Capítulo 1: Introducción A La Histotecnología Parte Ii: Técnicas Histológicas E Histoquímicas

LABORATORIO DE PATOLOGÍA VETERINARIA, U.
MAYOR (2021)
CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN A LA HISTOTECNOLOGÍA

PARTE II: TÉCNICAS HISTOLÓGICAS E HISTOQUÍMICAS
Generalidades sobre histotecnología

La histotecnología es definida como aquella rama disciplinaria de la tecnología encargada
de aplicar los avances tecnológicos para el tratamiento y procesamiento de tejidos, tanto
animales (histotecnología animal) como vegetales (histotecnología vegetal), además de
estudiar los fundamentos técnicos y científicos de los diferentes protocolos y
procedimientos abocados a la obtención de un espécimen óptimo, para permitir el
diagnóstico y análisis histopatológico, todo ello enmarcado en el contexto del
aseguramiento de la calidad, a través de sus tres fases operacionales.
Como tal, los procedimientos histotecnológicos comprenden una serie de pasos, cada uno
de ellos crucial para el procesamiento de un fragmento de tejido, mediante el empleo de
equipos especializados de alta precisión y reactivos (entre los que se encuentran
colorantes, fluorocromos, ácidos, álcalis, metales pesados, anticuerpos y sistemas de
detección) que permiten la demarcación topográfica selectiva de estructuras tisulares y
celulares específicas, para su posterior visualización microscópica y diagnóstico
histopatológico.
Conceptos clave
Histoarquitectura: corresponde a la disposición y ordenamiento estructural de los
diferentes componentes de un tejido, principalmente células y macromoléculas. En
condiciones normales, un tejido está compuesto por un segmento funcional, altamente
celular y encargado de ejercer todas sus funciones fisiológicas inherentes; dicha porción es
conocida como parénquima, mientras que el área compuesta esencialmente por matriz
extracelular rica en fibras y mucopolisacáridos, con escasa presencia celular, se le conoce
como estroma y constituye lo que denominamos como tejido de sostén o conectivo. El
hito tisular que separa ambos compartimientos es conocido como membrana o lámina
basal. Ciertas patologías, como las neoplasias, trastornos inflamatorios, enfermedades
inmunomediadas y presencia de agentes biológicos (microorganismos) ocasionan diversos
efectos deletéreos sobre los tejidos, hecho que conocemos como disrupción
histoarquitectónica.
Topografía tisular: término derivado del griego: Topos- (lugar o territorio) y
-grafia (descripción o trazado), hace alusión al posicionamiento, disposición o
localización de un determinado componente tisular, en el contexto de un tejido, siendo
1
LABORATORIO DE PATOLOGÍA VETERINARIA, U. MAYOR (2021)
aplicable tanto en condiciones normales, como patológicas. La topografía tisular puede

verse afectada en diversas patologías, siendo algunas de estas consecuencias la
sobreacumulación de pigmentos, la disgregación de la matriz extracelular, desarme
conformacional de la membrana basal, desconfiguración del cinturón de adhesión
intercelular, trastornos de almacenamiento intracelular de lípidos o glúcidos, entre otras
que serán tratadas a su debido tiempo, en el presente curso.
Histoquímica: rama de la histotecnología encargada del estudio e identificación de
componentes tisulares o celulares específicos, en su contexto topográfico, mediante el
empleo de colorantes y reactivos, con el objeto de obtener una fracción coloreada en el
sitio deseado. Por su parte, una reacción histoquímica comprende una modificación
ultraestructural del componente tisular, tras la adición de su sustrato correspondiente,
dando como resultado la emisión de color, que es detectable finalmente por el
observador. En términos globales, las reacciones histoquímicas se pueden emplear para
identificar biopolímeros, pigmentos, minerales o complejos inorgánicos y
microorganismos.
Pasos del procesamiento de tejidos
Cuando hablamos de histoprocesamiento, nos referimos a la serie de pasos que implica el

manejo y tratamiento de especímenes tisulares, con el fin de obtener un preparado
fácilmente manipulable y de fácil archivo, para permitir la observación microscópica y
diagnóstico histopatológico. Si bien, el manejo de tejidos comprende una serie de pasos
de elevada complejidad y dotado de una serie de fundamentos técnicos, biológicos,
químicos y físicos inherentes, en este apartado, se realizará la descripción de cada una de
las etapas que lo comprende, haciendo mención a los aspectos más relevantes y con
implicancias directas en el diagnóstico microscópico.
Fijación Macroscopía Deshidratación Intermediario Impregnación Inclusión Corte Coloración
a) Fijación: la fijación tisular (y celular) corresponde -por antonomasia- a la instancia

más preponderante de todo el histoprocesamiento, pues implica el primer
tratamiento, físico y/o químico, que se le confiere a las células y tejidos, para
permitir la conservación de la cito e histoarquitectura de la forma más cercana y
fidedigna posible a su estado in vivo. Por ello, una fijación inadecuada y/o
deficiente repercute negativamente en todas las fases ulteriores del
2
procesamiento de muestras. En vista de lo anterior, se afirma que la fijación tisular

tiene cuatro principios prácticos, los cuales se despliegan a continuación:
Detención
Evitar la
de la putrefacción
autólisis
Preservación de
Conservación de grupos
histoarquitectura funcionales
bioquímicos
1) Detención de la autolisis: la autolisis es definida como el proceso de

descomposición abiótica de un bioma y consistente en la activación de los
mecanismos efectores enzimáticos, tanto lisosómicos, como peroxisómicos, los
cuales tienen lugar en la instancia post mortem. Estas enzimas, nocivas para las
células y tejidos, inician una secuencia de degradación irreversible del
parénquima y estroma tisular, lo que resulta en un fragmento inviable para el
estudio microscópico, pues -tanto la cito, como la histoarquitectura- resultan
totalmente desintegradas. El agente fijador más ampliamente difundido en las
técnicas histológicas es el formaldehído al 10% (siendo recomendado
tamponarlo con solución amortiguadora salina de fosfato de sodio a pH 7.3);
este fijador, al constituir mallas reticularizantes (también llamadas cross-
linkings) consistentes en enlaces covalentes entre los residuos amino (-NH2) de
las proteínas del tejido y los radicales del agente químico, permite generar una
red estable en el tejido, evitando la degradación enzimática por las enzimas
post mortem. Se recomienda que, para efectuar una fijación completa y
prolija, el tejido debe estar en la solución fijadora durante 48-72 horas y
respetando una proporción de 1:10, correspondiente a volumen de
fragmento v/s fluido.
2) Evitar la putrefacción: tras el deceso de un organismo vivo, tiene lugar el inicio
de la descomposición biótica, de forma paralela a la autolisis. En esta instancia,
3
ocurre la proliferación de los bacilos de la putrefacción, la cual implica un

período de fermentación, proceso catabólico de oxidación incompleta, en el
que también participan enzimas, como la piruvato-descarboxilasa y la alcohol-
deshidrogenasa, cuando nos referimos a la fermentación alcohólica. Se afirma
que el formaldehído es un potente agente bactericida, pues tiene un elevado
poder de penetración en la configuración molecular bacteriana y, así mismo,
produce el efecto de reticularización proteica, formando mallas con los
factores infectantes proteicos de las bacterias.
Fig. 1. Modelo científico tridimensional representativo de la reticularización de

proteínas (en azul) con las moléculas del agente fijador (en rojo). Creación personal,
PMV 2021.
3) Conservación de la histoarquitectura: la histoarquitectura es definida como el

ordenamiento y. disposición determinados, de componentes celulares y
acelulares, que configuran y caracterizan un tejido, lo cual confiere rasgos
identitarios específicos para los diferentes tipos de tejidos y que permite
diferenciarlos entre sí. Es primordial dar a conocer que los tejidos que son
observados al microscopio, tras todas las etapas que componen el
histoprocesamiento, no preservan de forma absoluta a su histoarquitectura
original, pues son modificados por la acción, ya sea, de agentes deshidratantes
(retracción), intermediarios (disolución lipídica) y hasta del mismo agente
fijador. Estos cambios se conocen –en su conjunto- como artefactos post-
fijación. No obstante, un buen agente fijador debe permitir el mantenimiento
de la histoarquitectura de la forma más fiel posible a su estado in vivo,
facilitando de esta forma el estudio histopatológico.
4
4) Preservación de los grupos funcionales bioquímicos: tanto células, como el

espacio tisular intersticial, están configurados por una vasta cantidad de
componentes moleculares (biopolímeros, iones, sales minerales, entre otros),
los cuales cuentan con grupos radicales determinados y que serán cruciales
para permitir el estudio microscópico de especímenes biológicos, mediante
técnicas de coloración. Por ende, un buen agente fijador es capaz de preservar
y no enmascarar estos grupos reactivos, con los cuales interactuarán las
moléculas protagonistas de los mecanismos de coloración cito-histológica.
b) Macroscopía: una vez obtenido un fragmento tisular, destinado a estudio

histopatológico, comienza la etapa de descripción y reducción macroscópica, en la
que los tejidos son posicionados en lo que conocemos como casete o cápsula
histológica, los cuales son navecillas provistas de una tapa removible articulada y
ranuras, para permitir la penetración de los agentes deshidratantes, intermediarios
y de impregnación. Es crucial tener en cuenta que -para llevar a cabo un estudio
histopatológico y considerando que las dimensiones de estas cápsulas son 4 x 2,8 x
0,5 cm (largo x ancho x espesor)- los tejidos deben ser fragmentados a un tamaño
muy reducido. En esta etapa, es muy importante tener en consideración variados
aspectos y características inherentes al tejido en cuestión, pues dependerá del rol
conjunto del anátomo patólogo y el histotecnólogo el seccionar y optar por el
segmento adecuado, para llevar a cabo el estudio histopatológico. Para ello, se
debe realizar lo que se conoce como dictado macroscópico, el cual se define como
la descripción acabada y sistemática de todas las características físicas propias del
fragmento a analizar, incluyendo:
Color
Aspecto al Patrón de
corte crecimiento
Dimensiones Textura
Distribución
5
H B C D
E
A
Fig. 2. Estación macroscópica con campana para extracción de vapores orgánicos. Se

distingue el material principal que debe ser utilizado para esta etapa: A. Fragmento de
tejido. B. Cápsula histológica. C. Pinzas anatómicas. D. Tijeras (solo si es necesario). E.
Bisturí con navaja. F. Testigo métrico. G. Recipiente de remisión de biopsia. G. Balanza
analítica (para conocer la masa, se utiliza en caso de tumores voluminosos. H. Tabla
para cortar. Laboratorio de Patología Veterinaria, 2021.
¿Cómo proceder con una macroscopía?
1) Color: Al comenzar a manipular un fragmento tisular, es muy importante poner

atención a los cambios de coloración que pueden existir, los cuales pueden
estar asociados a diversas patologías (infamatorias, neoplásicas,
inmunomediadas, infecciosas, traumas mecánicos, entre otras causales), entre
los que podemos citar procesos ulcerativos, purulentos, hiperpigmentación o
despigmentación, etcétera.
2) Patrón de crecimiento: percatarse de la forma que adopta la lesión en el

tejido, por ejemplo, nodular, planar, irregular, sésil, pedunculada, bajorrelieve,
entre otras. Para comprender a cabalidad los términos recientemente
6
expuestos, existe un material de guía para realizar una correcta descripción

macroscópica, dentro del desarrollo del presente curso.
3) Textura: poner atención a la existencia de áreas alopécicas (de tratarse de un

fragmento de piel), rugosidades, induraciones, zonas reblandecidas,
bajorrelieves, segmentos exofíticos, entre otros.
4) Patrón de distribución lesional: siempre considerar los cuatro estados básicos

de una lesión patológica: focal, multifocal, multifocal coalescente y difusa. La
siguiente imagen ilustra estos conceptos, los cuales son clave para comprender
las formas y disposiciones que adoptan las diferentes lesiones en los órganos y
tejidos y cuya aplicación es crucial no solo para realizar una acabada
descripción macroscópica, sino también para tener certeza del grado de
severidad y extensión de una determinada noxa tisular.
Fig. 3. Esquematización, a modo de ejemplo, de los diferentes patrones de distribución

de lesión en un órgano o tejido, diferenciando claramente entre una noxa focal,
multifocal, multifocal con tendencia coalescente y difusa. Creación personal, PMV 2021.
5) Dimensiones: Antes de efectuar los cortes macroscópicos, es necesario

registrar las dimensiones del espécimen, con la ayuda de un testigo métrico (o
regla), el cual servirá como registro de grado de crecimiento y extensión de una
determinada injuria tisular. En rutina, se recomienda obtener una captura
fotográfica panorámica de la lesión, tanto en plano cenital, como lateral. Para
el caso de tumores voluminosos, es necesario también proveer información
adicional, respecto a su masa, para lo cual se utilizará una báscula analítica de
gramaje.
7
Fig. 4. Plano detalle de la etapa descriptiva de un proceso de descripción

macroscópica, en la que se muestra un fragmento tisular (izquierda), cápsula
histológica (derecha) y testigo métrico (abajo). Laboratorio de Patología
Veterinaria, 2018.
6) Aspecto al corte: una vez descritas las características esenciales del fragmento
recibido, se deberá proceder con su seccionamiento macroscópico, el cual
consiste en la obtención de fragmentos tisulares discretos, los cuales deberán
tener el tamaño adecuado para ser insertos en la cápsula histológica,
respetando las dimensiones descritas a priori. Sin embargo, la selección del
fragmento a procesar no es aleatoria, sino que deberá considerar un estricto
criterio por parte del anátomo patólogo, así como también por el
histotecnólogo, en el sentido que deberá incorporar el segmento lesionado del
tejido, así como también -si el fragmento captado por el médico cirujano lo
permite- un área de tejido sano o no lesionado, con el fin de efectuar una
comparación microscópica de eventuales disrupciones histoarquitectónicas,
respecto de su parte indemne. De momento -para este nivel- únicamente es
necesario comprender el fundamento general de la macroscopía y de cómo
proceder a efectuar un corte macroscópico de un fragmento de tejido, que
será destinado a histoprocesamiento; en cursos superiores, se enseñará el
protocolo correcto para la obtención de fragmentos macroscópicos,
dependiendo si el protocolo de obtención quirúrgica ha sido incisional o
excisional, para lo cual -en este último caso- se deberá realizar el estudio de
bordes correspondiente. Dado lo anterior, el siguiente diagrama tridimensional
ilustra -en términos generales- la forma de seleccionar adecuadamente un
segmento de tejido para el posterior análisis histopatológico.
8
Fig. 5. Esquematización tridimensional de un fragmento de piel provisto de una lesión

(en marrón), a partir de la cual se llevará a cabo un seccionamiento macroscópico con
bisturí, tomando un segmento injuriado y otro sano (en color claro). Creación personal,
PMV 2021.
c) Deshidratación: considerando que el tejido que será observado posteriormente al

microscopio debe estar embebido en un polímero de parafina sólida, resulta
fundamental remover todo vestigio de agua del tejido, (recordar que cerca del 80%
de los tejidos están provistos por agua) con el fin de tornarlo miscible con un
agente apolar e hidrofóbico, como la parafina. Por lo tanto, tras finalizar la
macroscopía, los tejidos deben ser lavados en agua corriente -para remover los
excedentes del agente fijador- y, posteriormente, sometidos a una secuencia
deshidratante, para lo cual, se emplea una batería de alcoholes de graduación
ascendente, desde 70 hasta 95% y -finalmente- un tratamiento con reactivos
higroscópicos1, como es el caso del etanol absoluto. Una vez completamente
deshidratados los tejidos, éstos deben posicionarse en lo que denominaremos
como agente intermediario, cuya función es preparar a los tejidos para a
impregnación en el polímero de parafina. El fundamento químico por el cual este
paso intermedio es fundamental, es debido a que los alcoholes tienen una
naturaleza polar e hidrofílica, aún cuando se trate de su graduación absoluta. Por
1
Dícese de un agente o fluido desprovisto de agua. En este caso, únicamente se aplica al etanol absoluto y al
xileno.
9
otro lado, considerando que la parafina es apolar (desprovista de áreas cargadas

iónicamente) e hidrofóbica (no miscible con el agua o con solventes polares, como
el alcohol), se hace necesario el paso por el xileno, el cual es apolar e hidrofóbico.
Como tal, el xileno (también denominado xilol) es un fluido oleoso y translúcido,
de aroma agradable y penetrante, el cual debe ser manipulado con cautela,
considerando estrictas medidas de bioseguridad, como guantes, mascarilla y
campana de extracción para vapores orgánicos. Todas estas instancias, incluyendo
la sucesora, se efectúan con los tejidos incorporados en sus respectivas cápsulas
histológicas ranuradas.
d) Impregnación: una vez finalizado el tratamiento con el líquido intermediario,
sobreviene la etapa de impregnación, la cual consiste en preparar los fragmentos
tisulares para la inclusión, mediante la penetración de polímeros de parafina hacia
todos los confines que antes estaban siendo ocupados por agua. Para fines
histotecnológicos, se utiliza un tipo especial de parafina, denominado parafina
polietilénica o paraplast. Recibe este nombre debido a sus componentes: se trata
de una aleación de cadenas hidrocarbonadas lipídicas, denominadas ceras, con
polímeros plásticos, en este caso, polietileno tereftalato, el cual le confiere
resistencia y dureza.
Fig. 6. Formato de venta de la parafina histológica, la cual se comercializa en

sacos de 2 a 2,5 kilogramos y cuya consistencia es sólida y en lentejas o, en
este caso, escamas.
10
Existen otros componentes aditivos, en menor proporción, consistentes en cera de

abeja, para otorgar maleabilidad, y caucho, para conferir resistencia mecánica y
evitar disrupciones tras la aplicación de golpes de calor. Pese a ello, estas parafinas
son de termolábiles, es decir, son polímeros que pueden sufrir una disrupción o
desconfiguración cuando se les administra una temperatura superior a 65ºC,
tornándose inviable para el análisis histopatológico, pues pierde sus propiedades
de resistencia y maleabilidad.
e) Inclusión: en términos globales, la inclusión es la instancia en la cual se le otorga

un soporte sólido al tejido ya deshidratado e impregnado en parafina. Para ello, se
emplean moldes de acero inoxidable, los cuales están provistos de un bajorrelieve
plano. Esto permite incorporar los tejidos en ellos y rellenarlos con parafina
fundida, la cual se solidificará al posicionar los moldes sobre una platina de
enfriamiento, calibrada a -20ºC, para así permitir la formación del taco.
A B
CANTO PARA Nº
Fig. 7. A. Aspecto de un molde histológico de acero inoxidable, el cual posee un

bajorrelieve plano, para permitir la orientación y fijación de los fragmentos de tejido y el
escanciado de parafina fundida. B. Cápsula histológica ranurada, con canto oblicuo para
permitir la anotación del número correlativo. Laboratorio de Patología Veterinaria, 2021.
Es importante saber que, para realizar la inclusión, todos los fragmentos de tejidos
que estaban en el interior de la cápsula deberán ser retirados, removiendo
previamente la tapa (la que se descartará como residuo domiciliario) para
orientarlos en el molde de acero. Las siguientes imágenes muestran una secuencia
de pasos sobre cómo proceder para realizar una adecuada inclusión tisular,
ejemplificando con un fragmento de colon de equino.
11
A B
C D E
Fig. 8. Secuencia de inclusión tisular. A. Cápsula histológica cerrada con un tejido

incorporado en ella, tras la etapa de impregnación en parafina a 60ºC. B. Remoción y
descarte de la tapa, para luego procederá retirar el fragmento tisular de la cápsula. C.
Relleno de molde de inclusión con parafina fundida. D. Inclusión del fragmento tisular en
el molde con parafina y fijación al fondo del molde, por su cara de corte (utilizar pinzas
anatómicas para esta fase). E. Confección de taco parafinado mediante enfriamiento y
solidificación de la parafina; para ello, el cuerpo de la cápsula (que antes portaba al
fragmento durante la deshidratación) debe posicionarse sobre el molde. Laboratorio de
Patología Veterinaria, 2021.
Lo más primordial es que la cara de interés para efectuar el estudio

histopatológico, denominada -así mismo- cara de corte, debe ser posicionada en
contacto con el fondo del molde; en histotecnología, este paso en el que se
disponen los fragmentos de tejido en la posición correcta se denomina orientación
tisular. Tras saber el sentido de orientación de cada fragmento, se debe rellenar el
molde con parafina fundida e -inmediatamente- proceder a solidificar en la platina
de enfriamiento; en ese instante, disponer la cápsula histológica sobre el molde
12
con parafina y los tejidos. Para tener certeza si el taco ya ha alcanzado su

temperatura idónea de solidificación, el operador deberá palpar en la parte
superior de la cápsula, la que deberá tener la misma temperatura que la platina de
enfriamiento; tras este control manual, alzar el taco con firmeza, hasta que se
separe del molde.
De este modo, se formará un taco histológico parafinado, que consiste en un

bloque de parafina, con el tejido incorporado con su cara de corte, adherido a la
parte posterior de la cápsula, lo que se observa como muestra la imagen a
continuación:
Fig. 9. Ejemplos de tacos histológicos parafinados, en los que se aprecia la orientación

tisular hacia la cara expuesta o de corte. En este caso, los tacos ya están talados (con los
bordes cincelados, para facilitar la obtención de la cinta en la etapa posterior.
Laboratorio de Patología Veterinaria, 2021.
f) Corte y adherencia: para permitir el estudio histopatológico, el cual, per se, es

microscópico, los tejidos deben seccionarse a un espesor micrométrico, formando
una cinta de tejido con varios eslabones repetitivos y circundado por su respectivo
polímero de parafina, como lo muestra la siguiente imagen. Para llevar a cabo esta
instancia, se requiere de un equipo de elevada precisión denominado micrótomo,
el cual permite la obtención de cortes seriados, a partir de un taco de parafina;
13
este corte es permitido -a su vez- gracias al empleo de una navaja (o cuchilla)

especializada para cortes histológicos, la cual debe manipularse extremando las
medidas de seguridad y cuyo uso está restringido únicamente al profesional
histotecnólogo. Una vez es obtenida la cinta con los cortes seriados, ésta es
recibida manualmente por el operador, el cual procede a disponerla sobre una
película de agua, en un baño de flotación termorregulado a 38-42ºC, rango de
temperatura que permite estirar el corte sin ser disgregado; de este modo, se
produce el estiramiento de la cinta de tejido, aprovechando la propiedad de
tensión superficial del agua. Finalmente, una vez estirados los cortes, el
histotecnólogo se apresta a seleccionar los eslabones que estén en perfecto
estado, sin rugas, melladuras (producto de una navaja dañada o tejidos muy
calcificados), áreas disgregadas, dobleces o cortes muy gruesos. Los eslabones
seleccionados se recogen y reciben en un portaobjetos limpio, con borde
esmerilado (para rotular con su respectivo número correlativo, el mismo presente
en la cápsula ranurada); en esta instancia, obtenemos una lámina de vidrio con su
correspondiente cinta de tejido -desprovista de coloración- adosada en ella, la que
referenciaremos como lámina en blanco. Tras ello, estos preparados se disponen
en un canastillo portaláminas en el interior de una estufa de incubación, calibrada
a 60ºC, para permitir su adherencia y evitar que las cintas de tejido se separen de
la lámina de vidrio, en las etapas de coloración tisular.
A B
C D
14
Fig. 10. Implementos de corte y obtención de cortes histológicos. A. Navajas histológicas de

acero inoxidable y aleación de carbono para micrótomo. B. Estiramiento de cinta de tejido,
a partir del taco parafinado, sobre película de agua, en el baño de flotación. C. Cortes
histológicos en blanco, sobre su portaobjetos, cada uno con su respectivo rótulo. D. Cortes
histológicos teñidos con Hematoxilina & Eosina. Laboratorio de Patología Veterinaria, 2021.
Generalidades sobre microscopía
Antes de abordar uno de los tópicos más relevantes, en lo que respecta al

histoprocesamiento, como lo es la coloración, es necesario desarrollar algunos aspectos
sobresalientes sobre la microscopía y sus variantes. Cuando nos referimos a microscopía,
hablamos del equipamiento e instrumentos ópticos especializados en el enfoque y
proyección de imágenes que exceden los límites inferiores de resolución del ojo humano,
lo que conocemos como estructuras microscópicas. Con respecto a su raíz etimológica, el
étimo microscopio deriva del griego y se escinde en Mikros- (“micros-”, pequeño)
y -spek (“-spek”, ver u observar). La escala de visualización, en cuanto a tamaño y
resolución, dependerá del tipo de microscopio, sin embargo, en la mayoría de los casos, se
emplea para observar estructuras medidas en micrómetros (µm; 1 µm = 1•10-6 m) y
nanómetros (nm; 1 nm = 1•10-9 m), es decir, la cienmilésima y millonésima parte de un
metro, respectivamente.
Por ello, es primordial que un equipo que permita detectar organismos y/o estructuras de
estas dimensiones tan minúsculas cuente con un sistema de amplificación basado en
superposición de lentes, con el acoplamiento de un sistema o fuente lumínica, a modo de
facilitar la formación de imágenes al observador. Derivado de ello, la principal
componente del fundamento de la microscopía se basa en la fotodinámica de la luz,
consistente en el estudio de las variadas modificaciones, tanto direccionales, como
conformacionales, que experimenta un haz de luz (reflexión, refracción y difracción). A
continuación, se especifican las cuatro principales variantes de la microscopía, cuya
selección y empleo dependerá de los propósitos del observador y del tipo de espécimen
en estudio.
a) Microscopía convencional o de luz clásica: es el equipo más ampliamente utilizado

para el estudio citopatológico e histopatológico, además del que posee el
fundamento de funcionamiento más simple, pues se basa en el uso de luz blanca o,
esencialmente, fotones. Este microscopio cuenta con diversos hitos estructurales,
fácilmente identificables, los cuales son posibles de visualizar en el siguiente
diagrama de bloque con orientación tridimensional:
15
Fig. 11. A. Esquematización del fundamento óptico del microscopio convencional, con a
proyección de imágenes y trazado de rayos paraxiales (en amarillo). Creación personal,
La figura muestra un eje óptico (en línea negra segmentada), en el cual se

disponen -en paralelo- el sistema de lentes convexas del microscopio, consistente
en el ocular y el objetivo, este último crucial para efectuar la concentración y
posterior refracción lumínica. Las líneas amarillas segmentadas, que muestran la
trayectoria de los haces lumínicos que pasan por el sistema de lentes, reciben el
nombre de rayos paraxiales. Como se puede apreciar, la fuente de luz emanada se
ubica -en este caso- en posición posterior a la platina que porta el espécimen, de
modo que el haz de luz de dirige, en dirección ascendente, primero hacia el
condensador, el cual converge los haces de luz hacia la muestra, para luego
direccionarse hacia a la lente del objetivo, que permitirá la refracción del haz de
luz, para formar una imagen más pequeña e invertida. Posteriormente, los rayos
paraxiales redirigen hacia la lente del ocular, el cual permite la proyección de una
imagen aumentada y derecha.
De acuerdo a las imágenes del microscopio óptico de campo claro, las partes más
relevantes a considerar de un microscopio óptico son las siguientes:
16
2
6
1
4
3 5
8
6
9 7
Fig. 12. Microscopio óptico de campo claro, con cabezal acoplado sobre sistema de captación de
microfotografías (cámara), con sus respectivos hitos más importantes, numerados a continuación.
1) Ocular: es la lente situada anterior a los objetivos y la más cercana al

observador, la cual permite la observación de la imagen aumentada formada
por la dinámica lumínica del sistema de lentes antes mencionado.
2) Objetivo: es un sistema de lentes que se encuentra inserto en el revólver, el
cual permite la generación de diversos aumentos del espécimen en cuestión,
facilitando la proyección de la imagen al observador.
3) Revólver: sistema portador de las diferentes lentes objetivas, el cual permite -
mediante rotación- cambiar a una lente de un determinado aumento, según los
requerimientos del observador. Por lo general, un revólver suele contar con
cuatro objetivos: 4X, 10X, 40X y 100X (o aumento de inmersión, pues se
emplea -mayoritariamente- con una alícuota de aceite de inmersión sobre el
espécimen), donde X es el tamaño del objeto y el número corresponde a la
cantidad de veces que aumentará las dimensiones del espécimen.
4) Condensador: lente biconvexa, posicionada inmediatamente superior a la
fuente lumínica del microscopio, el cual permite concentrar el haz de luz
emanado hacia la muestra, con el fin de evitar efectos de dispersión lumínica.
5) Diafragma: se encarga de regular la cantidad de luz que llega al condensador,
funcionando como un adaptador rotatorio posicionado justo por sobre el
condensador. Los microscopios ópticos suelen contar con un rótulo ubicado en
17
el canto del diafragma, el cual consiste en un indicador de posición

recomendado para regular el paso de luz hacia el espécimen, dependiendo del
objetivo con el que se esté observando.
6) Platina: soporte físico del espécimen (preparado montado en portaobjetos, por
lo general), el cual contiene dos pinzas de ajuste, para posicionar y asegurar la
muestra, evitando su deslizamiento. Al mismo tiempo, está conectada
directamente a los sistemas de ajuste de movimiento vertical y horizontal, para
permitir el recorrido completo del espécimen, por parte el observador, pues
también cuenta con una apertura inferior, que permite el paso del haz de luz
condensado hacia la muestra.
7) Ajuste micrométrico: tornillo de enfoque, localizado -por lo general- al costado
lateral inferior izquierdo o derecho del microscopio, cercano a la base. Permite
ajustar el foco durante la observación de un preparado, el cual difiere entre
cada observador, considerando las diferentes dioptrías.
8) Ajuste macrométrico: tornillo situado aledaño o asociado al ajuste
micrométrico, el cual permite el movimiento de la platina de observación, en
dirección ascendente y descendente, para facilitar el enfoque.
9) Fuente de luz: corresponde al área de emanación del haz de luz que permitirá
la formación de la imagen del espécimen en cuestión. En este caso, se
posiciona en la base del microscopio y se ubica en posición inferior al conjunto
diafragma/condensador.
b) Microscopía de polarización: se trata de una variante de campo oscuro de un

microscopio óptico convencional, al cual se le agregan dos aditivos, denominados
polarizadores. Un polarizador es un material (generalmente, prismas
confeccionados con sales de calcita) que permite la transmisión selectiva de una
determinada componente del haz de luz (expresado en longitud de onda). Cada
longitud de onda del rango visible del espectro de radiación electromagnética
representa un color determinado, el cual oscila en una determinada dirección.
18
Fig. 13. Fundamento de la polarización de una onda electromagnética, como es el caso

de la luz blanca, la cual -tras pasar por el polarizador- se separa en dos componentes
direccionales, cada una con una longitud de onda diferente (rayo ordinario y rayo
extraordinario). Creación personal, Laboratorio de Patología Veterinaria, 2021.
Cuando se interpone un polarizador en el paso de un haz de luz, se produce el

desdoblamiento del mismo en dos componentes electromagnéticas diferentes:
una en la dirección de la propagación de la onda de luz, llamado rayo ordinario y
otro en posición perpendicular al primero (con efecto de polarización),
denominado rayo extraordinario, dando como resultado la obtención de dos
índices de refracción diferentes y traducido en la emanación de dos longitudes de
onda, cada una de ellas expresada en un determinado color; la propiedad
inherente a los materiales que son capaces de polarizar un haz de luz y emitir
diferentes tonalidades en una misma muestra, se denomina birrefringencia.
Aquellas sustancias o macromoléculas con propiedades birrefringentes se les
denomina anisótropas, entre las cuales podemos citar al colágeno, amiloide,
pigmentos como la hemosiderina y la lipofuscina y proteínas contráctiles como la
actina y la miosina.
19
Fig. 14. Diagrama de bloque del funcionamiento de un microscopio de polarización, el

cual cuenta con un polarizador, encargado de crear la escisión de los haces de luz
emanados desde la fuente, en dos componentes lumínicas diferentes, y un analizador, el
que solapa las dos longitudes de onda separadas en la etapa anterior. Creación personal,
Tal como se aprecia en el diagrama de bloque, un microscopio de luz polarizada

está compuesto por dos discos modificadores del haz de luz, uno de los cuales (el
polarizador) se sitúa por sobre la fuente lumínica y cuya función es imprimir el
efecto de desdoblamiento direccional de la luz en dos ejes oscilantes
perpendiculares, para luego confluir en el analizador, artefacto situado por sobre
los objetivos, consistente en una lámina polaroide, que permite el solapamiento y
convergencia de los haces descompuestos, los cuales permitirán al observador
identificar una tonalidad dual, en las estructuras anisótropas de células y tejidos. A
diferencia del polarizador, el analizador no siempre está incorporado en los
20
sistemas de funcionamiento de los microscopios de luz polarizada, siendo su

presencia de exclusivo requerimiento, por parte de los observadores especialistas.
c) Microscopía de fluorescencia (epifluorescencia): es un sistema de observación en

campo oscuro, en el que la fuente lumínica, en este caso, luz ultravioeta, se
posiciona de forma externa -aunque conectada- al sistema óptico del microscopio,
cuyo principio fundamental se basa en la propiedad de estimulación de sustancias
fluorescentes (ya sea, autofluorescentes o dotadas de fluorescencia autónoma, o
bien, estructuras marcadas o conjugadas a un colorante emisor de fluorescencia,
denominado fluorocromo). La fluorescencia, como tal, corresponde a un subtipo
de luminiscencia, en la cual ciertas sustancias son capaces de absorber un haz de
radiación electromagnética -a una determinada longitud de onda- para luego
reflejar un haz de luz en una longitud de onda diferente, traducida en un color
diferente y de menor energía que el haz incidente.
Fig. 15. Diagrama de bloque del funcionamiento de un microscopio de epifluoresencia,

en el que la fuente de emanación de luz ultravioleta se ubica externamente al sistema
óptico. Creación personal, Laboratorio de Patología Veterinaria, 2021.
21
El diagrama de bloque muestra el funcionamiento general de la epifluorescencia,

comenzando con la emisión del haz de luz ultravioleta, a partir de la fuente
aledaña, la cual se dirige hacia un espejo dicroico de orientación oblicua,
posicionado en el interior del sistema óptico del equipo. Este espejo permite crear
la propiedad de dicroísmo en el haz de luz, la cual consiste en generar una división
del haz incidente y una descomposición en todas las longitudes de onda del
espectro visible (luz blanca). Posteriormente, estas componentes lumínicas se
dirigen hacia el espécimen, en posición inferior al espejo dicroico y producen la
excitación de las estructuras específicas de la muestra, con fluorescencia
autónoma o marcada. Una vez absorbido el haz incidente, sobreviene un periodo
de disipación no radiativa, para luego reflejar la luz en un color correspondiente a
una frecuencia de menor energía y mayor longitud de onda, el cual es concentrado
por la lente objetiva y proyectada antes de llegar al ocular, en contacto con el
observador.
Fig. 16. Corte histológico de riñón teñido con Isotiocianato de fluoresceína (FITC). Las
áreas color verde brillante corresponden a reacción positiva, mientras que las zonas
color verde opaco corresponden a ruido de fondo, siendo uno de los principales
inconvenientes de la microscopía de epifluorescencia.
Considerando que es posible efectuar un múltiple marcaje de estructuras celulares

o tisulares en una misma muestra, con diferentes fluorocromos, el microscopio de
fluorescencia permite la adición de filtros de selección de luminiscencia, los cuales
permiten el paso exclusivo solo de ciertas longitudes de onda, con el objeto de
enfocarse en una estructura emisora de una tonalidad en particular. Por ejemplo,
22
si se ha realizado un doble marcaje con DAPI (fluorocromo nuclear azul) y Cinina 5

o Cy5 (fluorocromo multipropósito rojo) y el observador únicamente desea
observar las estructuras demarcadas en rojo, se debe activar el interruptor para la
frecuencia de 700 nm, permitiendo nada más el paso del componente rojo del haz
de luz, el que excitará la muestra y permitirá su visualización. De este modo, todas
las demás estructuras marcadas con fluorocromos de otras longitudes de onda, no
se verán evidenciadas durante la observación.
d) Microscopía de fluorescencia confocal: corresponde a una variante del

microscopio de epifluorescencia, el cual emplea una técnica óptica de generación
de contraste y efecto volumétrico, gracias a la adición de un pinhole o colimador
de orificio delimitante, el que consiste en una estructura que permite
homogeneizar los haces de luz divergentes, surgidos a partir de la fuente de luz,
para transformarlos en un haces paralelos; de esta forma, se producen dos efectos
que favorecen la experiencia del observador:
- Eliminar la señal fluorescente inespecífica, surgida a partir de la divergencia
lumínica.
- Definición exacta y prolija de los contornos de una determinada estructura
celular o tisular, debido al efecto de proyección de rayos paralelos,
exclusivamente sobre el blanco del observador.
Fig. 17. Comparación visual de resultados entre un extendido citológico teñido con
fluorocromos, bajo un microscopio de epifluorescencia (A) y bajo microscopía confocal
(B), en los que se observan claras diferencias entre el grado de definición de estructuras
y contornos celulares.
23
En cuanto al funcionamiento del microscopio confocal, al igual que en el caso del

microscopio de epifluorescencia, se utiliza una fuente de luz externa y acoplada al
eje central del equipo. Tras la emisión, se encuentra posicionado el primer
colimador de orificio, el cual efectúa la primera concentración del haz lumínico
divergente, el que se dirige hacia el espejo dicroico. Una vez en contacto con éste,
se produce el ya mencionado efecto de descomposición lumínica por longitud de
onda, lo que tiende a inducir un leve efecto de dispersión lumínica (cono
expansivo); en este punto, la lente del objetivo -nuevamente- converge el haz de
luz y lo redirige hacia el espécimen fluorescente, excitándolo y permitiendo la
emisión del haz de luz reflejado, en una menor frecuencia y mayor longitud de
onda.
Fig. 18. Diagrama de bloque del funcionamiento de un microscopio de fluorescencia

confocal, el cual cuenta con un colimador que permite evitar la dispersión de los haces
de luz emanados desde la fuente energética. Creación personal, Laboratorio de Patología
Veterinaria, 2021.
Tras la reflexión, el haz se dirige hacia el segundo colimador, posicionado

inmediatamente anterior al fotodetector de señal fluorescente, el cual traduce y
proyecta la imagen a un ordenador o programa, controlado por el observador; de
esta manera, se permite la focalización de todos los componentes del haz de luz
únicamente en la estructura fluorescente. Al igual que en el caso del microscopio
24
de epifluorescencia, el equipo confocal está dotado, así mismo, de un filtro de

longitudes de onda, que permiten seleccionar las estructuras marcadas en un color
determinado.
Fig. 19. Esquematización del efecto que producen los colimadores en el direccionamiento
de los haces de luz. Creación personal, Laboratorio de Patología Veterinaria, 2021.
Coloración cito-histológica
Teniendo en consideración que, tanto los extendidos citológicos, como los cortes
histológicos, deben ser analizados, estudiados y diagnosticados mediante microscopía,
dichos preparados deben ser tratados por una serie de colorantes, sucesivos lavados y
reactivos, con el objeto de realizar una demarcación topográfica diferencial de las
diferentes estructuras tisulares.
Con el objeto de comprender más a cabalidad el fenómeno de la coloración tisular, es
necesario recordar algunos conceptos básicos acerca de la naturaleza física ondulatoria de
la luz. Como es sabido, la luz corresponde a un exiguo segmento situado en el centro del
espectro electromagnético, comprendido entre los 400 y los 750 nm de longitud de onda,
valores representados por la letra griega “lambda” (λ). Recordemos que 1 nm = 1x10-9 m).
En valores menores a 400 nm, continúa hacia la radiación ultravioleta (UV), mientras que
en valores mayores a 750 nm tenemos a la radiación infrarroja. Por su parte, los
colorantes son complejos moleculares capaces de proporcionar un determinado tinte o
color, en cuya estructura podemos distinguir dos porciones relevantes:
25
a) Cromóforo: corresponde a aquel radical químico, normalmente compuesto por

uno o más dobles enlaces asociados a un anillo aromático con enlaces resonantes y
es el responsable de conferir la tonalidad determinada a la molécula, en un rango
específico del espectro visible.
b) Auxocromo: radical químico o grupo funcional situado en la periferia de cada

molécula colorante, responsable de entablar la unión química con su grupo
bioquímico afín de la matriz tisular o celular.
Fig. 20. Estructura molecular de un colorante histológico de carga aniónica, también

llamado colorante ácido, lo cual se puede distinguir gracias a la presencia de radicales
sulfónicos (SO3-) en la periferia de su estructura. En este caso, se trata el colorante
Ponceau S, específico para la tinción de fibras colágenas en el método Tricrómico de Van
Gieson.
Cada molécula colorante, cuando es estimulada por un haz de luz blanca (haz incidente),
absorbe una determinada cantidad de longitudes de onda y, dependiendo de su
configuración molecular, refleja un haz de luz perteneciente a un valor específico de
longitud de onda del espectro visible (haz de luz reflejado), el cual es traducido –por el
observador- en un color característico.
26
Fig. 21. Esquematización del espectro de ondas electromagnéticas, en el que se distingue

el espectro visible o luz blanca, cuyo entendimiento es crucial para el estudio de los
fundamentos de coloración. Creación personal, Laboratorio de Patología Veterinaria,
2021.
Para nuestros efectos, acuñaremos una serie de términos que serán aplicables
directamente en el contexto de la histotecnología. Cuando nos referimos al tejido
propiamente tal, portador de alguna o más estructuras que deseemos identificar con un
color determinado, lo denominaremos matriz tisular o simplemente matriz, siendo
descritos dos tipos: ortocromática (la cual adquiere una tonalidad igual o similar al rango
de longitud de onda al cual pertenece el colorante) y metacromática (en este caso, ciertos
segmentos de la matriz de un tejido, tras interactuar con cierta clase de colorantes,
también conocidos como metacromáticos, emiten una coloración con una longitud de
onda diferente a la original, propia del colorante). Por otro lado, cuando se hace
referencia a los complejos moleculares dotados de una coloración localizada en un
determinado punto del espectro visible, los denominaremos como colorantes, sustrato
cromógeno o simplemente cromógeno. En casos puntuales, ciertos protocolos
histoquímicos no emplean sustratos cromógenos para demarcar componentes puntuales
de la matriz tisular; en su lugar, se utilizan otros componentes, tales como, metales
pesados, complejos salinos y agentes quelantes2. En todos los casos, el componente de la
matriz tisular que se desee identificar se visualizará, así mismo, con un color específico y
destacable.
Con dichos antecedentes como premisa, debemos considerar que, para que lo anterior
ocurra íntegramente, los colorantes y reactivos empleados en el proceso deben
2
Producto químico que tiene la propiedad de asociarse a cationes divalentes (como el ion cuproso o Cu++ y
el calcio, Ca++) y trivalentes, formando complejos órgano-metálicos u órgano-minerales estables e insolubles,
que pueden ser visualizados en un color o tonalidad específica.
27
interactuar selectivamente con determinadas porciones moleculares de un tejido,

permitiendo de este modo la generación de una reacción matriz tisular/sustrato
cromógeno en una gama determinada del espectro visible.
Coloración corriente
Cuando nos referimos a coloración corriente, también llamada tinción de rutina, hacemos
alusión a aquella técnica de coloración que debe ser aplicada a todo preparado
histopatológico, como un gold standard, para efectuar la primera evaluación microscópica
del mismo, con el fin de obtener un diagnóstico. En histotecnología, la coloración más
común es -por antonomasia- la Hematoxilina & Eosina; las razones que subyacen a su
empleo son variadas y abarcan conceptos tanto prácticos, como teóricos. En primera
instancia, se trata de una coloración topográfica núcleo-citoplasmática, de tonalidades
contrastantes, que demarca diferencialmente núcleos por la Hematoxilina (en púrpura) de
citoplasmas y otros constituyentes tisulares y celulares, por medio de la eosina (en
diferentes gamas de rosado); por otro lado, se trata de un protocolo sencillo, de fácil
implementación y alta reproducibilidad entre usuarios. En esencia, la propiedad que
tienen todas las estructuras tisulares o celulares que tengan afinidad por la Hematoxilina,
recibe el nombre de basofilia, mientras la cualidad de aquellas porciones de tejido o
células que presenten predilección por la eosina, recibe el nombre de eosinofilia o
acidofilia.
Todo preparado histopatológico debe ser analizado, en primera instancia, mediante esta
técnica. En caso de un eventual hallazgo o ante la pesquisa de un componente tisular o
celular específico, no detectable de forma directa y/o diferencial con la coloración
corriente, se procederá a la realización de un algoritmo diagnóstico complementario, el
cual consiste en el diseño de protocolo ordenado, sistemático y secuencial, a través del
cual se busca hallar –de forma certera- el diagnóstico cito o histopatológico.
A B
Fig. 22. Campos de cortes histológicos teñidos con Hematoxilina & Eosina. A. Retina de
erizo de tierra (Laboratorio de Patología Veterinaria, 2020). B. Metástasis de carcinoma
espinocelular en pulmón de erizo de tierra. Laboratorio de Patología Veterinaria, 2021. 28
Técnicas especiales histoquímicas

Como bien ha sido referida, la histoquímica es aquella rama de la histotecnología
encargada de estudiar la localización topográfica y concentración estimada de los
componentes químicos tisulares y celulares, con un color determinado, tras acaecer una
reacción química específica entre la matriz tisular o celular y un sustrato cromógeno o
reactivo.
En términos generales, podemos clasificar a los blancos celulares o tisulares, de acuerdo a
su origen, en compuestos endógenos y exógenos. Cuando nos referimos a componentes
endógenos, hacemos alusión a toda estructura inherentemente celular y/o tisular,
orgánica o inorgánica, la cual se puede localizar en determinadas porciones de un
espécimen biológico, tanto en condiciones fisiológicas, como patológicas, en mayor o
menor concentración, según corresponda. En casos patológicos, estos componentes
pueden derivar en una acumulación, disgregación, deficiencia, depósito, entre otras
consecuencias, siguiendo patrones de distribución y localización determinados. En este
contexto, citamos a los biopolímeros, pigmentos endógenos (hematógenos y lipídicos) y
minerales, en algunos casos. Por otro lado, los compuestos exógenos corresponden a toda
estructura química presente en las células o tejidos que, tras un proceso de incorporación
accidental o involuntaria a partir del medio externo, tras la ingesta, inhalación o
exposición más o menos prolongada, se acumulan, siguiendo un determinado patrón
topográfico.
Para efectos prácticos, subdividiremos los métodos histoquímicos según su objetivo de
detección molecular, teniendo en cuenta los blancos celulares o tisulares específicos; de
esta forma, tenemos: biopolímeros, pigmentos, iones (y compuestos inorgánicos) y
microorganismos.
Identificación de biopolímeros
Un biopolímero es un complejo macromolecular de origen biológico, compuesto –a su
vez- por una serie de subunidades reiterativas, conocidas como monómeros. En el
contexto de la química orgánica, podemos clasificar a los biopolímeros en cuatro grandes
familias: carbohidratos (azúcares), lípidos, proteínas y ácidos nucleicos. Dentro de cada
grupo, es posible encontrar una gran variedad de ejemplos, cada uno de los cuales cumple
funciones cruciales en las células y tejidos, tanto en condiciones fisiológicas o patológicas.
En el contexto de la histoquímica, la primera clasificación mencionada a priori abarca a los
glicosaminoglicanos (neutros y ácidos) y a polisacáridos animales, como el glicógeno. Por
su parte, los lípidos –en este contexto- podemos subdividirlos en lípidos neutros (entre los
cuales encontramos a los triglicéridos, como ésteres alcohólicos de ácidos grasos) y a los
lípidos complejos, como es el caso de la esfingomielina (constituyente esencial de la vaina
de mielina).
29
Por otro lado, las proteínas –uno de los grupos bioquímicos más trascendentes para el
estudio de patologías animales- en la actualidad, los métodos histoquímicos que existen
para su detección son escasos y poco empleados. Entre los principales constituyentes de
la matriz tisular que, hasta nuestros días, siguen siendo objeto de estudio e identificación
con estos protocolos, podemos citar a productos hormonales del sistema APUD (Amine
Precursor Uptake Decarboxylase, consistente en un sistema enzimático encargado de la
síntesis de mediadores neuroendocrinos polipeptídicos, tales como hormonas y
neurotransmisores derivados de aminoácidos), Regiones Organizadoras Nucleolares o
NORs (correspondientes a proteínas codificadas a partir de copias teloméricas de ARN
ribelosómico, participantes directas de la síntesis y ensamblaje de subunidades
ribosomales) y el amiloide (proteína patológica resultante de un plegamiento erróneo,
durante el ensamblaje de su estructura secundaria. Los métodos histoquímicos para
detectar los constituyentes fibrilares de la matriz extracelular (no carbohidratos) son
quizás los más difundidos y de amplio uso hasta nuestros días; en este caso, podemos
incluir el colágeno (en cuyo grupo agruparemos a las fibras reticulares de colágeno tipo
III), elastina y actina. Gran parte de las proteínas presentes en los tejidos, ya sea, en el
contexto de una sobreexpresión o regulación a la baja, en determinados procesos
patológicos, son identificadas con elevada especificidad y sensibilidad gracias a los nuevos
métodos inmunodiagnósticos, gracias a la reacción antígeno (detección de epítopes) y
anticuerpo (mediante un determinado CDR del paratopo), tópico que será tratado
inextenso en la tercera parte del presente capítulo.
• APUD
•GAGs • NORs
neutros • Amiloide
•GAGs ácidos • Componentes
fibrilares de la MEC
•Glicógeno
Azúcares Proteínas
Ácidos
Lípidos
nucleicos
•Neutros • ADN
•Mielina • ARN
En última instancia, tenemos a los ácidos nucleicos, clasificados –desde el punto de vista
bioquímico- en función de su azúcar constituyente, enlazada a su respectiva base
30
nitrogenada; de esta forma, tenemos al ácido desoxirribonucleico o ADN (cuyo

carbohidrato estructural es la desoxirribosa) y al ácido ribonucleico o ARN (conformado
por ribosa). En ambos casos, si bien, existen métodos histoquímicos específicos para su
demarcación, de similar forma a como se ha llevado a cabo en las técnicas para detección
de proteínas, el advenimiento de nuevos métodos moleculares e inmunomoleculares de
elevada sensibilidad y especificidad ha relegado a estas metodologías al desuso en
nuestros días. Por lo tanto, en el presente material, no haremos mención a los métodos
histoquímicos especializados en la detección de ácidos nucleicos, pues su uso práctico en
rutina, hoy en día, ha sido reemplazado por otros métodos más sofisticados.
Identificación de carbohidratos
Los hidratos de carbono son macromoléculas compuestas por subunidades monoméricas
repetitivas de monosacáridos, cada uno de los cuales –a su vez- está enlazado a su
eslabón antecesor o sucesor, mediante enlaces α-1,2 y β-1,4 glucosídicos. También
podemos encontrar carbohidratos del tipo heteropolisacáridos, constituidos por
eslabones sucesivos de disacáridos, donde uno de los azúcares simples está provisto de un
grupo amino (-NH2) en su estructura; de esta forma, están siguiendo el patrón formular
[Monosacárido-Aminomonosacárido]n. Esta última modalidad es habitual en un tipo
especial de hidrato de carbono conocido como mucopolisacárido.
En los tejidos, por una parte, forman una porción esencial de la matriz extracelular o
intersticial, que es definida como aquel compartimiento de elevada complejidad
bioquímica y consistencia gelificada, en el cual están inmersas las células que componen
un tejido (parénquima y estroma). Esta matriz está constituida, en primer lugar, por una
sustancia amorfa fundamental rica en proteoglicanos y glicosaminoglicanos o GAGs
(también referidos como mucopolisacáridos), responsables de la hidratación y turgencia
de la MEC, mediante la atracción de moléculas de agua. Por otro lado, tenemos una matriz
fibrilar, abundante en complejos proteicos de elevada masa molecular y responsables de
oponer resistencia a las fuerzas externas de tracción, compresión, flexión y torsión. Así
mismo, los GAGs también forman parte de diversos productos glandulares exocrinos, por
lo tanto, están presentes en la secreción salival, lacrimal y diversas secreciones
sintetizadas y liberadas por las células que constituyen el tubo digestivo, con gran ahínco
en los epitelios gástricos, duodenal y colónico.
En virtud del grado de acidez de los mucopolisacáridos, dada la presencia o ausencia de
radicales bioquímicos o grupos funcionales determinados en su molécula, podemos
clasificarlos en ácidos y neutros, respectivamente.
Por otro lado, dentro de los carbohidratos que podemos demarcar con técnicas
histoquímicas, tenemos el glucógeno, polisacárido de reserva energética, presente en
forma más abundante en el interior del citoplasma de los hepatocitos y los miocitos
31
esqueléticos, lisos y cardiacos, estando constituido por más de 120.000 monómeros

sucesivos de glucosas.
Métodos histoquímicos para identificación de carbohidratos
a) Reacción del Ácido Peryódico de Schiff (PAS): este método es específico para
detectar la presencia de azúcares complejos, como el glicógeno y
mucopolisacáridos neutros, en los que podemos encontrar –principalmente- a la
fracción coloidal de la Matriz Extracelular y a secreciones glandulares exocrinas,
como la lacrimal, salival y gástrica (presentes en la porción apical de la célula
epitelial glandular, que constituye el adenómero). Así mismo, esta reacción
también logra demarcar membranas basales y estructuras fúngicas; en el primer
caso, es necesario recalcar que las membranas basales son complejos acelulares y
macromoleculares, que delimitan las dos porciones esenciales de un tejido:
parénquima y estroma, estando compuestas por una gran cantidad de proteínas
glicosiladas, vale decir, poseen sustratos de azúcares añadidos en sus cadenas
polipeptídicas (tras haber tenido lugar una modificación post trandsuccional de
glicosilación). Por otro lado, los hongos son microorganismos que están provistos
de una resistente pared celular, compuesta por quitina y glicoproteínas, razón por
la cual también logran ser detectados mediante la Reacción de PAS. Todas las
estructuras positivas a la reacción de PAS se visualizan en un tono magenta.
A B
C D
Fig. 23. Aplicaciones de la Reacción de PAS. A. Secreción glandular (glándula lacrimal de erizo de
tierra). B. Membranas basales (túbulos seminíferos, equino). C. Acúmulo de glicógeno
intraneuronal en ternero. D. Neumonía granulomatosa por hongos en canino. Laboratorio de
Patología Veterinaria, 2021. 32
b) Método de extracción enzimática del glucógeno (PAS-Diastasa): considerando

que ciertas patologías están asociadas a degeneraciones vacuolares por
acumulación de glicógeno, debe existir un protocolo histoquímico para determinar
con exactitud si se trata de este azúcar, precisamente, el cual per se reacciona con
intensa positividad a la reacción de PAS. Para ello, está el caso de la extracción
enzimática de glicógeno, utilizando la enzima diastasa para efectuar la degradación
selectiva de este polisacárido; tras haber realizado la digestión, al llevar a cabo la
reacción de PAS, las áreas inicialmente positivas a la reacción se observarán
desprovistas de coloración, tal como lo demuestran las siguientes microfotografías.
A B
Fig. 24. Confirmación de la presencia de glicógeno en una degeneración vacuolar

hepática, positivo para la Reacción de PAS (A) y negativo una vez que se lleva a cabo la
digestión con diastasa (B). Laboratorio de Patología Veterinaria, 2021.
c) Método de Alcian Blue: a diferencia de la reacción de PAS, el método histoquímico con

el colorante Alcian Blue permite la identificación de glicosaminoglicanos ácidos (sulfatados
y carboxilados). En este grupo, podemos encontrar una serie de componentes bioquímicos
esenciales de la matriz extracelular (específicamente de la porción de sustancia amorfa
fundamental), como también intracelular, entre los que se encuentran: sulfato de
condroitina (abundante en la matriz cartilaginosa y en los mastocitos mucosales, cuya
función es permitir el secuestro de calcio intracelular, para evitar reacciones de
degranulación contra antígenos alimentarios, siendo crucial para el mantenimiento de la
homeostasis intestinal), sulfato de heparina (presente en grandes concentraciones en la
porción intersticial próxima a las superficies celulares), dermatán sulfato (en gran
cantidad en piel, estrato esponjoso de válvulas cardiacas, tejido tendinoso y vasos
sanguíneos) y queratán sulfato (siendo este último muy ubicuo en tejido tegumentario).
Del mismo modo, es posible encontrar glicosaminoglicanos ácidos como productos de
secreción de estructuras glandulares de diferentes porciones del tubo digestivo, tales
como, esófago y colon. Las estructuras positivas a este colorante se visualizan en un color
calipso.
33
A B
V
Fig. 25. Aplicaciones generales del método de coloración con Alcian Blue. A. Detección de
glicosaminoglicanos en núcleo pulposo intervertebral. B. Identificación de productos de
secreción glandular, en el colon de un gato. Laboratorio de Patología Veterinaria, 2021.
d) Método combinado de PAS/Alcian Blue: este método se utiliza para realizar una
marcación simultánea de glicosaminoglicanos neutros y ácidos en un mismo corte
histológico. A su vez, es muy empleado para el estudio de ciertos cuadros
patológicos conocidos como degeneraciones mixomatosas, en las que al menos
uno de estos tipos de mucopolisacáridos prolifera en un contexto tisular
determinado, en detrimento de otros constituyentes de la matriz extracelular,
tales como, colágeno, elastina o estructuras celulares especializadas, como
miocitos lisos o estriados.
Fig. 26. Caso de una valvulopatía por degeneración mixomatosa en un canino

(endocardiosis en válvula mitrálica). Se aprecia un patrón de coloración dual, entre
magenta y calipso, tras la demarcación simultánea de dos glicosaminoglicanos presentes en
el cuadro degenerativo, consistente en el reemplazo de matriz colágena y elástica por un
estroma rico en azúcares neutros y ácidos (PAS positivo y Alcian Blue positivo,
respectivamente). Laboratorio de Patología Veterinaria, 2020.
34
Identificación de proteínas
Como bien se mencionó en los párrafos introductores, la identificación histoquímica de
proteínas ha caído progresivamente en el desuso, por dos principales motivos:
- Las proteínas son estructuras tan complejas, como variadas, por lo que resulta muy
complejo es poder identificar una estructura proteica completa en un fragmento
tisular.
- Las proteínas son macromoléculas extremadamente ubicuas y de morfología muy
variada, es decir, pueden estar formando complejos con azúcares, lípidos y ácidos
nucleicos, al mismo tiempo que pueden ser, tanto pequeños homodímeros de
transmembrana, como grandes polímeros fibrilares helicoidales, que ocupan parte
sustancial de la matriz extracelular.
- El advenimiento de nuevos métodos de detección de elevada sensibilidad y
especificidad, tales como las técnicas inmunodiagnósticas, ha relegado a las
vetustas técnicas histoquímicas específicas para proteínas a la obsolescencia, ello
considerando que los métodos inmunohistoquímicos e inmunofluorescentes
detectan fracciones específicas y puntuales de una estructura proteica, suficientes
para confirmar la presencia y grado de expresión de una determinada molécula, en
un contexto tisular.
No obstante, en el presente material, se presenta la selección de algunas técnicas

histoquímicas, hasta hoy empleadas, para la demarcación de estructuras proteicas, entre
las que destacaremos: componentes fibrilares de la Matriz Extracelular (colágeno y
elastina), amiloide, Regiones Organizadoras Nucleolares (NORs) y productos hormonales
del Sistema APUD.
Identificación de componentes fibrilares de la Matriz Extracelular

La matriz extracelular (MEC) está situada en el espacio intersticial, es decir, entre las
células que constituyen un tejido y se compone de una gran variedad de biopolímeros,
cada uno de los cuales cumple funciones estratégicas en la homeostasis tisular,
mantenimiento de la histoarquitectura y migración celular a través de los tejidos, lo que se
conoce así mismo como cinética celular.
Si bien, la matriz extracelular está compuesta eminentemente por proteínas, también
reside una gran cantidad de carbohidratos, los que –en este contexto- son conocidos con
el nombre de mucopolisacáridos (ver apartado para identificación de hidratos de
carbono). Por ello, esta sustancia intersticial es dividida en dos porciones, como bien de
hubo mencionado: sustancia amorfa fundamental y matriz fibrilar. Esta última
corresponde al componente proteico de la MEC, entre cuyos constituyentes esenciales
encontramos al colágeno y a la elastina, componentes primordiales del tejido conectivo o
35
de sostén, las cuales se disponen conformando fascículos o cordones trabeculares, en

determinadas direcciones. En su totalidad, tanto el colágeno como la elastina participan
en el mantenimiento y equilibrio de las denominadas fuerzas biomecánicas tisulares,
correspondientes una serie de componentes de carga mecánica, proporcionada por
factores tanto intrínsecos (cinética celular invasiva y remodelación tisular) como
extrínsecos (fuerzas mecánicas externas, como también a modificaciones
histoarquitectónicas impresas por agentes exógenos, tales como microorganismos o
cuerpos extraños, que pueden ocasionar cambios en la configuración espacial de la red
proteica de sostén.
Fig. 27. Esquematización de las fuerzas biomecánicas que imprimen efectos en los
constituyentes fibrilares de la Matriz Extracelular, implicados en el mantenimiento de la
morfología tisular. Creación personal, Laboratorio de Patología Veterinaria, 2021.
Entre las fuerzas biomecánicas que se producen en los tejidos, podemos encontrar:
- Tracción: fuerza ejercida por ambos extremos de un fascículo fibrilar, en
direcciones opuestas, con tendencia al estiramiento.
- Compresión: fuerza impresa desde ambos extremos de un fascículo fibrilar, en
dirección centrípeta, con tendencia a la contracción.
- Flexión: fuerza proporcionada perpendicularmente al eje central del elemento,
con tendencia a generar un doblez. Lo anterior produce una compresión en su
parte cóncava y una tracción en la zona convexa (opuesta).
- Torsión: las fuerzas aplicadas, en diferentes puntos, actúan sobre el fascículo
generando un efecto de giro en dos direcciones contrarias.
36
- Cizalla o corte: hace alusión al fraccionamiento de un fascículo, producto de un

esfuerzo que producen fuerzas perpendiculares al eje longitudinal del elemento.
Este efecto suele ser consecuencia de uno de los tantos efectos deletéreos que
producen un grupo de enzimas conocidas como Metaloproteinasas de Matriz
(MMPs), las cuales fragmentan tanto componentes proteicos, como cadenas de
carbohidratos presentes en los tejidos.
a) Identificación de fibras de colágeno: el colágeno es uno de los componentes

esenciales de la MEC, el cual corresponde a un homotrímero (es decir, unidades
repetitivas compuestas por tres monómeros aminoacídicos diferentes y
concatenados) con disposición en triple hélice. Cada hebra que compone esta
triple hélice recibe el nombre de pro-colágeno, mide 300 nm de largo por 1,5 nm
de espesor y está constituida por una secuencia en tándem de 1050 aminoácidos
en total, donde tres de ellos conforman el trímero GXY, denominado así por seguir
el ordenamiento: Gly (glicina)-(X-Y), donde X e Y, en un 57%, corresponden a lisina
e hidroxiprolina. Posteriormente, cada extremo de la hebra de pro-colágeno posee
una secuencia reiterativa de residuos de prolina, segmento conocido como
telopéptido, el cual establece un enlace de tipo peptídico con el otro telopéptido
de su hebra aledaña.
C
B
A
Fig. 28. Esquematización tridimensional de los constituyentes moleculares el colágeno. A.

Hebra homotrimérica de procolágeno, compuesta por secuencias repetitivas de tres
aminoácidos en tándem. B. Hebra de colágeno, compuesta por varias cadenas de
procolágeno en disposición a-hélice. C. Fascículo de colágeno, compuesto por varias hebras
de colágeno. Creación personal con TinkerCAD, Laboratorio de Patología Veterinaria, 2021.
37
De este modo, estas hebras se disponen configurando fascículos, los cuales -a su

vez- se disponen en diferentes direcciones, abarcando gran parte de los confines
de la MEC. Esta macromolécula es uno de los principales exponentes a la hora de
efectuar el estudio de los efectos deletéreos que imprimen las metaloproteinasas
de matriz, sobre el colágeno, tanto en procesos inflamatorios, como neoplásicos;
estos patrones de daño se traducen en cambios en la disposición de las fibras,
reducción del grosor, disminución de la longitud y cambios en la gama de
coloración, cuando se hacen estudios con colorantes especiales, que permiten
visualizar en pleno estas alteraciones, las que se conocen –en su conjunto- como
patrones histomorfométricos. Si bien, existen cerca de 28 tipos de colágeno
identificados hasta la fecha, los más preponderantes para el estudio
histopatológico son los tipos I, II, III, IV, VII y XVII.
Nombre Ubicación Función
Colágeno tipo I Dermis, hueso, tendón, dentina y córnea. Resistencia al estiramiento.

Se entrelaza con tipos V,
VI, XII y XIII.
Colágeno tipo Cartílago, córnea embrionaria, notocorda. Resistencia a la presión intermitente. Se
II asocia al tipo IX.
Colágeno tipo Tejido conjuntivo laxo, paredes de vasos Sostén de órganos expandibles y
III sanguíneos, hígado, bazo, dermis y estroma componente de membranas basales. Se
de varias glándulas. Componente de la lámina asocia al tipo XII y XIII.
Electrón-Densa (LED) de la membrana basal.
Colágeno tipo Componente de la LED de la membrana basal, Sostén y filtración y componente inicial de
IV asociado al colágeno XVII y a la laminina. la LED, asociado a proteoglicanos como
Identificable sólo por IHQ. entactina y laminina.
Colágeno tipo Componente de la LED de la membrana basal, Entrelazado con colágeno tipo III a modo de
VII conocido también como fibras de anclaje o red, constituye la denominada reticulina.
refuerzo reticular.
Identificable sólo por IHQ.
Colágeno tipo No está presente en la MEC, sino que son Proteína fibrilar de transmembrana,
XVII pequeñas fibras de conexión ubicadas entre componente esencial de la lámina Electrón-
el hemidesmosoma y el colágeno IV. lúcida (LEL).
Fig. 29. Tabla que sintetiza los principales tipos de colágeno presentes en la matriz extracelular de los
tejidos animales, haciendo mención a su localización y función en su contexto determinado. Creación
personal, Laboratorio de Patología Veterinaria, 2021.
38
La principal técnica histoquímica –empleada bajo microscopía óptica de campo

claro- para realizar el estudio del colágeno se denomina Tricrómica de Masson,
tratándose de un método de coloración topográfica en tres colores contrastantes,
que efectúa la tinción diferencial y selectiva del colágeno en azul, citoplasmas y
fibras musculares en rojo escarlata y eritrocitos en amarillo ocre. Por otro lado,
como bien se mencionó, existe un método histoquímico especial para el estudio de
patrones histomorfométricos del colágeno, cuando el objetivo es estudiar el grado
de daño que adquiere la matriz extracelular fibrilar colágena, en presencia de
enzimas específicas, tanto en cuadros inflamatorios, como neoplásicos; este
método es conocido como Picrosirius Red y se emplea bajo microscopía de
polarización, con campo oscuro. Así, dependiendo del grosor y disposición de los
fascículos de colágeno, éste adquiere diferentes tonalidades, permitiendo
establecer un parangón entre situaciones de normalidad y variados grados de
noxa. De este modo, tenemos:
- Rojo a anaranjado: red de colágeno indemne, con fascículos gruesos, formando
cordones consistentes y continuos.
- Anaranjado a amarillo: red de colágeno con grado de injuria intermedio, los cuales
presentan –en promedio- un menor grosor y continuidad, respecto de una red
indemne.
- Amarillo a verde claro: cuando el colágeno presenta esta gama de coloración, se
asocia a un patrón de daño ocasionado por componentes tisulares enzimáticos,
que inducen un acortamiento de los fascículos de colágeno, una merma en el
grosor de los mismos y una disminución de la consistencia y continuidad de la red.
A B
C D
39
Fig. 30. Técnicas de coloración específicas para colágeno. A. Hígado de bovino con
distomatosis por Fasciola hepática, Hematoxilina & Eosina. B. Confirmación del patrón
cirrótico con técnica Tricrómica de Masson. C. Estudio de birrefringencia con microscopía
de luz polarizada, en un caso de carcinoma espinocelular cutáneo bien diferenciado
(Picrosirius Red, con birrefrinencia en rojo-anaranjado. D. Carcinoma espinocelular cutáneo
pobremente diferenciado, con birrefringencia en amarillo-verdoso. Laboratorio de
b) Identificación de fibras elásticas: las fibras elásticas son constituyentes proteicos

de la matriz extracelular fibrilar y tienen la función esencial de resistir a las fuerzas
de tracción y compresión, principalmente. Estructuralmente, cada fibra elástica
está compuesta por un núcleo central de elastina, el cual –a su vez- se compone de
sucesiones concatenadas de dos aminoácidos (desmosina e isodesmosina) y varios
filamentos de fibrilina, los cuales recubren –a modo de estriaciones longitudinales-
el corazón de elastina antes mencionado. El empleo de técnicas histoquímicas para
el estudio de elastina no es del todo habitual, sin embargo, es posible citar dos
métodos principales: Van Gieson Elástica y Orceína clorhídrica. El primero
demarca las fibras elásticas en un color negro, a su vez que –gracias al uso del
colorante de contraste Picrofuscina- el colágeno se visualiza en rojo y las fibras
musculares y citoplasmas en amarillo ocre. Por otro lado, la técnica de orceína
permite la detección de fibras elásticas en rojizo, mientras que los citoplasmas y
fibras musculares se colorean en verde y los núcleos en morado, gracias a las
coloraciones de contraste topográfico Verde luz y Hematoxilina de Harris,
respectivamente.
A B
Fig. 31. Campos de cortes histológicos de arterias musculares de erizo de tierra. A.

Técnica Elástica de Van Gieson. B. Técnica Orceína Clorhídrica de Unna Tanzer.
40
Identificación de amiloide
El amiloide es una proteína, cuya síntesis deriva de procesos netamente patológicos, por
lo tanto, no puede ser encontrada en tejidos indemnes. Morfológicamente y bajo tinción
corriente, se ha caracterizado como un depósito amorfo, hialino, eosinofílico, de
localización topográfica intersticial o extracelular, el cual puede confundirse fácilmente
con colágeno o sustancia amorfa fundamental, con la diferencia que el amiloide –a
diferencia del primero- no se dispone en fascículos continuos y consistentes, sino que –
debido a que su estructura consiste en un β-plegamiento aleatorio- se visualiza con un
aspecto más irregular; por otra parte, se distingue de los glicosaminoglicanos, en que
éstos –a la coloración de rutina- adquieren una afinidad tintorial muy débil por la eosina,
por lo que se observan de un color rosa pálido, mientras que el amiloide se aprecia en un
tono rosa fuerte. El daño principal que induce el amiloide en los tejidos es una atrofia
local en el sitio del depósito, comprimiendo las estructuras del parénquima y parte del
estroma.
Con respecto a su estructura orgánica, cada cadena de amiloide está compuesta por
polipéptidos con composición aminoacídica aleatoria y variada; el componente principal
se denomina fibrilla amiloídea y está formada por filamentos helicoidales de 7 a 10 nm de
diámetro, cada una de las cuales cuenta con una fracción glicoproteica, llamada
componente P y una matriz químicamente heterogénea, llamada componente C. Al
mismo tiempo, cada fibrilla se compone de filamentos, los cuales corresponden a sus
subunidades (proteínas β-plegadas), formando una estructura serpenteante y en dirección
ascendente. La figura A muestra un modelo tridimensional de un filamento de amiloide,
donde los aminoácidos se disponen –a modo de cuentas de collar- formando pliegues
sucesivos y cuyo eje (axis) muestra una trayectoria de crecimiento vertical, hasta formar
una fibrilla, la cual se asociará –mediante enlaces peptídicos- a otro filamento contiguo.
En este caso, cada segmento que está compuesto por cuentas de un color determinado,
corresponde a un pliegue beta. La figura B, la cual despliega un plano cenital del filamento
de amiloide, muestra en pleno la estructura β-plegada de esta proteína, en donde cada
surco corresponde al sitio de unión peptídica con otro filamento; de esta forma, las
uniones sucesivas de filamentos constituirán una fibrilla de amiloide. Al mismo tiempo,
este surco de β-plegamiento es el área donde se depositarán las moléculas de colorante
específico para detectar –de manera selectiva- esta estructura.
41
Si bien, su origen es tan complejo, como diverso, se ha establecido que existen dos
potenciales mecanismos principales, para comprender cómo se efectúa su síntesis y
depósito en el espacio tisular intersticial. De este modo, podemos aducir a dos tipos de
amiloidosis: primaria o autoinmune y secundaria o adquirida.
A B
Fig. 32. Esquematización tridimensional de un filamento de amiloide, el cual se

compone por segmentos aminoacídicos en disposición b-plegada (A). A cada filamento
de amiloide, en los surcos libres formados por cada pliegue, se añade otro filamento en
sentido antiparalelo, formando así una fibrilla helicoidal. Creación personal con
TinkerCAD, Laboratorio de Patología Veterinaria, 2021.
a) Amiloidosis primaria: se asocia con un mecanismo de generación autoinmune, en

el que se produce una discrasia inmunocítica, es decir, se trata de una disociación
y disrupción de las cadenas livianas de las inmunoglobulinas, las cuales constituyen
un componente proteico precursor de amiloide, denominado AL, localizado –
inicialmente- en el interior de las células plasmáticas. Se observa en el 20% de las
neoplasias derivadas de estas células, los cuales reciben del nombre de mielomas.
b) Amiloidosis secundaria: también denominada reactiva, se vincula a procesos
patológicos diversos, normalmente inducidos por agentes exógenos. En este caso,
se hace referencia a trastornos inflamatorios (iniciados por infecciones con
agentes etiológicos diversos), neoplasias y cuadros necróticos. El origen de este
subtipo reside en los hepatocitos, los cuales –ante las condiciones antes
mencionadas- sintetizan y liberan un reactante de fase aguda, denominado HDL-3
(lipoproteínas de baja densidad) que participa activamente en la inflamación,
sobre todo, ante casos de degeneración o daño celular. La acumulación progresiva
de HDL-3 dará paso al clivaje proteolítico de componentes proteicos normales de
las células plasmáticas, dando paso a la génesis del componente AA, el que –tras
42
adiciones sucesivas- irá constituyendo estructuras proteicas fasciculares

irregulares.
Independiente de su génesis, el amiloide se puede identificar con varias técnicas de
coloración, entre las cuales podemos encontrar el cristal violeta y la Tioflavina S
(colorante fluorescente). Sin embargo, el método histoquímico por antonomasia para la
detección de amiloide es el Rojo Congo Alcalino, el que permite la demarcación selectiva
del mismo en un color rojo ladrillo. Al mismo tiempo, cuando un preparado positivo a
amiloide se observa bajo microscopía de luz polarizada y teñido con Rojo Congo, éste
emite una birrefringencia característica en verde manzana.
A B C
Fig. 33. Demostración de la presencia de amiloide en un caso de amiloidosis intramesangial. A.

Material amorfo eosinofílico extracelular, con coloración corriente (Hematoxilina & Eosina). B.
Coloración de Rojo Congo positiva en rojo ladrillo (Rojo Congo Alcalino). C. Confirmación de la
presencia de amiloide bajo luz polarizada, en corte teñido con Rojo Congo Alcalino. Laboratorio
de Patología Veterinaria, 2021.
Identificación de Regiones Organizadoras Nucleolares (NORs)

Este método se utiliza, en gran medida y en concomitancia con técnicas de marcación
inmunomolecular, para el estudio del pronóstico y potencial proliferativo celular. Dentro
de los tipos de Ácido Ribonucleico (ARN) implicados en la síntesis de proteínas,
encontramos: ARN mensajero (ARNm), el cual se obtiene a partir de una réplica de una
hebra de ADN, derivado de la transcripción, y que sirve como molde para la síntesis de
proteínas en la etapa de traducción; ARN transferente (ARNt), el cual es un polímero
corto de 80 ácidos nucleicos, que cuenta con un triplete anticodón complementario al
codón del ARNm y que transfiere un aminoácido específico al polipéptido en crecimiento
(traducción de ARNm y síntesis proteica); ARN ribosomal o ribosómico (ARNr), el cual
juega un rol sustancial en la actividad celular global, pues está combinado con proteínas y
contribuye a la síntesis de las subunidades ribosomales mayor y menor, las cuales –a su
vez- son fundamentales para alojar el molde de ARN mensajero y así permitir fluidamente
la síntesis de proteínas. Al mismo tiempo, son el centro catalítico de los ribosomas, pues
43
entablan los enlaces peptídicos entre los aminoácidos del polipéptido en construcción,
actuando como ribozimas (ácidos nucleicos con capacidad de generar actividad
enzimática). En las células eucariotas, un 80% está localizado en el citoplasma y un 20% en
el núcleo, específicamente en el nucléolo, sitio en el que se produce la síntesis del ARN
ribosomal.
ARN pol I
B23
C23
UBF
Fig. 34. Esquematización de la localización de las Regiones Organizadoras Nucleolares en un

cromosoma acrocéntrico. Las secuencias de ADN cromosómico codifican para el ARN
ribosómico, el cual se posiciona en el nucléolo y circundado por cuatro proteínas no histónicas,
que facilitarán -posteriormente- el ensamblaje de las unidades ribosomales. Creación personal,
En este contexto, comenzaremos refiriéndonos a las llamadas Regiones Organizadoras

Nucleolares. Éstas se localizan en un determinado número de cromosomas, los cuales
varían dependiendo de la especie y de la célula eucariota, situándose en la posición
terminal de los brazos cortos de los cromosomas acrocéntricos, con dirección hacia el
nucléolo (de ahí su denominación). Cada región corresponde a un segmento de
nucleótidos en tándem, codificantes para ARN ribosómico; esta codificación se lleva a
cabo con la colaboración de tres nucleoproteínas ácidas no histónicas, localizadas en
torno a estas secuencias, la cuales reciben los siguientes nombres: B23 (o nucleolina),
C23, ARN Polimerasa I y UBF (Upstream Binding Factor). En su conjunto, estas proteínas
se detectan gracias a una técnica denominada AgNOR, en la cual –gracias al tratamiento
con sales de plata en solución coloidal, a un pH 3.0- permite su visualización en negro,
mientras que el resto del nucléolo se distingue en un color marrón.
44
Los resultados obtenidos a partir de este método deben expresare por medio de un
recuento de sumatoria de NORs en 10 campos de gran aumento (40X). En general, los
procesos neoproliferativos malignos, tales como carcinomas, sarcomas, mastocitomas de
alto grado, melanomas, entre otros, presentan un recuento elevado de NORs, puesto que,
considerando que las células neoplásicas se caracterizan por evadir los puntos de control
de restricción del ciclo celular –donde el objetivo es detener el ingreso a una determinada
fase del mismo y evitar así la continuación de su crecimiento- éstas comienzan un ciclo de
proliferación reiterativa y sostenida en el tiempo, evadiendo los mecanismos de inducción
de senescencia (tales como autofagia y apoptosis); en esta etapa de crecimiento, se
requiere de la síntesis de un sinnúmero de proteínas que participan en la fase expansiva
de una neoplasia, en la que se requiere de la presencia de ribosomas, para permitir la
traducción del ARNm y formación de polipéptidos. Entre estas proteínas encontramos a
factores de crecimiento, péptidos proangiogénicos, factores de motilidad, integrinas de
anclaje a la MEC y al endotelio, metaloproteinasas, entre otros; en consecuencia, las NORs
nos otorgan información sobre la actividad transcripcional de una célula, que es elevada
per se en una neoplasia, con más ahínco si es maligna.
A B
Fig. 35. Demostración histoquímica de las Regiones Organizadoras Nucleolares, gracias al

método de AgNOR. A. Carcinoma Espinocelular bien diferenciado en erizo de tierra. B.
Mastocitoma de alto grado en un canino. Laboratorio de Patología Veterinaria, 2020.
De esta forma, para el estudio del potencial proliferativo de una neoplasia –en conjunto
con marcadores inmunohistoquímicos de pronóstico- es necesario estimar el promedio de
NORs tingibles3 y establecer lo que se conoce como Tiempo de Generación, concepto que
hace alusión al lapso que demora una célula en completar su ciclo de crecimiento,
incluyendo desde síntesis de ARNm y proteínas (G1), replicación del ADN (fase S),
monitoreo de la maduración celular (G2), hasta la mitosis. Un elevado recuento de NORs
3
Dícese de una estructura que resulta identificable a la microscopía, dada su afinidad por un determinado
colorante o reactivo empleado en una técnica.
45
supone un bajo tiempo de generación, vale decir, la célula crece a una rápida velocidad,
evadiendo incluso la fase G2, en la que participan los factores promotores de la
maduración, consistentes en el conjugado proteico Ciclina B1/CDK1, antes del ingreso a la
instancia de división. Estudios en mastocitomas caninos como el de Sledge et al. (2016)
fijan un umbral de distinción entre bajo grado (mejor pronóstico) y alto grado (mal
pronóstico), mediante el Score AgNOR, en un promedio de 54 NORs por 10 campos de
gran aumento; de esta forma, un score ≥54 NORs, corresponde a un mastocitoma de bajo
grado, mientras que un score <54 NORs, equivale al diagnóstico de un mastocitoma de
alto grado.
Fig. 36. Esquematización tridimensional de las Regiones Organizadoras Nucleolares, las cuales se
posicionan en el telómero del brazo corto de los cromosomas acrocéntricos. La esfera irregular
situada más al fondo corresponde al nucléolo, sitio en el que se produce la codificación del ADN
a ARN ribosómico, el que se ensamblará junto a sus cuatro proteínas (en colores verde, rojo,
amarillo y marrón). Creación personal con Tinkercad, Laboratorio de Patología Veterinaria,
2021.
Identificación de componentes hormonales del sistema APUD
Hoy en día, se afirma que el sistema endocrino no está remitido únicamente a un grupo de
órganos o tejidos, sino que los tejidos de todos los sistemas orgánicos son capaces de
sintetizar y liberar mediadores químicos, capaces de controlar -regulando al alza, feedback
positivo, o a la baja, feedback negativo- los más diversos procesos biológicos que tienen
lugar en el organismo.
Hasta hace unas décadas, desprendiéndose de la premisa mencionada a priori, se pensaba
que existía una variante del sistema endocrino, la cual consiste en grupos celulares
específicos, asociados a tejidos epiteliales glandulares, tanto endocrinos, como exocrinos,
las cuales se encuentran ampliamente distribuidas en los diferentes sistemas, razón por la
cual se le acuñó el término de Sistema Endocrino Difuso. Precisamente, los avances en la
endocrinología abrogaron el empleo de esta denominación y se ha decidido adoptar una
46
nueva clasificación a estas células con funciones reguladores específicas y que no forman
parte de la trama tisular de un órgano endocrino, la cual conocemos hoy como sistema
APUD, del inglés, Amine Precursor Uptake Decarboxylase (sistema de captación y
descarboxilación de los mediadores amino precursores). Pese a que gran parte de estos
productos poseen una función endocrina, también están implicados en la regulación de la
actividad nerviosa, pues -en este grupo- encontramos así mismo a variados
neurotransmisores. Por este motivo, en caso que estas células desarrollen una
transformación de carácter neoplásico, estos procesos reciben el nombre de neoplasias
neuroendocrinas, entre cuyas particularidades se encuentra su elevado potencial invasivo
y metastásico, vinculados a un pobre pronóstico de sobrevida.
Fig. 37. Representación global de la reacción de descarboxilación enzimática de aminoácidos,

para producir la síntesis hormonal.
Para desarrollar y contextualizar lo anterior, el sistema APUD consiste en un conjunto de

enzimas que remueven el grupo carboxilo (-COOH) de aminoácidos precursores de
hormonas, los cuales se conocen como aminas biógenas. Como se mencionó, estos
aminoácidos son el eslabón previo antes de adquirir capacidad funcional endocrina, una
vez retirado su grupo carboxilo; gran parte de estos productos hormonales se sintetizan y
liberan en variadas células del organismo, aunque su mayor número se despliega en el
tubo digestivo, glándulas anexas, en este caso, el páncreas y glándula adrenal.
Por lo tanto, sus funciones -aunque variadas- suelen asociarse a regulación de la motilidad
de las capas musculares del tubo digestivo, estimulación de secreción pancreática (de
acuerdo a requerimientos sistémicos), activación del centro emético, regulación de la
contractibilidad vascular sanguínea, medición de respuestas de hipersensibilidad tipo I
(inmediata o alérgica), entre otras funciones.
La siguiente tabla sintetiza las funciones de las principales secreciones neuroendocrinas.
47
Péptido APUD Aminoácido Órgano, tejido o Función

células
Serotonina Triptófano Mastocitos, células Regulación del tono y
neuroendocrinas del motilidad de las capas
epitelio digestivo, musculares del tubo
neuronas del plexo digestivo,
mientérico. vasoconstricción y
modulación de la
coagulación.
Adrenalina Tirosina Médula adrenal. Relajación de
musculatura lisa de las
vías respiratorias,
contracción de la
musculatura lisa en
arteriolas, estimula la
secreción pancreática
de las células b
(insulina), estimula la
glucogenólisis en
hígado y musculo
esquelético, aumento
de frecuencia cardiaca
y respiratoria y
aumento de la
lipólisis.
Histamina Histidina Mastocitos, neuronas. Activación de la
respuesta alérgica
innata, mediada por
mastocitos, aumento
de permeabilidad
vascular, quimiotaxis y
adhesión leucocitaria,
estimulación de las
células parietales y
principales gástricas.
GABA (Ácido g-amino- Ácido glutámico Células de Kulchitsky Neurotransmisor con
butírico) (epitelio respiratorio funciones inhibidoras.
bronquial).
48
Dopamina DOPA (Di- Neuronas del Sistema Regulación al alza del

hidroxi-fenil- Nervioso Central, circuito de la
alanina) médula adrenal. sensación de
recompensa,
motivación,
regulación de la
producción láctea.
Fig. 38. Tabla resumen de los principales mediadores neuroendocrinos del sistema APUD, en la
que se incorporan hormonas y neurotransmisores, con sus respectivas funciones efectoras y
células encargadas de su síntesis y liberación. Laboratorio de Patología Veterinaria, 2021.
Estos productos se almacenan en el interior del citoplasma de las células neuroendocrinas,

a modo de discretas granulaciones, imperceptibles a la coloración corriente, sin embargo,
considerando que, durante la síntesis de estos mediadores neuroendocrinos, se forma un
grupo éster y aniónico (COO-), esto le confiere a estas moléculas la capacidad para atraer -
electrostáticamente- cationes divalentes, proveniente de sales de cromo (Cr++) y plata
(Ag++); estas propiedades reciben el nombre de cromafinidad y argentafinidad,
respectivamente. Para nuestros efectos, citaremos únicamente a la segunda de las
propiedades mencionadas, para lo cual, emplearemos un método histoquímico
denominado Reacción de Grimelius, tras cuyo proceso se visualizarán los gránulos
neuroendocrinos como finos acúmulos granulares negros, dispersos en todo el
citoplasma y excediendo los límites citoplasmáticos inclusive. Por otro lado, el resto de
los componentes tisulares (tejido conjuntivo, citoplasmas, fibras musculares, etcétera), se
observarán en una tonalidad caramelo amarillenta.
A B
A A
Fig. 38. A. Trastorno neoproliferativo pulmonar, de apariencia neuroendocrina, en un canino. Hematoxilina & Eosina.
B. Reacción de Grimelius positiva en células neoplásicas (flecha roja). Laboratorio de Patología Veterinaria, 2021.
49
Identificación de lípidos
Los lípidos son biomoléculas apolares e hidrofóbicas, los cuales se encuentran
ampliamente distribuidos en los tejidos animales. Dado que están compuestos, en gran
parte, por segmentos apolares, normalmente provistos de cadenas metílicas, son
disueltos en los fluidos deshidratantes empleados durante el histoprocesamiento, tales
como el Ottix Plus®, benceno, cloroformo y xileno. Por ello, los adipocitos (células del
tejido conectivo que están provistas de grandes inclusiones grasas intracitoplasmáticas)
son visualizados a como estructuras circulares dispuestas en empalizada, en las que
únicamente se denotan sus límites citoplasmáticos y su núcleo constreñido hacia la
periferia, no así su citoplasma, el cual se observa en blanco y de aspecto vacuo, cada vez
que el tejido es procesado con protocolos convencionales.
No obstante, como se hubo mencionado, existen protocolos de histoprocesamiento
expreso, los cuales no emplean agentes apolares, sino que los tejidos son inmersos de
forma directa en un medio hidrofílico (por ende, no presenta afinidad molecular por los
lípidos), denominado OCT®, además de un equipo especializado para el seccionamiento de
los tejidos a espesor micrométrico, conocido como crióstato. En éste, el fragmento tisular
es tratado a temperatura de congelación (-20°C), con el objeto de facilitar la formación de
un bloque sólido, resistente al corte histológico. Como resultado de este proceso, las
fracciones lipídicas de la matriz tisular no sufren modificaciones químicas, manteniendo
indemnes sus estructuras y permitiendo su coloración con determinados colorantes,
específicos para la detección de lípidos. Desde el punto de vista histoquímico, los lípidos
se pueden clasificar según su capacidad de unión a ciertas moléculas colorantes, en virtud
de su configuración molecular:
•Grasas neutras: •Fosfolípidos:

detectadas con empleo de
lisocromos, como colorantes
catiónicos, para su
el Oil Red o el fracción hidrofílica,
Negro Sudán. como el Luxol Fast
Blue.
•Glicolípidos: •Lípidos cíclicos:

empleo de métodos
métodos para específicos de
azúcares, como la escaso empleo en
Reacción de PAS. rutina.
50
a) Grasas neutras: también llamados como triacilglicéridos, están compuestos por

tres cadenas hidrocarbonadas asociadas –mediante enlaces éster- a una molécula
de glicerol.
Fig. 39. Corte histológico, obtenido mediante congelación, de un hígado de bovino con
esteatosis severa, teñido con técnica de Oil Red. Laboratorio de Patología Veterinaria,
2021.
Teniendo en cuenta su estructura molecular apolar, es decir, desprovista de

radicales aniónicos y catiónicos responsables de conferir una carga neta > 0 a su
estructura, son detectados de forma diferencial gracias al empleo de una familia
especial de colorantes conocida como lisocromos -que carecen así mismo de
radicales auxocromos- el principal de los cuales se denomina Oil Red, que permite
su coloración en una tonalidad rojo anaranjada.
b) Fosfolípidos: macromoléculas anfipáticas, es decir, provistas de un extremo

hidrofílico (dotado de carga iónica y soluble en solvente polares, como agua y
alcoholes) y uno hidrofóbico, insoluble en agua y soluble en solventes apolares,
como el xileno, cloroformo y tolueno. Químicamente, están provistos de una
molécula de glicerol y tres cadenas hidrocarbonadas, una de las cuales está
enlazada al glicerol por medio de un grupo fosfato (PO43-), formando así un enlace
éster-fosfato.
A
A
51
Fig. 39. Campos de un corte histológico de cerebelo de equino. A. Tinción con Hematoxilina &
Eosina. B. Tinción con Luxol Fast Blue, en el que la sustancia blanca se aprecia en un color azul
cobalto. Laboratorio de Patología Veterinaria, 2020.
Esta unión se asocia, a su vez, a un grupo bioquímico específico, localizado al final

de la molécula, el cual puede variar, dando como resultado variantes de
fosfolípidos, de acuerdo al nombre del este radical; de este modo, si el grupo
presente es colina, la molécula se denomina fosfatidilcolina; si es serina,
fosfatidilserina; si es etanolamina, fosfatidiletanolamina, etcétera. En nuestro
contexto, existe una estructura celular altamente compleja y especializada,
conocida como vaina de mielina, la cual circunda los axones neuronales y que
facilita la transmisión del impulso nervioso mediante conducción saltatoria, a
través de los nodos de Ranvier. Entre los principales fosfolípidos constituyentes de
esta estructura podemos encontrar a los esfingolípidos como: esfingosina
fosfocolina y esfingosina fosfatidiletanolamina. Todos son lípidos complejos,
compuestos por una fosfatidilcolina y una ceramida; por otro lado, el grupo fosfato
presente en la estructura, permite la unión de un colorante específico para vaina
de mielina, conocido como Luxol Fast Blue, el que produce su coloración selectiva
en un color azul cobalto.
c) Glicolípidos: corresponden a lípidos que, producto de una modificación

postransduccional del tipo glicosilación, poseen un monómero de azúcar
(monosacárido de esfingosina) asociado –mediante un enlace β-glucosídico- a una
molécula de ácido graso; este complejo recibe el nombre de ceramida. En las
matrices tisulares, existen diversos glicolípidos, situándose principalmente como
parte de la vaina de mielina, como es el caso de los cerebrósidos y gangliósidos. En
consideración que poseen un carbohidrato en su estructura, las técnicas
histoquímicas más adecuadas para su detección son los métodos ya tratados a
priori, en el acápite correspondiente para identificación de hidratos de carbono.
d) Lípidos cíclicos: la subunidad molecular de estos lípidos es denominada como

ciclopentanoperhidrofenantreno, consistente en tres anillos de seis carbonos y un
anillo pentacarbonado, entre los cuales podemos citar –principalmente- al
colesterol, hormonas esteroidales (testosterona y estradiol) y glucocorticoides
como el cortisol. Si bien, en un pasado, existían métodos histoquímicos para la
demarcación específica de estos lípidos, éstos han sido relegados a la
obsolescencia.
52
Reacción metacromática
Cuando el sustrato tisular, al ser tratado con una gama de colorantes específicos –
denominados, así mismo, como metacromáticos- emite una longitud de onda –traducida
en un determinado color- diferente a la tonalidad original del colorante empleado,
hablamos de metacromasia (del griego, Meta- , más allá de y -khroµos, -khromos,
color).
Ciertas matrices tisulares tienen características químicas únicas y particulares,
consistiendo en biopolímeros polianiónicos, es decir, provistos de una secuencia de
aniones (carga negativa) situados en tándem (uno tras otro) y espaciados el uno del otro
por una distancia de 0,5 nm. Este tipo de matrices de tejido recibe un nombre específico,
desde el punto de vista histoquímico, siendo conocidas como cromótropos; ejemplos de
éstos tenemos a la matriz cartilaginosa (que circunda los condrocitos de forma territorial e
interterritorial), correspondiente al sulfato de condroitina y al medio intracitoplasmático
de los mastocitos, en este caso, sulfato de heparina. Ambos medios moleculares tienen
en común el hecho que están compuestos por macromoléculas –clasificadas como
carbohidratos- provistas de una elevada concentración electrolítica aniónica, es decir,
polianiones. Ahora bien, si son carbohidratos ¿por qué simplemente no se identifican con
los métodos tratados en el párrafo destinado a esta clasificación? Debido a que, los
colorantes empleados para aquellas técnicas se ven imposibilitados de teñir de forma
directa estas estructuras, por un efecto volumétrico o estérico; de este modo, tanto el
colorante empleado en la Reacción de PAS (pararrosanilina), como el Alcian Blue, son
moléculas tan grandes que –al interaccionar con una secuencia de aniones separados por
un espacio tan exiguo- no logran entablar los enlaces químicos adecuados para lograr una
coloración estable. Es por este motivo, que estas estructuras –preferentemente- resultan
mejor demarcadas con colorantes de geometría molecular planar, como es el caso del
Azul de toluidina.
Si bien, el Azul de toluidina emite un color situado en la gama de los azules (480-530 nm),
cuando interacciona con otras estructuras tisulares, en el caso de estar en contacto con un
cromótropo –como los recientemente mencionados- se produce un cambio en su
espectro de absorción y reflexión, percibiéndose una coloración, dependiendo del largo de
la secuencia polianiónica, en una mayor λ (color rojo, hacia los 650-750 nm) o menor λ
(color violeta, hacia los 400-475 nm).
Fig. 40. Estructura molecular del colorante Azul de toluidina, en la que se aprecia su geometría
planar (180º), lo que es crucial para la comprensión del fundamento de la metacromasia.
53
De este modo, podemos citar dos tipos de metacromasia:
Tipo de metacromasia Color emitido Estructura de la matriz tisular

α-metacromasia (alfa) Azul Monomérica (moléculas simples).
β-metacromasia (beta) Púrpura Di y triméricas (agregados de 2 o
tres moléculas).
γ-metacromasia (gamma) Púrpura-violáceo Polímero de varios agregados
concatenados de polianiones,
asociados a su respectiva molécula
de colorante.
Fig. 41. Tabla resumen de los tipos de metacromasia y su color. Creación personal, Laboratorio
de Patología Veterinaria, 2021.
A B
A A
Fig. 42. Campos de cortes histológicos de mastocitomas cutáneos caninos, teñidos con Azul de
toluidina. A. Mastocitoma de bajo grado con metacromasia positiva (o g-metacromasia). B.
Mastocitoma de alto grado, con metacromasia negativa (o a-metacromasia). Laboratorio de
Una aplicación práctica de este método se emplea para el diagnóstico y graduación de

neoplasias de células cebadas en caninos, denominadas mastocitomas. Así, mientras más
diferenciado es el mastocitoma, es más benigno y –por ende- sus gránulos de heparina
intracitoplasmáticos se expresan en grandes concentraciones; esto implica que, en el
interior de la célula, existe una gran cantidad de secuencias polianiónicas, que ofrecerán
un resultado de metacromasia positiva e intensa (γ-metacromasia), la cual se visualiza en
púrpura-violáceo. Por su parte, los mastocitomas pobremente diferenciados –de peor
pronóstico- poseen una cantidad significativamente menor de gránulos de heparina, en
consecuencia, existe una concentración considerablemente menor de heparina en su
medio intracitoplasmático, lo que se traduce en una metacromasia negativa (α-
metacromasia); en este caso, los mastocitos se observan en una tonalidad azul marina.
54
Identificación de iones y complejos minerales

Cuando nos referimos a compuestos iones y complejos minerales, en histoquímica,
hacemos alusión a las fracciones inorgánicas que pueden estar presentes en un tejido, ya
sea, de manera fisiológica (como en el caso de la matriz ósea), o patológica (producto de
intoxicaciones o cursos de mineralización). En este caso, analizaremos las técnicas para la
detección diferencial de sales de calcio y cobre.
a) Identificación de sales de calcio: el calcio suele estar presente en el organismo en
dos formas químicas posibles: catión divalente libre (Cu++ o ion cálcico),
encontrándose mayoritariamente en circulación sanguínea o asociado a
compuestos aniónicos, formando sales, tales como el fosfato de calcio (CaPO4),
carbonato de calcio (CaCO3) y sulfato de calcio (CaSO4), en este caso, formando
parte de los tejidos. Como se ha mencionado, las sales de calcio forman parte
sustancial de los tejidos mineralizados, tales como la matriz ósea y estructuras
especializadas, como los dientes (en el caso de la dentina). Sin embargo, en el caso
de procesos patológicos, también se producen procesos de mineralización, en este
caso, calcificación; de acuerdo al mecanismo etiopatogénico de este fenómeno y
dependiendo de su desencadenante, podemos citar dos tipos de calcificación:
- Distrófica: está vinculada a cuadros necróticos, inflamatorios, neoplásicos,
infecciosos, deficiencias nutricionales, estrés oxidativo y respuestas a cuerpo
extraño (reacciones granulomatosas con calcificación), todos estos procesos en
los que subyace una falla orgánica o metabólica, tanto derivada de procesos
endógenos (por ejemplo, trastornos neoplásicos), como exógenos (por
ejemplo, infecciones).
- Metastásica: se producen como un proceso secundario a hipercalcemia,
generalmente producto de insuficiencia renal crónica, hiperparatiroidismo,
intoxicación por metabolitos de la vitamina D (mayormente vitamina D3 o 1,25-
D-trihidroxicalcitriol), incluyendo también algunos trastornos neoproliferativos
malignos, como es el caso de los osteosarcomas, en los que se produce una
resorción de la matriz ósea, por acción osteoclástica, incrementando los niveles
de calcio en circulación.
Bajo coloración corriente, el calcio suele evidenciarse en forma de estructuras

basófilas irregulares, las cuales pueden ser más o menos nítidas, dependiendo de
la concentración a la cual estén presentes en los tejidos. En ambos casos, los
depósitos anómalos de sales de calcio en los tejidos se pueden identificar con la
Reacción de Von Kossa, la cual emplea sales de plata y acción de luz ultravioleta,
para inducir un depósito selectivo en el sector específico donde se encuentran
estos complejos salinos, los cuales se demarcan en negro. Por su parte, el tejido
conectivo y los citoplasmas se contrastan con verde luz, observándose, por ende,
en un color verde.
55
A B
A A
Fig. 43. Campos de cortes histológicos de un pulmón de canino, con un cuadro de neumopatía
urémica. A. Tinción con Hematoxilina & Eosina. B. Reacción de Von Kossa, en la que los
depósitos de sales calcáreas se distinguen en negro, en torno a la lámina propia alveolar.
b) Identificación de cobre: a diferencia del calcio, el cobre es un oligoelemento que

está presente a niveles traza en el organismo y suele encontrase, ya sea, libre,
como asociado a proteínas de almacenamiento (metalotioneína) y/o transporte
(ceruloplasmina). En ciencias veterinarias, el estudio de cobre en los tejidos suele
apuntar al estudio de intoxicaciones con productos alimentarios y pesticidas e
insuficiencia hepática, presentándose como discretos acúmulos globulares
anaranjados e intracitoplasmáticos; en caso de que se lleve a cabo una respuesta
innata de fagocitosis, ésta puede mediada por macrófagos, los que se visualizan
como células voluminosas provistas de acúmulos puntiformes y globulares en el
color antes mencionado.
A B
A B
Fig. 44. Campos de cortes histológicos de un hígado de canino, con un cuadro de intoxicación
por cobre. A. Tinción con Hematoxilina & Eosina, en la que se observan depósitos globulares
café-anaranjados. B. Reacción con Ácido rubeánico, donde se visualizan los depósitos de cobre
en negro. Laboratorio de Patología Veterinaria, 2020.
56
Si bien, todos los metabolitos cuprosos son metabolizados en el hígado, este

último no es especialmente susceptible a su acumulación, pues los hepatocitos
sintetizan una proteína de almacenamiento denominada metalotioneína (MET), la
cual tiene afinidad selectiva por cationes divalentes, como el cobre y el cobalto.
Cuando los niveles de cobre intrahepático son muy elevados y todos los sitios
reactivos de la MET están siendo ocupados por iones cuprosos (Cu++), éstos
pueden ser transportados vía hemática hacia la circulación renal, con el objeto de
efectuar la ultrafiltración glomerular, sin embargo, esta presentación química es
altamente nociva para el parénquima renal, induciendo necrosis tubular y un
severo cuadro hemorrágico y hemolítico, adicionales a la acumulación
concomitante en estructuras tubulares, glomerulares e intersticio. El método
histoquímico diferencial para la identificación de cobre se denomina Reacción del
Ácido rubeánico, la cual consiste en la captura selectiva y precipitación cationes
divalentes, en este caso, el ion cuproso, lo que resultará en una coloración marrón
verdosa acerada. Al igual que en la Reacción de Fouchet, se suele emplear una
tinción de contraste denominada Picrofuscina, la que permite colorear el colágeno
en rojo y los citoplasmas y fibras musculares en amarillo ocre.
Identificación de pigmentos biológicos
Hemoglobina
Hematógenos Hemosiderina
Pigmento
Pigmentos biliar
Lipídicos Lipofuscina
No
hematógenos
Proteicos Melanina
Un pigmento se define como un complejo macromolecular, tanto endógeno, como

exógeno, dotado de una coloración natural. En el caso de los pigmentos biológicos,
también conocidos como biocromos, son sustancias producidas por diversas vías
metabólicas, los cuales poseen un color particular, tras la absorción selectiva de la luz
blanca.
57
En la mayoría de los casos, condiciones fisiológicas inclusive, estas estructuras son proclive
a depositarse formando acúmulos en determinadas localizaciones de la topografía tisular,
siendo detectables a la microscopía de luz incluso sin requerir de la técnica de coloración
corriente, para visualizarlos en una tonalidad particular y se presentan como acúmulos
globulares discretos, tanto intracitoplasmáticos, como extracitoplasmáticos, según sea el
caso. No obstante, la gran mayoría de los pigmentos presentes en tejidos animales se
caracterizan por presentar, en su totalidad, una condición de monocromía, es decir,
aquellos biocromos que serán objeto de estudio en diversas patologías presentan una
gama de coloración muy similar, oscilando entre en marrón anaranjado y el pardo. De esta
afirmación se escinde la importancia de recurrir a métodos histoquímicos especializados,
para permitir la detección selectiva de estas macromoléculas, las cuales poseen orígenes
metabólicos muy disímiles entre sí.
Desde el punto de vista biológico, podemos clasificar a los biocromos según su origen
metabólico en hematógenos y no hematógenos. Los primeros derivan, esencialmente, a
partir de la hemoglobina, pigmento bermellón presente en el interior de los citoplasmas
de los eritrocitos, la cual –mediante le paso de una serie de vías metabólicas- van
adquiriendo una tonalidad y localización tisular determinada. En esta clasificación,
podemos mencionar a la hemosiderina, hematoidina y bilirrubina (también denominada
como pigmento biliar). Por su parte, los pigmentos no hematógenos tienen su génesis a
partir de procesos en los que no se ven involucrados complejos del tejido sanguíneo; en
este caso, podemos clasificarlos en pigmentos proteicos y lipídicos. Mientras que los
proteicos provienen a partir de una serie de reacciones de oxidorreducción a partir de
ciertos aminoácidos, como la tirosina, que dará origen al pigmento melánico (melanina)
los lipídicos se originan tras reacciones de lipoperoxidación fosfolipídica, dando paso a la
formación de un grupo conocido como lipopigmentos, entre los cuales podemos
enumerar a la lipofuscina y al pigmento ceroide.
Pigmentos hematógenos
Su origen está ligado a la hemocatéresis o eriptosis, fenómeno de remoción fisiológica o
patológica de los hematíes, siendo el primer caso al cumplir su vida útil de 120 días en
circulación. Tras este evento, el cual tiene lugar –mayoritariamente- tanto en los
parénquimas esplénico como hepático (y, en menor medida, en la médula ósea), se
produce la liberación de la hemoglobina al espacio extracelular, induciendo la activación
del sistema fagocítico mononuclear (según el contexto tisular local: células de Küpfer en el
hígado y células retículo-endoteliales en el bazo). De este modo, los macrófagos tisulares
engloban y endocitan a la estructura cuaternaria integral de la hemoglobina. En el interior
del macrófago, se produce la activación de la enzima hemooxidasa, la cual actúa
directamente sobre el grupo prostético de la hemoglobina, produciéndose –en este
punto- la escisión de sus componentes originales en el grupo prostético (denominado
58
porfirina) y su corazón metálico, consistente en el catión divalente ferroso (Fe++), para

formar un pigmento verdoso conocido como biliverdina.
Aquellos remanentes de porfirina carentes de hierro que no sean derivados a
procesamiento enzimático intramacrogáfico, darán paso a un proceso de cristalización,
conformando un pigmento amarillo áureo llamado hematoidina, el cual es exocitado y
acumulado en el medio extracelular, observándose –sobre todo- en casos de hemorragias
profusas o hematomas organizados. A partir de este punto, obtendremos los dos
principales pigmentos hematógenos, que serán objeto de estudio y detección en el
presente curso:
Hemoglobina • Hemooxidasa
• Biliverdina
Biliverdina reductasa
• Transporte
Bilirrubina por albúmina
Pigmento biliar
(conjugación
hepática)
Fig. 45. Esquematización de la secuencia general de eventos moleculares que permiten la

formación del pigmento biliar, desde su estado basal como hemoglobina, hasta la conjugación
hepática con sales biliares. Creación personal, Laboratorio de Patología Veterinaria, 2021.
a) Bilirrubina: pigmento amarillo verdoso, derivado del grupo prostético de la

hemoglobina, la cual se origina luego de una reducción de la biliverdina, tras la
acción de la enzima biliverdina reductasa, la cual desarma el anillo tetrapirrólico
de la biliverdina, dando como resultado una estructura lineal. La bilirrubina es
requerida para la formación de la bilis, secreción oleosa, viscosa y verde acerada,
la cual es fundamental para la emulsión y absorción intestinal de los lípidos.
59
A B
A
Fig. 46. Campos de cortes histológicos de un hígado de canino, con un cuadro de intoxicación
por cobre y una consecuente obstrucción de los canalículos biliares, por una fibrosis secundaria,
generando un éstasis y acumulación de pigmento biliar en el parénquima hepático A. Tinción
con Hematoxilina & Eosina (ver pigmento café anaranjado). B. Reacción de Fouchet positiva.
HEMOGLOBINA
Fig. 47. Reacción de oxidación de la hemoglobina a biliverdina, producto de la acción de la

enzima macrofágica Hemooxidasa. Creación personal, Laboratorio de Patología Veterinaria,
2021.
Desde la histoquímica, el pigmento biliar es detectado mediante la Reacción de

Fouchet, la cual –mediante una reoxidación de la bilirrubina a su estado
precedesor, la biliverdina, se demarca en un color verde brillante.
Para cumplir con este propósito, la bilirrubina debe ser trasladada vía hemática
hacia el hígado, gracias a la albúmina, proteína transportadora por excelencia, la
cual –tras ingresar al parénquima hepático a través de la circulación sinusoidal-
será endocitada por los hepatocitos, para dar paso a las reacciones de conjugación
con los ácidos biliares (tales como, ácidos taurocólicos, desoxicólico,
quenosedoxicólico, ursodesoxicólico, glicocólico e hiodesoxicólico) y así constituir
60
las sales biliares. En su conjunto, estas sales serán encauzadas fuera del
parénquima hepático en la secreción biliar, mediante los colangíolos, los que se
anastomosarán en el conducto hepático, para ser almacenados en la vesícula biliar
y actuar en la emulsión grasa, de acuerdo a los requerimientos orgánicos. El 50%
de la bilirrubina que es absorbida en el epitelio intestinal es traspasada a la
circulación sanguínea, arribando a la circulación renal, para luego ser excretada en
forma de urobilinógeno, mientras que aquella bilirrubina que es absorbida, es
dirigida hacia el punto final de la digestión, produciéndose un pigmento
amarronado, conocido como estercobilina, que otorga la tonalidad característica a
las heces.
Fig. 48. Reacción de reducción de la biliverdina a bilirrubina (no conjugada), gracias a la acción
de la enzima Biliverdina reductasa. Creación personal, Laboratorio de Patología Veterinaria,
2021.
Ion ferroso
Ion férrico
Alto Bajo
requerimiento de requerimiento de
hierro hierro
Transporte ligado Almacenamiento

a transferrina ligado a ferritina
Eritropoyesis Hemosiderina
Fig. 49. Esquematización de los eventos metabólicos alternativos, que se producen dependiendo
de los requerimientos sistémicos de hierro. Se muestra la secuencia general para la síntesis de
hemosiderina. Creación personal, Laboratorio de Patología Veterinaria, 2021.
61
b) Hemosiderina: pigmento amarronado y birrefringente, el cual se forma a partir del

segmento metálico ionizado de la hemoglobina, el ion ferroso. Las sucesivas
reacciones de oxidorreducción acaecidas en el interior del macrófago dan paso a
un cambio en el estado de oxidación del ion ferroso, produciéndose –en
consecuencia- el ion férrico (Fe+++), el cual puede asociarse, nuevamente, a
diferentes grupos prostéticos, dependiendo de a los requerimientos de hierro del
organismo. Así, en caso de una elevada demanda sistémica de hierro, el ion férrico
es transportado –vía torrente sanguíneo- hacia la médula ósea, gracias a la
proteína transportadora transferrina, dando paso a un nuevo evento de
eritropoyesis. Por otro lado, en caso de menores exigencias de hierro, el ion es
vinculado a la proteína de almacenamiento ferritina, constituyendo así el
pigmento denominado hemosiderina. Cuando este pigmento se localiza en el
interior de los macrófagos, éstos reciben el nombre de hemosiderófagos.
La hemosiderina es identificada selectivamente gracias a la Reacción de Perls, la

cual permite virar su color a un azul intenso.
A B
A A
Fig. 50. Campo de un corte histológico de tejido esplénico en un canino, de un hematoma

organizado. A. Tinción con Hematoxilina & Eosina (ver pigmento en marrón). B. Confirmación de
hemosiderina con Reacción de Perls, en azul. Laboratorio de Patología Veterinaria, 2020.
Pigmentos no hematógenos
Pigmento melánico
La melanina es un pigmento marrón oscuro, la cual es sintetizada en los melanocitos,
células de origen neuroectodérmico derivadas de la cresta neural, correspondiente a un
grupo de células localizadas dorsalmente al tubo neural. Estas células suelen localizarse
aledañas a las células que constituyen el estrato proliferativo, tanto de la epidermis, como
del epitelio folicular piloso. En condiciones normales, son capaces de sintetizar y
almacenar este pigmento, el cual es responsable de dotar de una determinada tonalidad
62
al tegumento y –en casos puntuales- a las mucosas. La melanina se sintetiza a partir del
aminoácido L-DOPA (Dihidroxifenilalanina), a partir del cual se van sucediendo una serie
de reacciones oxidantes, hasta dar paso a la formación de un polímero de eumelanina. En
ciertos cuadros patológicos, en los que la melanina se distribuye con un patrón anómalo
ectópico, ya sea, en el interior de los melanocitos o melanófagos (como en los melanomas
pigmentados) o fuera de éstos (como ocurre en patologías inmunomediadas asociadas a
un daño en la membrana basal, como es el caso del complejo pénfigo, produciendo una
banda de pigmentación dermoepidérmica).
Para detectar la melanina, existe un método histoquímico específico, el cual aprovecha la
cualidad de este pigmento para atraer electrostáticamente los cationes de plata
(argénticos o Ag++), propiedad conocida como argentafinidad, por medio de un método
denominado Fontana-Masson. De este modo, la melanina es demarcada diferencialmente
en negro y –para facilitar su ubicación topográfica- se realiza un contraste de fondo (de
citoplasmas y matriz extracelular) con verde luz.
A B
A A
Fig. 51. Campo de un corte histológico de melanoma dérmico equino (ubicado en la base de la
cola). A. Tinción con Hematoxilina & Eosina, donde la melanina se observa en marrón. B.
Reacción de Fontana-Masson, en la que la melanina se torna a negro. Laboratorio de Patología
Veterinaria, 2021.
Lipopigmento: lipofuscina y pigmento ceroide
Cuando hablamos de lipopigmento, nos referimos a todos aquellos complejos

macromoleculares derivados de reacciones de lipoperoxidación de membranas lipídicas,
en las cuales intervienen directamente radicales libres, tales como, las especies reactivas
de oxígeno (ROS) y óxidos de nitrógeno (NOX), las cuales proliferan en grandes
concentraciones, tanto en condiciones fisiológicas (asociadas al envejecimiento celular),
como patológicas (neoplasias, intoxicaciones o trastornos alimentarios).
63
Teniendo en cuenta que las membranas lipídicas están compuestas –esencialmente- por
fosfolípidos, éstos son especialmente susceptibles a la acción de radicales libres,
induciendo su degradación oxidativa, gracias a la presencia de insaturaciones (en este
caso, dobles enlaces entre carbonos presentes en la cadena de ésteres de ácidos grasos);
ejemplos de estas estructuras son la fosfatidilserina, fosfatidilcolina y
fosfatidiletanolamina. El proceso en el cual los radicales libres capturan electrones no
enlazados, presentes en la membrana lipídica, se puede subdividir en dos instancias:
a) Fase I o iniciación: en este punto, los radicales libres del sistema están en contacto
directo con los fosfolípidos de las membranas lipídicas, dotándolos de una carga
neta negativa y pasando a ser denominados como lípidos peroxil-radicales (R-OO).
b) Fase II o propagación: en consideración que el lípido peroxil-radical es una
molécula muy inestable, se adiciona a otra cadena lipídica, con el objeto de
permitir la formación de un lípido peroxidado (R-OOH), responsable de la
disrupción irreversible de las bicapas lipídicas.
Fig. 52. Secuencia de pasos de la reacción de lipoperoxidación, la cual consiste en la

oxidación de lípidos insaturados, por la acción de especies reactivas de oxígeno, lo que da
paso a la formación de lípidos peroxidados. Laboratorio de Patología Veterinaria, 2021.
De este modo, se produce una sucesión de reacciones en cadena en la que los radicales
lipídicos, asociados a dobles enlaces, continúan captando radicales libres presentes en el
sistema. La adición continua de estos lípidos peroxidados, en conjunto con diversas
glicoproteínas del glicocálix celular) permite la formación de un complejo pigmentado café
anaranjado, birrefringente y de múltiples glóbulos discretos, conocido como
lipopigmento, también llamado lipocromo. El método histoquímico que permite su
detección diferencial se denomina Reacción de Schmörl, la cual aprovecha la capacidad de
64
los lípidos en proceso de peroxidación (específicamente, en su estado aniónico de peroxil-

radical) para captar cationes divalentes, como el ion ferroso (Fe++). De este modo, el
lipopigmento es visualizado en una tonalidad azul verdosa, siendo contrastado con la
solución colorante picrofuscina, en la que el colágeno se visualiza en rojo y el resto de las
estructuras en amarillo ocre.
A B
Fig. 53. Campo de corte histológico de colon de un felino, con acumulación de

lipopigmento en lámina propia. A. Tinción con Hematoxilina & Eosina (pigmento en
marrón). B. Confirmación de la presencia de lipopigmento con la Reacción de Schmörl, en
verde azulado. Laboratorio de Patología Veterinaria, 2019.
Identificación de microorganismos
Si bien, con el advenimiento de técnicas de biología molecular, las cuales han permitido el
desarrollo de métodos muy exactos, sensibles y específicos para el estudio y detección de
microorganismos (dos de los cuales serán tratados inextenso en la segunda parte de este
capítulo), existen algunos métodos histoquímicos diferenciales para la determinación de
bacterias y hongos. Se trata de metodologías de amplio uso en histopatología, gran parte
de ellas de alta reproducibilidad, bajo costo y fácil implementación, que se aplican, ya sea,
para una detección tipo tamiz y general, como también para determinaciones algo más
específicas, sin ánimos de efectuar una tipificación por género y especie. En este apartado,
trataremos los métodos generales para bacterias (según propiedad bioquímica de su
pared celular y algunas técnicas para cierto tipo de bacterias) y hongos (los cuales también
pueden ser determinados gracias a la Reacción de PAS, como se trató en el apartado de
técnicas específicas para identificación de carbohidratos).
65
a) Método de Gram: esta técnica es una de las más difundidas en el campo de la

microbiología, pues permite una tinción diferencial de bacterias, en virtud de la
composición bioquímica de su pared celular. Teniendo en cuenta estos resultados,
es posible distinguir bacterias Gram positivas y Gram negativas. Las primeras
tienen en su pared un copolímero de naturaleza glicoproteica, denominada
Peptidoglicano (compuesto por Ácido N-acetil-murámico y N-acetil-glucosamina,
formando dímeros en tándem). Es el constituyente básico de este tipo de
bacterias, el que confiere resistencia y protección contra rupturas osmóticas a las
bacterias; aquellas que posean este complejo, tienen la capacidad para retener un
colorante denominado cristal violeta, que permitirá su visualización diferencial en
un color púrpura-violáceo. Entre los ejemplos de bacterias Gram positivas,
podemos citar a los géneros: Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Lactobacillus,
Listeria, Staphylococcus y Streptococcus. Por otro lado, las bacterias carentes de
peptidoglicano en su pared reciben el nombre de Gram negativas, las cuales están
compuestas por una capa muy fina de peptidoglicano y dos membranas lipídicas,
razón por la cual no logran retener el cristal violeta y únicamente logran afinidad
tintorial por la coloración de contraste, denominada safranina; por este motivo, se
visualizan en un color rojo-rosáceo. Algunos ejemplos de bacterias Gram negativas
son: Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Proteus mirabilis, Enterobacter
cloacae, Helicobacter pylori, Acinetobacter baumanii, entre otras.
Fig. 54. A-B. Campo de un corte histológico de piel de canino, con un cuadro de reacción de Splendore-Hoeppli, por presencia de
bacterias Gram positivas, en morado. Laboratorio de Patología Veterinaria, 2020. C-D. Microabsceso en tejido nervioso de un caprino
con signología nerviosa, sugerente de listeriosis. Hematoxilina & Eosina, 40X. D. Confirmación de presencia de bacterias Gram
positivas en el mismo campo anterior. Tinción de Gram, 100X. Laboratorio de Patología Veterinaria, 2021.
66
b) Método de Ziehl-Neelsen: técnica utilizada tanto en citología, microbiología, como

también en histopatología, es un método específico para la identificación
diferencial de los denominados Bacilos Ácido-Alcohol Resistentes (BAAR). En este
caso, se trata de ciertos géneros de bacterias que están provistas de una pared
celular rica en ácidos micólicos (una clase de ácidos grasos) la cual –con la adición
de calor y fenol- son capaces de retener selectivamente un colorante llamado
fucsina básica. Posteriormente, cuando son tratadas con etanol clorhídrico al 1%
(alcohol ácido), las bacterias aún retienen firmemente el colorante en su
estructura, mientras que el resto de los componentes de la matriz tisular quedan
desprovistos de coloración, razón por la cual esta propiedad es conocida como
ácido-alcohol resistencia. Los principales géneros de bacterias pertenecientes a
este grupo son: Mycobacterium spp y Nocardia spp, que resultan teñidas en un
intenso color fucsia; por su parte, para facilitar la orientación topográfica, los
núcleos son tratados con Azul de metileno, como colorante de contraste,
observándose posteriormente en un color azul claro.
Fig. 55. Campo de un corte histológico de válvula ileocecal de bovino, en la que se observa
un acúmulo de Bacilos Ácido-Alcohol Resistentes (BAAR) en lámina propia, en color fucsia,
con el método de Ziehl-Neelsen. Laboratorio de Patología Veterinaria, 2018.
c) Reacción de Warthin Starry: esta técnica es específica para espiroquetas y emplea

sales de plata, como agente de impregnación, e hidroquinona como agente
reductor de la plata. Las espiroquetas son un filo de bacterias Gram negativas,
caracterizadas por su morfología alargada y espiralada, entre las cuales podemos
encontrar géneros como Helycobacter spp y Leptospira spp. La técnica permite la
detección diferencial de estos microorganismos en negro, al tiempo que el resto
de las estructuras tisulares de fondo adquieren una tonalidad dorado-miel.
67
Al tratarse de agentes tan minúsculos, es importante efectuar su pesquisa con

precaución y minuciosidad, preferentemente utilizando aumentos mayores, como
40X y 100X (con aceite de inmersión); en el caso de la búsqueda de Leptospira spp,
causantes de cuadros de nefritis intersticiales no supurativas, éstas suelen ubicarse
en la porción luminal de los túbulos renales, contiguas al epitelio de ribete en
cepillo.
Fig. 56. Campo de un corte histológico de sección tubular del parénquima renal de un bovino,
en el que se observa la presencia de espiroquetas (en negro) en el luen tubular, aledañas al
epitelio tubular de ribete en cepillo. Reacción de Warthin-Starry, Laboratorio de Patología
Veterinaria, 2021.
d) Reacción de Grocott: esta técnica se utiliza de forma mayoritaria para la

identificación de estructuras fúngicas y, al igual que Warthin-Starry, permite la
detección diferencial de ciertos microorganismos, gracias al tratamiento con sales
de plata, esta vez, asociadas a un complejo con metenamina, el cual es un agente
alcalino derivado de la síntesis a partir de amoniaco y formaldehído, encargado de
regular el pH de la solución de incubación, para permitir la precipitación diferencial
de la plata en la pared celular fúngica y de ciertas bacterias, las que se observan en
un color negro, mientras que el fondo –nuevamente por la adición del colorante
de contraste verde luz- se observa en verde. Es importante hacer mención a que
este método se utiliza ampliamente para confirmar la presencia de ciertos géneros
de bacterias y hongos productores de una respuesta inmune retardada,
consistente en reacción granulomatosa no macrofágica y de predominio
plasmocítico, que es conocida como Reacción de Splendore-Hoeppli.
68
A B
A A
Fig. 57. Campo de un corte histológico la piel de un canino, en la que se aprecia una reacción de Splendore-
Hoeppli, producto de agentes del complejo YACS. A. Tinción con Hematoxilina & Eosina. En rosado intenso, se
visualiza la presencia de depósitos de inmunoglobulinas B. Reacción de Grocott, en la cual se distinguen
acúmulos de bacterias filamentosas en negro. Laboratorio de Patología Veterinaria, 2021.
Esta suele presentarse en dermis profunda y juntura muco-cutánea. Este

fenómeno se caracteriza por la aparición de una reacción granulomatosa, con la
presencia de los cuerpos antigénicos al centro y la formación de una corona
radiada de estructuras eosinofílicas amorfas, consistentes en depósitos de
inmunocomplejos (antígeno-anticuerpo), células inflamatorias y restos celulares en
un color liláceo, cuando es observada con la técnica de coloración corriente. En el
caso de infecciones bacterianas, existe un complejo de agentes causales de esta
reacción, entre los cuales podemos citar a los géneros: Nocardia spp, Botriomyces
spp y Actynomyces spp. Del mismo modo, mencionaremos al subgrupo de
bacterias YACS, también positivas para Grocott y productoras de la Reacción de
Splendore-Hoeppli, denominadas así por ser el acrónimo de: Yersinia sp,
Actinomyces sp, Actinobacillus sp, Arcanobacter sp, Corynebacterium sp,
Staphylococcus sp y Streptococcus sp. Para el caso de géneros de agentes fúngicos,
podemos citar los siguientes ejemplos: Sporothrix, Pityrosporum, Zygomycetes,
Candida, Aspergillus y Blastomyces. Los principales diagnósticos diferenciales de la
Reacción de Splendore-Hoeppli son: figuras en llama del Síndrome de Well
(dermatitis eosinofílica), gránulos basófilos de las prolongaciones de Actynomyces,
cuerpos asteroideos de la sarcoidosis y reacción granulomatosa por presencia de
queratina. Finalmente, independiente del género del agente causal bacteriano o
fúngico, en todos los casos, éstos son detectados con la reacción de Grocott, en el
color correspondiente.
69
Estudio de tejido óseo y descalcificación tisular

Como se puede inferir, procesar tejidos especialmente caracterizados por su elevada
dureza, como es el caso del hueso y los dientes, supone un desafío de mayor complejidad
para el histotecnólogo, pues -de no tratarse adecuadamente con los reactivos requeridos-
puede introducir considerables daños en los equipos e insumos utilizados para el
histoprocesamiento, como el micrótomo y la navaja de corte. Es más, un fragmento óseo
o de diente que no haya pasado antes por un proceso de descalcificación resulta inviable
para su manejo técnico, pues ninguna de las etapas del procesamiento antes abordadas
pueden resultar correctamente, con más ahínco, la deshidratación, el corte y la
coloración.
La descalcificación, en términos simples, es un tratamiento físicoquímico que se realiza
sobre los fragmentos óseos o dentales, consistente en la remoción de las sales de calcio a
partir de la matriz ósea, ya sea, mediante afinidad electrostática, o bien, mediante un
efecto quelante, con el objeto de permitir la realización de todos los pasos ulteriores del
histoprocesamiento. En sí, un buen agente descalcificador debe ser capaz de ablandar un
fragmento tisular hasta un grado de dureza tal que permita realizar un correcto
seccionamiento macroscópico, así como también posibilitar la realización de
determinadas técnicas de coloración histoquímicas e inmunohistoquímicas y no introducir
artefactos negativos notorios a la coloración corriente, tales como el incremento de la
eosinofilia, que consiste en una propensión del tejido ya descalcificado por captar la
eosina con mayor facilidad, los núcleos inclusive, debido a un elevado grado de acidez
resultado en el tejido, producto del tratamiento con los agentes químicos.
De este modo, en rutina, es posible toparse con tres principales agentes químicos
descalcificantes, entre los que encontramos, en sus respectivas concentraciones de
trabajo:
a) Ácido nítrico al 5%: ácido fuerte que permite la descalcificación del fragmento
tisular en un escaso margen temporal, el cual varía dependiendo de las
dimensiones y el espesor del tejido. Su uso no se recomienda para protocolos de
inmunohistoquímica, puesto que, al ser un ácido fuerte, suele producir efectos
destructivos irreversibles en los epítopes antigénicos.
b) Ácido clorhídrico al 8% y ácido fórmico al 8% 1:1: mezcla de soluciones compuesta
por un ácido fuerte (clorhídrico) y fórmico (débil). Si bien, posee una acción similar
al ácido nítrico al 5%, el ácido débil contrarresta levemente los efectos del ácido
fuerte, induciendo menos artefactos técnicos, en comparación con el caso
anterior.
c) EDTA al 5%: el ácido etildiaminotetracético es un agente quelante, es decir, capta
por su radio atómico a cationes divalentes, como el calcio, permitiendo su
precipitación y, en consecuencia, su descalcificación. Debido a que es un agente de
acción lenta, produce muy pocos o nulos efectos adversos en los tejidos, así como
70
también en los epítopes antigénicos, razón por la cual se recomienda utilizar para
métodos inmunohistoquímicos.
Es primordial saber que el procedimiento para tratar las muestras óseas o calcificadas
difiere del procesamiento de los otros tipos de tejidos, por lo que la descalcificación es un
paso intermedio que debe añadirse antes de realizar el dictado macroscópico. De este
modo, el diagrama de flujo es el siguiente:
Protocolo de seccionamiento
A diferencia de las otras clases de tejido, un fragmento óseo debe seccionarse conforme
se produzca su curso progresivo de ablandamiento, durante el tratamiento con su
respectivo agente descalcificante. Sin embargo, a diferencia de lo que se puede suponer,
este seccionamiento no debe realizarse de manera aleatoria en cualquier parte del
fragmento, sino que debe efectuarse habiendo diseñado un concienzudo protocolo de
corte macroscópico, tomando como referencia las observaciones macroscópicas y los
antecedentes que figuren en la anamnesis. Para abordar más a fondo estos aspectos,
debemos considerar que gran parte de las ablaciones óseas que se llevan a cabo en
pabellones quirúrgicos del tipo falangectomía (amputación quirúrgica de las falanges
distales y garras) se basan en confirmar o detectar el compromiso del hueso por un
determinado proceso neoplásico, sobre todo maligno. En histotecnología, aquello es
conocido con el nombre de estudio de profundidad, pues consiste en la determinación
microscópica del grado de profundidad que alcanza una lesión en un fragmento óseo,
tomando como referencia el extremo, borde superficial o margen visible de la misma.
Fig. 58. Esquematización tridimensional de una vértebra, en la cual se aprecian dos opciones para proceder a la
realización de cortes anátomo-histológicos, para posterior estudio histopatológico. A. Realización de corte
longitudinal, a partir de una lesión observada (en rojo) desde el canal medular hacia el cuerpo de la vértebra. B.
Corte transverso o axial, que permite el estudio del cuerpo completo de la vértebra. Laboratorio de Patología
Veterinaria, 2021.
71
Para ello, tanto el anátomo-patólogo como el histotecnólogo deben acordar previamente,

en consideración a la localización de la lesión en cuestión, cómo se efectuará el protocolo
de corte macroscópico durante la descalcificación. Cabe destacar que este proceso tiene
dos objetivos: el primero de ellos tiene la función de controlar el estado de la
descalcificación, mediante el uso de una navaja de corte (la misma que se emplea para
microtomía); de este modo, cuando la navaja logra penetrar por completo el espesor del
tejido, ya está lista para iniciar todo su procesamiento ulterior, partiendo por la
deshidratación tisular.
Por otro lado, igual de importante, tiene la finalidad de permitir el seccionamiento del
fragmento, con el propósito de permitir efectuar estudios de profundidad de lesión. Para
lograr este efecto, mientras se esté descalcificando el tejido, deberán trazarse cortes que
sean paralelos a la dirección de la lesión, que comiencen en la superficie del tejido, donde
se ubica la zona afectada y finalicen en un punto determinado por el equipo del
laboratorio, que será el límite o borde inferior; gracias a la orientación de este borde
profundo, se logrará determinar si está o no comprometido o invadido por componente
neoplásico. Así pues, la dirección del trazado de los cortes dependerá de en qué cara
visible del fragmento óseo esté ubicada la lesión, gracias a lo cual será posible dirigir los
cortes hacia su respectivo borde profundo.
Una de las clases de estudio de fragmentos tisulares con este protocolo se aplica a la
descalcificación de vértebras, sobre todo para casos en los que se requiere determinar el
compromiso óseo y de la médula espinal por neoplasias originadas en estructuras
histológicas circundantes, como es el caso del periostio, espacios vasculares y meninges.
Así, dependiendo de la localización de la lesión en el perímetro vertebral, es posible
realizar dos planos de corte diferentes: uno transverso y otro axial; este último permite la
obtención de un fragmento tisular que incluye desde el periostio hasta el canal medular.
A B
A ©
72
Fig. 59. Descalcificación de cabeza de erizo, para estudio de patrón de crecimiento e invasión de neoplasia oral.
A. Vista cenital de cabeza de erizo de tierra afircano, Atelerix albiventris, en la que se observa el trazado previo
de los cortes anatómicos que se efectuarán en el tejido durante la descalcificación; en rojo, es posible apreciar
los cortes sagitales, mientras que en verde los cortes coronales. B. Corte sagital de cabeza de erizo de tierra
africano, en la que se visualiza una lesión exofítica blanquecino-amarillenta, que protruye desde el epitelio
palatino hacia la cavidad oral (recuadro rojo). En este caso, el análisis histopatológico permitió establecer el
patrón invasivo de la neoplasia, el cual alcanzó el área medular de las celdillas etmoidales y el metencéfalo
(pons). Laboratorio de Patología Veterinaria, 2020.
Otra de las aplicaciones del protocolo de descalcificación es el estudio del patrón de

crecimiento de neoplasias intracraneanas, cuyo objetivo es determinar el grado de
invasión tumoral, hacia diferentes estructuras anatómicas, en especies exóticas pequeñas,
como es el caso de los erizos de tierra africano y europeo (Atelerix albiventris y Erinaceous
europeus, respectivamente). En este caso, de efectúa una descalcificación de la cabeza
completa, sobre la cual se realizan los cortes macroscópicos de espesor completo en el
plano anatómico deseado (sagital, coronal o axial), dependiendo del patrón de
crecimiento e invasión propios de la lesión a estudiar, los cuales pueden ser orientados -si
corresponde- gracias a exámenes radiográficos o estereotáxicos4. Lo más relevante a
considerar para estos protocolos de descalcificación de espesor completo, al igual que
para el caso de las vértebras, es mantener la prolijidad en el corte macroscópico, evitando
alterar a dirección del paso de la navaja, pues, de realizarse un seccionamiento irregular,
da como resultado un plano de inclusión y corte irregulares, hechos que dificultarán la
obtención de un corte histológico, debido a que las capas tisulares de la cara de corte se
encontrarán a desnivel y ello requerirá de un mayor desgaste de las capas superficiales del
fragmento, que podrán perderse cuando la navaja arribe a los estratos más profundos.
Fig. 60. Fragmento de tejido óseo durante el dictado macroscópico, en pleno proceso de descalcificación. A. La flecha azul
indica la dirección en la que se estima que podría estar invadiendo el componente neoplásico, hacia el borde profundo (en
verde). B. Corte macroscópico de tejido descalcificado con navaja. C. Seccionamiento del fragmento destinado a estudio.
4
Estereotaxia: vocablo proveniente del griego stereós- (espacio, volumen) y -taxis (localización). Dícese de
todo procedimiento, ya sea, quirúrgico o exploratorio, el cual utiliza -como base- la proyección de imágenes
en un sistema de monitoreo guiado por ordenadores y que permite la orientación y localización exacta de
una lesión en un órgano o tejido interno determinado.
73
Tal como se logra apreciar en la imagen secuencial, el fragmento remitido inicialmente

(aún sin seccionar) posee dos límites bien definidos: superficial (demarcado con línea
segmentada roja) y profundo (flanqueado por la línea segmentada verde). Si
consideramos que el propósito central es determinar si la lesión se encuentra o no
invadiendo los límites profundos del fragmento, debemos practicar un corte longitudinal,
cuyo trazo conecte ambos bordes, permitiendo de este modo el estudio de todo el
espesor longitudinal del fragmento tisular (línea segmentada azul).
Es importante recordar, así mismo, que -dependiendo de las dimensiones del fragmento
original remitido por el clínico- los fragmentos destinados a histoprocesamiento deben
respetar las dimensiones de la cápsula histológica, de modo que, de requerir un estudio
de profundidad hacia un punto que sobrepase el límite establecido por el corte
macroscópico, se recomienda incorporar el remanente en una cápsula aparte y
debidamente rotulada.
Esquema de inclusión y corte

Cada vez que se lleva a cabo un estudio de determinación profundidad de lesión en
fragmentos óseos, es importante tener en cuenta que, para poder orientar con facilidad el
diagnóstico microscópico, el anátomo-patólogo debe tener certeza en qué extremo del
corte se encuentran los respectivos bordes, tanto superficial como profundo, para lo cual,
se debe definir a priori un criterio de inclusión que permita dar a conocer correctamente
la posición de ambos flancos.
74
Si bien, esta determinación dependerá de los manuales procedimientos de cada

laboratorio en particular, lo importante es saber que esta instancia deberá ser definida
obligatoriamente, para poder efectuar correctamente el estudio histopatológico. En
nuestro caso, definiremos el extremo del canto numérico de la cápsula como el borde o
límite superficial, por lo cual, este lado debe orientarse mirando hacia el canto oblicuo del
casete, mientras que el borde inferior o profundo se situará hacia el otro extremo.
A B
A A
Fig. 61. Protocolos para inclusión y corte de fragmentos óseos, destinados a estudio histopatológico. A. Tacos
parafinados, en los que se aprecia la orientación del borde superficial o externo de la lesión hacia el canto
numerado de la cápsula (línea segmentada roja) y el borde profundo hacia el extremo contrario (línea
segmentada verde). B. Láminas histopatológicas teñidas con Hematoxilina & Eosina, respetando la orientación
del fragmento tisular especificado en el taco parafinado, con el borde superficial (S) dirigido hacia el rótulo y el
profundo (P) hacia abajo. Laboratorio de Patología Veterinaria, 2021.
De este modo, como se aprecia en la figura, el borde superior (en rojo) representa el
extremo de la lesión visible a la macroscopía, mientras que el borde inferior (en verde)
corresponde al límite profundo definido de antemano por el equipo del laboratorio de
patología, con el fin de constatar si existe invasión o compromiso en un plano profundo.
Por otro lado, para la obtención del corte histológico a partir del taco parafinado, se
recomienda recoger las cintas en portaobjetos con carga positiva (los mismos que se
emplean para inmunohistoquímica), o bien, en portaobjetos tratados con cualquier medio
adhesivo, como cola fría al 2%, para evitar que los cortes se escindan del portaobjetos en
los lavados en la etapa de coloración. De todas maneras, como se puede apreciar en la
imagen de la derecha, en la que se visualizan los cortes histológicos ya teñidos con
75
Hematoxilina & Eosina, los límites superficial y profundo han sido demarcados con lápiz de
tinta negra como S y P, respectivamente. Se sugiere también incrementar el tiempo de
tinción con el colorante nuclear (Hematoxilina), pues -como se ha mencionado- el
tratamiento prolongado de un fragmento tisular con un medio ácido provee de una
elevada carga de protones disociados (H+) a la matriz tisular, lo que fomenta la unión de
radicales aniónicos de colorantes ácidos, como la eosina, incluso a sitios del tejido a los
que suelen asociarse colorantes catiónicos, como los núcleos; esto corresponde al
fenómeno de incremento de eosinofilia previamente referido y que puede subsanarse, o
bien, mitigarse efectuando una coloración nuclear más prolongada y -con precaución- un
lavado copioso con agua corriente, para facilitar el viraje de tinción nuclear a un azul
intenso; de este modo, se ofrece un excelente resultado en lo que respecta a contraste
núcleo-citoplasmático.
Técnica de coloración histoquímic especial para tejido óseo: Tricrómica de Goldner
Si bien, son muy variadas las técnicas que se emplean para el estudio de tejido óseo,
dependiendo de los requerimientos del patólogo y del proceso patológico que esté
afectando al tejido, existe una técnica histoquímica la cual -pese a no ser empleada
rutinariamente para el diagnóstico histopatológico de fragmentos óseos- otorga
información crucial para discernir -microscópicamente- ante la presencia de matriz ósea
madura (mineralizada y provista de fascículos de tejido conectivo colágeno denso) y
matriz inmadura u osteoide; en este caso, hablamos del método tricrómico de Goldner.
Las principales aplicaciones de esta técnica, en este contexto, se centran en determinar si

en el tejido óseo coexisten áreas mineralizadas y matriz osteoide, pues la presencia de
esta última se vincula al desarrollo de diversos trastornos del sistema osteoarticular, tanto
neoplásicos como degenerativos, en los cuales, ya sea, no se ha producido una
maduración y mineralización suficiente de la matriz ósea, o bien, el tejido está
experimentando un progresivo cuadro de resorción, producto de la presencia de
osteoclastos, los cuales son activados -a su vez- por los osteoblastos, gracias al contacto
del receptor RANK-1 (propio de los osteoclastos) y RANK-L o ligando de RANK-1, presente
en la superficie de los osteoblastos, siendo esta una cascada de señales muy frecuente en
el desarrollo de osteosarcomas, es decir, neoplasias mesenquimales malignas propias del
tejido óseo.
76
A B
A A
C D
A A
Fig. 62. Microfotografías de fragmentos óseos destinados a estudio histopatológico. A. En esta imagen,
correspondiente a un campo de un corte de vértebra de felino con espesor completo, se demuestra que, pese
al protocolo de descalcificación practicado en este fragmento tisular, la médula ha mantenido de forma intacta
su histoarquitectura. B. El recuadro de línea segmentada azul muestra un área del fragmento que aún presenta
sales de calcio en abundante cantidad, los que pueden observarse como acúmulos basófilos, mientras que las
laminillas que han sido descalcificadas con éxito muestran únicamente el colágeno subyacente a las sales de
calcio, en color rosado. C. Corte de hueso esponjoso vertebral, en el que se aprecia el límite entre tejido óseo y
cartilaginoso (línea segmentada azul). D. Campo equivalente al de la microimagen C, el cual demuestra, con la
técnica Tricrómica de Goldner, la presencia de matriz osteoide en rojo y la matriz cartilaginosa y ósea madura,
provista de abundante colágeno, en verde cian. A, B, C. Hematoxilina & Eosina. D. Tricrómica de Goldner.
En este contexto, es necesario recordar que los osteoblastos son aquellas células
inmaduras del tejido óseo (análogas a los fibroblastos de la matriz extracelular fibrilar y a
los condroblastos del tejido cartilaginoso) los cuales, inducidos por proteínas
osteomorfogénicas como BMP-2 y BMP-4 y la expresión de genes como KLF-4, inician la
síntesis y producción de matriz osteoide, la cual es rica en fosfatasa alcalina y escasa en
sales minerales. Si bien, el osteoide forma parte de alrededor del 40% del total de la masa
ósea madura, su proporción se ve notoriamente incrementada, incluso en campos que
77
trascienden los límites del tejido óseo de un fragmento tisular determinado, en procesos
neoplásicos malignos, por lo que el uso de esta técnica es imperativo para coadyuvar a la
determinación morfológica e histoquímica de estos trastornos neoproliferativos, sobre
todo en caso de no contar con el método inmunohistoquímico. De este modo, en caso de
acaecer mutaciones en las células osteoprogenitoras (ya sea, en mecanismos de
osificación intramembranosa, donde las células afectadas son las mesenquimales
primitivas o endocondral, en la que la afección se centra en las células
condroprogenitoras) puede derivar en el desarrollo de osteosarcomas.
MC
©√
MO
©√ MO
©√
Fig. 63. Microfotografías de cortes de tejido óseo descalcificado, para un caso de neoplasia mesenquimal en
estudio, localizada en 4º y 5º falange de un canino. A. Presencia de células fusadas y osteoblastos con
disposición aleatoria, rodeadas de una abundante matriz rosado intensa. Hematoxilina & Eosina, 10X. B.
Confirmación de la presencia de matriz osteoide, en rojo anaranjado, aledaña a la matriz madura, en verde, en
un caso de osteosarcoma canino. Tricrómica de Goldner, 10X. C. Presencia de metaplasia condro-ósea en un
caso de tumor mamario mixto benigno canino, en el cual es común encontrar áreas de hematopoyesis
extramedular. MC. Metaplasia cartilaginosa. MO. Metaplasia ósea. Hematoxilina & Eosina, 10X. D. Campo
equivalente al de la imagen C, en el que se demuestra la abundancia de matriz osteoide, en rojo, abarcando
gran parte de la laminilla ósea en formación y que permite constatar un tejido óseo inmaduro o en curso de
formación. Laboratorio de Patología Veterinaria, 2021.
78
Así, desde un punto de vista más holístico, en diversas osteopatologías o trastornos en los
que se esté produciendo degeneración, neoformación o génesis ectópicas de tejido óseo,
tales como, osteomalacias, osteosarcomas y hematopoyesis extramedular,
respectivamente (esta última muy común en tumores mamarios mixtos benignos), aquella
matriz inmadura se produce en cantidades tan considerables que dificulta y ralentiza el
proceso de mineralización, como ocurre normalmente en las etapas tardías de la
maduración ósea.
Los resultados de una coloración con la técnica Tricrómica de Goldner se basan,
nuevamente, en la afinidad que presentan los colorantes utilizados en el proceso por
determinados componentes de la matriz tisular. Por ejemplo, para la demarcación de la
matriz ósea madura (mineralizada y provista de fascículos de colágeno denso) se utiliza un
colorante denominado Fast Green, el cual se asocia al colágeno tipo I presente en el
hueso, confiriéndole una tonalidad verde cian, mientras que el colorante Ponceau de
Xilidina tiñe todos los sitios del tejido en los que no hay colágeno, entre ellos, la matriz
osteoide, en un color rojo escarlata. Por su parte, los núcleos pueden ser teñidos con
Hematoxilina, observándose de un color púrpura, mientras que los eritrocitos adquieren
una tonalidad anaranjada oscura.
Francisco A. López Eldredge, T.M.

Esp. Morfofisiopatología y Citodiagnóstico
79

Capítulo 1: Introducción A La Histotecnología Parte Ii: Técnicas Histológicas E Histoquímicas

Cargado por

Información del documento

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Capítulo 1: Introducción A La Histotecnología Parte Ii: Técnicas Histológicas E Histoquímicas

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

LABORATORIO DE PATOLOGÍA VETERINARIA, U.

CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN A LA HISTOTECNOLOGÍA

Generalidades sobre histotecnología

aplicable tanto en condiciones normales, como patológicas. La topografía tisular puede

Pasos del procesamiento de tejidos

Cuando hablamos de histoprocesamiento, nos referimos a la serie de pasos que implica el

Fijación Macroscopía Deshidratación Intermediario Impregnación Inclusión Corte Coloración

a) Fijación: la fijación tisular (y celular) corresponde -por antonomasia- a la instancia

procesamiento de muestras. En vista de lo anterior, se afirma que la fijación tisular

1) Detención de la autolisis: la autolisis es definida como el proceso de

ocurre la proliferación de los bacilos de la putrefacción, la cual implica un

Fig. 1. Modelo científico tridimensional representativo de la reticularización de

3) Conservación de la histoarquitectura: la histoarquitectura es definida como el

4) Preservación de los grupos funcionales bioquímicos: tanto células, como el

b) Macroscopía: una vez obtenido un fragmento tisular, destinado a estudio

Fig. 2. Estación macroscópica con campana para extracción de vapores orgánicos. Se

¿Cómo proceder con una macroscopía?

1) Color: Al comenzar a manipular un fragmento tisular, es muy importante poner

2) Patrón de crecimiento: percatarse de la forma que adopta la lesión en el

expuestos, existe un material de guía para realizar una correcta descripción

3) Textura: poner atención a la existencia de áreas alopécicas (de tratarse de un

4) Patrón de distribución lesional: siempre considerar los cuatro estados básicos

Fig. 3. Esquematización, a modo de ejemplo, de los diferentes patrones de distribución

5) Dimensiones: Antes de efectuar los cortes macroscópicos, es necesario

Fig. 4. Plano detalle de la etapa descriptiva de un proceso de descripción

Fig. 5. Esquematización tridimensional de un fragmento de piel provisto de una lesión

c) Deshidratación: considerando que el tejido que será observado posteriormente al

otro lado, considerando que la parafina es apolar (desprovista de áreas cargadas

Fig. 6. Formato de venta de la parafina histológica, la cual se comercializa en

Existen otros componentes aditivos, en menor proporción, consistentes en cera de

e) Inclusión: en términos globales, la inclusión es la instancia en la cual se le otorga

Fig. 7. A. Aspecto de un molde histológico de acero inoxidable, el cual posee un

Fig. 8. Secuencia de inclusión tisular. A. Cápsula histológica cerrada con un tejido

Lo más primordial es que la cara de interés para efectuar el estudio

con parafina y los tejidos. Para tener certeza si el taco ya ha alcanzado su

De este modo, se formará un taco histológico parafinado, que consiste en un

Fig. 9. Ejemplos de tacos histológicos parafinados, en los que se aprecia la orientación

f) Corte y adherencia: para permitir el estudio histopatológico, el cual, per se, es

este corte es permitido -a su vez- gracias al empleo de una navaja (o cuchilla)

Fig. 10. Implementos de corte y obtención de cortes histológicos. A. Navajas histológicas de

Generalidades sobre microscopía

Antes de abordar uno de los tópicos más relevantes, en lo que respecta al

a) Microscopía convencional o de luz clásica: es el equipo más ampliamente utilizado

La figura muestra un eje óptico (en línea negra segmentada), en el cual se

1) Ocular: es la lente situada anterior a los objetivos y la más cercana al

el canto del diafragma, el cual consiste en un indicador de posición

b) Microscopía de polarización: se trata de una variante de campo oscuro de un

Fig. 13. Fundamento de la polarización de una onda electromagnética, como es el caso

Cuando se interpone un polarizador en el paso de un haz de luz, se produce el

Fig. 14. Diagrama de bloque del funcionamiento de un microscopio de polarización, el

Tal como se aprecia en el diagrama de bloque, un microscopio de luz polarizada

sistemas de funcionamiento de los microscopios de luz polarizada, siendo su

c) Microscopía de fluorescencia (epifluorescencia): es un sistema de observación en

Fig. 15. Diagrama de bloque del funcionamiento de un microscopio de epifluoresencia,

El diagrama de bloque muestra el funcionamiento general de la epifluorescencia,

Considerando que es posible efectuar un múltiple marcaje de estructuras celulares

si se ha realizado un doble marcaje con DAPI (fluorocromo nuclear azul) y Cinina 5

d) Microscopía de fluorescencia confocal: corresponde a una variante del

En cuanto al funcionamiento del microscopio confocal, al igual que en el caso del

Fig. 18. Diagrama de bloque del funcionamiento de un microscopio de fluorescencia

Tras la reflexión, el haz se dirige hacia el segundo colimador, posicionado

de epifluorescencia, el equipo confocal está dotado, así mismo, de un filtro de

a) Cromóforo: corresponde a aquel radical químico, normalmente compuesto por