GUÍA DE LABORATORIO 2

TEMAS: EXAMEN DE LA CÉLULA BACTERIANA CON COLORACIÓN DE

GRAM

1. OBJETIVOS
1.1. Adquirir destreza en la realización de la coloración Gram.
1.2. Reconocer las morfologías de las bacterias y su afinidad de tinción.
1.3. Reconocer los esquemas de cuantificación de bacterias y células al
microscopio.

2. INTRODUCCIÓN

La coloración de Gram es una de las tinciones que con mayor frecuencia se emplea
en el laboratorio de bacteriología, fue ideada por el médico danés Hans Christian
Joachim Gram en 1884. Ésta coloración permite agrupar a las bacterias en Gram
positivas y Gram negativas de acuerdo a la capacidad que tienen o no de retener el
colorante Cristal Violeta, respectivamente, después del proceso de decoloración. Esta
característica se encuentra directamente relacionada con la composición de su pared
celular.
Existen bacterias con características intermedias y se comportan algunas veces como
Gram positivas y en otras como Gram negativas por lo que se denominan Gram-
variables. Las características de coloración de las bacterias pueden cambiar con su
edad, por el tratamiento con antibióticos o la presencia de enzimas autolíticas.
Han sido descritas una serie de modificaciones a la técnica original, orientadas a
resolver problemas específicos y cuyas variaciones radican en la composición del
colorante primario, cristal violeta, así como en tipo de solvente orgánico empleado
como agente decolorante y el colorante empleado como contraste. En este laboratorio
se empleará la tinción de Gram de Hucker modificada. En esta técnica, se emplean el
cristal violeta -oxalato como colorante primario, solución de lugol como mordiente,
alcohol-acetona (en proporción 1:1) como decolorante y la safranina, como colorante
de contraste.
3. MATERIALES Y REACTIVOS

Materiales y Equipos suministrados por la Universidad

Placas de Agar inoculados con

Bacillus spp, Gradillas de coloración: 4
Staphylococcus spp, Proteus spp y
Acinetobacter spp . 2 de c/u
Alcohol para mecheros 2000 ml Gradillas para frascos icopor
:12
Caldos de cultivo inoculados con
Bacillus spp, Staphylococcus spp, Láminas Portaobjetos en
Proteus spp y Acinetobacter spp alcohol 95%: 30
(que se ha dejado crecer toda la
noche). 5 de
c/u
Encendedores: 6 Una caja de agar con
diferentes tipos de
colonias
Frascos de descarte con hipoclorito Mecheros con alcohol: 12
1% : 12
Microscopios: 12 Pinzas: 12
Reactivos para la coloración de Trapos para limpiar: 12
Gram de Hucker
:4 Juegos
Asas de argolla: 12 Vasos de plástico pequeños:
12
Goteros con aceite de inmersión: 4 Escobillones de algodón :12
Goteros con solución salina Tarros colectores para los
fisiológica: 4 reactivos

Materiales No suministrados por la Universidad

Algunos materiales que no son suministrados por la Universidad y son indispensables

para llevar a cabo las prácticas son los siguientes:

Traer por estudiante:

un lápiz de cera de color blanco, un trozo de tela no abrasiva de aproximadamente 15
cm x 15 cm. (sirve un pañuelode tela)

4. PROCEDIMIENTO

El profesor le proporcionará para su práctica:

a. Un microscopio: registre el número y su nombre en el cuaderno destinado
para tal fin.
b. Caldos con cultivos puros de Bacillus spp, Staphylococcus spp, Proteus
spp y Acinetobacter spp
d. Un escobillón de algodón estéril: con este escobillón cada uno se tomará un
frotis de la pared interna del carrillo, dentro de la boca, haciendo un frotis
enérgico.

4.1. PREPARACIÓN Y FIJACIÓN DEL FROTIS de Bacterias y de la

Muestra de boca

4.1.1. Con una pinza tome una placa portaobjetos nueva que se encuentra
inmersa en alcohol al 95% y pásela por la llama para que se encienda
el alcohol. Espere a que
4.1.2. Rotule la placa con sus iniciales empleando lápiz de cera diferente al
rojo. Seguidamente, dibuje cuatro círculos de aprox 0.5 cm de
diámetro en la parte de debajo de la placa (para evitar que se borre
durante la tinción) y sobre los círculos escriba:
X BGP (Bacilo Gram Positivo), aquí ira el cultivo de Bacillus spp, X
CGP (coco Gram Positivo), aquí ira el cultivo de Staphylococcus spp,
BGN (Bacilo Gram negativo), aquí ira el cultivo de Proteus spp y
CGN (Coco Gram negativo), aquí ira el cultivo de Acinetobacter spp

4.1.3. Tome el asa de argolla y esterilícela, ubicándola verticalmente en la

llama del mechero, hasta que se encuentre al rojo vivo.
4.1.4. Retire el asa de la llama y déjela enfriar a una distancia del mechero
de aproximadamente 10 cm.
4.1.5. Con el asa de siembra de argolla ponga 1 a 3 gotas
(aproximadamente 50 µL) de cada suspensión bacteriana sobre cada
círculo del portaobjetos y realice un frotis en movimientos circulares
de adentro hacia afuera dentro del círculo previamente marcado.
Esterilice el asa en la llama cada vez que tome un nuevo cultivo y
complete la placa según del dibujo de la figura 1.

Figura 1: Placa de portaobjetos 1, en la que se realizan los 4 frotis de los caldos.

(Andrey Payan G. 2019)

4.1.6.
Tome una

nueva lámina y Repita el procedimiento 4.1.1 a 4.1.4

4.1.7. En un extremo de la placa coloque una gota pequeña con
aproximadamente 50 µL de solución salina sobre el portaobjetos.
(Figura 2)
4.1.8. Con el asa estéril toque una colonia de una bacteria que esté aislada
en una placa de agar (evite tomar del crecimiento confluente, en
donde no se distingue una colonia de otra). Lleve el asa con la
colonia hasta la gota de solución salina puesta en la lámina y frótela
con movimientos circulares de adentro hacia afuera, directamente
sobre el círculo correspondiente en la placa portaobjetos. El
extendido debe quedar delgado.
4.1.9. En el otro lado de la palca haga un frotis de manera circular con la
muestra que ud ha tomado con el escobillón de la parte interna de su
boca. (figura 2)
Figura 2: Placa de portaobjetos 2, en la que se realiza el frotis de colonia y el
hisopado de boca (Andrey Payán G. 2019)

4.1.10.
Deje

ambas placas en un soporte para que se sequen a temperatura

ambiente. No se debe intentar fijar a la llama mientras estén
húmedos, pues el calor altera la estructura de las células y su
posterior tinción.
4.1.11. Una vez secos, fije los frotis, de la siguiente forma: tome la placa con
una pinza y pásela, de canto, rápidamente sobre la llama de un
mechero tres o cuatro veces cuidando que no se caliente demasiado.
4.1.12. Ponga las placas fijadas sobre la gradilla de coloración con el frotis
hacia arriba.

4.2. TINCIÓN DE GRAM MODIFICADA POR HUCKER

4.2.1. Cubra el extendido con cristal violeta. Ponga el colorante con

suavidad sobre la placa, sin salpicar y sin tocar el extendido con el
gotero.
4.2.2. Deje teñir por 30 segundos.
4.2.3. Descarte el cristal violeta. Esto es: levante cuidadosamente la placa
portaobjetos desde el extremo más cercano con una pinza y elimine
el colorante en la bandeja.
4.2.4. Lave con agua a baja presión de una manera suave y cuidadosa para
evitar desprender la preparación; esto se logra no poniendo el chorro
de agua directamente sobre los frotis, sino en la primera parte de la
placa en la que se ha rotulado. Gire el extendido y lave con cuidado
la parte posterior.
4.2.5. Elimine el exceso de agua y con la solución de lugol e inunde la placa
4.2.6. Deje esta solución por un minuto.
4.2.7. Enjuague el lugol con agua corriente de la misma forma que eliminó
el cristal violeta
4.2.8. Incline el portaobjetos para eliminar el exceso de agua y así evitar
diluir los reactivos que se utilizarán a continuación.
4.2.9. Tomar la placa de un extremo con la ayuda de una pinza, en ángulo
de aprox 45° y aplique un chorro de alcohol - acetona encima de la
 placa continuamente por 3-5 segundos
4.2.10. Inmediatamente lave con agua a baja presión y escurra el exceso de
la forma ya descrita
4.2.11. Cubra el extendido con el colorante Safranina y déjelo actuar por al
menos 2 minutos
4.2.12. Lave con agua a baja presión y escurra de la manera ya descrita
4.2.13. Deje secar la placa a temperatura ambiente
4.2.14. Observe al microscopio con aceite de inmersión, Siguiendo las
recomendaciones vistas en el laboratorio de Microscopía
Nota: los tiempos recomendados en la presente guía son el producto de ensayos
múltiples con los reactivos que se poseen en este laboratorio. Estos tiempos pueden
variar de un laboratorio a otro laboratorio dependiendo de la marca, calidad y tiempo
de almacenamiento de los reactivos empleados. Por lo anterior se recomienda que
cada en cada lote de reactivos, cada laboratorio debe estandarizar estos tiempos.

4.3. INTERPRETACIÓN

4.3.1. Observación de Bacterias con objetivo de alto poder (100 X)

4.3.1.1. Examine el extendido bajo el objetivo de inmersión en aceite de un
microscopio. Observe los microorganismos y las características
morfológicas.
4.3.1.2. Aquellas células bacterianas que aparecen azules o violetas son
Gram positivas (Gram +); aquellas con color rosa a rojo son Gram
negativas (Gram -).
4.3.1.3. Observar las formas de las células bacterianas (Cuadro 1) y las
características de éstas (Cuadro 2).
4.3.1.4. Al terminar la observación de cada placa, se debe limpiar el
objetivo del microscopio.
4.3.1.5. Cuando termine:
● Retirela preparación y limpie el aceite que quedó en el objetivo de 100 X con la
ayuda de un trapo o con papel de arroz. Limpie la platina y todas las partes del
microscopio que pudieron quedar con residuos de aceite o de muestra con un
trapo. NO EMPLEE SOLVENTES ABRASIVOS NI ALCOHOLES.
● Envuelva el cable de la manera recomendada por el profesor, cubra el
microscopio.
● Guarde el microscopio en el sitio asignado y reporte si encontró alguna novedad
en el microscopio como por ejemplo una avería o si tenía aceite antes de usarlo
Cuadro 1: Descripción de la morfología básica de las bacterias más comunes.
(Andrey Payan G. 2108)

Terminología usada en la descripción de la morfología bacteriana al Gram.

Morfotipo: una morfología bacteriana compatible con un género en particular, con

muy pocas excepciones dentro de éste. Sin embargo, debe recordarse que no es
posible identificar un género bacteriano solamente con base en la morfología de una
bacteria a la coloración de Gram y para esto se hace necesario hacer pruebas de
identificación. Por esto se debe emplear la palabra “compatible” cuando solo se
emplee el Gram. Por ejemplo: Si yo anoto: “Se observa morfotipo compatible con
Lactobacillus”, quiero decir que observo bacterias con morfología similar al género
Lactobacillus pero que para hacer esta aseveración, me baso sólo en su morfología.
Lo cual debe entenderse que no es una identificación definitiva sino una presuntiva.

Difteroide: morfotipo que se usa para describir bacterias Gram positivas que son
pleomórficas, o irregularmente teñidos o que suelen agruparse en forma de
empalizadas y/o arreglos irregulares o letras chinas (formas de V y L). Denominados
así por su similitud con el Corynebactrium diphterie, algunos autores se refieren a
ellos como corinebacterias o corineiformes, sin embargo la morfología se puede
encontrar en muchos otros géneros bacterianos

Bacteroides: Morfotipo que corresponde a un bacilo Gram negativo muy pleomórfico

(esquizofrénico). El término también describe un género de bacterias anaerobias
(Bacteroides), por esto es importante hacer
distinción cuando se está hablando del morfotipos y del género. Con este morfotipo
pueden observarse bacterias pertenecientes a los géneros: Bacteroides y
Haemophilus entre otros.

Vibrio: el término vibrio usado para definir una forma bacteriana es un término que ha
entrado en desuso y se emplea para describir bacterias bacilares con una sola
curvatura o en forma de coma.

NOTA: para observar la distribución de las bacterias en cadenas, pares, letras chinas,
etc, se debe partir de un caldo o de la muestra; resulta muy poco frecuente observar
la distribución típica de un género bacteriano cuando se parte de un cultivo sólido.

Cuadro 2. Características y terminología usada en la descripción de las Formas

Bacterianas

Características
de bacterias Descripciones comunes
teñidas con
Gram
Características Homogénea, bipolar, moteado, punteado,
de la tinción irregular
Formas Redondo, cocoide, cocobacilar,
predominantes bacilares,
filamentosas, levaduriformes.
Extremos de las Redondeados, agudos, rectos, hinchados,
células cóncavos
bacterianasa
Lados Paralelos, ovoides, cóncavos, irregulares
eje Rectos, curvos, espirales
pleomórficos Variaciones en formas
Tamaño relativob
General Diminutos (<0.3 µm), pequeños (0.3-0.5
µm), medio o grande (1 o
>1 µm)
Largo Cortos (0.5-1 µm), medio, largo o
filamentosos (10-30 µm)
Ancho Elongados, medianos, gruesos
Pleomórficos Variación en tamaño
Arreglos Solos, en pares, cadenas, tétradas,
característicos grupos, racimos, empalizadas, letras
 chinas, paquetes, formas angulares
(formas V y L), entre otras.
Adaptado por Andrey Payan G, a partir de: García, Lynne Shore. Clinical Microbiology
Procedures Handbook (v1). 3 ed. 2011.
a
La hinchazón de los extremos puede sugerir la presencia de esporas, pero puede ser
también debido a la presencia de vacuolas, inclusiones, pleomorfismo marcado o
tinción irregular. La microscopía de contraste de fase o la tinción de esporas pueden
ser útiles en la observación de endosporas.
b
Los tamaños mencionados son solo guías. El tamaño promedio de un eritrocito es 7
µm, y los gránulos citoplásmicos en los neutrófilos tiene un tamaño promedio de 0.2 a
0.3 µm.
4.4. Observación de Células con Objetivo de bajo poder (10 X)
En especímenes biológicos examine la presencia de Células epiteliales (CE),
Leucocitos Polimorfonucleares (PMN).

4.4.1. Reporte de resultado de placas coloreadas a partir de

especímenes clínicos

La tinción de Gram no es la mejor tinción para describir la morfología de las células

del huésped, y por esta razón principalmente se enumeran las células epiteliales y los
leucocitos (tales como polimorfonucleares). Si esto últimos son abundantes, se
determina que la muestra es purulenta y se toma como indicador de inflamación
aguda. Para otros tipos de células solo se informan tal cual, es decir, como “otras
células”. Adicionalmente, cabe anotar que no hay razón clínica útil para reportar
células que estén presentes en cantidades <10/40 campos de una tinción de Gram
observada en campo de bajo poder (CBP) (objetivo 10 X) 1
Se debe determinar el número de células y bacterias en 20-40 campos usando lentes
de 18-22 mm de campo de visión. Ignorar los campos en los cuales no hay células ni
bacterias y no promediar estos campos en el recuento con los campos en donde si
hay células y /o bacterias

El esquema que se muestra en el cuadro 3, es recomendado para obtener un dato

numérico que permite obtener un resultado reproducible de la lectura de la cantidad
de bacterias y células en una placa portaobjetos coloreada con Gram.

Cuadro 3. Como reportar los resultados del Gram

1
García, Lynne Shore. Clinical Microbiology Procedures Handbook (v1). 3 ed.
2011
5. CUADROS DE RESULTADOS
5.1. Complete la siguiente tabla con los cultivos y placas empleadas
en el laboratorio

Microorganis Staphylo Prot Bacil Acineto

mo coccus eu lus bacter
spp s spp spp
sp
p
A. Dibuje las Ejemplo:
formas de las
bacterias
coloreadas
con Gram a
partir del
cultivo líquido2
B. Haga la

descripción
microscópica

6. AMPLIACIÓN DE TEMA
1. VE a el video de coloración de Gram de Amrita university:
https://youtu.be/vlnIDGmgQfk
2. Haga un dibujo de lo que sucede durante cada etapa de la coloración
de Gram de Hucker en una bacteria Gram positiva y una Gram
negativa.
3. Mencione diferencias entre las coloraciones de Hucker y la de
Kopeloff en cuanto tiempos y reactivos.
4. Averigüe cuál es la sensibilidad del Gram como método diagnóstico
cuando se aplica a muestras clínicas.
5. Investigue y cree una ficha técnica de cada uno de los reactivos que
se utilizarán en la práctica.

La ficha debe contener al menos la siguiente información:

- Composición del reactivo
- Toxicidad en la manipulación y para el medio ambiente
- Acciones en caso de accidente
- Conservación y Almacenamiento

2
Para este propósito: haga un dibujo a mano alzada en una hoja, empleando los colores
correspondientes, luego tome una foto e insértela en el espacio de la tabla. Asegúrese de tomar la
foto con buena luz y que sea en una resolución baja pero clara (p ej: 4,7 mp. 2160 X 2160)
7. RECOMENDACIONES PARA LA PRESENTACIÓN DEL INFORME

● Emplee esta misma guía para entregarlo, utilice hojas adicionales de ser necesario
● Debe ser una redacción propia, (evite el corte y pegue).
● Debe seguir las normas ICONTEC en cuanto a uso de tipo de letra, numeración de
apartados, interlineado y márgenes (No agregue portada ni otros folios de ese tipo)
● Cada informe debe tener como mínimo dos referencias Las citaciones deben hacerse en
normas Vancouver.