Está en la página 1de 5

Determinación cuantitativa de proteínas solubles por el método de biuret

Ángela Ruiz, Angélica Quiroz & Carlos Maje


Estudiantes Del V semestre de Ingeniería De Alimentos
Docente: Yudi Silva
Universidad De La Amazonia Avd. Circunvalar, Barrio Porvenir
Florencia -Caquetá
Bioquímica
Abril 2015
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Resumen: Para el estudio de la estructura de una proteína, de la actividad de una enzima o el contenido
proteínico de un alimento, es necesario conocer cuantitativamente la concentración de las proteínas por tal razón
en esta práctica se utilizó el método de Biuret con el objetivo de conocer la concentración de proteína contenida
en la clara de huevo, donde se realizo una curva estándar, al despejar la ecuación la curva se obtuvo 130,14mg/
ml de albumina y en porcentaje se obtuvo 13%.

Palabras claves: cuantificación de proteínas, Biuret, curva patrón,


espectrofotometría.

Introducción
Estimar la concentración de proteína es necesario no
solo en los laboratorios de investigación, sino
también en la industria alimenticia, farmacéutica, y
biotecnológica en general. Existen muchos métodos
para la determinación de proteínas. Primitivamente,
la cantidad de proteínas se evaluaba midiendo la
cantidad total de nitrógeno proteico, y teniendo en
cuenta que este elemento representa
aproximadamente el 16% del peso de una proteína.
Este era un método largo y laborioso y con poca
sensibilidad. La aparición de métodos calorimétricos
ha permitido solventar estos dos inconvenientes.
(Arellano & Duhalt, s.f)

Entre los métodos que se basan en la formación de


complejos colorimétricos entre las proteínas y
reactivos específicos se encuentran: el método de
Biuret, el método de Lowry y el método de Bradford.

Tomado de: MANUAL PRÁCTICAS DE


LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
Los tres métodos tienen como principio alguna Materiales y métodos
reacción química de los grupos alquilo o arilo de los Los materiales utilizados en esta práctica fueron: 8
diferentes aminoácidos. tubos de ensayo, una gradilla, un beaker, un agitador
el espectrofotómetro, dos pipetas.
El método de Biuret es la técnica más simple para la Reactivos: solución de albumina de huevo, reactivo
determinación de proteínas solubles, las sustancias de Biuret, NaCl.
que contienen dos o más enlaces peptídicos forman
un complejo purpura-violeta con sales de cobre (II) La prueba consistió en: primero, en preparar la
alcalinas (figura 1). Es posible que el color se forme muestra con solución de albumina de huevo, luego se
por la formación de un ion coordinado, tetracuprico, rotularon 9 tubos de ensayo y se procedió de la
con dos grupos amida adyacentes. El desarrollo del siguiente manera:
color es diferente para cada proteína y su intensidad
se puede determinar espectroscópicamente a 540nm. Un tubo se rotulo como blanco, y el resto se rotularon
La cuantificación de la proteína se lleva acabo con con números de 1 al 8; al tubo rotulado como blanco
una curva patrón, el principio establecido por la ley se le agrego 2.0 ml de agua y 4.0 ml del reactivó de
de Lambert Beer. Existen pocas interferencias en biuret, al tubo 1 se la agrego, 0.2 ml de patrón de
esta determinación; entre ellas, la presencia del ion albumina, 1,8 ml de agua y 4.0 del reactivó de biuret,
amonio altera el desarrollo del color; algunos al tubo 2 se le agrego 0.4 ml de patrón de albumina,
pigmentos absorben a la misma longitud de onda, 1.6 ml de agua y 4.0 del reactivó de biuret, al tubo 3
algunos lípidos y carbohidratos son capaces de se le agrego 0.6 ml de patrón de albumina, 1,4 ml de
formar complejos con el ion coordinado. (Bolaños, agua y 4.0 del reactivó de biuret, al tubo 4 se le
Giselle, & Herrera, 2003) agrego 0.8 ml de patrón de albumina, 1,2 ml de agua
y 4.0 del reactivó de biuret, al tubo 5 se le agrego 1.0
ml de patrón de albumina, 0,5 ml de muestra, 1,5 ml
de agua y 4.0 del reactivó de biuret, al tubo 6 se le
agrego 0.5 ml de muestra, 1.5 ml de agua y 4.0 del
reactivó de biuret, al tubo 7 se le agrego 1.0 ml de
muestra, 1.0 ml de agua y 4.0 ml del reactivó de
biuret y al tubo 8 se le agrego 0.3 ml de muestra, 1,7
ml de agua y 4.0 del reactivó de biuret.

Después de tener todos los tubos con la solución se


colocaron en reposo por 30 minutos en una parte
oscura. Al término del tiempo se realizó la
cuantificación de la solución por medio de un
espectrofotómetro a 540 nm de los tubos, entre cada
medición se lavaban las celdas; al tener todas las
mediciones se dispuso a realizar la curva de
El espectrofotómetro que se va a manejar en la calibración.
práctica es del tipo convencional de haz simple. Un
esquema del mismo se presenta a continuación:
Resultados y Cálculos

Figura 3: tubos de ensayo después de agregarle


patrón de albumina, muestra, agua y reactivo de
Biuret.

Figura 2: Esquema de un espectrofotómetro


convencional de haz simple

El objetivos a realizar en esta práctica es determinar


el porcentaje de albumina obtenida en la clara de
huevo por el método de biuret.

2
Cálculos para determinar la concentración del
tubo 8:

TABLA 2: Resultados Obtenidos Del


Espectrofotómetro Y Cálculos De La Concentración
De Albumina

TUBOS Absorbancia [ Mg/Ml Albumina ]

1 0.135 0.167

2 0.163 0.330

3 0.200 0.500

4 0.238 0.667

5 0.273 0.833
Convertir los mg a gramos
Tubo de la muestra a determinar la concentración de
albumina :

8 0.249 130,14

Los tubos 6 y 7 se omitieron debido a que los Regla de tres simple para saber cuántos gramos
resultados arrojados por el espectrofotómetro están hay en 100 ml.
por fuera de los rangos de los tubos 1 al 5
1 ml

X 100 ml

Ahora si determinamos del porcentaje peso/


volumen de la concentración de albumina en el
tubo 8
Discusión de los resultados 4. mencione cual es la razón de que el método de
biuret la absorbancia de una proteína se lea a una
Cuando se determinó la absorbancia por medio del longitud de 540nm.
espectrofotómetro de los diferentes tubos del 1 al 5
(véase tabla 2) se observa que la absorbancia va Rta: El color violeta característico se presenta a esa
aumentado de tubo en tubo, y esto es debido a que la longitud la cual se da por la coordinación de un
intensidad del color de la reacción es proporcional a átomo de cobre con cuatro átomos de nitrógeno. El
la cantidad de proteína en la muestra. Esto se observó complejo se basa en la desprotonación de los grupos
claramente en la coloración de las soluciones (véase amida para formar el enlace con el cobre (II) o por el
figura 3), el tubo #1 fue el más claro de todos y es el establecimiento de un enlace coordinado entre el
tubo que contiene tan sólo 0.2ml de la solución metal y los pares de electrones libres de los átomos
patrón de proteína. En el tubo #2, 3, 4, y 5 el color va de oxígeno y de nitrógeno del péptido.
aumentando en tubo en tubo, de acuerdo al aumento
de la concentración de proteína. Además, la solución .5. Explique si una curva patrón puede ser empleada
problema (tubo 8) tiene también un color claro y para cuantificar sustancias diferentes a las proteínas y
presentó un valor de absorbancia de 0,249 que se cuáles serían las diferencias con estas.
encuentra entre los valores del tubo #4 y 5.
6. ¿cuál es la finalidad de utilizar un tubo como
blanco? Mencione si siempre se utiliza agua como
Despejando de la ecuación de la recta se obtuvo una
blanco.
concentración de 130,14mg/ml de albumina
contenida en el tubo 8, y en porcentaje Rta: Tomar la medida de la cual parte la curva patrón,
peso/volumen se obtuvo 13%. Según Gómez, 2013. no siempre se utiliza agua como blanco, sino una
la clara de huevo tiene 10,9 % de proteina. El mezcla concentrada de la sustancia con la cual se está
resultado obtenido es casi silimar al establecido por trabajando.
Gomez.

Conclusión
Aplicando el método Biuret se puede determinar la Bibliografía
concentración de proteína en unas muestras Arellano, H. G., & Duhalt, R. V. (s.f). cuantificacion
problema, que resulta de despejar una ecuación de los de proteinas. Recuperado el 19 de 04 de
valores de absorbancia en una curva patrón originada 2015, de
a partir de concentración de proteína conocida. http://www.smbb.com.mx/revista/Revista_1
998_2/bitacora.pdf.
Cuestionario:
Bolaños, N., G. L., & Herrera, C. H. (2003). Química
1. Describa que es el espectrofotómetro y para qué de Alimentos: Manual de laboratorio.
sirve. Recuperado el 19 de 04 de 2015, de
https://books.google.com.co/books?
Rta: Un espectrofotómetro es un instrumento para id=8VpJ8foyDiIC&pg=PA36&lpg=PA36&d
medir la transmitancia o absorbancia de una muestra, q=curva+de+calibraci
en función de la longitud de onda de la radiación %C3%B3n+para+la+determinaci
electromagnética.Sirve para calcular las %C3%B3n+cuantitativa+de+las+prote
concentraciones de las distintas sustancias en función %C3%ADnas&source=bl&ots=q1sOlQfj1f
de la absorción del color. &sig=lqVb8LgOiSKr0VnCK2NTZ3uQqOw
&hl=es&sa=X&ei=5UcwVYrgMoKFsAWQ
2. defina con sus propias palabras que es una curva -4CACw&ved.
patrón.
CALLE, H. D., SÁNCHEZ, S. C., & LAITÓN, J. C.
Rta: Son las medidas conocidas en orden ascendente (s.f). MANUAL PRÁCTICAS DE
que sirven de guía para ajustar una solución LABORATORIO DE BIOQUÍMICA.
problema. Recuperado el 19 de 04 de 2015, de
http://tux.uis.edu.co/quimica/sites/default/fil
3. cuáles son las ventajas y desventajas, de emplear es/paginas/archivos/V00Man10Bioqca_MF
los reactivos de biuret para cuantificar proteínas OQ-BQ.01_08072013.pdf.
explique.
Gómez, D. (2013). HUEVOS: GENERALIDADES.
Rta: Dentro de las ventajas del reactivo de Biuret es Recuperado el 29 de 04 de 2015, de
que es bastante específico para proteínas, muestra https://deymerg.files.wordpress.com/2013/1
pocas interferencias y es barato. Y la desventaja es 0/huevos_generalidades.pdf.
que es poco sensible.