Facultad de Ingeniería, Programa de Ingeniería Agroindustrial, Laboratorios de Ingeniería Bioquímica

FACULTAD DE INGENIERÍA, PROGRAMA DE INGENIERÍA
AGROINDUSTRIAL, LABORATORIOS DE INGENIERÍA BIOQUÍMICA
La Biotecnología es la ciencia llamada a solucionar muchos problemas de índole

mundial en los campos de la medicina, la industria y el sector agropecuario. En
países como Colombia, donde la inversión en investigación es muy precaria; los
aportes e iniciativas de investigación y desarrollo en el área de la Biotecnología
Alimentaria, indudablemente, contribuirán en brindar alternativas de
soluciones a la gran ola de hambruna que tienen muchas poblaciones de este y
otros países del mundo.
Dentro de las herramientas más valiosas y consistentes con que cuenta el

Ingeniero Agroindustrial para suplir las necesidades de progreso científico,
tecnológico y de Ingeniería, se encuentra la Interacción armónica de los
diferentes aspectos de la Biotecnología Alimentaria; para ello es indispensable
la formación de profesionales capaces de aplicar y desarrollar conceptos de
ingeniería en los procesos biotecnológicos realizados en la industria de
Alimentos.
El desarrollo de la biotecnología industrial en Colombia es evidente y se

manifiesta en los diferentes renglones de la economía nacional. Entre las
industrias de alimentos que generan o consumen productos biotecnológicos se
encuentran: las cervecerías y malterías, productos lácteos fermentados,
panificadoras, jugos y néctares, industrias vinícolas y licoreras, etc. La política
nacional de ciencia y tecnología, en uno de sus programas orientados a
fortalecer la competitividad del sector productivo y su inserción en el mercado
mundial, reconoce que los adelantos científicos en biología molecular y
biotecnología han tenido gran impacto en los sistemas de producción; y por ello
es prioritario el fomento a las investigaciones y a la formación de nuevos
profesionales en estas áreas.
Este manual de laboratorio, dirigido a estudiantes de Ingeniería de

Agroindustrial y otras Ingenierías o áreas relacionadas con el sector de la
industria agroalimentaria, fue diseñado con mucho esmero y dedicación para
complementar y demostrar en el laboratorio los referentes teóricos discutidos
previamente en el aula de clases. Surge, entonces como una herramienta
pedagógica que fortalecerá el procesó de enseñanza-aprendizaje en el
Manual elaborado por la Universidad de Córdoba, programa de Ingeniería de Alimentos, agradeciendo a sus creadores
Ingenieros Deivis Luján Rhenals y Jairo Salcedo Mendoza
desarrollo de programas académicos relacionados con la Biotecnología
Alimentaria.
BIOSEGURIDAD Y BUENAS PRÁCTICAS MICROBIOLÓGICAS EN EL

LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA
Desde el primer momento en que el estudiante entra a un laboratorio donde se

trabajen procesos biológicos microbianos, está expuesto a recibir cualquier
clase de infección, dependiendo del microorganismo con el que entre en
contacto, ya sea directamente o por contaminación cruzada. Para prevenir este
tipo de riesgos, el estudiante debe cumplir con las normas de bioseguridad
dentro y fuera del laboratorio. Las normas de bioseguridad son una
recopilación de los procedimientos de laboratorio más esenciales que
constituyen la base de técnicas microbiológicas y biotecnológicas apropiadas;
éstas son fundamentales para la seguridad en el laboratorio y no pueden
sustituirse, en ningún momento, con equipos especializados; ya que estos no
serán más que un complemento para facilitar el trabajo y en algunos casos para
disminuir la exposición a sustancias peligrosas.
Las normas de seguridad que se deben cumplir en un laboratorio donde se

trabaje con material microbiológico se clasifican en: De orden personal, de
orden del laboratorio y de orden del trabajo microbiológico.
a) DE ORDEN PERSONAL:
❖ Usar siempre la bata dentro del laboratorio; no se debe llevar puesta fuera
del mismo. Las prendas contaminadas se deben esterilizar antes de
lavarlas.
❖ No se deben colocar los bolsos, prendas de vestir, paraguas, carteras, etc.
en los mesones de trabajo. Debe existir un lugar destinado para ello.
❖ Dentro del laboratorio no se permitirá al personal comer, beber, fumar ni
aplicar cosméticos.
❖ Se deberán lavar las manos al iniciar y al terminar el trabajo; como también,
después de haber manipulado material contaminado y/o infeccioso.
❖ No se deberá pasar la lengua por las etiquetas; los materiales no se
colocarán en la boca
❖ No se llevará calzado sin puntera o que no sea cerrado.
❖ No se debe hacer uso de pañuelos o bata de laboratorio para limpiar
objetos o instrumentos de trabajo.
❖ No se debe participar del trabajo si se tiene alguna herida, quemadura o
rasguño en las manos o antebrazos; estas deben ser tratadas
inmediatamente.
❖ Se debe comunicar inmediatamente cualquier sospecha de haber contraído
alguna enfermedad como consecuencia del trabajo.
❖ Cuando sea necesario, se deben proteger los ojos y la cara de salpicaduras o
impactos; se utilizaran gafas de seguridad, viseras o pantallas faciales.
❖ No se deberá pipetear con la boca; se deben usar pipetas automáticas, pera
de goma o auxiliar de pipeteo.
b) DE ORDEN DEL LABORATORIO:
❖ Mantener cerradas las puertas del laboratorio; abrirlas sólo en caso de

emergencia.
❖ No permitir la entrada de niños a las zonas de trabajo
❖ No debe haber material que no tenga relación con el trabajo
❖ Debe haber un programa de lucha contra insectos y roedores
❖ Las superficies de trabajo se limpiarán y desinfectarán al menos una vez al
día y en caso de derramamiento fortuito de sustancias potencialmente
peligrosas.
❖ No olvidar cerrar la válvula del gas al terminar cada jornada de trabajo.
❖ La señal internacional de riesgo biológico debe colocarse en las puertas de
los locales en donde se manipulen microorganismos del grupo de riesgo 2.
c) DE ORDEN DEL TRABAJO MICROBIOLÓGICO
❖ Estudiar, con anterioridad, las técnicas y protocolos de las prácticas y

experimentos de laboratorio; esto evitará confusiones y dinamizará el
trabajo.
❖ Trabajar, siempre, de manera ordenada, tranquila, constante y metódica;
evitando movimientos y gasto de energía innecesarios.
❖ Llevar, siempre, un registro ordenado de los resultados y modificaciones.
Esto evitará contratiempos desagradables por la pérdida de datos
importantes.
❖ El material de trabajo (Caldos de fermentación, cepas, medios, etc) deben
ser tocados, únicamente, con instrumentos estériles; nunca con material
contaminado y mucho menos con las manos.
❖ Limpiar y desinfectar las superficies de trabajo antes y después de cada
jornada.
❖ Cada vez que se derrame material infeccioso, se debe cubrir la zona con
papel absorbente impregnado de desinfectante y dejarlo por un periodo de
15 minutos.
❖ Las pipetas de vidrio, deben tener en su abertura superior un algodón que
sirva como filtro para proteger a la muestra y al manipulador.
❖ Colocar todo material contaminado, tales como: Porta objetos, laminillas,
espátulas, pinzas, pipetas, etc. en recipientes adecuados con soluciones
desinfectantes.
❖ El resto de material contaminado se debe colocar en recipientes especiales
para su posterior esterilización.
❖ Al depositar líquidos, viértalos por las paredes.
❖ Recuerde que siempre se debe adicionar ácidos al agua y nunca agua a los
ácidos, porque ocasiona salpicaduras peligrosas.
❖ No retire cultivos celulares del laboratorio sin previa autorización
❖ Las asas deben esterilizarse antes y después de usarse flameándolas en la
llama del mechero hasta ponerlas al rojo vivo en toda su extensión y luego
dejarla enfriar por espacio de 20 segundos cerca de la llama.
❖ Si se va a repicar de un cultivo a otro, termine por enfriar el asa en este
último
❖ Flamee la boca de tubos, balones, Erlenmeyers, etc. antes y después que
introduzca asas o pipetas
❖ Nunca hable, tosa, estornude o respire fuerte cuando abra un cultivo o esté
sembrando
❖ Trabaje lo más cerca posible al mechero.
RECUERDE SIEMPRE!
❖ Las improvisaciones son el primer paso para un accidente

❖ En todo momento esté consciente de lo que hace
❖ En caso de un accidente, actúe rápidamente sin perder la calma
❖ Pregunte al profesor si no está seguro de lo que va a hacer
❖ Tenga mucho sentido común.
EXPERIMENTO Nº 1
TÉCNICAS PARA MEDICIÓN DE BIOMASA
1. INTRODUCCIÓN:
El crecimiento microbiano se pude considerar como el aumento ordenado de

todos los constituyentes químicos de un organismo, lo cual, para los organismos
unicelulares, conduce a un aumento del número de individuos en la población.
Se puede considerar el crecimiento al nivel de individuos dentro de una

población (ciclo celular) o el crecimiento de poblaciones celulares (ciclo de
crecimiento). El crecimiento de las poblaciones celulares se puede subdividir en
sistemas cerrados, como el cultivo intermitente y en sistemas abiertos, como
el cultivo alimentado por lotes y el cultivo continuo.
Para determinar el número total de células de un cultivo, el método de elección

es el recuento microscópico directo. Para células de levadura, puede emplearse
un hemocitómetro. Es necesaria una ampliación de 100X a 400X para visualizar
la cámara de recuento y las células en suspensión. Para células bacterianas se
usa frecuentemente una cámara de Petroof-Hauser o una de Neubauer y una
ampliación de 1000X a causa del pequeño tamaño de las bacterias. El recuento
microscópico directo tiene la ventaja de que permite observar directamente la
morfología de las células estudiadas. Las morfologías aberrantes o atípicas
podrían indicar unas condiciones subóptimas de crecimiento o la presencia de
un genotipo o fenotipo alterados.
El método más usado para medir el crecimiento microbiano es secar volúmenes

conocidos de cultivo celular lentamente hasta obtener un peso constante.
Cuando se trata de células que sedimentan rápidamente, como las levaduras,
esto usualmente implica centrifugación de muestras del cultivo en tubos de
centrífuga prepesados. Para células bacterianas difíciles de concentrar por
centrifugación, las muestras de cultivo se filtran a través de membranas
hidrofílicas con un tamaño de poro de 0,2 m.
Otro método muy utilizado es el de determinación de biomasa por densidad
óptica. Se aprovecha la proporcionalidad de la densidad óptica a la masa
celular, cuando no se tienen en el medio de fermentación otros sólidos en
suspensión. Este método se basa en la Ley de Beer y Lamberty; en este caso,
se asume que la absorción del rayo incidente es proporcional a la concentración
de células presentes.
2. OBJETIVO:
Desarrollar la habilidad para medición la biomasa microbiana que interviene en

los bioprocesos a través del conocimiento de las técnicas más utilizadas para
este fin.
3. MATERIALES Y REACTIVOS:
a) Materiales
❖ Cámaras de Neubauer
❖ Microscopios
❖ Estufa
❖ Desecador
❖ Balanza analítica (6 cifras decimales)
❖ Espectrofotómetro
❖ Centrífuga
❖ Pipetas graduadas
❖ Pipetas automáticas
❖ Auxiliar de pipeteo
❖ Beakers
❖ Erlenmeyers
❖ Tubos para centrífuga
❖ Pinzas
b) Reactivos
❖ Cultivo de Levadura
❖ Agua destilada
❖ Solución salina isotónica estéril (0,85%)
4. PROCEDIMIENT
4.1. Preparación del cultivo madre:
Disolver aproximadamente 0,5 gr. de levadura seca comercial (Saccharomyces
cerevisiae) en un erlenmeyer que contenga 200ml de agua destilada estéril.
4.2. Preparación de las soluciones problema:
En tubos de 20-25 ml, previamente secos en estufa, preparar 6 diluciones de

levadura a partir del cultivo madre, así:
TUBO 1 2 3 4 5 6
ml de agua 10 8 6 4 2 0
ml de cultivo 0 2 4 6 8 10
Cada dilución de levadura será medida con las siguientes técnicas:
4.3. Medición de la biomasa microbiana por conteo directo en cámara de

Neubauer:
Agitar muy bien el cultivo de levadura. Tomar un volumen pequeño (0,1 – 0,3
mL) con la pipeta automática. Depositar una alícuota en la superficie pulida de
la cámara de Neubauer cerca del extremo del cubreobjetos; la suspensión
entrará en la cámara por capilaridad. Una cámara llenada adecuadamente
contiene células sólo en el espacio contenido entre el cubre y la cámara de
recuento. No debería sobrar fluido que se deposite en los surcos.
Posteriormente se coloca en la platina de un microscopio compuesto y se

enfoca el enrejado con los objetivos de menos aumento (4X y 40X). Para
contar las levaduras se utiliza el cuadro central (Ver figura 1). El cuadro
central está señalado con un círculo y contiene 25 cuadros, cada uno rodeado
por un borde de tres líneas. Cada uno de los 25 cuadros a su vez contiene 16
cuadritos. Se debe ajustar la intensidad de la luz de modo que se hagan
visibles tanto las líneas como las células. Se deben contar las células que se
encuentren dentro de los 5 cuadros marcados (los cuatro de las esquinas y el
del centro).
El cuadro central (marcado con el círculo) tiene un área de 1 mm 2 y una

profundidad de 0.1 mm.
Tenga en cuenta los Siguientes aspectos:
❖ Para aquellas células que estén tocando las líneas de los bordes, sólo cuente
aquellas que estén en dos de los cuatro bordes (superior e izquierdo); esto
evitará que se repita el conteo.
❖ Si cuenta más de 50 o menos de 20 células por cuadro, repita la toma de
muestra o cambie la dilución que esté usando.
❖ Limpie la cámara con agua destilada estéril y séquela con gasa o algodón
después de cada lectura.
1 mm
1 mm
Figura 1. Cámara de Neubauer
4.4. Medición de la biomasa microbiana por densidad óptica:
Tomar 1 ml de cada muestra problema y preparar en tubos tapa – rosca una

dilución de cada una de ellas de tal forma que la concentración final de solutos
no sobrepase las 1000 ppm. (máxima concentración de sólidos leídas por el
espectrofotómetro)
Agitar muy bien. Realizar la lectura de absorbancia en el espectrofotómetro a

540 nm.
4.5. Medición de la biomasa microbiana por peso seco celular:
Centrifugue los tubos, previamente pesados, que contienen las soluciones

originales de levadura (volumen restante conocido) a 4000 rpm durante 15
minutos. Con ayuda de una pipeta evacue cuidadosamente el sobrenadante.
Posteriormente someta a evaporación en estufa el agua restante a una
temperatura de 90ºC durante 20 horas. Pese los tubos y vuelva a evaporar
hasta que haya alcanzado un peso constante.
5. CÁLCULOS Y CONSULTAS:
❖ Calcule y reporte la concentración de cada una de las diluciones problemas

(células/ml, Absorbancia y gr de célula/L) .
❖ Elabore una gráfica de No Células/ml vs Absorbancia. Calcule el valor de

R2
❖ Elabore una gráfica de gr de células/L vs Absorbancia. Calcule el valor de

R2
❖ Consulte y explique otros métodos utilizados para la medición de la biomasa

microbiana.
❖ Consulte las ventajas y desventajas de cada uno de las técnicas utilizadas

en el experimento.
❖ ¿Qué son los colorantes supravitales y para qué se usan.
EXPERIMENTO Nº 2
DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES POR EL MÉTODO
DNS (Ácido 3,5 - dinitrosalicílico)
1. INTRODUCCIÓN:
Este método nos ayuda a determinar la presencia de grupos carbonilos libres

(C=O) en los también llamados azúcares reductores. Esto involucra la oxidación
del aldehído presente en el grupo funcional. Simultáneamente, en presencia
de calor el ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) se reduce a ácido 3-amino,5-
nitrosalicílico bajo las condiciones alcalinas, desarrollándose un color amarillo
café:
oxidación
grupo aldehído grupo carboxilo
reducción
DNS ácido 3-amino,5-nitrosalicílico
Se adiciona sulfito (no necesario para la reacción del cambio de color) en el

reactivo para absorber el oxígeno disuelto, ya que éste puede interferir con la
oxidación de la glucosa.
En la reacción se muestra que una mol de azúcar reaccionará con una mol de
DNS. Sin embargo, no cabe duda que se dan muchas otras reacciones, y la
estequiometría de la reacción es mucho más complicada que lo previamente
descrito. El tipo de reacción lateral depende de la naturaleza exacta del
azúcar reductor. Diferentes azúcares reductores arrojan distintas
intensidades de color ; así, se hace necesario calibrar para cada azúcar.
Además de la oxidación de los grupos carbonilos en el azúcar, otras reacciones
laterales como la descomposición de azúcar también compiten para la
disponibilidad del ácido 3,5-dinitrosalicílico. Como consecuencia, la
carboxymetil celulosa puede afectar la curva de calibración alterando la
intensidad del color desarrollado.
Este es un método conveniente y relativamente barato, aunque su especificidad

es relativamente baja. Cuando los efectos de compuestos extraños no son
conocidos, uno puede incluir efectivamente el llamado control interno para el
desarrollo del color en muestras desconocidas; entonces, una cantidad conocida
de azúcar se adiciona a esta muestra. El aumento en la absorbancia en el
segundo desarrollo de color es equivalente a la cantidad incrementada de
azúcar. Altas concentraciones de proteína interfieren en la determinación de
los azúcares reductores. Otra de las ventajas de este método es que el color
final desarrollado es estable hasta 24 horas, es sencillo y rápido.
2. OBJETIVO:
Aplicar una técnica sencilla, rápida y eficaz para determinar azúcares

reductores en caldos y medios de fermentación que permitan conocer los
rendimientos en sustrato y/o productos.
a) Materiales
❖ Tubos de ensayo tapa rosca

❖ Pipetas de 1, 5 y 10 ml
❖ Pipeteador automático
❖ Auxiliar de pipeteo
❖ Matraz aforado de 1000 ml
❖ Frasco color ámbar
❖ Espectrofotómetro
❖ Vortex
b) Reactivos
❖ Solución del ácido 3,5 dinitrosalicílico, 1% :
o DNS: 10 g
o Fenol: 2 g
o Sulfito de sodio anhidro: 0.5 g
o Hidróxido de sodio: 10 g
o Aforar a 1 litro con Agua destilada
Conservar refrigerado dentro del frasco color ámbar.
❖ Solución estándar de glucosa :

Disolver 1 gr. de glucosa anhidra en 1000 ml de agua destilada, conservar en
refrigeración hasta el momento de usarla.
4. PROCEDIMIENTO:
❖ Establecer una escala estándar de 0 a 1000 ppm. Dentro de una serie de

tubos de ensayo, previamente lavados y sumergidos en solución de ácido
sulfúrico al 5% durante una noche, introducir: 0; 0.2; 0.4; 0.6; 0.8; y 1 ml de
solución estándar y completar a 1 ml con agua destilada. Elabore la
siguiente tabla al momento de registrar los datos:
Tubo ml. de s/n ml. de agua Concentración Absorbancia

estándar destilada final (ppm) (575 nm)
1 0.0 1.0 0 -
2 0.2 0.8 200 -
3 0.4 0.6 400 -
4 0.6 0.4 600 -
5 0.8 0.2 800 -
6 1.0 0.0 1000 -
La determinación de azúcares reductores es efectuada sobre 1 ml de la

muestra convenientemente diluida. La curva estándar y las muestras sufren
las siguientes operaciones:
❖ Adicionar 1 ml del reactivo DNS

❖ Agitar fuertemente en un vortex
❖ Poner a ebullición durante 5 minutos
❖ Enfriar rápidamente (baño de hielo)
❖ Adicionar 8 ml de agua destilada dentro de cada tubo
❖ Agitar fuertemente en un vortex
❖ Leer absorbancia a 575 nm.
❖ Grafique la curva de calibración (Concentración vs Absorbancia) para la
determinación de azúcares reductores con el método del DNS. Muestre
todos los resultados obtenidos. Calcule el valor de R 2.
❖ Calcule la concentración en azúcares reductores (Glucosa) de la muestra

problema.
❖ Consulte otros métodos utilizados para la determinación de azúcares

reductores y glucosa. ¿Qué ventajas y desventajas presentan para su uso
en biotecnología?
ADVERTENCIA!
El reactivo DNS es altamente tóxico, cancerígeno y abortivo. Mucho cuidado

al manipularlo. Usar siempre guantes de látex.
6. REFERENCIAS:
EXPERIMENTO Nº 3
DETERMINACIÓN DE ETANOL POR EL MÉTODO DE WINNICK
1. INTRODUCCIÓN:
La determinación de la cantidad de etanol en los productos obtenidos a partir

de la fermentación alcohólica es una de las principales preocupaciones del
biotecnólogo; ya que éste es un análisis que requiere de una dotación adecuada
de equipos de medición o, por otro lado, de una cantidad considerable de
volumen de muestra, como en el caso del método de destilación.
El método de Winnick permite determinar bajas concentraciones de alcohol

etílico a través de la acción oxidante de la solución 0.4 N de dicromato de
potasio en ácido sulfúrico 10N, posterior valoración con Tiosulfato de sodio.
Se diluye la muestra de forma que la cantidad de dicromato utilizada sea

suficiente para oxidar todo el etanol, formando acetaldehído; de otra manera
debe repetirse la prueba usando una mayor dilución de la muestra.
El exceso de dicromato se elimina con yoduro de potasio, el volumen de

Tiosulfato de sodio gastado en titulación se emplea para determinar el
porcentaje de etanol en la muestra teniendo en cuenta la respectiva dilución.
Las reacciones que se manifiestan en el proceso son:
2K2Cr2O7 + 8H2SO4 + 3CH6O 2Cr2(SO4)3 + 2K2SO4 + 3C2H4O2 + 11H2O
K2Cr2O7 + 6KI + 7H2SO4 Cr2(SO4)3 + 4K2SO4 + 7H2O + 6I
2Na2S2O3 + 2I Na2S4O6 + 2NaI
2. OBJETIVO:
Aplicar una técnica rápida y sencilla para la determinación de alcohol etílico en

caldos de fermentación alcohólica que pueda ser usado en determinaciones de
velocidad de reacción.
a) Materiales:
❖ Microburetas
❖ Soporte universal
❖ Erlenmeyers de 50 ml
❖ Balones aforados de 250 y 500 ml
❖ Pipetas de 1, 5 y 10 ml
❖ Balanza
❖ Beakers
❖ Varillas de agitación
b) Reactivos:
❖ Ácido Sulfúrico 10 N
❖ Dicromato de potasio 0.4N en H2SO4 10N
❖ Solución de Yoduro de potasio 3N (KI)
❖ Solución reactivo de almidón soluble
❖ Tiosulfato de sodio 0.1 N+
4. PROCEDIMIENTO:
a) Preparación de Reactivos:
• ÁCIDO SULFÚRICO 10N:
Disolver 138.9 ml de H2SO4 (densidad 1,84 gr/ml y 96% de pureza) con agua
destilada hasta aforar a 500 ml.
ADVERTENCIA ! : Se presenta una reacción altamente exotérmica; por lo que

se debe adicionar lentamente el ácido al agua (nunca lo contrario).
Hacer esto con el balón sumergido en baño de agua con hielo. Al enfriarse la
solución, se produce una contracción de volumen que se debe corregir
adicionando más agua destilada hasta alcanzar el volumen final.
• DICROMATO DE POTASIO 0.4 N EN H2SO4 10 N:

Pesar 19.614 gr. de Dicromato de potasio previamente seco a 100ºC durante 4-
6 horas y disolverlo en el H2SO4 10 N hasta completar un volumen de 1000ml.
• SOLUCIÓN DE YODURO DE POTASIO 3 N:
Disolver 49.8 gr. De yoduro de potasio (KI) en suficiente agua destilada y

aforar en un balón de 100 ml.
• SOLUCIÓN REACTIVO DE ALMIDÓN SOLUBLE:
Pesar 1 gr. de almidón soluble. Verter lentamente con agitación constante en

200 ml de agua destilada hirviente. Hervir hasta obtener un líquido ligero y
translúcido. Dejar decantar y usar únicamente el líquido sobrenadante.
En un recipiente limpio y bien tapado, esta solución puede durar hasta dos
meses. El reactivo es propenso a contaminarse con hongos.
• TIOSULFATO DE SODIO 0.1 N:
Preparar a partir de un stock comercial para 1 L de solución.
b) Determinación:
Realizar una curva patrón en tubos de ensayo con tapa que contengan 5 ml. de
las siguientes concentraciones: 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14% de etanol. A éstas
diluciones y a la muestra se someten al siguiente proceso:
❖ Realizar una dilución 1:9 (muestra: agua) para cada tubo.
❖ Adicionar exactamente 1 ml de solución de Dicromato de potasio 0.4 N en

H2SO4 10 N dentro de un erlenmeyer pequeño (20-50 ml).
❖ Adicionar 2 ml de la solución a estudiar
❖ Dejar en reposo durante 5 minutos
❖ Transcurrido el tiempo, adicionar 1 ml de solución de yoduro de potasio 3N
y mezclar.
❖ Adicionar 2 gotas de solución de reactivo de almidón soluble.
❖ Titular con solución volumétrica de Tiosulfato de sodio 0.1 N con agitación

cuidadosa hasta obtener un cambio nítido hacia un color azul marino.
❖ Restar el volumen de Tiosulfato gastado por el blanco al momento de

construir la curva de calibración.
❖ Grafique la curva de calibración para las diluciones de alcohol realizadas.

Calcule el valor R2 y muestre la ecuación que explique la curva.
❖ Calcule el porcentaje de alcohol de la muestra problema utilizando la curva

de calibración.
❖ Consulte otros métodos para determinar alcohol etílico. Explique las

ventajas y desventajas para su uso
EXPERIMENTO Nº 4
EVALUACIÓN DE CULTIVOS LÁCTICOS
1. INTRODUCCIÓN:
Las Bacterias lácticas tienen la capacidad de fermentar la lactosa contenida en

la leche a ácido láctico, como es el caso de Lactobacillus, Streptococcus,
Leuconostoc y Pediococcus. Esta capacidad bacteriana puede ser explotada
industrialmente para obtener productos como el Yogurt y el Kumis. El Yogurt
es un producto obtenido por la simbiosis entre el Lactobacillus bulgaricus y
Streptococos thermophylus; los cuales se pueden obtener de la leche
desnatada concentrada por evaporación.
Una de las etapas más importantes del proceso de obtención del producto
fermentado es el cultivo, ya que aporta a la leche las bacterias acidolácticas
responsables del proceso de acidificación. Este cultivo consta exclusivamente
de especies termofílicas; que para el caso del yogurt son : L. bulgáricus y St.
Thermophylus. El cultivo no debe contener especies no termofílicas. La
producción de cada una de las especies varía a lo largo del proceso; al comienzo
es de 1:1 a 2:5. Durante la incubación se favorece el desarrollo de St.
Thermophylus hasta el punto de alcanzar una proporción de 5:1 que se equilibra
nuevamente al final del proceso. Por otra parte, el L. bulgaricus proporciona el
aroma característico del yogurt.
2. OBJETIVO:
Conocer y evaluar la fabricación de cultivos lácticos utilizados en la industria

del yogurt a través de un seguimiento en el comportamiento de la acidez, el pH,
relación cocos/bacilos y rendimientos (YP/S , YX/S) a intervalos regulares de
tiempo.
a) Materiales:
❖ Balanza
❖ Frascos tapa rosca de 250 ml
❖ Erlenmeyer de 500 ml
❖ Pipetas de 5 y 10 ml
❖ Pipetas de 1 ml
❖ Tubos de ensayo
❖ pHmetro
❖ Bureta
❖ Baño María
❖ Cámara de Neubauer
b) Reactivos:
❖ NaOH 0,1 N
❖ Fenolftaleina 2%
❖ Azul de metileno
❖ Leche descremada en polvo
❖ Cultivo Láctico de Yogurt
❖ Agua destilada estéril
4. PROCEDIMIENTO:
4.1. Preparación del Cultivo.
❖ En 3 frascos con tapa rosca reconstituir 200 ml de leche en polvo

descremada (8%, 12%, y 16%)
❖ Pasteurizar en baño maría a 80ºC por 30 minutos.
❖ Los gramos de leche en polvo se calculan con la siguiente ecuación:
Volumen total x % deseado

gr de Leche = -----------------------------------------
100 - % de Humedad Leche P.
Volumen de agua = Volumen deseado - gr de leche en polvo
❖ Enfriar a 43 ºC.
❖ Inocular cada concentración con 3% de cultivo de yogurt. ¡AGITAR BIEN!
❖ Incubar a 43 ºC por 3 horas. ¡ NO AGITAR!
❖ Refrigerar a 4 ºC por 2 horas. ¡ NO AGITAR!
4.2. Actividad Del Cultivo Madre:
❖ Medir el pH cada 30 minutos con ayuda de un pHmetro.
❖ Medir la acidez cada 30 minutos tomando 9 ml del cultivo, adicionar 2 gotas

de fenolftaleina al 2%. Titular con NaOH 0,1 N hasta que persista el color
rosa pálido por 30 segundos. Expresar la acidez en porcentaje de ácido
láctico:
ml NaOH gastado x 0,1N x meq-gr Ácido láctico

% Ácido Láctico = --------------------------------------------------------------- x
100
ml muestra
4.3. Relación Cocos – Bacilos:
❖ Realizar conteo en cámara de Neubauer cada 60 minutos y observar la

relación coco - bacilo en cada intervalo de tiempo. (Incluir una gota de azul
de metileno en la dilución para colorear las bacterias)
4.4. Rendimientos ( YX/S, YP/S) :
❖ Realizar los balances de masa respectivos y encontrar los rendimiento de

Sustrato en biomasa (YX/S) y sustrato en producto (YP/S), considerando que
para una concentración de 12,5 % de sólidos existen 4,7% de lactosa.
❖ Grafique el incremento de sólidos Vs acidez.

❖ Grafique el incremento de sólidos Vs pH
❖ Grafique el incremento celular de cada bacteria en función del tiempo
❖ Calcule los respectivos rendimientos para cada intervalo de tiempo y
muestre los rendimientos globales de la fermentación. Compare resultados.
❖ ¿Qué problema representa el hecho de encontrar levaduras, en alto
porcentaje, en productos como el yogurt?
❖ ¿Qué efecto tiene en el pH y la acidez en el aumento de sólidos dentro de

un cultivo láctico?
6. REFERENCIAS:
EXPERIMENTO Nº. 3
EVALUACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE VINO DE FRUTAS
1. INTRODUCCIÓN:
La historia de la fermentación se remonta más allá de nuestros conocimientos.

El hombre, tal como lo conocemos; es decir, el hombre que trabaja y lucha,
aparece en la escena con una jarra de vino. Su realidad vinícola se aproxima
más a nuestra experiencia de vida con la expansión de la dominación griega,
iniciada 1000 años a. C., fue entonces cuando el vino llegó por primera vez a los
países en los que se sentaría su verdadero hogar: Italia y Francia. Los últimos
noventa años han presenciado la revolución industrial de los licores y, sobre
todo, en los últimos 25 años el fundamento científico de la elaboración de los
licores ha clasificado la situación de tal modo que técnicas que antes parecían
imposibles hoy son fáciles de realizar.
Los microorganismos que intervienen en la fermentación del vino son

principalmente levaduras del género Saccharomyces, y dentro de este género,
la especie que ha sido tradicionalmente utilizada es S. Cerevisiae. Var.
Ellipsoideus
La fabricación del vino más que ciencia es un arte. Aunque la uva es la fruta
comúnmente más usada, también pueden usarse muchas otras frutas como los
melocotones, ciruelas, manzanas y duraznos para la fabricación de vinos. Los
procedimientos de fabricación del vino de uva casero son bastante sencillos.
Simplemente se inocula el jugo de la uva con un cultivo iniciador de levaduras
adquirido en un supermercado. La fermentación primaria tarda
aproximadamente una semana; durante ese tiempo la mayoría del azúcar
originalmente presente en el jugo se convierte en etanol por acción de las
células de levadura, al mismo tiempo se produce dióxido de carbono. El exceso
de células de levadura son posteriormente removidas del mosto de uva junto
con otros sedimentos, y una fermentación secundaria más lenta permite
desarrollar el sabor final del vino. Puede adicionarse azúcar (sacarosa o
glucosa) para lograr alcanzar el porcentaje de alcohol deseado o para modificar
el sabor del vino. El tipo de vino puede ser clasificado según el color del vino.
Otra clasificación está basada en el contenido de azúcar presente en el
producto final, como se muestra en la tabla 1.
Tabla 1. Clasificación de vinos según el contenido de azúcar.
TIPO DE VINO GRAVEDAD ESPECÍFICA CONT. DE AZÚCAR (%P/P)
Vino Seco 1.085 – 1.100 21 – 25
Vino semi dulce 1.120 – 1.140 29 – 33
Vino Dulce 1.140 – 1.160 33 - 37
2. OBJETIVO:
Evaluar el efecto del contenido de azúcar (Fructosa) en el proceso de la

fermentación del vino de frutas.
a) Materiales:
❖ Fermentador estéril de 1 L. (Erlenmeyer)

❖ Manguera estéril
❖ Gasa estéril
❖ Cinta de enmascarar y bisturí
❖ Rollo de papel aluminio
❖ Beaker de 500 ml
❖ Colador
❖ Mortero grande
❖ Pipetas estériles de 1, 5 y 10 ml.
❖ Baño maría
❖ Tubos de ensayo estériles
b. Reactivos:
❖ 4 Kg. de Uvas o corozo, manzana, mango, piña, maracuyá

❖ Fructosa
❖ Levadura para vino (Saccharomyces cerevisiae)
❖ Azufre en polvo o Metabisulfito de sodio
❖ Agua destilad
4. PROCEDIMIENTO:
❖ Seleccionar las uvas alto grado de madurez (12 – 15 ºBrix) y sanidad. Lavar
la uva con abundante agua. Quitar manualmente las pepas de la fruta.
Macerar manualmente (Usar guantes) en un recipiente grande para sacar el
jugo de la uva (mosto).
❖ Curar el fermentador, previamente limpio y estéril, con sulfuroso. Pesar 1
gr. de Azufre y cubrirlo con un pedazo de algodón alrededor de una varilla
delgada. Quemar el azufre y flamear en el interior del fermentador con los
gases sulfurosos para evitar la posterior contaminación del vino. Evitar un
exceso de sulfuroso en el fermentador que pueda alterar las
características organolépticas. En su defecto, se puede usar Metabisulfito
de sodio al 1,5% para el curado del fermentador esparciendo esta solución
por toda la superficie del recipiente.
❖ Verter el mosto de uva en el fermentador, adicionar agua en relación 2:1
(Mosto : Agua). Adicionar la cantidad de fructosa correspondiente a cada
ensayo y agitar. (Ver tabla).
❖ Sacar la muestra inicial y determinar: Azúcares reductores, %Alcohol, pH y
Acidez.
Ensayo Conc. de Fructosa adicionada
(gr/L)
1 50
2 100
3 200
❖ Pasteurizar el mosto en baño maría a 65ºC durante 20 minutos. Agitar

suavemente 2 o 3 veces para distribuir el calor.
❖ Enfriar en baño de hielo hasta temperatura ambiente (28 – 30ºC)
❖ Inocular el mosto con un preinóculo de Levadura S. Cerevisiae para vino
(2%). . Adicionar al fermentador y agite hasta disolver.
❖ Tapar el fermentador con la gasa estéril (Bien ajustada) y conectar la
manguera como se muestra en la figura.
❖ Permitir que se realice la fermentación primaria por un periodo de 8 días.
❖ Luego de los 8 días, realizar un frotis del velo de crecimiento y colorear con
azul de lactofenol, observe la morfología; realice una siembra en agar malta;
incube durante 5 días a temperatura ambiente y anote los resultados
obtenidos.
❖ realizar un trasciego del mosto (separar el vino del sedimento acumulado en
el fondo del fermentador, evitar la agitación) a otro fermentador en las
mismas condiciones de esterilidad y curado.
❖ Ajustar nuevamente todos los accesorios y continuar con la fermentación
secundaria por un periodo de 8 días más. Realizar otro Frotis para observar
la morfología microbiana.
MONTAJE DEL FERMENTADOR PARA LA PRODUCCIÓN DE VINO
TAPÓN O GASA MANGUERA ESTERIL
MOSTO AGUA
DESTILADA
FERMENTADOR
❖ Al cabo de los 8 días, realizar otro trasciego y finalmente dejar fermentar

por 2 semanas más.
❖ Filtrar el vino obtenido, lo más higiénicamente posible con ayuda de un papel
filtro y utilizando una bomba de vacío.
❖ Pasteurizar a 65ºC por 20 minutos. Posterior enfriamiento a 4ºC.
❖ Degustar el vino y anotar sus características sensoriales.
❖ Envasar el restante en botellas de vidrio oscuro y permitir su
envejecimiento.
❖ Determinar en cada trasciego: Azúcares reductores, porcentaje de
alcohol etílico, pH y acidez expresada en ácido láctico.
NOTA: Todo material que entre en contacto con el caldo de fermentación

debe estar previamente estéril para evitar una contaminación. Utilice siempre
el mechero para sacar las muestras.
 A través de un gráfico de barras analice los resultados obtenidos entre la

concentración de azúcar adicionada Vs. Porcentaje de alcohol obtenido.
 A través de un gráfico de barras analice los resultados obtenidos entre la
concentración de Azúcares reductores Vs. %Alcohol.
 Calcule los rendimientos de sustrato en producto (Y p/s) puntuales y globales
de cada ensayo. Analice los resultados.
 Realice los balances de masa de cada proceso y calcule los rendimientos de
cada uno. Incluya costos - beneficios.
 ¿Cómo evitar la contaminación por bacterias acéticas en la producción
industrial de vino?
 ¿Cuáles son los principales defectos físicos de los vinos?
 ¿Qué análisis organolépticos le haría a un vino?
 ¿Qué diferencia existe entre un vino espumoso y un vino tradicional?
 ¿Qué exigen las normas ICONTEC para la calidad de los vinos?
6. REFERENCIAS:

Facultad de Ingeniería, Programa de Ingeniería Agroindustrial, Laboratorios de Ingeniería Bioquímica

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Agitar muy bien. Realizar la lectura de absorbancia en el espectrofotómetro a

4.5. Medición de la biomasa microbiana por peso seco celular:

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