Actividades Previas. Práctica 1.

1. Conceptos teóricos requeridos para realizar la práctica.

Explique de forma breve los siguientes conceptos y en cada caso explique la relación de cada
concepto respecto a la práctica de laboratorio que se va a realizar.

 Concentración.
La concentración se refiere a la cantidad de soluto que se encuentra disuelta en una solución, entre
mayor sea la cantidad de soluto más concentrada será la solución. La concentración de células
microscópicas se trata de la cantidad presente en una suspensión que contiene microorganismos. Es
necesario conocer la concentración de una muestra problema, ya que permite revelar el progreso de
un bio-proceso.

 Biomasa.
Se trata de materia orgánica generada en un proceso bioquímico y es utilizable como fuente de
energía. En la práctica se conoce a la biomasa a la masa de microorganismos presentes en la
muestra, que será analizada para calcular la proporción de levaduras en la misma.

 Densidad óptica.
La densidad óptica es una magnitud física que mide la absorción de un elemento óptico por una
unidad de distancia, para una longitud de onda dada. Es un concepto fundamental del
funcionamiento del espectrofotómetro, referente a la cantidad de luz “absorbida” o que no atraviesa
una solución problema con microorganismos de cierto tamaño.

 Peso seco.
Es la parte de un material o muestra resultante de una extracción total de agua. Este concepto se
utiliza en la práctica para poder pesar una muestra de levaduras a la cual se le extrajo toda el agua,
teniendo como resultante un filtro que solo contiene levaduras, y que al ser pesado permite la
medición cuantitativa de la concentración de células en una muestra problema.

 Ley de Lambert-Beer
La Ley de Lambert-Beer establece que: La intensidad de un haz de luz monocromática, que incide
perpendicularmente sobre una muestra, decrece exponencialmente con la concentración de la
muestra. Es decir, establece que la absorbancia está directamente relacionada con las propiedades
del analito, la concentración y la longitud de la trayectoria del haz al atravesar la muestra.

 Regresión lineal.
Es un modelo matemático utilizado para aproximar la relación entre una variable de respuesta
continua como una función de varias variables predictoras. Permite analizar datos experimentales.
En la práctica se utilizará como variable de respuesta a la concentración de la muestra de levaduras,
mientras que las distintas absorbancias obtenidas serán utilizadas para realizar el modelo de
regresión lineal.
  Coeficiente de correlación.
Es una medida para cuantificar la dependencia lineal entre dos variables distintas. En la práctica
permite establecer la validez de los datos obtenidos, un coeficiente de correlación cercano a 1
demuestra la dependencia y relación entre los distintos datos obtenidos.
2. Conocimiento del equipo que se utilizará en la práctica.
Explique el fundamento del funcionamiento, las partes, los pasos para su uso, sus cuidados y cómo
serán usados en la práctica los siguientes equipos.

 Espectrofotómetro
El espectrofotómetro es un instrumento de laboratorio que permite proyectar un haz de luz a una
longitud de onda seleccionada a través de una solución (muestra), y posteriormente medir la
cantidad de luz que es absorbida por dicha muestra.
Se divide en 4 componentes principales, fuente de luz (lámpara de wolframio, lámpara de arco de
xenón, etc.), monocromador (prisma que aísla las radiaciones de longitud de onda para obtener una
luz monocromática), compartimiento de muestra (lugar donde se lleva a cabo la interacción de la
muestra y donde se aplica la ley de Lambert-Beer), detector o lector (detecta la radiación y permite
una lectura de los datos obtenidos).

Para el uso general del espectrofotómetro se requiere insertar la longitud de onda que emitirá el
espectrofotómetro que será requerida para llevar a cabo la interacción con la muestra problema, se
coloca el blanco solución sin el analito para establecer un punto inicial para medir las absorbancias,
se colocan las distintas soluciones a distintas concentraciones de las muestras y se miden las
absorbancias una por una.
El espectrofotómetro es un instrumento sensible por lo que se debe tener cuidado con el instrumento
para evitar descalibrarlo. Las celdas se utilizan por el lado que no es opaco para que por este mismo
el haz de luz atraviese la muestra, aunado a esto las celdas requieren estar limpias para evitar
interferencias con los resultados.
Para la práctica son necesarias las muestras preparadas a distintas concentraciones del analito, se
coloca agua como blanco y se colocarán las muestras en las celdas con distintas cantidades de
levadura.

 Secador por convección

Un instrumento que con ayuda de aire y energía térmica permite secar el material y eliminar la
humedad contenida.
Se divide en recinto, sistema de calefacción: calorifugado, donde se realiza la evaporación.
Debido a las temperaturas variables que puede alcanzar un secador es importante poner atención
para evitar quemaduras.
Se colocarán los micro-filtros en el secador durante 4 horas para lograr eliminar toda la humedad
del micro-filtro.

 Microfiltro de jeringa
Un microfiltro es un instrumento para el filtrado de organismos microscópicos, se divide en pre-
filtros con poros de 10, 1 y 0.7 micras, además de un medio filtrante de 0.20 o 0.45 mm.
Se coloca el microfiltro de 0.22-70 micras en la jeringa y se presiona con cuidado para evitar una
fractura del filtro, comprobando que el líquido resultante sea transparente.
3. Conocimiento de los pasos requeridos de la práctica
 Elabore una tabla en la que explique la razón de ser de cada uno de los pasos de la práctica.

Paso 1 Se ponen a secar los filtros horas antes de realizar la práctica para evitar algún tipo de
error por residuos contenidos en los filtros
Paso 2 Se colocan para que se enfríen a temperatura ambiente y eviten el daño de las
levaduras de la muestra
Paso 3 Se toma la muestra de 1 mL y se dispersa para asegurar una mezcla uniforme de la
muestra
Paso 4 Se presiona el embolo con cuidado para evitar ruptura del filtro y se verifica la
transparencia del líquido resultante para confirmar
Paso 5 Se sacude ligeramente y se coloca en el secador para eliminar restos de agua
Paso 6 Se saca el filtro del secador con unas pinzas para evitar quemaduras
Paso 7 Se pesa el filtro para obtener la cantidad de biomasa
Paso 8 Se necesita calcular la biomasa para obtener el peso seco
Paso 9 Se agitan las suspensiones originales para tener una mezcla uniforme y se colocan en
el espectrofotómetro a 600 nm para calcular la absorbancia usando agua como blanco
Paso 10 Se grafican los datos para obtener una gráfica de regresión lineal que explique las
concentraciones de las muestras
Paso 11 La muestra problema será analizada con el fin de obtener la concentración
desconocida utilizando las gráficas previamente realizadas.
 Diagrama de flujo. Práctica 1. Determinación de la concentración celular.
 4. Conocimiento de los riesgos involucrados
El manejo del secador por convección debe realizarse con precaución y el uso de pinzas para evitar
dañar el equipo y causar lesiones como quemaduras a los alumnos.
El manejo del espectrofotómetro debe realizarse con cuidado porque es un instrumento sensible que
puede descalibrarse con relativa facilidad, por lo que debe tratarse con cuidado y evitando golpear
la mesa sobre la cual está instalado.
5. Reconocimiento de fuentes de interferencia
Las soluciones iniciales con distintas concentraciones de levadura deben ser realizadas con
precisión para evitar errores por masa o volúmenes mal medidos.
La presión aplicada al émbolo debe ser con precaución para evitar fracturas y por ende perdida de
las levaduras a través del filtro.
Se debe maniobrar el microfiltro con pinzas para evitar la contaminación de los filtros por contacto
directo con las manos.
Deben limpiarse bien las celdas para permitir la interacción del haz de luz.
Debe colocarse la celda correctamente por el lado que no es opaco para permitir que el haz de luz
atraviese la celda.
6. Conocimiento de los resultados esperados para compararlos.

(Camacho & Sáenz, 2010) (Nevarez et al, 2010)

Camacho, L. N., & Sáenz, R. T. (2010). Implementación de diferentes técnicas analíticas para la
determinación de biomasa bacteriana de cepas Pseudomonas putida biodegradadoras de fenol.
Revista Ion, 23(1), 41-46.
Nevarez-Álvarez, L. F., Noriega-Rodríguez, J. A., & Vargas-Lópezb, J. M. 2016. Cinética de
crecimiento del cultivo de la microalga Chaetocero muelleri en un fotobiorreactor semi-estático.
Actividades Previas. Práctica 2.
1. Conceptos teóricos requeridos para realizar la práctica
 Morfología y metabolismo
La bacteria S. thermopfilus, es una bacteria termoresistente es capaz de fermentar lactosa, sacarosa,
glucosa y en algunos casos galactosa. Crece en medios con temperatura de 50 °C a 52 °C, S.
thermopfilus produce una enzima activa (lipasa) a tributirina que lleva a cabo la oxidación de los
ácidos grasos (lipólisis) de la grasa de la leche. Mientras que, L. bulgaricus, fermenta azucares
como lactosa, glucosa, fructosa, en algunos casos como galactosa o manosa, produciendo ácido
láctico. Crece a temperaturas de 48-50 °C.

 Detallar la simbiosis bioquímica entre ambos organismos y su importancia para la práctica

Está documentada la interacción positiva entre ambos microorganismos (simbiosis facultativa). L.
bulgaricus degrada caseína por medio de proteasas, otorgando aminoácidos y péptidos asimilables
por S.thermophilus, por otro lado S. thermophilus libera CO2 y ácido fórmico en cantidades
suficientes que estimulan el crecimiento de L. bulgaricus.

 Estructura de caseínas α, ß, k y el efecto del pH en ellas.

La caseína α es la mayoritaria en la leche de vaca. Desde el punto de vista estructural, está formada
por tres regiones hidrofóbicas, con dos de ellas situadas en los extremos y una zona muy polar, en la
que se encuentran todos los grupos fosfato menos uno, lo que le da una carga neta negativa muy
importante al pH de 6.6 de la leche.
La caseína ß es la caseína más hidrofóbica, y presenta además estructura particular, con una clara
división en dos zonas. La que corresponde al extremo C-terminal es particularmente hidrofóbica,
mientras que los aminoácidos más hidrofílicos, y todos los grupos fosfato unidos a serinas, se
concentran en el extremo N-terminal.
La caseína κ tiene una estructura claramente distinta de la de las otras caseínas. En primer lugar, es
algo más pequeña. Además, está muy poco fosforilada, teniendo solamente un grupo de fosfato.
Esto hace que interaccione con el ión calcio mucho menos que las otras caseínas.
Cuando se añade ácido a la leche, los grupos fosfato de la caseína se protonan y la proteína neutra
precipita, la caseína tiene una baja solubilidad con pH alcalino de 4.6.

 Características de calidad del producto según las normas oficiales.

De acuerdo con la NOM-181-SCFI/SAGARPA-2018 debe contener los siguientes parámetros de
calidad.
Parámetros microbiológicos: establece la denominación, las especificaciones fisicoquímicas,
microbiológicas, y la información comercial que debe cumplir el producto denominado yogurt, así
como los métodos de prueba que deben aplicarse para comprobar dichas especificaciones. En él se
explica que las especies deben que usar para yogurt son S. thermophilus, L. bulgaricus, algunas
subespecies bitrodobacterium y otros lactobacillus. La NMX-F_444-1983, establece que el yogur
no debe contener microorganismos patógenos, toxinas, ni inhibidores microbianos. La leche se ve
afectada significativamente por el tratamiento térmico afectando a la discapacidad y producción de
acetaldehído. Adicionar leche descremada en polvo mejora la textura y previene la generación de
suero.
  Pruebas sensoriales y requerimientos escala hedónica.
Parámetros sensoriales: El yogurt debe presentar un olor color y sabor agradable un poco ácido
debe tener consistencia firme o batida con viscosidad y características del yogurt.
La escala hedónica es una prueba bipolar en donde el consumidor expresa su opinión subjetiva del
producto, en una escala desde disgusto hasta aceptación, para ello se utilizan equivalentes
numéricos para volverlo una ciencia cuantitativa sujeta a análisis estadísticos. La aceptación del
producto se basa en las características sensoriales, como olor, color, sabor, dulzor, textura y
apariencia del producto.
2. Conocimiento del equipo que se utilizará en la práctica
 Potenciómetro
El potenciómetro es un instrumento sensorial que se usa para medir el pH de una disolución. El pH-
metro mide la actividad de los iones hidrogeno en soluciones acuosas, indicando la acidez o
alcalinidad del medio. Para su uso general debe sumergirse el electrodo en agua destilada para
lograr su calibración cuando la pantalla indique un pH 7 es decir neutro. El instrumento consiste en
tres partes principales, sonda de pH, electrodo de pH de referencia y medidor de entrada de alta
impedancia.
Para la práctica debe limpiarse antes de ser utilizado, se recolecta un poco de la muestra del yogurt
y se coloca en un vaso de precipitado, se mide el pH de la mezcla sumergiendo el sensor del
potenciómetro en el vaso de precipitados con yogurt, esta prueba se realiza varias veces a lo largo
del día para calcular el pH a distintos tiempos.

 Incubadora eléctrica con termostato.

Una incubadora es un instrumento para mantener cultivos microbiológicos, cuentan con un sistema
de calefacción para mantener a los microorganismos a una temperatura ideal estable. La incubadora
cuenta con un termómetro en su interior para monitorear la estabilidad de la temperatura a lo largo
del tiempo.
Durante la práctica se utilizará para incubación para la elaboración del yogurt, el recipiente debe
mantenerse quieto debido a que las bacterias fermentadoras llevan a cabo el proceso en condiciones
de anaerobiosis.
3. Conocimiento de los pasos requeridos
 Elabore una tabla en la que explique la razón de ser de cada uno de los pasos de la práctica.

Paso 1 Se seleccionan tres cepas de orígenes distintos para poder evaluar cuales tienen mejor
rendimiento con respecto entre sí
Paso 2 Se debe preparar con antelación un inoculo para que pueda ser utilizado para la
fermentación del yogurt durante la práctica
Paso 3 Se debe lograr mantener la temperatura de la incubadora a 43°C para evitar errores en
el desarrollo por falta de crecimiento a una temperatura no óptima
Paso 4 Se coloca la leche, el azúcar y la leche en polvo en el recipiente para iniciar la
integración de los componentes
Paso 5 Se calientan 500 mL a 43°C (temperatura óptima para el crecimiento) y se reparten
para evaluar su rendimiento.
Paso 6 En cada frasco se inoculan 10% de peso de inoculo y se mezcla lentamente para evitar
introducir aire a la mezcla
Paso 7 Se colocan los frascos a la temperatura óptima de 43°C y se introducen a la
incubadora
Paso 8 Se utiliza una cuchara limpia y desinfectada para registrar el pH inicial de la leche
Paso 9 Incubar por 4 h tomando muestras cada 30 min después de 2 horas
Paso 10 Cuando el pH alcance los 4.2 se extrae y se guarda en refrigeración para detener la
fermentación
Paso 11 Se mezcla para integrar el yogurt y se deja reposar por 24h
Paso 12 Se mide el pH final y se almacena para su consumo
Paso 13 Se realiza la prueba sensorial sin conocer el origen de las muestras
Paso 14 Se diluye con 50 mL en 50 mL de agua destilada. Añadir dos gotas de fenolftaleína y
titular con NaOH a 0.5N para conocer cuantitativamente la concentración del yogurt
Paso 15 Se calcula la acidez del producto, mediante la titulación
Paso 16 Se realiza la comparación sensorial con otros yogurt y otros compañeros para evaluar
la calidad del yogurt
Paso 17 Finalmente se calcula el rendimiento total del producto en peso.
 Elabore el diagrama de flujo de la práctica con la simbología correcta
 4. Conocimiento de los riesgos involucrados
El calentamiento, inicial de la leche debe tratarse con precaución para evitar quemaduras de los
alumnos.
Los instrumentos como termómetros, potenciómetros e incubadoras deben tratarse con cuidado para
asegurar la precisión de los resultados.
Un correcto trato del yogurt evitará contaminación de los mismos, por lo que se debe procurar no
contaminar para evitar provocar malestares por consumo de yogurt contaminado.
5. Reconocimiento de las fuentes de interferencia en la práctica
Medir correctamente la cantidad de leche e inoculo, para poder realizar los calculas necesarios para
obtener correctos análisis de rendimiento de la práctica.
Evitar la contaminación del yogurt.
Evitar la introducción de aire al yogurt para que se pueda llevar a cabo la fermentación en
anaerobiosis.
6. Conocimiento de los resultados esperados para compararlos

(da Silva et al, 2017)

(Muncan et al, 2020)
Los ejemplos también hacen uso de potenciómetros para hacer la medición del pH a través del
tiempo, además se alcanza un pH de 4.6 después de 4-5 horas de monitoreo, este tiempo es el
esperado para obtener en la realización de la práctica.
Muncan, J., Tei, K., & Tsenkova, R. (2020). Real-time monitoring of yogurt fermentation process
by aquaphotomics near-infrared spectroscopy. Sensors, 21(1), 177.
Felix da Silva, D., Junior, N. N. T., Gomes, R. G., dos Santos Pozza, M. S., Britten, M., &
Matumoto-Pintro, P. T. (2017). Physical, microbiological and rheological properties of probiotic
yogurt supplemented with grape extract. Journal of Food Science and Technology, 54(6), 1608-
1615.
Actividades Previas. Práctica 3.
1. Conceptos teóricos requeridos para realizar la práctica.
 Diseño de experimentos.
En el diseño de experimentos se pretende manipular algunas variables, para medir el efecto que
tienen las variables en un resultado propuesto. Un ejemplo de esto es el análisis del crecimiento
bacteriano y la proporción de sus metabolitos resultantes.

 Factor experimental, variable de respuesta.

Un factor experimental es la variable que investiga en el experimento para analizar cómo influye la
variable de respuesta. La variable de respuesta es el resultado de la manipulación de las variables
independientes. Un ejemplo de esto es el efecto en la concentración de carbono y del nitrógeno,
cuyo efecto simultaneo tiene como fin aumentar la concentración del producto.

 Nivel de factor, tratamiento, réplica.

Niveles son los valores límite de factores dentro de un experimento 22 significa que existen 2
factores con 2 niveles cada uno, una réplica constaría de 4 corridas experimentales, la temperatura y
la concentración inicial de los sustratos son ejemplos de factores y las variaciones entre estos son
los niveles.

 Efecto de un factor, interacción, efecto cuadrático.

Es el cambio de una variable de respuesta como causa del cambio de nivel del factor, la interacción
se refiere a la relación entre los factores independientes, la presión y la temperatura trabajar
relacionadas para propiciar un correcto desarrollo celular.

 Regresión lineal múltiple.

Es un método matemático para determinar la relación entre dos o más variables independientes, en
el caso de la práctica se evaluará la relación entre dos sustratos.

 Significancia estadística.
Es el resultado significativamente estadístico de que el resultado sea obtenido por el azar. En la
práctica se utiliza la significancia estadística para otorgarle veracidad a los resultados obtenidos en
las corridas experimentales.

 Índice de refracción.
Es el cociente de la velocidad de la luz al vacío y la velocidad de la luz sobre el medio que
atraviesa. El fundamento se utilizará en la práctica durante el uso del refractómetro.

 Inhibición por sustrato en una fermentación.

Ocurre cuando dos sustratos inhiben una actividad enzimática, en algunos casos los sustratos no
pueden unirse a la misma enzima, por lo que ocurre una inhibición por sustrato.

 Inhibición por producto en una fermentación.

Esta es una inhibición por retroalimentación, es decir, las enzimas de la ruta metabólica son
inhibidas por los productos resultantes de la reacción que llevan a cabo.
 2. Conocimientos del equipo que se utilizará en la práctica.
Refractómetro portátil
Es un instrumento diseñado para medir el índice de refracción de un medio, se compone por un
prisma, cubierta, tornillo de ajuste, tobo de espejo, escala y un ocular. Se debe utilizar un paño
húmedo para la limpieza del instrumento.

 Agitador de tubos vortex

Es un agitador para el mezclado rápido y eficiente de una mezcla, está compuesto principalmente
por un pistón que mueve el cabezal rápidamente. Se debe encender el vortex y presionar contra el
cabezal para hacer uso del mismo. Durante la práctica se utilizará para mezclar las soluciones con
sustrato.

 Espectrofotómetro UV-vis
Es un instrumento que permite calcular la absorbancia a una longitud de onda específica, está
compuesto por una lámpara de wolframio, un monocromador, espacio para celdas y un detector. Es
un instrumento sensible que requiere cuidado para su uso. Se utilizará para medir las absorbancias
de las muestras incubadas.

 Incubadora con termostato

Instrumento utilizado para el cultivo de microorganismos, es una cámara designada con cierta
temperatura que optimice el desarrollo microbiano. Se requiere monitorear la temperatura para la
fermentación. Es necesaria durante la práctica para fermentar los inóculos.
3. Conocimiento de los pasos requeridos
 Elabore una tabla que explique la razón de cada paso de la práctica

Paso 1 Se debe preparar el medio YPD estéril para el correcto crecimiento de la bacteria sin
contaminantes
Paso 2 Se inocula la levadura para poder utilizarse en la práctica
Paso 3 Se preparan los factores a distintos niveles para analizar su relación
Paso 4 Se inoculan con la levadura para evitar contaminación
Paso 5 Se agita levemente para evitar introducir aire a la mezcla
Paso 6 Se incuban los tubos por 24h a 25°C para realizar el crecimiento bacteriano
Paso 7 Se toma la muestra y se analiza su concentración mediante absorbancia a 600nm
Paso 8 Se utiliza un filtro para medir el porcentaje de etanol producido
Paso 9 Se analizan los datos mediante regresión lineal
Paso 10 Se calcula el efecto de la relación entre las fuentes de C y N
 Diagrama de flujo. Práctica 3.
 4. Conocimiento de los riesgos involucrados
Los refractómetros pueden dañarse si no se limpian correctamente con un paño húmedo.
El espectrofotómetro puede presentar errores si se manipula inapropiadamente.
5. Reconocimiento de las fuentes de interferencia en la práctica.
Se deben medir correctamente las proporciones de los sustratos,
Es necesario que se limpien bien los instrumentos utilizados.
Debe evitarse la introducción de aire al inoculo, además de evitar contaminaciones en el medio.
6. Conocimiento de los resultados esperados.

(Pérez et al, 2019)

(Oramas et al, 2019)

Se espera obtener como resultado gráficas de superficie que den respuesta a la relación que existe
entre la fuente de carbono (sacarosa) y la fuente de nitrógeno (sulfato de amonio).
Oramas García, J. Pérez Peñaranda, M., Sotolongo Valdés, E., Miranda Galuzzo, A., Román Tabio,
Y., & González Soto, A. (2019). Optimización del medio de cultivo y las condiciones de
fermentación para la producción de un biofertilizante a base de Pseudomonas fluorescens.
Biotecnología Vegetal, 19(2).
Pérez Peñaranda, María Cristina, Oramas García, Julio, Sotolongo Valdés, Emilio Arcadio, Román
Tabio, Yoandra, & López Rodriguez, Héctor. (2020). Optimización del medio de cultivo y las
condiciones de fermentación para la producción de un biofertilizante a base de Azotobacter
chroococcum. Biotecnología Vegetal, 20(3), 189-201. Epub 01 de septiembre de 2020.