PRÁCTICA # 3

PROPIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS DE LAS PROTEÍNAS

INTRODUCCIÓN

Las proteínas son macromoléculas compuestas por unidades de L-a-aminoácidos que se unen
entre si mediante enlaces peptídicos y que alcanzan un peso molecular igual o superior a 5 000 D.

El enlace peptídico, característico de estos compuestos, resulta de la reacción del grupo carboxilo
de un aminoácido con el grupo amino de otro aminoácido, lo cual da lugar a un enlace covalente de
tipo carbamida y que tiene algunas características peculiares como son:

1.-El enlace C-N tiene cierto carácter de doble enlace, por lo cual le confiere rigidez a la molécula

2.- El oxígeno y el nitrógeno quedan en posición trans

3.- Todos los elementos que componen el enlace se encuentran ubicados en el mismo plano.

4-La rotación de la molécula formada queda restringida a los carbonos a.

En el espacio siguiente Ud. debe representar la fórmula de dos aminoácidos cualesquiera e indicar
cómo quedarían enlazados a través de un enlace peptídico. En la representación que se haga de
este enlace peptídico deben respetarse y evidenciarse las características descritas anteriormente.

COOH Enlace P COOH

H2N C H + H2N C H Enlace Peptidico

CH3 CH2

COOH

H H

H O H O

N C C + N C C

H H H H

CH3 CH2

ALANINA COOH ASPARTATO

El enlace peptídico es un enlace covalente y se establece entre -OH del grupo carboxilo (-COOH)
de un aminoácido -H y el grupo amino (-NH2) del otro aminoácido.
 H H

H O O

N C C N C C OH H2O
H

CH3 H CH2

COOH

El gran número de aminoácidos que componen a la molécula proteica determina que su estructura
sea extraordinariamente compleja, y que para poder estudiarla nos veamos precisados a dividirla
artificialmente en los llamados «niveles de organización de la estructura proteica», de los cuales se
describen habitualmente 4, aunque algunos actores llegan a describir 5 y más.

Estos cuatro niveles se conocen como:

1.- Primer nivel de organización o «Estructura Primaria».

2.- Segundo nivel de organización o «Estructura Secundaria»

3-Tercer nivel de organización o «Estructura Terciaria».

4-Cuarto nivel de organización o «Estructura Cuaternaria»

Por supuesto que toda organización estructural que implique determinado orden requiere de la
presencia de una fuerza estabilizadora, que en el caso de las proteínas estaría constituida por
diferentes tipos de enlaces o interacciones físicas y químicas Ud. debe buscar en su libro y
completar el cuadro siguiente:

Nivel de organización Enlaces que lo mantienen

Primario enlaces peptídicos
s la secuencia lineal
de aminoácidos que
integran una proteína.
Secundario enlaces peptídicos
Es la organización
regular y periódica en
el espacio de las
cadenas polipeptídicas
en una dirección.
Terciario covalentes y no covalentes
define la forma
tridimensional que
adquiere una cadena
polipeptídica.
Cuaternario enlaces débiles, no covalentes
Aparece en las
proteínas constituidas
por más de una
 subunidad o
protómero.

Ahora en el espacio siguiente Ud. debe representar gráficamente cada uno de estos enlaces.

HO O

CH2 C O O C

H3C C H3C O CH

HS CH OH CH O H CH N CH2

N NH2

N N NH2 H HS

AMIINOACIDO 1 AMINOACIDO 2 PEPTIDICO

ENLACE COVALENTE

ELECTRONES DE HIDROGENO

H ELECTRONES DE CARBONO

H C H

H
La complejidad estructural de las proteínas se manifiesta desde el punto de vista funcional en una
gran diversidad de funciones biológicas. A pesar de ellos, y llevado hasta las últimas instancias, las
funciones biológicas de estos compuestos pueden comprenderse basados en una sola propiedad
inherente a estos compuestos, es decir que estas son macromoléculas informacionales.

En las macromoléculas informacionales la estructura del compuesto lleva implícita la presencia de

una codificación con sentido biológico. Esta información contenida en la estructura puede ser de
dos grandes tipos: la información secuencial y la conformacional.

La información secuencial depende exclusivamente del modo en que se organizan las diferentes
unidades monoméricas que componen a la macromolécula; en otras palabras, depende del orden
en que se ubican los aminoácidos dentro de la cadena proteica. En tanto que la información
conformacional dependerá de la estructura tridimensional de la molécula. Lógicamente la
información secuencial dependerá de la secuencial y el cambio de tan sólo un aminoácido por otro
en la estructura de las proteínas implicará por tanto una modificación de su estructura
tridimensional y por ende una alteración de la información conformacional

Como resultado de la existencia de la información conformacional, en las proteínas aparece una

característica fundamental para su funcionamiento que es el reconocimiento molecular. El
reconocimiento molecular es la propiedad que tienen las proteínas de poder unirse selectivamente
con otras moléculas gracias a la existencia de una complementariedad eléctrica y estérica que le
permiten interactuar con dichas moléculas. Esta propiedad citada, por consiguiente, depende
fundamentalmente de las cadenas laterales de los aminoácidos que como ya ha sido mencionado
representan la parte variable de la estructura de los aminoácidos, y de ahí el hecho de la gran
variabilidad de funciones de las proteínas y su posibilidad real de reconocer un número
prácticamente infinito de compuestos.

Sobre la base de los postulados anteriormente, seleccione de su texto tres de las funciones de las
proteínas y trate de explicarlas como resultante del reconocimiento molecular.

Transporte

Una de las funciones de las proteínas es el transporte dentro de nuestro organismo, porque éstas
transportan minerales a las células. La hemoglobina, por ejemplo, transporta oxígeno de los tejidos
a los pulmones.

Receptores

Estos receptores suelen encontrarse fuera de las células para controlar las sustancias que entran
dentro de ésta. Por ejemplo, las neuronas contienen distintos receptores proteicos en sus
membranas.

fabricar

estas fabrican células, tejidos, hormonas, enzimas, neurotransmisores, catalizadores entre otras.
Además, fortalecen músculos, piel y huesos, realizan la mayor parte del trabajo celular, creando
nuevas células y reparando las dañadas.
Por supuesto que para que se produzca el reconocimiento molecular la estructura tridimensional de
la proteína tiene que estar intacta y deben existir en el medio circundante condiciones de pH que le
confieran a esta macromolécula un estado iónico compatible con la molécula a reconocer.

De lo anteriormente expuesto se deduce que el estado iónico de la proteína experimentará

modificaciones en dependencia del pH del medio. Esto se debe a la existencia en la cadena lateral
de los aminoácidos de diferentes grupos ionizables, cuya forma iónica variará de acuerdo a las
condiciones del medio. En el espacio siguiente Ud. debe representar las diferentes estructuras
posibles de los aminoácidos polares iónicos.

Valina Leucina

Isoleucina Metionina
Fenilalanina Triptófano

Treonina Lisina

Como podrá apreciar existe una forma en cada uno de los aminoácidos que al sumar el número
total de cargas positivas y negativas el resultado será igual a 0, y por consiguiente si se colocara
bajo la influencia de un campo eléctrico no migraría hacia ninguno de los polos. A este valor del pH
en el que un aminoácido en solución colocado bajo la influencia de un campo eléctrico no migra ni
hacia el ánodo ni hacia el cátodo porque sus cargas eléctricas están compensadas se le denomina
PUNTO ISOELÉCTRICO (pl). Cuando el aminoácido se encuentra en un pH por debajo de su
punto isoeléctrico su carga será positiva, en tanto que si el valor del pH del medio es superior al
punto isoeléctrico su carga neta será negativa y migrará hacia el ánodo. A manera de ejemplo
represente a continuación la estructura química de la histidina, busque en su texto el valor de pl y
desarrolle la reacción que transcurriría cuando se aumente la concentración de hidrogeniones y
cuando aumente el pH.
En las proteínas también se reconoce la existencia del pl. A continuación escriba la definición de
punto isoeléctrico de las proteínas.

Para el caso de las proteínas los grupos a amino y a carboxilo de los aminoácidos constituyentes
no tienen prácticamente ninguna influencia en la determinación del pl. ¿Por qué?

Lo determinante en la aparición del estado iónico de las proteínas serán, por tanto,
fundamentalmente las cadenas laterales de los aminoácidos ionizables constituyentes y de ahí que
se haya mencionado con anterioridad que la función de reconocimiento molecular de las proteínas
dependiera de ellos en gran medida, puesto que serían los que estarían estableciendo la
compatibilidad o incompatibilidad eléctrica con la sustancia a reconocer.

El otro aspecto a considerar en relación con el reconocimiento molecular, como ya se mencionó, es

la complementariedad estérica que dependerá de la integridad de la estructura tridimensional de
las proteínas. Si se produjera la desnaturalización de las mismas, por consiguiente, se estaría no
sólo cambiando las propiedades físicas y químicas de las proteínas, sino que se perdería su
función biológica.

Escriba en el espacio siguiente el concepto de desnaturalización de las proteínas y mencione al

menos 3 agentes desnaturalizantes físicos y 3 químicos.
En la presente práctica nos proponemos estudiar un método de reconocimiento o identificación de
las proteínas, así como determinar el pl de una proteína y verificar que la desnaturalización
modifica las propiedades físico-químicas de las proteínas.

Para dar cumplimiento al primer propósito utilizaremos la reacción del biuret, mientras que para los
otros dos emplearemos las características de solubilidad de las proteínas.

REACCIÓN DEL BIURET.

El biuret es un compuesto químico resultante del calentamiento de la urea, según se muestra en la

reacción siguiente.

La reacción del biuret dará positiva con todos aquellos compuestos que como los anteriores
posean grupos carbamidas (-CONH2) consecutivos o separados por un átomo de nitrógeno o de
carbono. Las proteínas, al tener los enlaces peptídicos separados por el carbono a tienen una
estructura similar a la de la malonamida y por tanto darán positivo con este reactivo. Cabe
destacar que en el reactivo del biuret no se encuentra presente la sustancia que le da el nombre a
la reacción, sino que este nombre deriva del hecho de haber sido esta sustancia la que se
descubrió históricamente como la primera que desarrolló color al ponerla en contacto con los
iones cúpricos. Posteriormente se comprobó que otros compuestos de estructura química similar
también daban positiva la reacción.
El reactivo del biuret consiste, en esencia, en una solución de sulfato cúprico a la que se le
adicionan otros compuestos que evitan que los iones cúpricos puedan reducirse, ya que se
fundamenta en la formación de un complejo órgano metálico con el ion cúprico, que en medio
alcalina toma una coloración violeta. Este complejo se muestra en el dibujo de la página siguiente,
donde se ve como el ion cúprico forma un complejo de coordinación con el agua y con los
nitrógenos de enlaces peptídicos consecutivos.

La reacción del biuret tiene también importancia cuantitativa, pues el color resultante de la
formación del complejo de coordinación sigue las leyes de Lamberty Beer y por lo tanto resulta de
utilidad práctica para conocer el contenido de proteínas en una solución, siempre y cuando la
concentración de la misma sea relativamente elevada, pues la sensibilidad del método no permite
discriminar pequeñas variaciones del contenido proteico. Esta técnica es muy empleada en la
práctica médica para la cuantificación de proteínas en diferentes líquidos biológicos como son la
sangre y el líquido cefalorraquídeo.

COMPLEJO DE COORDINACIÓN ORGANO-METÁLICO RESULTANTE DE LA REACCIÓN DEL BIURET.

SOLUBILIDAD DE LAS PROTEÍNAS.

En términos generales las proteínas son solubles en agua y en soluciones diluidas de ácidos, bases
y sales; sin embargo, esto es muy variable pues dependerá de la composición aminoacídica de la
misma. Mientras mayor sea el número de aminoácidos polares más soluble será la proteína en
soluciones acuosas; pero a medida que se incremente el contenido de aminoácidos apolares esta
solubilidad irá disminuyendo y se irán haciendo cada vez más solubles en solventes orgánicos.

La solubilidad en agua de las proteínas depende en primera instancia de la interacción que ejercen
los grupos polares de las cadenas laterales de los aminoácidos constituyentes con el agua, de
manera que mientras más polar es la proteína mayor será su interacción con el agua del medio y
logrará crearse una capa de moléculas de agua que recubren a la macromolécula, a la que se
denomina agua de solvatación, por consiguiente cualquier efecto o agente que excluya el agua de
solvatación provocará la precipitación de las proteínas.
De esta manera si se modifica el pH del medio hasta alcanzar el valor del pl de la proteína, aunque
no se eliminan las cargas de la proteína, ésta si estará en un estado eléctricamente neutro y la
interacción agua-proteína será más débil y como consecuencia del elevado peso molecular de las
proteínas las mismas precipitarán. Por intermedio de esta técnica se logrará estimar el pl de una
proteína y también se podrá efectuar la purificación parcial de las mismas y es lo que se ha llamado
la precipitación isoeléctrica de las proteínas. Este procedimiento será utilizado en esta práctica con
el fin de determinar el pl de la albúmina de huevo.

La adición de sales neutras a una solución de proteínas tendrá un efecto diferente de acuerdo con
la concentración en que se adicione la sal. Si la concentración de la sal es baja, la misma constituirá
un puente entre la proteína y el agua de solvatación que permitirá que la solubilidad de la
macromolécula se incremente; sin embargo, si se añade sal en exceso la misma provocará la
sustracción del agua de solvatación de la proteína y estas últimas precipitarán. A este
procedimiento de disminuir la solubilidad en agua de las proteínas se le denomina <<salting out>>
o precipitación salina.

La desnaturalización de las proteínas también traerá como consecuencia la disminución de la

solubilidad de las mismas, siempre que la misma se haga irreversible por la acción de un agente
desnaturalizante muy enérgico como serían las altas temperaturas o los ácidos y las bases fuertes.
Este efecto será el resultado de la liberación de los grupos apolares de las proteínas que
normalmente se encuentran localizados en el interior de las proteínas globulares; pero que al
distorsionarse su estructura tridimensional quedarían expuestos al medio, además, en estas
condiciones las proteínas se encuentran con más grupos reactivos disponibles, e interactuarán
unos con otros provocando la formación de agregados proteínicos (coágulos) que no podrán
mantenerse en solución.

Combinando la acción de la desnaturalización proteica y la precipitación salina, en esta práctica

demostraremos la posibilidad de extraer todas las proteínas de una solución, conservando los
otros componentes. Este proceder es extraordinariamente importante en la práctica médica en la
determinación de compuestos diferentes a las proteínas en los líquidos biológicos, ya que las
proteínas en muchas ocasiones interfieren con el desarrollo de la técnica que se debe emplear y
por lo tanto deben ser eliminadas.

OBJETIVOS

En la presente práctica nos hemos propuesto los objetivos siguientes

1.- Demostrar la utilidad de la reacción del biuret en la detección cualitativa de las proteínas.

2.- Determinar el pl de la albumina de huevo mediante el estudio de la solubilidad.

3.- Realizar un filtrado libre de proteínas utilizando el método de Nelson.

4.- Demostrar que en el filtrado libre de proteínas no se pierden las otras sustancias presentes en
la solución.

5.- Caracterizar a una solución desconocida.

DESARROLLO.

EXPERIMENTO # 1. REACCIÓN DEL BIURET.

Prepare 4 tubos de ensayo según se muestra en el cuadro siguiente:

Reactivo Tubo # 1 Tubo # 2 Tubo # 3 Tubo # 4
Albúmina 1 ml - - -
Aminoácidos - 1 ml - -
Albúmina+aminoácido - - 1 ml -
s
Solución desconocida - - - 1 ml
Reactivo del Biuret 4 ml 4 ml 4 ml 4 ml

Espere 10 minutos y observe los resultados. Dibuje en el espacio siguiente los resultados
obtenidos:

¿Cuáles fueron las soluciones que dieron positivo para la reacción?

Considera Ud. Que los aminoácidos infirieron con el desarrollo del color de la reacción.

¿A que conclusión puede Ud. Arrivar respecto a la solución desconocida?

 EXPERIMENTO # 2. OBTENCIÓN DE UN FILTRADO LIBRE DE PROTEÍNAS.

Prepare cuatro tubos de ensayo siguiendo las orientaciones del cuadro siguiente:

Reactivo Tubo # 1 Tubo # 2 Tubo # 3 Tubo # 4

Albúmina 1 ml - - -
Aminoácidos - 1 ml - -
Albúmina+aminoácidos - - 1 ml -
Solución desconocida - - - 1 ml
Hidróxido de Bario 4,5% 4,5 ml 4,5 ml 4,5 ml 4,5 ml
Sulfato de Zinc 5% 4,5 ml 4,5 ml 4,5 ml 4,5 ml

Para que los resultados sean confiables, Ud. debe agitar cada uno de los tubos de ensayo
vigorosamente después de añadir cada uno de los reactivos.

Describa qué ha sucedido en cada uno de los tubos de ensayo.

Proceda ahora a filtrar cada uno de los tubos de ensayo anteriores y describa en el siguiente
espacio cómo es el aspecto de cada uno de estos tubos. Guarde los filtrados libres de proteinas
(FLP) para utilizarlos en el próximo experimento.

A qué conclusión se puede arribar respecto a la solución desconocida.

EXPERIMENTO # 3. CARACTERIZACIÓN DE LOS FILTRADOS LIBRES DE PROTEÍNAS.

Prepare 8 tubos de ensayo según se describe en el siguiente cuadro:

Reactivo Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo

#1 #2 #3 #4 #5 #6 #7 #8
FLP Albúmina - - - 1 ml 1 ml - - -
FLP Aminoácidos - - 1 ml - - 1 ml - -
FLP Albúmina+aminoácidos - 1 ml - - - - 1 ml -
FLP Solución desconocida 1 ml - - - - - - 1 ml
Reactivo de Biuret 4 ml 4 ml 4 ml 4 ml - - - -
Ninhidrina - - - - 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

Lleve los tubos del 5 al 8 al baño de agua en ebullición y manténgalos ahí durante 5 minutos

Observe los resultados obtenidos y dibújelos en el espacio siguiente.

¿Qué ha sucedido en todos los tubos con la reacción del biuret?

¿Qué ha sucedido con la reacción de la ninhidrina? ¿Interfirió la obtención del FLP con la detección
de los aminoácidos?

A qué conclusiones se llega respecto a la solución desconocida.

EXPERIMENTO #4. DETERMINACIÓN DEL PUNTO ISOELÉCTRICO DE LA ALBUMINA DE

HUEVO.

En el cuadro que se le muestra a continuación se describe la forma en que Ud. debe preparar los 9
tubos de ensayo necesarios para este experimento.

Reactivo Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo # Tubo Tubo Tubo Tubo
#1 #2 #3 #4 5 #6 #7 #8 #9
Agua 8,4 ml 7,7 ml 8,8 ml 8,5 ml 8,0 ml 7,0 ml 5,0 ml 1,0 ml 7,4 ml
Ac. Acético 0,01 N 0,6 ml 1,3 ml - - - - - - -
Ac. Acético 0,1 N - - 0,2 ml 0,5 ml 1,0 ml 2,0 ml 8,0 ml 8,0 ml -
Ac. Acético 1,0 N - - - - - - - - 1,6 ml
Albúmina 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml
pH resultante 5,9 5,6 5,3 5,0 4,7 4,4 4,1 3,8 3,5

Debe tener cuidado de agitar cada uno de los tubos de ensayo cada vez que añade un reactivo.

La aparición de turbidez estará manifestando la insolubilidad de las proteínas, luego donde mayor
turbidez exista menor solubilidad tendrá la proteína.

Describa los resultados de la experiencia anterior después de transcurrido 5 minutos y escriba el

valor del punto isoeléctrico de la albumina de huevo.

INFORME DE LA PRÁCTICA No. 3

PROPIEDADES FISICO-QUIMICAS DE LAS PROTEÍNAS

Nombres:

¿Cuáles de las soluciones ensayadas dio positiva con la reacción del biuret? ¿Por qué?

¿Por qué cambia el aspecto de las soluciones que tienen proteínas cuando se adiciona el reactivo
de Nelson?

¿Por qué cambia nuevamente su aspecto después que se filtran?

Describa el procedimiento que se usó para determinar el pl de la albumina. Explique por qué