Concentración (mg/ml)

B 0

1 0.01

2 0.01

3 0.01

4 0.01

5 0.01

D 0.01

- Las concentraciones se han determinado de la siguiente manera:

1.000 ml 10 mg
1ml X x=0.05mg/ml
- Ahora para calcular la concentración de cada alícuota hasta un aforo de
5ml mezclado con agua destilada se calculó de la siguiente manera
utilizando la fórmula de (volumen x concentración) inicial= (volumen x
concentración) final.
(1ml) (0.01mg/ml) =5ml(x) x=0.001
- Llevando las concentraciones obtenidas al espectrofotómetro no arroja
los resultados de la segunda columna.
 Tabla 2. Espectrofotometría:

C/C (nueva) DO (Abs λ efectiva)

mg/ml

0 0.049
0.002 2.057
0.004 3.586
0.006 4.426
0.008 4.715
0.01 4.763

0.005 4.092

Gráfica 1. Curva de calibración:

Con los datos que tenemos se graficó la siguiente curva de calibración:

f(x) = 462.628571428572 x + 0.952857142857142

5 R² = 0.851266559227817

Absorbancia 4

0
0 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012

- La recta de calibración (curva de calibración) obtenida será nuestra

referencia para transformar la medida de cualquier muestra desconocida
en un valor de concentración para nuestro analito.
 - Para calcular el factor de calibración necesario para encontrar la
concentración de cualquier solución desconocida se hizo a siguiente
tabla.

Tabla 3:

C/C (nueva) DO (Abs λ efectiva) FC=C/A

mg/ml

0.002 2.057 0.0010

0.004 3.586 0.0011
0.006 4.426 0.0014
0.008 4.715 0.0017
0.01 4.763 0.0021

Factor de calibración promedio es 0.001448

- En la tabla número 4 se muestra dos métodos para calcular la
concentración problema
Para el método A se calculó de la siguiente manera
Datos:
¿DO (sustancia desconocida) = 4.092 [ ? ] =DO X Fc
El Fc= 0.001448 [ ? ] =4.092 X 0.001448
[ ? ] = 0.059

Pata el método B solamente se reemplazó los datos de la absorbancia

en la variable “Y” y consecuentemente se obtuvo una concentración de
0.0068

Tabla 4:

Método A Método B
Solución Cc a partir del
Desconocida FC Conc. A partir de la Gráfica
mg/ml [ ]=DO*Fc y= 462.63X + 0.9529
 0.005 0.0059 0.0068

III. CUESTIONARIO

1. ¿En qué se basa el fundamento de la espectrofotometría?

La espectrofotometría se basa en la capacidad de las moléculas para absorber

las radiaciones electromagnéticas con base en la ley de Beer-Lambert, y a su
vez que la cantidad de luz absorbida depende de forma lineal a la
concentración, para esto se emplea un espectrofotómetro, en el que se puede
seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa por una solución y medir la
cantidad de luz absorbida por la misma para encontrar la máxima absorción y
cuantificar las concentraciones de distintas biomoléculas, lo cual también
depende de la estructura atómica y condiciones del medio.(2 y 3)

2. ¿Cuál es la importancia de la ley de Lambert-Beer?

La ley fue presentada en diversas formas por Pierre Bouguer (1729), Johann
Heinrich Lambert (1760) y August Beer (1852). Describe la absorción de
radiación (Io (ʎ) e I(ʎ)) a medida que esta pasa a través de una capa de grosor
L (longitud de trayecto), donde la especie (con una sección transversal de
absorción σ(ʎ) en el largo de onda ʎ) está presente en una concentración (4)

La aplicación de la ley de Lambert podemos relacionar la absorción de

radiación con su concentración lo permite:

a) Determinar la cantidad de concentración de un compuesto en una

solución.
b) Identificar unidades estructurales específicas por sus distintos tipos de
absorbancia.
c) Determinar constantes de disociación de indicadores ácido-base.

3. ¿Cuál es la diferencia entre los conceptos de transmitancia y

absorbancia? 
 La absorbancia y la transmitancia son dos aspectos del mismo fenómeno, pero
tienen distintas definiciones.

A) Transmitancia: se define como la cantidad de energía que atraviesa un

cuerpo en determinada cantidad de tiempo, es decir la relación que
existe entre la cantidad de luz transmitida y la que llega al detector
después de atravesar la muestra.
B) Absorbancia: indica la cantidad de luz absorbida por la misma por la
sustancia. (5)

4. Según su análisis, ¿cuáles serían las aplicaciones clínicas de la

espectrofotometría? Brindar 2 ejemplos.

Aplicaciones clínicas:

 Identificar de unidades estructurales específicas, posible por sus

distintos tipos de absorbancia.
 Análisis cuantitativo y cualitativo de soluciones desconocidas en un
laboratorio de investigación.
 Estudio de tejidos y ayudar en el diagnóstico para determinar las
características bioquímicas de estos.
 Ayudar en la determinación de estructuras moleculares, utilizado en
farmacéutica para el mejorar la eficacia de medicamentos.
 Determinación de trazas de impurezas en alimentos y en reactivos. (6)

Ejemplos:

 Espectrofotometría de masas MALDI-TOF en la identificación de

microorganismos en muestras clínicas.
 La espectroscopia de infrarrojo cercano o NIRS (near-infrared
spectroscopy) es un método óptico de diagnóstico no invasivo que
permite observar variables fisiológicas en tiempo real como la saturación
de oxígeno y el índice de oxigenación en cualquier tejido para el
descarte de isquemia y la medición de flujos sanguíneos. (6)
 IV. DISCUSIÓN

El espectro de absorción muestra una creciente al comenzar porque la

concentración es muy parecida, entonces comienza a separarse poco a poco
del rango inicial y alcanza su punto máximo de absorbancia, para así́,
entonces, permitir asegurar que la concentración es la que juega el papel más
importante, puesto que si tiene muy poca, va hacer una absorbancia baja,
porque “se absorben aquellas frecuencias que son capaces de producir
excitación electrónica”, pero luego desciende debido a que ya no existe un
equilibrio en la solución que le permita absorber la intensidad incidente
optimizando la transmitancia mucho más que la absorbancia .(8)

Transmitancia y absorbancia

Puedo cuantificar la luz

transmitida (transmitancia) o
la absorbida (absorbancia)

Toda vez que exista una gráfica interpolarle,

será́ posible, por medios gráficos determinar la concentración de las sustancias
problema, pero debido a que es un medio gráfico, arroja un margen de error
considerable, además, el espectrofotómetro presenta falencias para determinar
la absorbancia.(7 y 8)

- La absorbancia es la capacidad que tiene algunos compuestos para absorber

la radiación electromagnética, pudimos observar cómo, dependiendo de la
concentración y la longitud a la cual se le aplique un rayo, puede alcanzar un
punto máximo de absorción.(7 y 8)
- Según esto la longitud y la absorbancia son proporcionales hasta alcanzar el
punto máximo y de allí́ empieza a descender.(7 y 8)

- Según la concentración varia la absorbancia del compuesto, variando la

cantidad de solvente (siendo agua destilada) se puede disminuir la
absorbancia.(7 y 8)

- Los fundamentos de la técnica espectrofotométrica se refieren a la medida de

cantidades relativas de luz absorbida por una muestra, en función de la longitud
de onda y sus aplicaciones son: estandarización de colores de diversos
materiales, como plásticos y pinturas, detección de niveles de contaminación
en aire y agua.(7 y 8)

- Para elaborar la curva de calibración de preparan varias concentraciones del

estándar cuyas densidades ópticas se leen en un espectrofotómetro y luego se
grafican los resultados obtenidos.(7 y 8)

CONCLUSIONES

 La técnica de espectrofotometría se basa en la capacidad de las

moléculas para absorber las radiaciones, entre ellas las radiaciones del
espectro UV visible, lo cual dependerá a su vez de la estructura atómica
y las condiciones del medio como (PH, temperatura, fuerza iónica,
constante eléctrica).
 Podemos observar una relación directamente proporcional entre las
variables, concentración y absorbancia, ya que se evidencia que un
aumento en la concentración, indica una mayor absorbancia de la
muestra, obteniendo de esta forma una línea recta creciente.
 La transmitancia es la razón entre la luz monocromática transmitida (P)
por una muestra y la energía o luz incidente (Po) sobre ella; mientras
que la Absorbancia es la cantidad de energía radiante absorbida por una
sustancia pura o en solución.
 Las aplicaciones clínicas de la Espectrofotometría se ven reflejadas en
investigaciones farmacéuticas y toxicológicas, en la identificación de
 microorganismos en muestras clínicas, en la determinación de
concentración de analitos, etc.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Díaz NA, Antonio Bárcena Ruiz J, Reyes EF, Cejudo AG, Novo JJ,
Peinado JP, et al. 8. Espectrofometría: Espectros de absorción y
cuantificación colorimétrica de biomoléculas [Internet]. Uco.es. [citado el
9 de agosto de 2021]. Disponible en:
https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/08_ESPECTROFOTO
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3. Camelino SO, Minchiotti M, Bariles R, Padilla RL, Colazo J. Optimización
de un procedimiento para la determinación de oro mediante
espectrofotometría UV / Vis. Matér (Rio Jan) [Internet]. 2018 [citado 09
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4. Abril Díaz N, Bárcena Ruiz A, Fernández Reyes E, Galván Cejudo A,
Jorrín Novo J, José Peinado Peinado J, Toribio Meléndez-Valdés F,
Túnez Fiñana I. Espectrometría: Espectros de absorción y cuantificación
colorimétrica de biomoléculas [Internet]. [citado 6 agosto 2021].
Disponible en:
https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/08_ESPECTROFOTO
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5. Rodríguez, Lizzette A., Nadeau, Patricia, resumen de las principales
técnicas de percepción remota usadas en volcanes para monitorear las
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[Internet]. 2015 [citado 09 agosto 2021]; (52): 67-105. Disponible en:
https://www.redalyc.org/articulo.oa?id=45439324005
6. Ramírez S, Carranza P, Gutierrez J, et al. Aplicación en medicina de la
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7. Gonzales M. Transmitancia y absorbancia [Internet]. La guía. 2010
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https://quimica.laguia2000.com/conceptos-basicos/transmitancia-y-
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8. USMP. Guía prácticas - Bioquímica 2020. Espectrofotometría. [citado 09

agosto 2021]. Disponible en: file:///C:/Users/OFICINA/Downloads/GUIA
%20PRACTICAS%20- %20BIOQUIMICA%202020-I-No
%20presenciaI.pdf