SEP TecNM

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE TIJUANA

“CURVA DE CALIBRACIÓN PARA LA DETERMINACIÓN

DE LA CONCERTACIÓN MOLAR DE CRISTAL VIOLETA
EN UNA SOLUCIÓN PROBLEMA”

Practica l

INGENIERÍA BIOQUÍMICA

Elaborado por:

20211720 – HERNÁNDEZ ROMERO CRUZ DAVID

20211727 – LLAMAS VALDEZ SEBASTIAN ALBERTO

20211734 – PACHECO PLASCENCIA ANGEL RAMÓN

20211735 – PÉREZ CONTRERAS KARLA IVONNE

20211744 – SANDOVAL LEÓN MARÍA ELENA

CINÉTICA Y QUÍMICA BIOLÓGICA – BQ6A

LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Y BIOQUÍMICA

Docente:

M.C. Raúl Alberto Gracia Soto

Tijuana B.C. 15 febrero de 2023

 ÍNDICE

INTRODUCCIÓN------------------------------------------------------------------------------------------------ 4
OBJETIVO-------------------------------------------------------------------------------------------------------- 5
MARCO TEÓRICO---------------------------------------------------------------------------------------------- 5
B. FENÓMENO DE EMISIÓN---------------------------------------------------------------------------------------- 6
LEYES DE ABSORCIÓN----------------------------------------------------------------------------------------------- 6
LEY DE BEER------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 6
METODOLOGÍA------------------------------------------------------------------------------------------------ 7
Materiales y reactivos----------------------------------------------------------------------------------------------- 7
Procedimiento--------------------------------------------------------------------------------------------------------- 7
RESULTADOS--------------------------------------------------------------------------------------------------- 8
DISCUSIÓN DE RESULTADOS------------------------------------------------------------------------------ 11
CONCLUSIONES---------------------------------------------------------------------------------------------- 12
CUESTIONARIO----------------------------------------------------------------------------------------------- 14
SUGERENCIAS Y RECOMENDACIONES-----------------------------------------------------------------16
REFERENCIAS------------------------------------------------------------------------------------------------- 16

2
 ÍNDICE DE TABLAS Y FIGURAS
Tabla 1_________________________________________________________________________8
Figura 1_________________________________________________________________________9
Figura 2_________________________________________________________________________9
Figura 3________________________________________________________________________10

3
 INTRODUCCIÓN

La espectroscopia UV-Visible estudia el fenómeno de adsorción de la

radiación UV-Visible de moléculas orgánicas e inorgánicas. La absorción de la
radiación ultravioleta o visible por moléculas, ya sean orgánicas o inorgánicas,
generalmente se produce por la excitación de los electrones de enlace, por lo
tanto, la longitud de onda de los máximos de absorción se puede relacionar con
los enlaces de las especies absorbentes.

Los métodos espectroscópicos se basan en la capacidad de las sustancias de

absorber (o emitir) radiación electromagnética. Éstos se pueden emplear para
determinar la concentración de un reactivo o producto durante una reacción. El
aparato detecta la cantidad de luz transmitida o absorbida a través de la solución
en la celda y la compara con la que se transmite o absorbe a través de una
solución de referencia denominada “blanco”. La transmitancia de la muestra se
I
define como la relación de la radiación transmitida y la incidente (T = ). La
I0
disminución de la intensidad de la radiación depende de la concentración del
absorbente y de la longitud del camino recorrido por el haz. Estas relaciones se
recogen en la Ley de Lambert-Beer, la cual es el fundamento de la
espectrofotometría.
A=−log 10 T =ε b c
La ley de Lambert-Beer se cumple para una radiación monocromática que
atraviesa una disolución diluida (≤0.01M), cuando la especie absorbente no
participa en un equilibrio que dependa de su concentración.

El método de calibración es un procedimiento analítico muy utilizado en

análisis cuantitativo en química analítica que implica la construcción de una “curva
de calibración” para determinar la concentración de una sustancia (analito) en una
muestra problema. Una curva de calibración es la representación gráfica de una
señal que se mide en función de la concentración de un analito. Conociendo esta
relación funcional, será posible conocer la concentración en una muestra dada
mediante la medida de esa señal.
4
 OBJETIVO

Conocer y aplicar los fundamentos de la espectrofotometría para la

determinación de concentraciones en soluciones.

MARCO TEÓRICO

La espectrofotometría es el método de análisis óptico más usado en las

investigaciones biológicas. El espectrofotómetro es un instrumento que permite
comparar la radiación absorbida o transmitida por una solución que contiene una
cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la
misma sustancia.
Todas las sustancias pueden absorber energía radiante, aun el vidrio que
parece ser completamente transparente absorbe longitud de ondas que
pertenecen al espectro visible; el agua absorbe fuertemente en la región del
infrarrojo.
La absorción de las radiaciones ultravioleta, visibles e infrarrojas depende
de la estructura de las moléculas, y es característica para cada sustancia química.
Cuando la luz atraviesa una sustancia, parte de la energía es absorbida; la
energía radiante no puede producir ningún efecto sin ser absorbida.
El color de las sustancias se debe a que éstas absorben ciertas longitudes
de onda de la luz blanca que incide sobre ellas y solo dejan pasar a nuestros ojos
aquellas longitudes de onda no absorbidas.
La Radiación Electromagnética es una forma de Energía radiante que se
propaga en forma de ondas. En este fenómeno ondulatorio se define:
a) Longitud de onda (l): es la distancia entre dos máximos de un ciclo completo del
movimiento ondulatorio.
b) Frecuencia (n): es el número de ciclos por segundo.
c)Fotones: la luz está formada por fotones, y estos son paquetes discontinuos de
E.
d) Espectro Electromagnético: cubre un amplio intervalo de E radiante, desde los
rayos g de longitud de onda corta hasta las ondas de radio, de longitud de onda
larga. Se divide en varias regiones, las más interesantes para nosotros son:
· Región Ultravioleta: l = 10-380 nm
· Región Visible: l = 380-780 nm
· Región Infrarroja: l = 780-30.000 nm

5
 En la Región Visible, la luz se descompone en colores. La luz blanca
contiene todo el espectro de longitudes de onda. Si interacciona con una molécula
puede ser dispersada o absorbida.
A. FENÓMENO DE ABSORCIÓN
Cuando una partícula que se encuentra en estado de reposo o estado
fundamental interacciona con un haz de luz, absorbe E y se transforma en una
partícula en estado excitado. La molécula absorbe la E de la onda y aumenta su
energía, y ese aumento de energía es igual a la E de la Radiación
Electromagnética absorbida (E =h.n). La partícula en estado excitado tiende a
volver de forma espontánea a su estado de reposo desprendiendo la E absorbida
en forma de calor.
“Espectro de Absorción”. La medida de la cantidad de luz absorbida por una
solución es el fundamento de la espectrofotometría de absorción.
B. FENÓMENO DE EMISIÓN
Algunos compuestos, tras ser excitados por la luz, vuelven al estado
fundamental produciendo la emisión de energía radiante.
LEYES DE ABSORCIÓN
Cuando un haz de luz pasa a través de un medio, se registra una cierta
pérdida de intensidad, debido a la absorción por parte de la sustancia.
LEY DE BEER
“La absorbancia de una solución es directamente proporcional a la
concentración y a la longitud del paso de la luz”.

6
 METODOLOGÍA
Materiales y reactivos
Materiales Reactivos
vasos de precipitados de 50 ml Cristal violeta
tubos de ensayo (15 mL) Agua destilada
1 pipeta graduada de 1 mL
1 propipeta
1 espectrofotómetro
2 celdas espectrofotométricas

Procedimiento
1. Pesar 0.32 gramos de cristal violeta.
2. Introducir los 0.32 gramos en un matraz de 100 mL y aforar con agua
destilada.
3. Preparar diluciones a partir de la solución madre con las siguientes
concentraciones: 2x10-3 M, 2X10-4 M, 2X10-5 M, 2X10-6 M y 2X10-7.
4. Colocar en una celda espectrofotométrica el blanco para tener el valor de
referencia.
5. Colocar en celdas espectrofotométricas las diluciones de mayor a menor
concentración.
6. Realizar la medición en el espectrofotómetro UV- Visible y registrar
resultados.

7
 RESULTADOS

Para la preparación de la curva de calibración, se requirió de la selección de

un colorante. Se seleccionó cristal violeta, el cual cuenta con un peso molecular de
407.98 g/mol. Como punto de partida se realizó una solución madre con una
concentración de 2x10-2M.

Cálculos:

g n g
PM =407.98 M =2 X 10−2 M = n= g=( PM )( n)
mol V PM

siV =0.1 L n=2 x 10−2 M ( 0.1 L ) n=2 x 10−3

g= ( 2 x 10 ) ( 407.98 ) g=0.32 g
−3

Se colocan 0.32 g de cristal violeta en un matraz aforado de 100 mL y se

afora, y así se preparó la solución madre.

Después de hacer las diluciones correspondientes con la ayuda de la formula

C1V1 = C2V2, donde C1 y C2 son concentraciones y V1 y V2 es volumen. Se
obtuvieron las siguientes concentraciones: 2x10 -3 M, 2X10-4 M, 2X10-5 M, 2X10-6 M
y 2X10-7. Posteriormente cada muestra se colocó en el equipo de UV- Vis, en
donde se obtuvieron las
CONCENTRACIÓN ABSORBANCIA
siguientes absorbancias:
(M) (A)
0 0
2x10-3 3.216
2x10-4 1.568
2x10-5 0.186
2x10-6 0.043
2x10-7 0.021

8
 Tabla 1. Absorbancias
de cada muestra
diluida de cristal violeta.

En el siguiente
grafico se muestra la
curva de

concentración de cristal violeta obtenida después de graficar los datos anteriores.

Figura 1. Curva de concentración de cristal violeta.

Se puede apreciar en el grafico que no tiene una tendencia lineal, por lo

tanto, se opta por no graficar la concentración de 3x10 -3 M con 3.216 de A, dando
como resultado el siguiente gráfico:

9
 Figura 2. Curva de concentración de cristal violeta con ajustes.

Para conocer la concentración de una solución problema, se obtiene la

ecuación de regresión haciendo algunos ajustes en la curva de concentración
obtenidas, en minitab. Se obtuvo lo siguiente:

C: Concentración

A: Absorbancia

10
C = - 3x10-6 + 1.3x10-4 A

Gráfica de línea ajustada

Concentración = - 0.000003 + 0.000130 Absorbancia

0.00020 S 0.0000008
R-cuad. 100.0%
R-cuad.(ajustado) 100.0%

0.00015
Figura 3. Grafico de
Concentración

regresión 0.00010
lineal de la

0.00005

0.00000

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6

Absorbancia

concentración de cristal violeta.

 Determinar la concentración de una muestra problema con una absorbancia de

0.181 A con la ecuación de regresión obtenida,

C = - 3x10-6 + 1.3x10-4 (0.181)

C = 2.053x10-5 M.

11
 DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Se realizaron diferentes diluciones de cristal violeta de 2x10 -3 M hasta

2x107 M. La solución madre tuvo una concentración de 2x10 -2. Originalmente se
tenía planeado realizar la solución madre de 2x10 -1 M, pero la solución era muy
viscosa y aparentaba tener una alta concentración, por lo tanto, se optó por volver
a diluirla.

La eliminación del dato de la absorbancia 2x10 -3 ya que el resultado

obtenido se encontraba fuera del intervalo de aceptación de transmitancia del
equipo; al aplicar la fórmula de la transmitancia con una absorbancia mayor o igual
a 2 se pierde la linealidad de la recta, por lo tanto, no se puede aplicar la ley de
Lambert – Beer y como consecuencia no se podrá conocer la concentración de
una solución problema.

Obteniendo la regresión lineal de la recta se pudo determinar la

concentración de la solución problema, la cual tenía una absorbancia de 0.181 A,
en donde se obtuvo una concentración de 2.053x10 -5 M.

12
 CONCLUSIONES

Hernández Romero Cruz David

Se determinó la ecuación de regresión lineal de la curva de calibración de

concertación de cristal violeta contra absorbancia; con el modelo matemático (C =
- 3x10-6 + 1.3x10-4 A) obtenido se logró el objetivo de conocer la concertación de la
solución problema dada (0.181 A), donde se obtuvo una concentración de
2.053x10-5 M. Para la realización de la curva de calibración se realizaron
diluciones de: 2x10-3 M, 2x10-4 M, 2x10-5 M, 2x10-6 M y 2x10-7 M, donde se
obtuvieron absorbancias de: 3.216 A, 1.568 A, 0.186 A, 0.043 A y 0.021 A,
respectivamente, la medición analítica de absorbancias se llevó a cabo en el
espectrofotómetro de ultravioleta – visible. Se optó por no tomar en cuenta el valor
de la primera dilución ya que se pierde la linealidad de la recta tangente y no se
puede aplicar la ley de Lambert – Beer.

Llamas Valdez Sebastian Alberto

Mediante la realización experimental, se determinaron las mediciones de
absorbancia de cristal violeta a diferentes concentraciones, con el uso del equipo
espectrofotómetro de ultravioleta - visible. En base a un modelo matemático se
logró conseguir la concentración de la solución de 0.181 A, obteniendo 2.053x10-5
M de concentración. Se realizo una curva de calibración con diferentes diluciones
para obtener su absorbancia, teniendo diluciones de: 2x10-3 M, 2x10-4 M, 2x10-5
M, 2x10-6 M y 2x10-3 M, con absorbancias de: 3.216 A, 1.568 A, 0.186 A, 0.043 A
y 0.021 A, obteniendo que la absorbancia es directamente proporcional a la
concentración. Se omitió el primer valor de la dilución ya que afecta en la recta
tangente y no se puede aplicar la ley de Lambert-Beer.

13
Pacheco Plascencia Angel Ramón
Con la realización de esta práctica experimental se logró determinar la
concentración de una muestra problema, la cual contenía el colorante cristal
violeta. Los datos pudieron ser calculados gracias a que se hizo un registro de las
diferentes mediciones de absorbancia que obtuvimos del espectrofotómetro UV-
visible; las diferentes concentraciones en que se calcularon las absorbancias con
el equipo fueron 2x10-3 M, 2x10-4 M, 2x10-5 M, 2x10-6 M y 2x10-7 M, con
absorbancias de 3.216 A, 1.568 A, 0.186 A, 0.043 A y 0.021 A, respectivamente,
obtenido así la curva de calibración (Concentración vs Absorbancia). Para poder
aplicar la ley de Lambert-Beer ,se ignora el primer valor de la dilución (además de
que este valor se encontraba fuera del rango de transmitancia del equipo), lo que
resulta en una trayectoria lineal (recta tangente) para después poder obtener un
modelo que se ajuste y sea aceptable para poder utilizarlo y calcular la
concentración de la muestra problema.
El modelo se obtuvo con el software MINITAB, con el cual se realizó una
regresión lineal permitiendo obtener el modelo: C=−3 x 10−6 +1.3 x 10− 4 A , siendo
altamente efectivo. La determinación de la concentración de la muestra problema
con este modelo con 0.181 A arrojó una concentración calculada de 2.053x10 -5 M.
Con esto se cumple el objetivo propuesto de la práctica ya que fue posible aplicar
fundamentos de espectrofotometría para el cálculo y determinación de
concentraciones en soluciones.

Pérez Contreras Karla Ivonne

La espectrofotometría es una técnica analítica valiosa y ampliamente

utilizada en ciencias químicas y biológicas. Sin embargo, es importante realizar
mediciones precisas y tomar medidas para minimizar los efectos de factores
externos para obtener resultados precisos y confiables.

14
Sandoval León María Elena

Con esta práctica se cumplió con el objetivo de conocer y aplicar los

fundamentos de la espectrofotometría para la determinación de concentraciones
en soluciones. Se realizaron disoluciones con diferentes concentraciones a partir
de una solución madre de cristal violeta con agua destilada, las concentraciones
utilizadas fueron de 2x10-3 M, 2x10-4 M, 2x10-5 M, 2x10-6 M y 2x10-7 M.

Los resultados de las mediciones de absorbancia obtenidos del

espectrofotómetro UV- visible se registraron para obtener la curva de calibración y
a partir de ahí hacer la regresión lineal para obtener el modelo matemático y así
poder calcular la concentración de 2.053x10-5 M de la muestra problema que fue
de 0.181 A.

CUESTIONARIO

1.- ¿Cómo se determina el espectro de absorción de una solución colorida?

El proceso implica la emisión de un haz de luz blanca a través de la

solución, y la detección de la luz que emerge del otro lado de la solución mediante
un detector sensible a la luz. La cantidad de luz que se absorbe a diferentes
longitudes de onda se registra en un espectrómetro y se presenta como un gráfico
del espectro de absorción.

Para realizar la medición, se debe preparar una solución diluida de la

muestra y ajustar la longitud del camino óptico de la solución (es decir, la distancia
que la luz atraviesa la solución) a un valor estándar para garantizar una medición
precisa. Luego, se mide la absorbancia de la solución a diferentes longitudes de
onda, normalmente en el rango de 200 a 800 nanómetros (nm), y se registra el
espectro de absorción.

15
2.- ¿Cómo se selecciona la longitud de onda apropiada en un espectro para
la aplicación en la determinación de concentraciones por
espectrofotometría?
La selección de la longitud de onda apropiada en un espectro para la
aplicación en la determinación de concentraciones por espectrofotometría
depende de la naturaleza de la muestra y de las propiedades de absorción de los
componentes que se desean medir. La mayoría de las moléculas absorben luz en
una longitud de onda específica que es característica de su estructura química y
electrónica. Para determinar la concentración de una especie en una muestra, se
debe seleccionar una longitud de onda en la que la especie de interés absorba la
mayor cantidad de luz y que no se vea afectada por interferencias de otras
especies presentes en la muestra.
3.- ¿Qué establece la ley de Lambert-Beer?
La ley de BOUGUER-LAMBERT-BEER, también conocida como ley de
Beer-Lambert-Bouguer. (Ley debouguer-lambert-beer, 2013)
Establece un medio o método matemático, el cual es utilizado para expresar
de qué modo la materia absorbe la luz. En óptica (Rama de la física que se
encarga del estudio de la luz) La ley de Beer afirma que la totalidad de luz que
emana de una muestra puede disminuir debido a tres fenómenos de la física, que
serían los siguientes:
1. El número de materiales de absorción en su trayectoria, lo cual se
denomina concentración.
2. Las distancias que la luz debe atravesar a través de la muestra.
Denominamos a este fenómeno, distancia del trayecto óptico.
3. Las probabilidades que hay de que el fotón de esa amplitud particular de
onda pueda absorberse por el material. Esto es la absorbencia o también
coeficiente de extinción.
(Ley debouguer-lambert-beer, 2013)
4.- ¿Qué es, para qué sirve y cómo se construye una curva patrón?
Es un marco de referencia que se construye de cantidades conocidas de
una sustancia (por ejemplo, la albúmina sérica bovina) que se utiliza para
determinar la cantidad de proteínas presente en una muestra incógnita. (Métodos
espectroscópicos y curva patrón, 2009)
Esta curva sirve para la representación gráfica de una señal que se mide
en función de la concentración de un analito. Se construye a partir de una serie de

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muestras con una cantidad conocida de antígeno descendente, para lo que se
suele partir de antígeno purificado. (Métodos espectroscópicos y curva patrón,
2009).

SUGERENCIAS Y RECOMENDACIONES

 Leer la hoja de seguridad de los reactivos antes de trabajar con ellos en el

laboratorio.
 Utilizar guantes y cubrebocas al pesar el violeta de cristal.
 Evitar dejar caer el reactivo y que este se esparza.
 Usar siempre las mismas celdas y el mismo espectrofotómetro.

REFERENCIAS

Ley debouguer-lambert-beer. (2013, 13 de abril). Universidad

Veracruzana. https://www.uv.mx/personal/aherrera/files/2014/05/L.-Ley-de-
Bouguer-Lambert-Beer-0.pdf
Métodos espectroscópicos y curva patrón. (2009, 18 de agosto).
Bioquimexperimental. https://bioquimexperimental.files.wordpress.com/2009/08/
metodos-espectroscopicos-y-curva-patron.pdf

Artedinámico (n.d.). ESPECTROFOTOMETRÍA. [online] Equipos y laboratorio de

Colombia. Consultado en:
https://www.equiposylaboratorio.com/portal/articulo-ampliado/espectrofotomet%20ria

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