PRÁCTICA

BIOENSAYOS PARA LA DETECCIÓN DE NEMATODOS

INTRODUCCIÒN

Para obtener productos de calidad, es necesario conocer la sanidad del suelo y de las
semillas respeto a la presencia de nemátodos. Una forma sencilla y económica es el
bioensayo, mediante el método de la bolsa cerrada.
Este método de diagnóstico permitirá al interesado obtener resultados tanto de la muestra
de suelo como en semillas , en 30 días, sin necesidad de acudir a un laboratorio
especializado.

OBJETIVO

• Reconocer la presencia de nematodos en suelo y en las semillas

MATERIAL DE PRÀCTICA

A. Biológico:
• Semilla o brote de papa (Solanum tuberosum)
B. De Laboratorio:
• 1,5 Kg muestra de suelo problema
• 1000 ml agua destilada
• 12 bolsas de polietileno
• 01 estufa

PROCEDIMIENTO

A. Utilizando plantas de papa (Solanum tuberosum)

1. Mezcla 1.5 kg de la muestra problema de suelo de manera homogénea
2. Tomar tres submuestras de 400 g cada una.
3. Colocar 200 g de suelo en una bolsa de polietileno y agregarle 50 ml de agua
de grifo, suficiente, para llevarla a capacidad de campo.
4. Sembrar una semilla o brote de papa de una variedad susceptible a nemátodos
5. Agregar los 200 g de suelo restante y añadir agua hasta dejar el suelo en
capacidad de campo.
6. Cerrar la bolsa y llevarla a incubación a 25º C por 30 días.
7. Observar a través del plástico la presencia de nódulos radicales, cerciorándose
luego mediante un análisis visual.

B. MUESTRA DE RAICES y SUELOS

Las muestras se toman de hoyos rectangulares de 40cm de largo y 60 cm de profundidad,
se recolectan tres muestras de 100 g de las raíces funcionales y 100 g de suelo.
Se depositan en bolsas plásticas transparentes debidamente rotuladas

1. EXTRACCIÓN DE NEMATODOS TÉCNICA FLOTACIÓN EN AZÚCAR

1.1. Lavar las raíces con agua corriente
1.2. Pesar 30 g. y cortar en pedazos
1.3. Licuar por 30 segundos en 500 ml de agua
 1.4. Solución de licuado depositarlo en tamiz de 250 um colocado a su vez sobre tamiz
de 25 um
1.5. Lavar la muestra con agua a presión para desprender nematodos de raíces
1.6. Material remanente de tamiz 25 um llevarlo a centrifugar
1.7. Centrifugar a 3800 rpm durante 5 minutos
1.8. Se elimina el sobrenadante y se adiciona sacarosa al 50% para repetir la
centrifugación.
1.9. Los nematodos flotantes en la solución de sacarosa se depositan en tamiz de 25
um
1.10. Lavar la sacarosa con agua a baja presión
1.11. Tomar 20 ml de agua con mematodos en una placa Petri
1.12. La extracción de nematodos del suelo se hace de la misma manera, excepto el
licuado.
1.13. Las muestras obtenidas son transferidas a placas Petri que contienen 36
cuadrantes de 6 x 6 cm y se extrapola en base a una muestra de 100 g de suelo y
100g de raíces
1.14. Se selecciona al azar tres cuadrantes y se cuantifica el número de nemátodos
en cada uno de ellos con uso de microscopio estereoscopio.

2. EXTRACCIÓN DE HUEVOS DE MELOIDOGYNE

Meloidogyne no forma quistes sino nódulos y deposita sus huevos en una masa
gelatinosa ubicada en la parte posterior de su cuerpo.
Se ha descubierto que la lejía o hipoclorito de sodio diluye la masa que cubre a los huevos,
por lo cual se debe tener cuidado con el tiempo de exposición que no debe ser mayor de
4 minutos para evitar su desintegración completa.
Se recomienda usar :

- Solución de lejía al 0.5% : Cuando se quiere obtener nemátodos vivos

- Solución de lejía al 1%: Cuando se quiere obtener nemátodos muertos, útil para el
conteo.
Para la obtención de los huevos se procede de la siguiente manera:
a. Colocar en un vaso cerrado 5 gr. de raíces más solución de lejía al 0.5% en cantidad
suficiente que cubra a todo el tejido vegetal luego proceder a taparlo y agitarlo por tres
minutos.
b. Luego se disponen dos tamices de 180 y 38 u de arriba hacia abajo respectivamente.
se vierten las raíces lavadas con lejía y se procede a lavarlas con abundante agua.
c. Seguidamente los huevos retenidos en el tamiz de 38 u se juntan a un lado con el agua
de la pizeta y se vacea a un vaso, se lleva a una solución de 100 ml, se homogeniza la
solución con el burbujeador y se saca a placas petri dos alicuotas de 10 ml. cada una.
d. Finalmente se procede al conteo con la ayuda del contómetro, y se determina el número
de huevos por planta y el número de huevos por gramo de raíz.

MÉTODO DE FUCSINA ÁCIDA – LACTOFENOL (nematodo en tejido vegetal)

Materiales:
• Raíces infectadas libres de suelo
• Lactofenol puro
• Fenol líquido 94 ml
• Acido láctico 63 ml
• Glicerina 160 ml
• Agua destilada 100 ml
• Fucsina ácida al 0.1% del lactofenol
Procedimiento:
1° Lave cuidadosamente las raíces sumergidas en agua para quitar el suelo.
2° La tinción se puede hacer caliente o fría. Primero podría tratarse la tinción fría para lo cual el
material vegetal se transfiere a fucsina ácida lactofenol al 0.1 %. Sedeja allí 12 ó 24 horas
dependiendo del grosor del material vegetal. Si no se obtienen buenos resultados con la tinción
fría se puede tratar con la tinción caliente, para lo cual se sumerge el material vegetal en fucsina
ácida lactofenol 0.1% caliente (80°C o más dependiendo del grosor del material vegetal).
3° Después de la tinción fría transfiera el material teñido directamente a lactofenol puro para
clarificar el tejido vegetal. Después de la tinción fría caliente el material vegetal teñido a un
recipiente conteniendo agua y lávelo con agua en circulación para eliminar el exceso de tinte.
Transfiera el material vegetal teñido a lactofenol puro para clarificar el tejido vegetal.
4° Después de algún tiempo que puede ser 3 días o un mes, el material estará listo
para su observación. Los nematodos que estarán teñidos pueden ser vistos dentro
del tejido vegetal.
5° Los nematodos teñidos pueden ser montados en porciones de tejido vegetal en lactofenol
puro o pueden ser disecados del material vegetal y montados en lactofenol puro, pero los porta
objetos deben llevar un anillo de parafina, glicel o esmalte de uñas para sostener el cubre- objeto.
El cubre-objeto se coloca sobre este anillo y así no se aplasta los nematodos.
6° Las partes del cubre - objeto que van a ser sellados límpielas con un hisopo
pequeño de algodón humedecido en etanol de 100 %. Fije el cubre -objeto con tres
gotas pequeñas de glicel o esmalte de uñas, mediante un pincel de pintar. Después
de 24 horas vuelva a aplicar glicel a todo el contorno del cubre-objeto.
7° Anotar en el montaje permanente:
• El nombre específico del nematodo.
• El número, sexo o estado del nematodo.
• El método de montaje.
• Lugar del que se extrajeron los nematodos (suelo y el cultivo).
• Número de slides en su colección.
• Iniciales del nombre de la persona que realiza el montaje.
• La fecha del montaje.

PROCESO DE MUERTE, FIJACIÓN Y MONTAJE DE

NEMÁTODOS
1. MUERTE
1° Colectar los nematodos en una gota de agua sobre una luna de reloj.
2° Coloque en un tubo de vidrio cerrado, una mezcla de formalina y ácido propiónico en la
proporción 4:1 y caliente a Baño María (90º C). En otro tubo tenga formalina al 4%. En lugar del
ácido propiónico puede usar ácido acético (80º C).
3° Agregue a la luna de reloj que contiene la gota de agua con los nemátodos, 5 cc de FP 4:1,
caliente a 90 ºC e inmediatamente agregue 50 cc de formalina al 4%.
2. FIJACIÓN
Después de matar los nematodos, transfiéralos a una placa de fijación con formalina al 4%. Tape
la placa con una laminilla cubreobjeto y guárdela en una placa petri conteniendo en el fondo,
papel filtro humedecido en formalina al 4%. Mantenga los nematodos en este lugar por 10 a 15
días. Después de matar el protoplasma sin causar distorsión, los diferentes tejidos deben ser
deshidratados y endurecidos para que los nematodos puedan ser montados. La deshidratación
se realiza con la finalidad de facilitar la penetración de la glicerina, no soluble en agua, dentro de
los tejidos del nematodo, esto se consigue mediante los siguientes pasos:
1° Transfiera los nematodos de la placa de fijación con formalina al 4%, a otra placa de fijación
conteniendo la solución SEINHORST I:
Solución Seinhorst I:
• Etanol al 96%, 26 partes
• Glicerina, 1 parte
• Agua destilada, 73 partes
2° Tape la placa de fijación con una laminilla cubreobjeto y colóquela en un vaso conteniendo
exceso de etanol de 0.6% (mas o menos la mitad del vaso). Cierre herméticamente el vaso y
deposítelo en una incubadora a 35 - 40º C por 16 horas.
3° Al cabo de 16 horas con una micropipeta, saque la solución de la placa de fijación, chequeando
bajo el estereoscopio que los nemátodos no sean sacados y llénela con la solución Seinhorst II.
Solución Seinhorst II:
• Glicerina deshidratada, 7 partes
• Etanol 96%, 93 partes
4° Tape la placa de fijación con un cubre objeto y colóquela en una placa petri.
Guarde la placa petri en una incubadora a 30 - 40 º C. Después de 3 horas agregue a la placa
de fijación una gota de glicerina deshidratada tápela con la laminilla cubreobjeto y déjela en la
incubadora a 35 - 40ºC.
5° Al día siguiente retire la laminilla cubreobjeto y después de 4 a 5 horas, coloque la placa de
fijación en un desecador con CaCl2 o sílica gel por 4-5 días.
3. MONTAJE
1° Transfiera los nematodos procesados a glicerina deshidratada.
2° Limpie el cubre y portaobjeto con etanol al 96%. Coloque una gota de glicerina deshidratada
sobre el portaobjeto.
3° Coloque los nematodos a montar en el centro de la gota de glicerina y en posición radial a la
gota tres fibras de vidrio de diámetro similar al de los nematodos. Deposite suavemente una
laminilla cubreobjetos tibia para que no quede burbujas de aire. El cubre-objetos queda sobre las
fibras de vidrio las que impiden que los nematodos sean presionados por el cubreobjeto.
4° Si la gota no llena el cubreobjeto, se puede añadir glicerina deshidratada. Si lo sobrepasa
retire el exceso con pedazos de papel filtro.
5° Las partes del porta y cubreobjetos que van a ser sellados límpielas con un hisopo de algodón
humedecido en etanol al 100%. Fije el cubreobjeto con tres gotas de glicel aplicados en tres
puntos distintos. Después de 5 minutos selle completamente con glicel mediante un pincel.
Después de 24 horas vuelva aplicar glicel en el contorno.
6° Rotule en el montaje permanente:
• Nombre específico del nematodo.
• Número y sexo.
• El método de montaje.
• Lugar del que se extrajeron los nematodos (suelo y cultivo).
• Número de slide en su colección.
• Iniciales de la persona que realiza el montaje.
 CUESTIONARIO

Con la lectura de la bibliografía obligatoria conteste las preguntas siguientes:

1) Cuáles son las características morfológicas que definen a cualquier nematodo

fitoparásito.
Los nematodos están definidos como animales filiformes con cuerpo sin segmentos y
cubiertos de una cutícula hialina, marcada por estrías u otras marcas. La mayoría de
ellos son microscópicos y miden entre 300 y 1000 μm de largo y entre 15 y 35 μm de
ancho.

2) ¿ Como se reproducen?
La reproducción se efectúa por medio de huevecillos y puede ser sexual, hermafrodita o
partenogenica, lo anterior puesto que en muchas especies faltan los machos (Agrios,
2005).

3) ¿Qué tipos de aparato bucal pueden presentar?

También es llamado estoma, consiste en un tubo cóncavo.

4) Defina nematodo endoparástico, ectoparásito, migratorio y sedentario.

Endoparásito: Son aquellos que pasan parte o todo su ciclo de vida en el interior del
tejido vegetal y se alimentan de él.

Ectoparásito: Son los que se pueden encontrar alimentándose de los tejidos radiculares,
pero que no penetran en la raíz, se encuentran en su mayoría en el suelo, por lo que son
los más afectados por los nematicidas.

Migratorio: Retienen su movilidad, no están fijos en un sitio, migran de dentro a fuera,

por lo que podemos encontrarlos igualmente en las raíces que en el suelo.

Sedentario: Son aquellos que se alimentan del interior de las raíces y pasan allí su ciclo
de vida, con la masa de huevos incluida.

5) Explique el ciclo biológico de Meloidogyne sp.

El ciclo biológico se inicia con un huevo, dentro del cual se desarrolla el juvenil de primer
estado (J1). La primera muda ocurre dentro del huevo y es el segundo estado juvenil
(J2), conocido como estado infestivo, el que sale en búsqueda de una raíz a la que
ingresa por la zona apical no diferenciada. Una vez dentro de ella se mueve
intercelularmente hasta establecer un sitio de alimentación en las cercanías del cilindro
vascular.

En este sitio induce la formación de células gigantes multinucleadas y altamente

especializadas. Alrededor de estos sitios de alimentación se produce hipertrofia e
hiperplasia celular lo que origina la agalla o nódulo radicular característico. Luego de
sucesivas mudas se desarrolla la hembra globosa que puede ovipositar cientos de
huevos en una masa gelatinosa. Los machos abandonan la raíz.

6) ¿Cuáles son los daños que producen los nematodos en general a la agricultura?

El proceso de alimentación causa una reacción en la células de las plantas afectadas,

resultando en la muerte o debilitamiento de los extremos de las raíces y yemas,
formación de lesiones y rompimiento de tejidos, abultamientos, agallas, arrugamiento
y deformación en tallos y hojas. Algunas de estas manifestaciones son causadas por la
descomposición del tejido afectado por las enzimas del nematodo, la cual, con o sin la
ayuda de metabolitos tóxicos, causa desintegración del tejido y muerte de las células
(Arauz, 1998). Otros síntomas son causados por alargamiento anormal de la célula
 (hipertrofia), por supresión de la división celular, o por la estimulación de proceso de
división celular de una manera controlada y que resulta en la formación de agallas
(hiperplasia) o de un gran número de raíces laterales en o cerca de los sitios de
infección.
Los síndromes de las enfermedades de las plantas producidas por los nematodos son
complejos. Las especies que se alimentan de la raíz posiblemente disminuyen la
capacidad de las plantas de absorber agua y nutrientes del suelo y dé ésta manera
producen síntomas de deficiencia de agua y nutrientes en los órganos aéreos de ellas.
En algunos casos, son las interacciones bioquímicas entre la planta y el nematodo las
que afectan negativamente la fisiología total de las plantas y la función de los
nematodos de proporcionar los puntos de entrada para otros patógenos, a lo que se
deben principalmente los daños que sufren las plantas; los daños mecánicos o la
obtención del alimento de las plantas por los nematodos es, en general, menos
importante, pero puede adquirir importancia cuando las poblaciones de estos
fitopatógenos son muy grandes (Talavera, 2003).

7) Enumere las características taxonómicas que se usan para clasificar los

nematodos.
Es conveniente hablar ahora acerca de los órganos o estructuras que se tienen en cuenta
en la clasificación de los nemátodos. Alien y Sher mencionan al menos seis que son:
- Cutícula
- Estilete
- El corpus
- El sistema reproductor femenino
- Los caracteres masculinos
- Mediciones

8) ¿A qué Orden pertenecen los nematodos transmisores de virus?

Al orden Dorylaimida

9) ¿ Todos los integrantes de ese Orden tienen esa característica?

Si, todos poseen la capacidad de transmitir virus.

10) ¿En cuales órganos de las plantas producen síntomas los nematodos?

En las raíces, yemas, tallos y hojas.

11) ¿Cómo está constituído el inóculo?

Está constituido por microorganismos o células capaces de garantizar la infección del

virus en el huésped.

12) Enumere las vías de diseminación y analice la distancia a la que pueden llegar.

La principal vía de diseminación, es mediante el uso de tubérculo papa infestada usada

como semilla. Otras formas, son por movimiento de suelo contaminado adherido a
maquinarias, implementos agrícolas, vehículos, sacos, animales y botas, entre otros.

13) ¿De qué modo sobreviven y dónde?

Los nemátodos quísticos sobreviven a la estación sin cultivo como huevos dentro de los
quistes, Los exudados radiculares de sus plantas hospedadoras estimulan la eclosión
de los huevos, los juveniles migran en el suelo hasta las raíces donde generan sitios de
alimentación y comienzan a engordar, hasta llegar a adultos.
14) ¿Cómo influyen los factores ambientales en el desarrollo de estas enfermedades?

El desarrollo de los nematodos en el suelo está influenciado por suelo impropiamente

tratado por la humedad, la aireación y temperatura del mismo, plantas en contacto con
la tierra y material de propagación vegetativa infectado.

15) En el caso de dos chacras contiguas donde uno de los productores tiene
problemas de Meloidogyne sp. En su invernáculo: ¿qué cirterios de manejo
tomaría en cuenta para evitar el problema en sus plantaciones?
Es conveniente evitar la contaminación de lotes mediante la limpieza de máquinas e
implementos con partículas de suelo adheridas a los neumáticos, herramientas y
zapatos, y el uso de semillas procesadas sin partículas del suelo ya que se pueden
propagar nematodos a zonas limpias.

El uso de fuertes chorros de agua para desinfectar es eficaz para prevenir la propagación
de estos organismos.

Además, utilizar -si es necesario- plántulas libre de nematodos y evitar plantar en

ocasiones de altas temperaturas y las precipitaciones.

17) Explique los criterios de manejo que propondría a un productor en un campo

recién adquirido para evitar y/o reducir la aparición de agallas en un cultivo de
tomate.

Usar en las nuevas plantaciones material vegetal sano, procedente de viveros

autorizados y preferentemente certificado, y rechazar las partidas que presente
síntomas. En plantaciones, eliminar plantas con síntomas y si no es posible, podar
desinfectando los útiles entre árboles y realizar en último lugar la poda de las plantas
afectadas.

Evitar labores que puedan producir heridas en el cuello de las plantas. No replantar
en el mismo lugar con peral, manzano u otras especies sensibles a la enfermedad.