Laboratorio de Química Analítica Instrumental Espectrofotometría

Práctica No.1
MANEJO DE INSTRUMENTOS ANALÍTICOS
BASADOS EN LA ABSORCIÓN DE REM
I. Objetivos:

 Adquirir soltura en el manejo de instrumentos analíticos usados para medir la

radiación electromagnética, para su posterior aplicación a la determinación de
muestras problema.
 Diferenciar gráficamente el diseño de instrumentos analíticos usados para medir la
absorción de radiación electromagnética.
 Analizar las ventajas de los instrumentos analíticos utilizados, sobre la base de los
resultados obtenidos.

II. Fundamento Teórico:

Componentes básicos:
1. Fuente de REM
2. Selector de longitud de onda
3. Cubeta para la muestra
4. Detector de entrada
5. Dispositivo de lectura

Según la trayectoria óptica pueden clasificarse en Instrumentos de haz

simple o haz doble:
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Los instrumentos comerciales adecuados para medir absorbancia o %T en las

regiones UV-VIS pueden dividirse en:
 Fotómetros o Fotocolorímetros de filtro
 Espectrofotómetros manuales
 Espectrofotómetro con registro automático.

III. Material, reactivos y equipos:

Espectrofotómetro Coleman u otro disponible en laboratorio

Fotocolorímetro o Fotómetro
Cubetas de absorción
Solución coloreada de concentración conocida
Vaso de precipitados de 100 ml
Matraz aforado de 100 ml
Pipetas graduadas de 5 ml

IV. Procedimiento de Laboratorio:

Antes de empezar asegurarse que tenga sus componentes:
Así las etapas a seguirse en un instrumento de haz simple son:

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1. Cuando no llega ninguna radiación al detector se ajusta el medidor a cero de
Transmitancia.
2. Con el blanco en posición de medida, se abre el obturador y se ajusta la intensidad
de la fuente a 100% de Transmitancia, o cero de absorbancia.
3. Se coloca la disolución de la muestra en posición de medida y se lee la
correspondiente Transmitancia o Absorbancia.
Si se trabaja a más de una longitud de onda estas tres etapas deben repetirse cada vez,
puesto que tanto la potencia de salida de la fuente como la respuesta del detector varían
con la longitud de onda.
Con un instrumento de doble haz la mayoría de estos problemas no existen y la
operación es más sencilla. Para calibrar el instrumento antes de usarlo solo se requieren
los siguientes pasos:
1. Con el blanco en ambas cubetas se ajusta el medidor a cero (cero de absorbancia o
100% Transmitancia.
2. Con el blanco en la cubeta por la que pasa el haz de referencia y sin que llegue
ninguna radiación al detector, se lleva el medidor hasta su valor máximo
(absorbancia infinita o Transmitancia cero)
3. Una vez que se ha calibrado el instrumento puede medirse la Transmitancia de la
muestra a cualquier longitud de onda, dentro del margen que permite el instrumento
sin necesidad de volverlo a calibrar, puesto que el haz que pasa a través de la
muestra se compara continuamente con la del haz que pasa a través de la referencia
y lo que se amplifica y registra es la diferencia entre las señales de los dos haces.

V. Resultados y conclusiones:

Sobre la base de los resultados obtenidos ¿qué instrumento analítico es más exacto y / o
preciso? Explique su respuesta

VI. Cuestionario:

1. Mencione tres ventajas de los instrumentos analíticos de haz simple y haz doble.
2. Mencione tres desventajas de los instrumentos utilizados en su práctica.
3. Señale los componentes instrumentales que permiten diferenciar un Fotómetro de
un Espectrofotómetro
4. Señale los principales criterios de selección de un instrumento analítico
5. Defina los siguientes términos y compare los mismos:
 Colorímetro
 Fotocolorímetro
 Espectrofotómetro
 Espectrómetro

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Práctica No. 2
CONTROL DE CELDAS DE ABSORCION

I. Objetivos:

 Realizar el control de las celdas de absorción con una solución estándar.

 Determinar el error absoluto y el % de error relativo que se presentan al realizar el
control de celdas de absorción con una solución estándar.
 Determinar el % de error relativo que proceden del mal manejo de las cubetas de
absorción.
 Comprobar la ley de Lambert en laboratorio utilizando una solución de
concentración conocida

II. Fundamento Teórico:

La buena utilización y cuidado de las celdas de absorción o cubetas en técnicas de

absorción de radiación electromagnética son fundamentales para la obtención de
resultados precisos y confiables para el operador. Así toda cubeta debe estar siempre
en perfectas condiciones de limpieza, no presentar rayaduras, huellas ni adherencias.

Las celdas de absorción de vidrio y de cuarzo que se utilizan en las regiones espectrales
Visible y Ultravioleta deben limpiarse con ácido nítrico concentrado y frío o bien con
agua regia y no con soluciones de dicromato que tienen cierta tendencia a ser absorbido
por estas cubetas. Debe evitarse la utilización de ácidos concentrados y calientes que

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puedan atacarlas. Las cubetas deben aclararse con agua destilada y con varias porciones
de la disolución a medir, y no intentar secarlas por dentro. La parte exterior de las
celdas deben secarse cuidadosamente con pañuelos de algodón o paños de papel, debe
comprobarse antes y después de la medida de la solución que no contenga burbujas de
aire. También debe comprobarse que las disoluciones no contengan polvo y partículas
no disueltas en las muestras las cuales pueden provocar dispersiones de la radiación
electromagnética.

En general, una de las cubetas debe reservarse para el disolvente, pero ambas deben
contrastarse previamente colocando la misma solución en cada una de ellas. La no
uniformidad de la sección transversal de las celdas de absorción influyen en las
lecturas, al igual que toda radiación parásita que pueda llegar, por ejemplo cuando las
mismas no son tapadas antes de realizar las lecturas en el instrumento analítico.

III. Material, reactivos y equipos:

Espectrofotómetro Coleman u otro disponible en laboratorio

Cubetas de absorción de diferente sección transversal
Vaso de precipitados de 100 ml
Matraz aforado de 100 ml
Varillas de vidrio
Pipetas graduadas de 5 ml
Frascos lavadores
Paños absorbentes de limpieza
Solución coloreada de un estándar

IV. Procedimiento de Laboratorio:

1. Leer el % T de una solución estándar coloreada proporcionada por el profesor, a la

longitud de onda máxima utilizando agua destilada como blanco para ajustar el
instrumento a 100% de Transmitancia, la misma lectura se constituye en el valor de
referencia (.lectura realizada con todos los cuidados explicados).
2. Contrastar cada una de las cubetas con la solución coloreada estándar.
3. Leer el %T de la solución coloreada con diferentes giros en el portacubetas,
variando de esta manera la marca que indica la posición correcta de las cubetas.
4. Leer el % T de la solución coloreada una frente a la otra en diferentes cubetas.
5. Leer el % Transmitancia de la solución coloreada con diferentes volúmenes de
llenado, determinando de esta forma el volumen mínimo que puede leer el
instrumento, sin variación de lecturas de % de Transmitancia.
6. Leer el % Transmitancia de la solución coloreada con cubetas rayadas, sucias o
rotas, y comparar las lecturas con el valor de referencia.
7. Realizar lecturas de % Transmitancia de la solución coloreada sin ajustar el
instrumento a 100 % Transmitancia.
8. Realizar las lecturas del % Transmitancia en cubetas de diferente diámetro, grosor y
tamaño y verificar con los cálculos respectivos la ley de Lambert
9. Leer el % Transmitancia de las diferentes cubetas sin tapar, y comparar las lecturas
obtenidas con el valor de referencia.

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V. Resultados y conclusiones:

Realice los cálculos respectivos para determinar el error absoluto y % de error relativo
al usar inadecuadamente las cubetas de absorción.
Realice los cálculos respectivos para determinar el error absoluto y % de error relativo
en la demostración de la ley de Lambert.
Señale las conclusiones de su práctica.

VI. Cuestionario:

1. Explique el requisito principal de toda celda de absorción

2. Señale las características de los materiales utilizados para la fabricación de las
cubetas en la región visible
3. Explique por que no debe utilizarse soluciones alcalinas para el lavado (NaOH) si
las cubetas son de vidrio?
4. Señale los parámetros estadísticos que se utilizan en el control de cubetas.
5. Si no se dispone de una solución estándar ¿qué procedimiento de laboratorio
seguiría para realizar para el control de cubetas?

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Práctica No.-3
BARRIDO ESPECTRAL
“Determinación del máximo de absorción de Radiación electromagnética y
del Coeficiente de Extinción Molar “

I. Objetivos:

 Determinar la longitud de onda a la cual la muestra o estándar posee un máximo de

absorción de radiación electromagnética
 Determinar el coeficiente de extinción molar, a partir de la absorbancia máxima
obtenida en laboratorio.
 Graficar los valores obtenidos de Absorbancia versus Longitud de onda (nm) y
%Transmitancia versus Longitud de onda (nm)

II. Fundamento Teórico:

https://upcommons.upc.edu/handle/2117/80376?locale-attribute=es

El barrido espectral es la búsqueda de la longitud de onda a la cual el analito o estándar

presenta su máxima absorción de la REM.

La Ley de Lambert-Beer es la base del análisis cuantitativo ya que demuestra que la

absorbancia es directamente proporcional a la concentración de un determinado analito.
Para aplicar esta ley es necesario seleccionar la longitud de onda óptima, y por esta
razón se realiza el barrido espectral.

En la práctica se representa el %T ó A en función a la longitud de onda,

manteniéndose constante la concentración del analito y el espesor del medio

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absorbente. Así de acuerdo al dato de la ordenada estas gráficas obtenidas en
laboratorio son consecuencia de un barrido espectral realizado de acuerdo a la región a
utilizar.

La experiencia puede simplificarse si se tiene en cuenta la regla de que una solución

posee el color complementario de la radiación que absorbe, esto cuando se trabaje en la
región visible.

Los colores complementarios son útiles para predecir la longitud de onda de absorción
de compuestos coloreados. Así por ejemplo una solución amarilla absorberá luz azul
aproximadamente a 435-480 nm.
( nm ) Color absorbido Color Complementario

400-435 violeta amarillo-verdoso

435-480 azul amarillo
480-490 verde-azulado anaranjado
490-500 azul-verdoso rojo
500-560 verde púrpura
560-580 amarillo-verde violeta
580-595 amarillo azul
595-610 anaranjado verde-azulado
610-780 rojo azul-verdoso

A partir del valor hallado del máximo de absorción puede calcularse el coeficiente de
extinción molar respectivo tomando en cuenta la expresión de Lambert y Beer.

ε= A / b c
Donde:
ε = Coeficiente de extinción molar en L / mol. cm
b = espesor del medio absorbente en cm
c = concentración del analito mol/L

III. Material, reactivos y equipos:

Espectrofotómetro Coleman u otro disponible en laboratorio
Cubetas de absorción
Gradilla
Frascos lavadores
Pipetas graduadas
Probetas de 25 ml
Varillas de vidrio
Vasos de precipitados
Sol. Dicromato de potasio
Sol. Permanganato de potasio
Sol. Ácido sulfúrico diluido 0,1M
Sol. Azul de metileno u otro colorante de concentración conocida

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IV. Procedimiento de Laboratorio:

1. Preparar una solución coloreada cuyas concentraciones estén dentro de los límites
de las leyes cuantitativas.
2. Ajustar el instrumento analítico a 100 %Transmitancia y cero de Absorbancia con
el disolvente a utilizar, cerciorándose antes del buen funcionamiento del mismo.
3. Leer la Absorbancia de la muestra en la región del espectro que se indique (400 a
750 nm)
4. Las primeras lecturas se realizaran de 50 en 50 nm. Una vez ubicada la banda de
longitud de onda máxima se realizará una segunda lectura de 10 en 10 nm. Se
puede realizar las lecturas incluso con 1 nm de precisión de acuerdo al instrumento
disponible.
5. Con los datos obtenidos realizar una gráfica espectral en la cual se ubique la
longitud de onda máxima

NOTA. AJUSTAR EL INSTRUMENTO A CERO DE ABSORBANCIA O 100

%TRASMITANCIA, CADA QUE SE CAMBIE DE LONGITUD DE ONDA SI SE
UTILIZA INSTRUMENTOS DE HAZ SIMPLE
Datos para una solución de Permanganato de potasio 0,001 M en celdas de 1 cm:

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V. Resultados y Conclusiones:

Determine gráficamente la longitud de onda que corresponde a un máximo de

absorción.
Interprete la grafica obtenida en el barrido espectral
Determine el valor del coeficiente de extinción molar a partir del valor de la
absorbancia máxima.
Señale las conclusiones de su práctica

VI. Cuestionario:

1. Explique la importancia de realizar un barrido espectral

2. ¿Qué importancia tiene el barrido espectral en el análisis cuantitativo en el área de
salud?
3. Describa los cuidados para realizar un barrido espectral en el región visible
(respecto a material, equipos y reactivos)
4. ¿Cómo realizaría un barrido espectral en la región Ultravioleta? Señale un ejemplo
de analito aplicable al área de salud.
5. ¿Por que se determina la constante de absortividad molar con el valor de máxima
absorbancia?

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Práctica No. 4

PREPARACIÓN DE GRÁFICO CALIBRATORIO PARA HIERRO

I. Objetivos:

 Elaborar una gráfica calibratoria para la determinación de hierro en material

orgánico ó inorgánico, utilizando como reactivo color el Tiocianato de potasio.
 Realizar las curvas de trabajo, las cuales relacionan Absorbancia, %Transmitancia
y log %T versus la concentración del estándar de Hierro.

II. Fundamento Teórico:

El hierro al igual que muchos analitos no absorbentes se pueden determinar

fotométricamente haciéndoles reaccionar con reactivos cromóforos, originando
compuestos que absorben intensamente en las regiones ultravioleta y visible. La
aplicación adecuada de éstos reactivos formadores de color requiere generalmente que
su reacción con el analito sea completa.

Reacción REDOX:
Fe+2 + H+ + MnO4-1 ----- Fe+3 + Mn+2 + H2O

Un reactivo inorgánico típico para el hierro es el tiocianato de potasio. El hierro férrico

reacciona con el tiocianato de potasio dando un compuesto coloreado.

Reacción de color:
Fe+³ + 3 SCN¯  Fe  SCN3
Complejo rojo
III. Material, reactivos y equipos:

Espectrofotómetro Sulfato doble de hierro II y amonio p.a.

Pipetas graduadas de 10ml-5ml-1 ml Permanganato de potasio 0,1N
Matraces aforados de 100 ml-500ml Ácido sulfúrico 1:1
Varillas de vidrio Ácido nítrico ©
Vaso de precipitados de 200ml Muestra problema
Calentador Tiocianato de potasio 40%
Rejilla de amianto
Matraz erlenmeyer de 125 ml

IV. Procedimiento de Laboratorio:

1. Preparación de las diluciones del estándar: Se disuelven 0,3511 g de sulfato de

hierro II y amonio p.a. en 50 ml de agua destilada, se añade 2,5 ml de ácido
sulfúrico 1:1, y la solución resultante se calienta hasta llegar a ebullición, se añaden
gotas de Permanganato de potasio 0,1 N, hasta que el color de la solución vire a rosa

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débil. Se enfría la solución, se transfiere a un matraz aforado de 500 ml y se enraza
con agua destilada hasta el aforo.

La solución preparada en la forma indicada contiene 0,1 mg de hierro por cada ml

de solución. A un matraz aforado de 100 ml se transfieren V (ml) de la solución
madre, y se enraza con agua destilada, en total se preparan 9 soluciones patrón de
diferentes concentraciones, conforme indica la siguiente tabla:

No. de matraz V (ml) solución madre Concentración (mg/L)

1 0,1 0,1
2 0,5 0,5
3 1,0 1,0
4 1,5 1,5
5 2,0 2,0
6 2,5 2,5
7 3,0 3,0
8 3,5 3,5
9 4,0 4,0

2. Preparación de la solución coloreada: Se toma 20 ml de cada solución patrón y se

transfiere a un matraz erlenmeyer de 125 ml de capacidad, se añaden VI gotas de
ácido nítrico concentrado y VI gotas de solución de tiocianato de potasio al 40%.
A continuación se mide la Absorbancia ó el % de Transmitancia de cada solución a
una longitud de onda de 400 nm, ajustando el instrumento analítico con un blanco a
100 %Transmitancia.

En el caso del Fotocolorímetro se trabaja con el filtro verde.

3. Preparación del blanco: El blanco se prepara con 20 ml de agua destilada, donde
se añaden VI gotas de ácido nítrico concentrado y tiocianato de potasio al 40 % p/v
respectivamente.
4. Preparación de la muestra: Se disuelve la muestra en un poco de agua destilada, y
se transfiere a un matraz de 100 ml de capacidad (si hay turbidez filtrar). Cuando se
trata de materia orgánica compleja es necesario previamente incinerar hasta obtener
cenizas, la cual se trata con 3 ml de ácido clorhídrico 1:1 en un matraz aforado de
100ml hasta su enrace
En caso de presentarse turbidez se filtra. Se transfiere la muestra preparada a un
matraz erlenmeyer de 250 ml de capacidad, se añaden 2,5 ml de ácido sulfúrico 1:1,
gotas de Permanganato de potasio 0,1N hasta color rosa pálido, que al instante
desaparece después de calentar la muestra hasta ebullición.

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Laboratorio de Química Analítica Instrumental Espectrofotometría
Se toma 20 ml de esta solución fría y se añaden VI gotas de ácido nítrico y
tiocianato de potasio al 40% p/v respectivamente.
Se lee inmediatamente a 400 nm de longitud de onda frente a un blanco.

https://www.youtube.com/watch?v=7PZJGGfbU7U

V. Resultados y conclusiones:

Los valores obtenidos para las soluciones patrón se grafican sobre un papel
milimetrado donde las abcisas corresponden a las concentraciones de las diluciones
del patrón de hierro (mg/L), y en la ordenada los valores de Absorbancia,
%Transmitancia y log % Transmitancia. En caso necesario la gráfica calibratoria
debe corregirse mediante el método de los mínimos cuadrados, encontrando los
puntos que pasen sobre la línea recta.

Para determinar la concentración de una muestra problema, se interpola en la

gráfica el valor de absorbancia obtenido (una vez corregida la gráfica).

Determinar el factor de la gráfica de calibración según la ley Lambert y Beer.

VI. Cuestionario

1. ¿Qué son las graficas calibratorias?

2. ¿Cual es el objetivo de realizar graficas calibratorias?
3. Señale la importancias de realizar graficas calibratorias en el área de salud
4. Qué parámetros de calidad se toman en cuenta al realizar gráficas calibratorias
5. Como determina la sensibilidad de calibrado en la gráfica de calibración.

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Laboratorio de Química Analítica Instrumental Espectrofotometría
Práctica No. 5

DETERMINACIÓN DEL pKa INDICADOR ACIDO-BASE

POR MEDIO DE ESPECTROFOTOMETRIA VISIBLE
I. Objetivos:

 Determinar el pKa de un indicador ácido-base mediante Espectrofotometría visible.

 Interpretar y analizar las gráficas realizadas para la determinación de pKa sobre la
base de los cálculos teóricos obtenidos.

II. Fundamento Teórico:

El azul de bromo timol es un indicador ácido-base neutro cuyo rango de viraje de pH

es de 6 (amarillo en medio ácido) a 7,8 (azul en medio básico) y en solución neutra
presenta un color verde.

El indicador HIn se disocia como sigue: HIn  H + In¯

pH = pKa – log HIn/ In¯

donde: log In¯ / HIn = pH – pKa

Si comparamos con la ecuación de la línea recta tenemos que: y = m x +b

Donde: y = logIn¯./HIn,
m = 1 , b = -pKa

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Laboratorio de Química Analítica Instrumental Espectrofotometría
La razón In¯ / HIn se puede determinar por medio de Espectrofotometría. Primero se
prepara una solución de azul de bromotimol en solución ácida en la cual el indicador se
encuentra en la forma HIn. Posteriormente se prepara el indicador en solución alcalina
en donde el indicador se encuentra en la forma In¯. Se determina el espectro de
absorción de In¯ y HIn y se selecciona la longitud de onda óptima.

Luego se preparan soluciones amortiguadoras con valores de pH alrededor del pKa del
azul de bromo timol, y se mide la absorbancia a las dos longitudes de onda máximas;
éstas soluciones contienen la misma concentración total del indicador ( HIn + In¯ ),
pero las proporciones varían con el pH. La figura muestra una figura típica de
absorbancia a la longitud de onda máxima para la especie In¯ y HIn.

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Laboratorio de Química Analítica Instrumental Espectrofotometría
III. Material de laboratorio:

Espectrofotómetro Sol. 0,01 M de NaH2PO4

Peachimetro manual Sol. 0,01 M de K2 HPO4
Pipetas graduadas de 10ml-5ml-1 ml Sol. de azul de bromotimol al 0,5%
Matraces aforados de 100 ml
Gradilla
Tubos de ensayo grandes
Varillas de vidrio
Vaso de precipitados de 200ml

IV. Procedimiento de Laboratorio:

1. Prepare las siguientes soluciones:

- 100 ml de solución de azul de bromo-timol al 0,1% p/v.

- 100 ml de solución 0,01 M de NaH2PO4
- 100 ml de solución 0,01 M de K2 HPO4

2. Preparación de la escala : Prepare una serie de soluciones amortiguadoras en siete

matraces aforados de 50 ml de capacidad:

No. Matraz 1 2 3 4 5 6 7
azul de bromo-timol 1 1 1 1 1 1 1 ml
NaH2 PO4 5 5 10 5 1 1 - ml
K2HPO4 - 1 5 10 5 10 5 ml

Aforar cada uno de los matraces con agua destilada. Mezclar bien y medir el pH.

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Laboratorio de Química Analítica Instrumental Espectrofotometría
3. Para determinar el espectro de absorción del azul de bromo-timol a pH bajo (HIn)
mida la absorbancia de la solución del primer matraz desde 400 a 600 nm utilizando
agua destilada como blanco. Grafique Absorbancia versus Longitud de onda.
4. Para determinar el espectro de absorción a pH alto (In¯) mida la absorbancia del
matraz número siete en la misma forma.
5. Sobre la base de los datos obtenidos para los dos espectros, seleccione la longitud
de onda máxima para In¯ y HIn según la gráfica obtenida.
6. Mida la absorbancia de las diluciones a las dos longitudes de onda máxima.

V. Resultados y Conclusiones:

Realice una gráfica de Absorbancia versus pH a las dos longitudes de onda máxima y
ubique el valor de la constante de acidez correspondiente al indicador.
Determine las razones de In¯/ HIn para las soluciones 2 a 6
Grafique el log In¯/ HIn contra pH, y obtenga el valor de pKa del indicador en la
gráfica y compare con los datos teóricos obtenidos.

VI. Cuestionario

1. Investigue el nombre de un medicamento que se comporte como ácido débil y

explique su determinación mediante Espectroscopia visible
2. Explique la importancia de la constante de ionización ácida o básica en el ser
humano.
3. Explique por que los ácidos y base débiles presentan dos bandas de absorción
máximas cuando se determinan mediante Espectrofotometría.
4. Explique porque se relaciona el pH en función de la absorbancia y no en función a
la concentración.
5. Explique la importancia de determinar el pH en la determinación de pKa mediante
espectrofotometría visible.

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