ESPECTROSCOPA DE

FLUORESCENCIA
MOLECULAR
Introduccin
Principios tericos
Instrumentacin
Aplicaciones

Introduccin: Fenmenos luminiscentes

moleculares
emisin de radiacin por
parte de determinadas sustancias que se
encuentran en un
estado electrnico excitado
Fotoluminiscencia
Quimioluminiscencia
Bioluminiscencia
Termoluminiscencia
Radioluminiscencia
Triboluminiscencia

Emisi
n de
prE
exEmisin
citado Ede
o procedente
Fluo
s por cedente de
rescende E procedente
radia
nivele
molculas,
una
Emisin
cin de
cia: Aproducto
UV-V s
b
s
o
r
is
c
reaccin
qumica
in una
molculas,
producto
de
Fosfo
1
y
-2
0
e
m
-10 -9 s
rescen
e isin en
t
reaccin
en
sistema
n
cia:un
e
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Apbrsoocre
Emeisnibiolgico
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E
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Em
a
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l
a
as
u
ad
s
c culaesxexcit

ol cincitadas
mol m
medfirainctde
alta
partculas e cal
orenerga

Fotoluminiscencia

Se divide en dos categoras:

fluorescencia y fosforescencia dependiendo
de la naturaleza del estado excitado.
Emisin
luminiscente

ESPN DEL ELECTRN:

SINGLETES Y TRIPLETES
Molculas en estado
fundamental
OM con 2 e- espines opuestos

e- en nivel
energtico
superior con
espines opuestos
SINGLETE

SINGLETE

e- en nivel
energtico
superior con
espines paralelos
TRIPLETE

Fluorescencia y fosforescencia
Transicin PERMITIDA

FLUORESCENCIA

Estado excitado SINGLETE

Rpido retorno al
estado fundamental

Transicin PROHIBIDA

Tiempo de vida 10 ns

FOSFORESCENCIA

Estado excitado TRIPLETE

Velocidad de
emisin lenta

Tiempo de vida ms a s

Diagrama de Jablonski
Diagrama tpico de los niveles energticos para una molcula
luminiscente

Excitacin

Tiempo requerido
para el proceso de
absorcin del
fotn: 10-15 10-14 s

Molcula h Molcula

Relajacin vibracional y Conversin

interna y externa
Conversin interna:
Relajacin vibracional:
Prdida de E vibracional
excesiva en forma de choques
entre la especie excitada y
otras (T mnimo)
Muy rpido (10-10 10-13 s)
Ocurre siempre.
Todos los procesos pueden
considerarse originados desde
el nivel vibracional ms bajo
de un estado electrnico
excitado
La emisin fluorescente se
produce a > excitacin

Nivel vibracional inferior de un estado electrnico excitado

Nivel vibracional superior de un estado electrnico de E inferior
(Sin emisin de radiacin)

Conversin interna

Espectros de excitacin y
emisin de quinina

Fluorescencia
Nivel vibracional
inferior SINGLETE Estado fundamental h
excitado

Proceso inverso a la absorcin

Relacin inversa entre y

tiempo de vida del estado
excitado

= 103 -105

tiempo de vida de S* = 10-7 -10-9 s

< 103

tiempo de vida de S* = 10-5 -10-4 s

Cruce entre sistemas

Nivel vibracional inferior de
singlete excitado

Nivel vibracional superior

de un triplete
(Sin emisin de radiacin)
(Seguido de relajacin
vibracional)

Cruce entre sistemas

Cambio en el spin del eVelocidad < C.I.

Espectros de excitacin y emisin

Espectros de excitacin y emisin

Espectro de
excitacin

Espectro de emisin

Variacin de IF al variar la
exc. a una em = cte
Eficacia de las diferentes exc. para
producir fluorescencia

Variacin de IF al variar la em a
una exc = cte
Intensidad de la radiacin
emitida a diferentes

Factores que afectan a la fluorescencia

Del compuesto:
Rendimiento cuntico
Estructura molecular

Del entorno qumico:

Disolvente
Temperatura
pH
Presencia de O2

Rendimiento cuntico (0 < F < 1)

No. fotones emitidos como fluorescencia
F
No. fotones absorbidos

Funcin de la velocidad del proceso de desactivacin por

emisin/velocidad de otros procesos de desactivacin

KF
F
K F K CI K CS ...

Estructura molecular

Estructura molecular: Transiciones

electrnicas
* anti-enlazante

Energa
n
n

* antienlazante

*
*
*
n no-enlazante
-enlazante
-enlazante

* mayor rendimiento cuntico > fluorescencia

Tiempos de vida media

ms cortos (mayor KF)

Menor probabilidad de cruce

entre sistemas (menor KIC)

Estructura molecular: Aromaticidad

No presentan fluorescencia

Presentan fluorescencia

Estructura molecular: Aromaticidad

Estructura molecular: Sustituciones en

el anillo aromtico
INFLUYE SOBRE

carcter aceptor de e-

Longitud de onda de excitacin (exc)

Longitud de onda de emisin (em)
Rendimiento cuntico de fluorescencia (F)

carcter donor de e-

Estructura molecular
Rigidez
estructural

Reduce el grado de interaccin con el

medio
Aumenta F en quelatos

Factores que afectan a la fluorescencia:

Entorno qumico
Efecto del solvente
Viscosidad y polaridad

Efecto de la temperatura
Variacin de la viscosidad y el nmero de colisiones

Efecto del pH
Longitud de onda e intensidad diferenciada para la forma cida y
bsica

Presencia de oxgeno disuelto

Amortiguacin de la seal fluorescente

Efecto del solvente

En general, un aumento de la viscosidad, aumenta F
Aumento de la polaridad,

Transiciones *

Desplazamiento de
(mx)em hacia el rojo

Transiciones n *

Desplazamiento de
(mx)em hacia el azul

Efecto del tomo pesado

F disminuye

Solventes con tomos pesados

Favorecen tripletes
Solutos con tomos pesados

Efecto del solvente

Fotografa y espectros de
fluorescencia del 4dimetilamino-4'nitroestilbeno
(DNS) en solventes de
polaridad creciente.
H, hexano; CH, ciclohexano;
T, tolueno; EA, acetato de
etilo; Bu, n-butanol.

Temperatura
Aumento de temperatura

Disminuye F

Colisiones entre molculas

Procesos de
desactivacin no
radiativos

Efecto del pH
Afecta a F y a (mx)em de compuestos con sustituyentes cidos o
bsicos
El pH del medio afecta la carga y las formas resonantes del fluorforo

Oxgeno disuelto
Oxidacin del fluorforo
Disminuye F
Carcter paramagntico del O2

Cruce entre sistemas

Anlisis Cuantitativo: Efecto de la

concentracin
Relacin entre IF y
concentracin

Base de las aplicaciones

analticas

I F K F I 0 I
I0 = intensidad incidente
I = intensidad transmitida
K = cte. de proporcionalidad (depende del instrumento)

F = rendimiento cuntico de fluorescencia

ec. 1

Anlisis Cuantitativo: Efecto de la

concentracin
De acuerdo a la ley de Beer:
Reemplazando en la ec. 1:

I I 0 10 bc

I F K F I 0 ( 1 10 bc )

Desarrollando en serie:
n
bc ( bc )2
n ( bc )
I F K F I 0 2.3bc 1

... ( 1 )

2
!
3
!
(
n

1
)!

A bajas concentraciones bc < 1 y es posible despreciar todos los trminos

frente a 1:

I F K F I 0 2.3bc

Anlisis Cuantitativo: Efecto de la

concentracin

Anlisis Cuantitativo: Efecto de la

concentracin

Instrumentacin

Instrumentacin
Fuente de energa: lmpara de Xe
Monocromadores de red de difraccin
Detectores: tubos fotomultiplicadores

Cubetas de cuarzo con las 4 caras

transparentes a la radiacin

Aplicaciones de la fluorescencia
Anlisis cualitativo y estructural
Campo de aplicacin

Anlisis cuantitativo
Auxiliar en otras tcnicas

Mtodos analticos

Fluorescencia directa

Analito fluorescente

Fluorescencia indirecta

Analito no fluorescente

Anlisis cualitativo y estructural

Identificacin de sustancias con espectros de emisin muy
caractersticos
Hidrocarburos aromticos y compuestos heterocclicos

Identificacin de iones inorgnicos

Con fluorescencia nativa (sales de uranio y tierras raras)
No fluorescentes por formacin de quelatos fluorescentes

Anlisis cuantitativo
Muy til en la determinacin de trazas de iones inorgnicos y compuestos
orgnicos
Lmite de deteccin: ppb
Determinacin de iones inorgnicos

Formacin de quelatos
luminiscentes con reactivos orgnicos
no luminiscentes

Formacin de complejos
luminiscentes con reactivos
inorgnicos (HCl, HBr)

Fluorescencia del propio in

(tierras raras, U(VI))

Determinacin de compuestos
orgnicos y biolgicos

Por fluorescencia directa (PAHs,

hormonas, etc.)

Por fluorescencia inducida por

reaccin qumica (N-metilcarbamato)

Auxiliar en otras tcnicas

Indicadores fluorescentes en volumetras
Deteccin fluorescente en cromatografa

Bibliografa

BSICA
Principios de Anlisis Instrumental, D. Skoog, F.
Holler, T. Nieman.
Fundamentos de Qumica Analtica, D. Skoog, D.
West, F. Holler, S. Crouch.
AVANZADA
Photoluminiscence of solutions, C. Parker.
Principles of fluorescence spectroscopy, J.
Lakowicz