INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SANTO DOMINGO

ÁREA DE CIENCIAS BÁSICAS Y AMBIENTALES

BIOTECNOLOGÍA

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA ESTRUCTURAL Y ENZIMOLOGÍA

PRÁCTICA 6
ESTIMACIÓN CUANTITATIVA DE UN ANALITO POR ESPECTROFOTOMETRÍA UV-
VISIBLE.
Integrantes:
Lirianny Pacheco 1099321
Mayurie Mejía 1099888
Wilson Soto 1099350
Jessie Pepen 1092947
Robert Brito 1098655

OBJETIVO:
Cuantificar la cantidad de un analito mediante el uso de la técnica de espectrofotometría
UV-Visible

REACTIVOS:

Solución estándar.
Patrones de concentración conocida.
Agua destilada

MATERIALES NECESARIOS:

Celdas para el equipo

Pipetas
Espectrofotómetro Uv-visible.
 
Principio del Espectrofotómetro UV-Visible:
 
Medición de la absorbancia (A):
 
Los compuestos desconocidos pueden ser identificados por sus espectros de absorción
característicos en las regiones ultravioleta, visible o infrarroja. Las reacciones catalizadas
por enzimas con frecuencia pueden ser seguidas por la medición espectrofotométrica de la
aparición de un producto o la desaparición de un sustrato. Un espectrofotómetro /
colorímetro es un instrumento para medir la absorbancia de una solución midiendo la
cantidad de luz de una longitud de onda dada que es transmitida por una muestra.
 
Perfil de luz y espectro:
 
La luz se puede clasificar de acuerdo con su longitud de onda. La Figura 1 muestra la
relación entre la longitud de onda de la luz y los tipos comunes de radiación
electromagnética. La luz en las longitudes de onda cortas de 200 a 400 nm se conoce como
ultravioleta (UV). La luz en las longitudes de onda más largas de 700 a 900 nm se conoce
como infrarrojo cercano (IR cercano).

La luz visible cae entre las longitudes de onda de 400 y 700 nm. Todos los colores visibles
para el ojo humano caen dentro de este rango de longitud de onda. Cualquier solución que
contenga un compuesto que absorba la luz en la región visible aparecerá coloreada a los
ojos. La solución se colorea porque las longitudes de onda específicas de la luz se absorben
a medida que pasan a través de la solución. Entonces, la única luz que el ojo percibirá son
las longitudes de onda de la luz que se transmiten (no se absorben).
 
Ley Beer-Lambert:
 
La Ley de Beer-Lambert establece que la cantidad de luz absorbida es proporcional al
número de moléculas de sustancia absorbente en la trayectoria de la luz, es decir, la
absorción es proporcional tanto a la concentración de la solución de muestra como a la
longitud de la trayectoria de la luz a través de la solución. Esta relación se puede expresar
de la siguiente manera:     
  
Absorbancia, A= ε x c x l c = concentración de la muestra (en moles/litro),
l

= longitud de la trayectoria de la luz a través de la solución (en cm) y ε = coeficiente de

extinción molar
 

Para determinar la concentración absoluta de una sustancia pura, se construye una curva
estándar a partir de las concentraciones conocidas y, utilizando esa curva estándar, se
determinó la lectura de absorbancia de la concentración desconocida. La determinación de
la concentración desconocida a partir de la curva estándar se realiza dibujando una línea
paralela al eje X desde el punto en el eje Y que corresponde a la absorbancia de lo
desconocido. Esta línea se hará para interceptar la curva estándar dibujada, y se extiende
verticalmente de tal manera que cumpla con el eje X y la concentración de desconocido se
lea desde el eje X. Una curva estándar típica se representa en la figura.
 
 
PROCEDIMIENTO:
1. Prepare los patrones de concentración conocida del analito según le indica su profesor.
2. Agregue agua destilada en todos balones y enrase.
3. Mezcle el contenido de los tubos vórtice / agitando los tubos.
4. Prepare un blanco, el cual contiene todos los reactivos menos el analito.
5. Proceda a calibrar a 0 absorbancia y medir los patrones y muestras.
 
Cómo configurar el Espectrofotómetro UV-Visible:
 
1. Encienda el espectrofotómetro y establezca la longitud de onda en la que se medirá la
absorbancia [esto debe hacerse unos 30 minutos antes de tomar las lecturas]. Para este caso
colocar en 535 nm.
2. Enjuague la cubeta con la solución en blanco, escurra la solución invirtiendo la cubeta y
tocando su boca con el papel de filtro.
3. Llene la cubeta con la solución en blanco hasta la marca apropiada y colóquela en el
orificio provisto en el espectrofotómetro.
4. Se debe tener cuidado de que la cubeta se inserte correctamente en el agujero. Pulse 0
absorbancia.
5. Introduzca el resto de las cuatro celdas con los patrones y lea los valores de absorbancia
para cada concentración del analito.
6. Mida el valor de la absorbancia de la muestra problema.

ANÁLISIS DE LA PRÁCTICA

1. Realice la curva de calibración de los patrones suministrados en Excel.

Determinación de la concentración Patrón:
Solución madre = 10-2
1) 5ml 100ml = 0.050
2) 10ml 100ml = 0.100
3) 15ml 100ml = 0.150
4) 20ml 100ml = 0.200
Absorbancia:
1) 0.007
2) 0.015
3) 0.025
4) 0.031

Curva de Calibracion
0.035
Concentración Patron
0.03 f(x) = − 2.54993392810309E-16 x² + 0.16 x − 0.000399999999999999
R² = 0.99502487562189
0.025

0.02

0.015

0.01

0.005

0
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25
Absorbancia
2. Determine la ecuación de la gráfica y el coeficiente de correlación lineal R.
y = 0.16x – 0.0004
R2 = 0.995
3. En caso de no ser totalmente lineal, realice los ajustes correspondientes.

Curva de Calibracion
0.035
Concentración Patron
0.03 f(x) = 0.156 x − 0.000400000000000001
R² = 0.999249178789301
0.025

0.02

0.015

0.01

0.005

0
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25
Absorbancia
3. Determine la concentración de la muestra de la muestra problema a través de la
gráfica y a través de la ecuación de la gráfica.
Excel = 0.00228
0.02 = 0.16x – 0.0004
0.04+0.0004
X= =¿ 2.5x10-3
0.16

CONCLUSIONES
La práctica de hoy nos muestra la forma de detectar sustancias desconocidas y su cantidad
por medio de la espectrometría UV visible, que podemos usar para ver a su vez, reacciones
mediadas por enzimas y medir la desaparición y transformación de sustancias en el analito.
Usando una simple gráfica de Excel pudimos ver las titulaciones mediante una curva de
titulación, para el laboratorio obtuvimos cuatro soluciones, estas fueron medidas mediante
un espectrofotómetro de luz visible para así comprobar sus pH

REFERENCIAS.