Prácticas Bioingeniería Ia - Ingeniería Agroindustrial

MANUAL PRÁCTICAS DE BIOINGENIERÍA I
PROGRAMA DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL
FACULTAD DE INGENIERÍA
Elaborado por:
CARLOS ALBERTO GARCIA

MOGOLLON
Docente de Planta
Programa de Ingeniería Agroindustrial
Revisado por:
COMITÉCURRICULAR
Departamento de Ingeniería Agroindustrial
Julio de 2015
Manual de Prácticas de Bioingeniería I
TABLA DE CONTENIDO
INTRODUCCIÓN .......................................................................................................... 3
BIOSEGURIDAD Y BUENAS PRÁCTICAS ........................................................................ 4
INDICACIONES METODOLÓGICAS Y DE ORGANIZACIÓN .............................................. 7
COMPLEMENTO 1. TÉCNICAS PARA MEDICIÓN DE BIOMASA ...................................... 8
COMPLEMENTO 2. DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES ............................ 13
COMPLEMENTO 3. DETERMINACIÓN DE ALCOHOL ................................................... 17
PRÁCTICA 1. EFECTO DEL NUTRIENTE EN LA FERMENTACIÓN.................................... 24
PRÁCTICA 2. EVALUACIÓN DE CULTIVOS LÁCTICOS ................................................... 28
PRÁCTICA 3. EVALUACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE VINO DE FRUTAS ........................ 32
PRÁCTICA 4. CINÉTICA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO ........................................... 38
PRÁCTICA 5. EVALUACIÓN DE LA FERMENTACIÓN ACÉTICA ...................................... 42
SUPLEMENTO. EL INFORME FINAL ............................................................................ 46
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INTRODUCCIÓN
La Biotecnología es la ciencia llamada a solucionar muchos problemas de índole mundial en

los campos de la medicina, la industria y el sector agropecuario. En países como Colombia,
donde la inversión en investigación es muy precaria; los aportes e iniciativas de investigación
y desarrollo en el área de la Biotecnología Alimentaria, indudablemente, contribuirán en
brindar alternativas de soluciones a la gran ola de hambruna que tienen muchas poblaciones de
este y otros países del mundo.
Dentro de las herramientas más valiosas y consistentes con que cuenta el Ingeniero
Agroindustrial y de Alimentos para suplir las necesidades de progreso científico, tecnológico y
de Ingeniería, se encuentra la Interacción armónica de los diferentes aspectos de la
Biotecnología Alimentaria; para ello es indispensable la formación de profesionales capaces
de aplicar y desarrollar conceptos de ingeniería en los procesos biotecnológicos realizados en
la industria de Alimentos.
El desarrollo de la biotecnología industrial en Colombia es evidente y se manifiesta en los

diferentes renglones de la economía nacional. Entre las industrias de alimentos que generan o
consumen productos biotecnológicos se encuentran: las cervecerías y malterías, productos
lácteos fermentados, panificadoras, jugos y néctares, industrias vinícolas y licoreras, etc. La
política nacional de ciencia y tecnología, en uno de sus programas orientados a fortalecer la
competitividad del sector productivo y su inserción en el mercado mundial, reconoce que los
adelantos científicos en biología molecular y biotecnología han tenido gran impacto en los
sistemas de producción; y por ello es prioritario el fomento a las investigaciones y a la
formación de nuevos profesionales en estas áreas.
Este manual de laboratorio, dirigido a estudiantes de Ingeniería de Alimentos y otras

Ingenierías o áreas relacionadas con el sector de la industria agroalimentaria, fue diseñado con
mucho esmero y dedicación para complementar y demostrar en el laboratorio los referentes
teóricos discutidos previamente en el aula de clases. Surge, entonces como una herramienta
pedagógica que fortalecerá el proceso de enseñanza-aprendizaje en el desarrollo de programas
académicos relacionados con la Biotecnología Alimentaria.
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BIOSEGURIDAD Y BUENAS PRÁCTICAS
Desde el primer momento en que el estudiante entra a un laboratorio donde se trabajen

procesos biológicos microbianos, está expuesto a recibir cualquier clase de infección,
dependiendo del microorganismo con el que entre en contacto, ya sea directamente o por
contaminación cruzada. Para prevenir este tipo de riesgos, el estudiante debe cumplir con las
normas de bioseguridad dentro y fuera del laboratorio. Las normas de bioseguridad son una
recopilación de los procedimientos de laboratorio más esenciales que constituyen la base de
técnicas microbiológicas y biotecnológicas apropiadas; éstas son fundamentales para la
seguridad en el laboratorio y no pueden sustituirse, en ningún momento, con equipos
especializados; ya que estos no serán más que un complemento para facilitar el trabajo y en
algunos casos para disminuir la exposición a sustancias peligrosas.
Las normas de seguridad que se deben cumplir en un laboratorio donde se trabaje con material
microbiológico se clasifican en: De orden personal, de orden del laboratorio y de orden del
trabajo microbiológico.
a) De orden personal:
1. Usar siempre la bata dentro del laboratorio; no se debe llevar puesta fuera del mismo. Las
prendas contaminadas se deben esterilizar antes de lavarlas.
2. No se deben colocar los bolsos, prendas de vestir, paraguas, carteras, etc. en los mesones
de trabajo. Debe existir un lugar destinado para ello.
3. Dentro del laboratorio no se permitirá al personal comer, beber, fumar ni aplicar
cosméticos.
4. Se deberán lavar las manos al iniciar y al terminar el trabajo; como también, después de
haber manipulado material contaminado y/o infeccioso.
5. No se deberá pasar la lengua por las etiquetas; los materiales no se colocarán en la boca
6. No se llevará calzado sin puntera o que no sea cerrado.
7. No se debe hacer uso de pañuelos o bata de laboratorio para limpiar objetos o instrumentos
de trabajo.
8. No se debe participar del trabajo si se tiene alguna herida, quemadura o rasguño en las
manos o antebrazos; estas deben ser tratadas inmediatamente.
9. Se debe comunicar inmediatamente cualquier sospecha de haber contraído alguna
enfermedad como consecuencia del trabajo.
10. Cuando sea necesario, se deben proteger los ojos y la cara de salpicaduras o impactos; se
utilizaran gafas de seguridad, viseras o pantallas faciales.
11. No se deberá pipetear con la boca; se deben usar pipetas automáticas, pera de goma o
auxiliar de pipeteo.
b) De orden del laboratorio:
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1. Mantener cerradas las puertas del laboratorio; abrirlas sólo en caso de emergencia.
2. No permitir la entrada de niños a las zonas de trabajo
3. No debe haber material que no tenga relación con el trabajo
4. Debe haber un programa de lucha contra insectos y roedores
5. Las superficies de trabajo se limpiarán y desinfectarán al menos una vez al día y en caso
de derramamiento fortuito de sustancias potencialmente peligrosas.
6. No olvidar cerrar la válvula del gas al terminar cada jornada de trabajo.
7. La señal internacional de riesgo biológico debe colocarse en las puertas de los locales en
donde se manipulen microorganismos del grupo de riesgo 2.
c) De orden del trabajo microbiológico:
1. Estudiar, con anterioridad, las técnicas y protocolos de las prácticas y experimentos de

laboratorio; esto evitará confusiones y dinamizará el trabajo.
2. Trabajar, siempre, de manera ordenada, tranquila, constante y metódica; evitando
movimientos y gasto de energía innecesarios.
3. Llevar, siempre, un registro ordenado de los resultados y modificaciones. Esto evitará
contratiempos desagradables por la pérdida de datos importantes.
4. El material de trabajo (Caldos de fermentación, cepas, medios, etc) deben ser tocados,
únicamente, con instrumentos estériles; nunca con material contaminado y mucho menos
con las manos.
5. Limpiar y desinfectar las superficies de trabajo antes y después de cada jornada.
6. Cada vez que se derrame material infeccioso, se debe cubrir la zona con papel absorbente
impregnado de desinfectante y dejarlo por un periodo de 15 minutos.
7. Las pipetas de vidrio, deben tener en su abertura superior un algodón que sirva como filtro
para proteger a la muestra y al manipulador.
8. Colocar todo material contaminado, tales como: Porta objetos, laminillas, espátulas,
pinzas, pipetas, etc. en recipientes adecuados con soluciones desinfectantes.
9. El resto de material contaminado se debe colocar en recipientes especiales para su
posterior esterilización.
10. Al depositar líquidos, viértalos por las paredes.
11. Recuerde que siempre se debe adicionar ácidos al agua y nunca agua a los ácidos, porque
ocasiona salpicaduras peligrosas.
12. No retire cultivos celulares del laboratorio sin previa autorización
13. Las asas deben esterilizarse antes y después de usarse flameándolas en la llama del
mechero hasta ponerlas al rojo vivo en toda su extensión y luego dejarla enfriar por
espacio de 20 segundos cerca de la llama.
14. Si se va a repicar de un cultivo a otro, termine por enfriar el asa en este último
15. Flamee la boca de tubos, balones, Erlenmeyers, etc. antes y después que introduzca asas o
pipetas
16. Nunca hable, tosa, estornude o respire fuerte cuando abra un cultivo o esté sembrando
17. Trabaje lo más cerca posible al mechero.
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GLOSARIO
Colonia: Población de células que crecen en un medio de cultivo sólido, provenientes de una sola célula.
Cultivo: Cepa o clase particular de un organismo que crece en un medio de laboratorio.
Estéril: Libre de organismos vivos.
Esterilización: Tratamiento que da como resultado la muerte de todos los organismos vivos y virus en un
material.
Inóculo: Material utilizado para iniciar un cultivo microbiano.
Metabolismo: Todas las reacciones bioquímicas de una célula, tanto catabólicas como anabólicas.
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INDICACIONES METODOLÓGICAS Y DE ORGANIZACIÓN

Durante el desarrollo de la asignatura se desarrollará una estrategia didáctica encaminada a
relacionar los aspectos ACADEMICOS-INVESTIGATIVOS-EXPERIMENTALES-
LABORALES de forma integral a través de la ejecución del programa, utilizando las
invariantes pedagógicas: Objetivos, la información, las vías de solución, las variables a
controlar.
El planteamiento del método investigativo, orientado por el docente, que consta de:
1. Planteamiento de la tarea experimental.
2. Análisis de la tarea (interpretación).
3. Propuestas de vías de solución (teórico-experimental, experimental, teórico, virtual

experimental).
4. Ejecución del experimento.
5. Análisis e interpretación de resultados.
Los medios de aplicación como la tarea experimental tendrán en cuenta las habilidades
experimentales, el proceso de formación, la INDEPENDENCIA DE LOS ESTUDIANTES,
las etapas de desarrollo y el AUMENTO DE LA COMPLEJIDAD.
Metodología de estudio de las guías prácticas.
Son cuatro aspectos los que se deben tener en cuenta para estudiar y preparar las técnicas
analíticas:
1. Fundamento del método.

a. Principio de la determinación.
b. Reacciones químicas.
2. Preparación de la muestra.
a. Caracterización y composición.
b. Disoluciones.
c. Etiquetado.
3. Parámetros operacionales.
a. Condiciones de almacenamiento de muestra (si es necesario).
b. Reactivos y concentraciones.
c. Condiciones operativas.
4. Cálculos y expresión de resultados.
a. Parámetros estadísticos para validar las determinaciones.
b. Expresión de los resultados de acuerdo al tipo de alimento.
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COMPLEMENTO 1. TÉCNICAS PARA MEDICIÓN DE BIOMASA
Introducción
El crecimiento microbiano se pude considerar como el aumento ordenado de todos los

constituyentes químicos de un organismo, lo cual, para los organismos unicelulares, conduce a
un aumento del número de individuos en la población.
Se puede considerar el crecimiento al nivel de individuos dentro de una población (ciclo
celular) o el crecimiento de poblaciones celulares (ciclo de crecimiento). El crecimiento de las
poblaciones celulares se puede subdividir en sistemas cerrados, como el cultivo intermitente y
en sistemas abiertos, como el cultivo alimentado por lotes y el cultivo continuo.
Para determinar el número total de células de un cultivo, el método de elección es el recuento

microscópico directo. Para células de levadura, puede emplearse un hemocitómetro. Es
necesaria una ampliación de 100X a 400X para visualizar la cámara de recuento y las células
en suspensión. Para células bacterianas se usa frecuentemente una cámara de Petroof-Hauser
o una de Neubauer y una ampliación de 1000X a causa del pequeño tamaño de las bacterias.
El recuento microscópico directo tiene la ventaja de que permite observar directamente la
morfología de las células estudiadas. Las morfologías aberrantes o atípicas podrían indicar
unas condiciones inapropiadas de crecimiento o la presencia de un genotipo o fenotipo
alterados.
El método más usado para medir el crecimiento microbiano es secar volúmenes conocidos de
cultivo celular lentamente hasta obtener un peso constante. Cuando se trata de células que
sedimentan rápidamente, como las levaduras, esto usualmente implica centrifugación de
muestras del cultivo en tubos de centrífuga pre-pesados. Para células bacterianas difíciles de
concentrar por centrifugación, las muestras de cultivo se filtran a través de membranas
hidrofílicas con un tamaño de poro de 0,2 m.
Otro método muy utilizado es la determinación de biomasa por densidad óptica. Se aprovecha
la proporcionalidad de la densidad óptica a la masa celular, cuando no se tienen en el medio de
fermentación otros sólidos en suspensión. Este método se basa en la Ley de Beer y Lamberty;
en este caso, se asume que la absorción del rayo incidente es proporcional a la concentración
de células presentes.
Objetivos
General
Desarrollar la habilidad para medición la biomasa microbiana que interviene en los

bioprocesos.
Específicos
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Aplicar la técnica de recuento en cámara de Neubauer y de medición de biomasa por densidad

óptica.
Correlacionar los datos de Neubauer y densidad óptica con la biomasa del microorganismo en
estudio.
Comparar con otros métodos utilizados para la medición de la biomasa microbiana.
Materiales y reactivos
a) Materiales
Cámaras de Neubauer Pipetas graduadas
Microscopios Pipetas automáticas
Estufa Auxiliar de pipeteo
Desecador Beakers
Balanza analítica (6 cifras decimales) Erlenmeyers
Espectrofotómetro Tubos para centrífuga
Centrífuga Pinzas
b) Reactivos
Cultivo de Levadura
Agua destilada
Solución salina isotónica estéril (0,85%)
Procedimiento
Preparación del cultivo madre.

Disolver aproximadamente 0,5 gr. de levadura seca comercial (Saccharomyces cerevisiae) en
un erlenmeyer que contenga 200ml de agua destilada estéril.
Preparación de las soluciones problema.

En tubos de 20-25 ml, previamente secos en estufa, preparar 6 diluciones de levadura a partir
del cultivo madre, así:
TUBO 1 2 3 4 5 6
ml de agua 10 8 6 4 2 0
ml de cultivo 0 2 4 6 8 10
Cada dilución de levadura será medida con las siguientes técnicas:
Medición de la biomasa microbiana por conteo directo en cámara de Neubauer.
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Agitar muy bien el cultivo de levadura. Tomar un volumen pequeño (0,1 – 0,3 mL) con la
pipeta automática. Depositar una alícuota en la superficie pulida de la cámara de Neubauer
cerca del extremo del cubreobjetos; la suspensión entrará en la cámara por capilaridad. Una
cámara llenada adecuadamente contiene células sólo en el espacio contenido entre el cubre y
la cámara de recuento. No debería sobrar fluido que se deposite en los surcos.
Posteriormente se coloca en la platina de un microscopio compuesto y se enfoca el enrejado

con los objetivos de menos aumento (4X y 40X). Para contar las levaduras se utiliza el cuadro
central (Ver figura 1). El cuadro central está señalado con un círculo y contiene 25 cuadros,
cada uno rodeado por un borde de tres líneas. Cada uno de los 25 cuadros a su vez contiene
16 cuadritos. Se debe ajustar la intensidad de la luz de modo que se hagan visibles tanto las
líneas como las células. Se deben contar las células que se encuentren dentro de los 5 cuadros
marcados en rojo (los cuatro de las esquinas y el del centro).
El cuadro central (marcado con el círculo) tiene un área de 1 mm 2 y una profundidad de 0.1
mm.
Figura 1. Cámara de Neubauer
Tenga en cuenta los siguientes aspectos:
Para aquellas células que estén tocando las líneas de los bordes, sólo cuente aquellas que estén
en dos de los cuatro bordes (superior e izquierdo); esto evitará que se repita el conteo.
Si cuenta más de 50 o menos de 20 células por cuadro, repita la toma de muestra o cambie la
dilución que esté usando.
Limpie la cámara con agua destilada estéril y séquela con gasa o algodón después de cada
lectura.
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Medición de la biomasa microbiana por densidad óptica
Tomar 1 ml de cada muestra problema y preparar en tubos tapa – rosca una dilución de cada
una de ellas de tal forma que la concentración final de solutos no sobrepase las 1000 ppm
(máxima concentración de sólidos leídas por el espectrofotómetro)
Agitar muy bien. Realizar la lectura de absorbancia en el espectrofotómetro a 540nm.
Medición de la biomasa microbiana por peso seco celular.
Centrifugue los tubos, previamente pesados, que contienen las soluciones originales de
levadura (volumen restante conocido) a 4000 rpm durante 15 minutos. Con ayuda de una
pipeta evacue cuidadosamente el sobrenadante. Posteriormente someta a evaporación en estufa
el agua restante a una temperatura de 90ºC durante 20 horas. Pese los tubos y vuelva a
evaporar hasta que haya alcanzado un peso constante.
Tabla de datos
1. Recuento cámara de Neubauer.
TUBO 1 2 3 4 5 6
ml de agua 10 8 6 4 2 0
Concentración (g/ml)
Recuento cuadro 1
Recuento cuadro 2
Recuento cuadro 3
Recuento cuadro 4
Recuento cuadro 5
Nota: Si cuenta más de 50 o menos de 20 células por cuadro, repita la toma de muestra o
cambie la dilución que esté usando.
Haga los cálculos y reporte la dilución.
2. Recuento por densidad óptica.
TUBO 1 2 3 4 5 6
ml de agua 10 8 6 4 2 0
Concentración (ppm)
Absorbancia 1
Absorbancia 2
Absorbancia 3
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Nota: Si una concentración sobrepase las 1000 ppm, haga una dilución de la muestra.
Haga los cálculos y reporte la dilución.
Cálculos
Calcular el volumen de la cámara de recuento teniendo en cuenta las dimensiones de los

cuadros donde se realice el conteo.
Calcular el No. células/L para cada concentración
Elabore una gráfica de g de células/L vs No. células/L y g de células/L vs Absorbancia.
Aplicar un ajuste con el modelo lineal y validar con R2.
Elabore el informe final (Suplemento).
Consultas
Consulte y explique otros métodos utilizados para la medición de la biomasa microbiana.
Consulte las ventajas y desventajas de cada uno de las técnicas utilizadas en el experimento.
Referencias
BAYONA, Martín. Microorganismos de Interés Industrial. Manual de Laboratorio. Pontificia

Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias. Dpto. de Microbiología. 1999.
SCRAGG, Alan. Biotecnología para Ingenieros. Sistemas biológicos en procesos

tecnológicos. México. D.F. Limusa. S.A. 2002.
WANG, Nam Sun. Biochemical Engineering Laboratory Manual. University of Maryland.

Deparment of Chemical Engineering. 1999.
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COMPLEMENTO 2. DETERMINACIÓN DE AZÚCARES

REDUCTORES
Introducción
Este método nos ayuda a determinar la presencia de grupos carbonilos libres (C=O) en los
también llamados azúcares reductores. Esto involucra la oxidación del aldehído presente en el
grupo funcional. Simultáneamente, en presencia de calor el ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS)
se reduce a ácido 3-amino, 5-nitrosalicílico bajo las condiciones alcalinas, desarrollándose un
color amarillo café:
𝑂𝑥𝑖𝑑𝑎𝑐𝑖ó𝑛
𝐺𝑟𝑢𝑝𝑜 𝑎𝑙𝑑𝑒ℎ𝑖𝑑𝑜 → 𝐺𝑟𝑢𝑝𝑜 𝐶𝑎𝑟𝑏𝑜𝑥𝑖𝑙𝑜
Reducción
DNS → ácido 3 − amino, 5 − nitrosalicílico
Se adiciona sulfito (no necesario para la reacción del cambio de color) en el reactivo para
absorber el oxígeno disuelto, ya que éste puede interferir con la oxidación de la glucosa.
En la reacción se muestra que un mol de azúcar reaccionará con un mol de DNS. Sin
embargo, no cabe duda que se dan muchas otras reacciones, y la estequiometria de la
reacción es mucho más complicada que lo previamente descrito. El tipo de reacción lateral
depende de la naturaleza exacta del azúcar reductor. Diferentes azúcares reductores arrojan
distintas intensidades de color; así, se hace necesario calibrar para cada azúcar. Además de la
oxidación de los grupos carbonilos en el azúcar, otras reacciones laterales como la
descomposición de azúcar también compiten para la disponibilidad del ácido 3,5-
dinitrosalicílico. Como consecuencia, la carboximetil celulosa puede afectar la curva de
calibración alterando la intensidad del color desarrollado.
Este es un método conveniente y relativamente barato, aunque su especificidad es

relativamente baja. Cuando los efectos de compuestos extraños no son conocidos, uno puede
incluir efectivamente el llamado control interno para el desarrollo del color en muestras
desconocidas; entonces, una cantidad conocida de azúcar se adiciona a esta muestra. El
aumento en la absorbancia en el segundo desarrollo de color es equivalente a la cantidad
incrementada de azúcar. Altas concentraciones de proteína interfieren en la determinación de
los azúcares reductores. Otra de las ventajas de este método es que el color final desarrollado
es estable hasta 24 horas, es sencillo y rápido.
Objetivo
General
Aplicar una técnica para determinar azúcares reductores en caldos y medios de fermentación.
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Específico
Aplicar el método de DNS para azúcares reductores
a) Materiales b) Reactivos
Tubos de ensayo
tapa rosca Solución del ácido 3,5 dinitrosalicílico, 1% :
Pipetas de 1, 5 y
10 ml
Pipeteador o DNS: 10 g
automático o Fenol: 2 g
Auxiliar de pipeteo o Sulfito de sodio anhidro: 0.5 g
Matraz aforado de o Hidróxido de sodio: 10 g
1000 ml o Aforar a 1 litro con Agua destilada
Frasco color ámbar
Espectrofotómetro
Conservar refrigerado dentro del frasco color ámbar.
Vortex.
Refractometro.
Solución estándar de glucosa. Disolver 1 gr. de glucosa anhidra en 1000
ml de agua destilada, conservar en refrigeración hasta el momento de
usarla.
Procedimiento
Establecer una escala estándar de 0 a 1000 ppm. Dentro de una serie de tubos de ensayo, previamente
lavados y sumergidos en solución de ácido sulfúrico al 5% durante una noche, introducir: 0; 0.2; 0.4;
0.6; 0.8; y 1 ml de solución estándar y completar a 1 ml con agua destilada. Elabore la siguiente tabla
al momento de registrar los datos:
Tubo ml. de sln estándar ml. de agua destilada Concentración final (ppm)
1 0.0 1.0 0
2 0.2 0.8 200
3 0.4 0.6 400
4 0.6 0.4 600
5 0.8 0.2 800
6 1.0 0.0 1000
La determinación de azúcares reductores es efectuada sobre 1 ml de la muestra convenientemente

diluida. La curva estándar y las muestras sufren las siguientes operaciones:
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1. Adicionar 1 ml del reactivo DNS

2. Agitar fuertemente en un vortex
3. Poner a ebullición durante 5 minutos
4. Enfriar rápidamente (baño de hielo)
5. Adicionar 8 ml de agua destilada dentro de cada tubo
6. Agitar fuertemente en un vortex
7. Leer absorbancia a 575 nm.
¡ADVERTENCIA!
El reactivo DNS es altamente tóxico, cancerígeno y abortivo. Mucho cuidado al manipularlo.

Usar siempre guantes de látex.
Tabla de datos
Lectura de la absorbancia
Tubo Concentración final Absorbancia (575 nm)

(ppm) R1 R2 R3
1 0
2 200
3 400
4 600
5 800
6 1000
Cálculos
Grafique la curva de calibración de concentración vs Absorbancia para la determinación de

azúcares reductores con el método del DNS.
Consultas
Consulte otros métodos utilizados para la determinación de azúcares reductores y glucosa.
¿Qué ventajas y desventajas presentan para su uso en biotecnología?
Referencias
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MILLER, G. L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar.

Analyt Chem. 1959; p. 31, 426-429. En: RAIMBAULT, Maurice. Manual de Laboratorio:
Métodos Físicos, Químicos y Microbiológicos. Cali, Colombia: ORSTOM – UV, 1994; p. 1-3.
WANG, Nam Sun. Biochemical Engineering Laboratory Manual. University of Maryland.

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COMPLEMENTO 3. DETERMINACIÓN DE ALCOHOL
Introducción
La determinación de la cantidad de etanol en los productos obtenidos a partir de la

fermentación alcohólica es una de las principales preocupaciones del biotecnólogo; ya que éste
es un análisis que requiere de una dotación adecuada de equipos de medición o, por otro lado,
de una cantidad considerable de volumen de muestra, como en el caso del método de
destilación.
El método de Winnick permite determinar bajas concentraciones de alcohol etílico a través de

la acción oxidante de la solución 0.4 N de dicromato de potasio en ácido sulfúrico 10N,
posterior valoración con Tiosulfato de sodio. Se diluye la muestra de forma que la cantidad de
dicromato utilizada sea suficiente para oxidar todo el etanol, formando acetaldehído; de otra
manera debe repetirse la prueba usando una mayor dilución de la muestra. El exceso de
dicromato se elimina con yoduro de potasio, el volumen de tiosulfato de sodio gastado en
titulación se emplea para determinar el porcentaje de etanol en la muestra teniendo en cuenta
la respectiva dilución. Las reacciones que se manifiestan en el proceso son:
2K2Cr2O7 + 8H2SO4 + 3CH6O 2Cr2(SO4)3 + 2K2SO4 + 3C2H4O2 + 11H2O
K2Cr2O7 + 6KI + 7H2SO4 Cr2(SO4)3 + 4K2SO4 + 7H2O + 6I
2Na2S2O3 + 2I Na2S4O6 + 2NaI
Un hidrómetro o densímetro, mide la diferencia de densidad entre el agua pura y agua con
azúcar disuelta. A mayor cantidad de azúcar disuelta mayor será la flotabilidad del
instrumento. El hidrómetro se usa para medir el progreso de la fermentación a través de una de
sus características, la atenuación. Atenuación es la conversión del azucar en alcohol (etanol) a
través de las levaduras. El agua tiene una densidad de 1.000. Las cervezas normalmente tienen
una densidad entre 1.015 y 1.005. Los champagnes y licores pueden tener densidades menores
a 1.000, porque contienen gran cantidad de alcohol, el cual tiene una densidad menor a 1.000.
Las lecturas de los hidrómetros están estandarizadas a 15°C (59°F). La densidad varía con la
temperatura, por lo cual para obtener mediciones correctas, es necesario corregir la lectura a
través de tablas diseñadas especialmente para ello. Un hidrómetro es un instrumento muy útil
en manos de un cervecero que sabe que es la densidad del mosto y porqué es importante
medirla. A menudo las recetas dan como dato las densidades iniciales y/o finales (en inglés
O.G. – Original Gravity y F.G. – Final Gravity) para describir mejor la cerveza al lector. Para
una levadura promedio, puede estimarse que la densidad final debe estar entre ¼ y 1/5 de la
densidad inicial. Por ejemplo, una cerveza con una densidad inicia de 1.040 debería terminar
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más o menos en 1.010 (o menos). De todos modos, un par de puntos más o menos de ese valor
es normal.
Potential Alcohol
The Potential Alcohol (PA) level listed assumes a must beginning at the SG given on that
same row and fermenting to dryness, i.e. it is the maximum potential alcohol assuming all
sugar is fermented and no sugar additions are made after inoculation. PA values are calculated
based on "SG"/"Brix" values, not on "Sugar" values.
Objetivo
General
Determinar alcohol etílico en caldos de fermentación alcohólica.
Específico
Aplicar el método de Winnick para determinar alcohol en una solución.
Determinar Densidad especifica con un hidrómetro.
a) Materiales: b) Reactivos:
Microburetas Ácido Sulfúrico 10 N
Soporte universal Dicromato de potasio 0.4N en H2SO4 10N
Erlenmeyers de 50 ml Solución de Yoduro de potasio 3N (KI)
Balones aforados de 250 y 500 ml Solución reactivo de almidón soluble
Pipetas de 1, 5 y 10 ml Tiosulfato de sodio 0.1 N+
Balanza, Beakers
Varillas de agitación
Hidrómetro, espectrofotometro
Procedimiento
El método de Winnick
a) Preparación de Reactivos:
Ácido sulfúrico 10N.
Disolver 138.9 ml de H2SO4 (densidad 1,84 gr/ml y 96% de pureza) con agua destilada hasta
aforar a 500 ml.
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ADVERTENCIA!: Se presenta una reacción altamente exotérmica; por lo que se debe

adicionar lentamente el ácido al agua (nunca lo contrario). Hacer esto con el balón sumergido
en baño de agua con hielo. Al enfriarse la solución, se produce una contracción de volumen
que se debe corregir adicionando más agua destilada hasta alcanzar el volumen final.
Dicromato de potasio 0.4 N en H2SO4 10 N:
Pesar 19.614 gr. de Dicromato de potasio previamente seco a 100ºC durante 4-6 horas y
disolverlo en el H2SO4 10 N hasta completar un volumen de 1000ml.
Solución de yoduro de potasio 3 N:
Disolver 49.8 g de yoduro de potasio (KI) en suficiente agua destilada y aforar en un balón de
100 ml.
Solución reactivo de almidón soluble:
Pesar 1 gr. de almidón soluble. Verter lentamente con agitación constante en 200 ml de agua
destilada hirviente. Hervir hasta obtener un líquido ligero y translúcido. Dejar decantar y usar
únicamente el líquido sobrenadante.
En un recipiente limpio y bien tapado, esta solución puede durar hasta dos meses. El reactivo
es propenso a contaminarse con hongos.
Tiosulfato de sodio 0.1 N:
Preparar a partir de un stock comercial para 1 L de solución.
b) Determinación:
Realizar una curva patrón en tubos de ensayo con las siguientes diluciones a partir de la
muestra pura:
Tubo Etanol ml Agua destilada ml etanol puro

1 0.0
2 1/100
3 1/200
4 1/300
5 1/400
6 1/500
7 1/600
8 1/800
Las diluciones se someten al siguiente proceso:
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Prepare en un erlenmeyer una mezcla con 25 cc de dicromato de potasio (K2Cr2O7) 0,1 N y

10 cc de ácido sulfúrico concentrado.
Agregue a la mezcla anterior 10 cc de la solución a analizar y deje en reposo durante 30 min

para que ocurra la reacción:
2K2Cr2O7 + 3C2H5OH + H2SO4 = K2SO4 + 2Cr2(SO4)3 + 3CH3COOH + 11H2O
Añada a la mezcla anterior 10 cc de solución de yoduro de potasio al 10%
K2Cr2O7 + 6KI + 7H2SO4 = 4K2SO4 + Cr2(SO4)3 + 3I2 + 7H2O
Titule de inmediato el yodo puesto en libertad durante la reacción anterior con tiosulfato de
sodio 0,1 N y 0,5 cc de solución de almidón como indicador:
2Na2S2O3 + I2 = 2NaI + Na2S4O6
Prepare un blanco siguiendo el proceso descrito pero con agua en lugar de la muestra.
Titular con solución volumétrica de Tiosulfato de sodio 0.1 N con agitación cuidadosa hasta
obtener un cambio nítido hacia un color azul marino.
Uso del hidrómetro (Densímetro)
1. Ponga una muestra de bebida alcohólica de 200cc en una probeta.

2. Hunda el Hidrómetro cuidadosamente hasta que flote libremente.
3. Remueva por si hubiera burbujas adheridas en la probeta.
4. El líquido debe estar a una temperatura entre 18º y 24º pero no habrá un error
importante en una temperatura +- 2º.
5. Haga la lectura de la DE (SG) y la temperatura (T).
Los hidrómetros están calibrados a 15°C. Todos los valores de densidad mencionados en
textos y recetas están referenciados a esa temperatura, por lo cual es importante aprender a
efectuar estas correcciones.
Tabla de datos
Datos de la titulación de método de Winnick.
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Tubo %Etanol Volumen ml (Tiosultafo)

1 0.0
2 1/100
3 1/200
4 1/300
5 1/400
6 1/500
7 1/600
8 1/800
Nota: Restar el volumen de Tiosulfato gastado por el blanco al momento de construir la curva
de calibración.
Datos de las lecturas de hidrómetro
Muestra DE (SG) T(°C)

A
B
C
D
Cálculos
1. Método de Winnick
Grafique la curva de calibración de concentración vs Absorbancia para la

determinación de alcohol.
Calcule el porcentaje de alcohol de la muestra problema utilizando la curva de

calibración.
Concentración de etanol en la muestra original
1,15(𝑎 − 𝑏)𝐹𝑁
𝐶=
𝑉
Donde:
C: concentración, g/L
a: volumen de tiosulfato gastado en el blanco
b: volumen de tiosulfato gastado en la muestra
F: factor de dilución de la muestra
N: normalidad del tiosulfato de sodio
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V: volumen de solución titulada
2. Hidrómetro
Aplicación de lecturas para medios en fermentación.
En la siguiente tabla está calibrada para el agua, no uva jugo (difieren ligeramente, pero no
apreciable). La tabla muestra gravedad específica (SG), el porcentaje de azúcar en el líquido
expresado en °Brix, el incremento volumétrico en un galón de agua si fue necesario agregar
azúcar para lograr una lectura particular de la SG y el alcohol potencial a un SG especificado.
Tabla de relación gravedad especifica (Densitómetro) Alcohol potencial (PA) en fermentación.
Gravedad Azúcar Volumen Alcohol

especifica °Brix incrementado/ Potencial
(SG) Azúcar (PA)
adicionada
1.000 0.0 1 gal. 0.0
1.010 3.8 1 gal 0.7 oz. 1.4
1.015 4.9 1 gal 2.4 oz. 2.0
1.020 6.0 1 gal 4.0 oz. 2.7
1.025 7.1 1 gal 5.6 oz. 3.4
1.030 8.2 1 gal 6.4 oz. 4.1
1.035 9.3 1 gal 8.0 oz. 4.8
1.040 10.4 1 gal 8.8 oz. 5.4
1.045 11.5 1 gal 10.4 oz. 6.1
1.050 12.6 1 gal 11.2 oz. 6.8
1.055 13.7 1 gal 12.8 oz. 7.5
1.060 14.8 1 gal 13.6 oz. 8.2
1.065 15.9 1 gal 15.2 oz. 8.8
1.070 17.0 1 gal 16.0 oz. 9.5
1.075 18.1 1 gal 17.6 oz. 10.2
1.080 19.2 1 gal 18.4 oz. 10.9
1.085 20.3 1 gal 20.0 oz. 11.5
1.090 21.4 1 gal 21.6 oz. 12.2
1.095 22.5 1 gal 22.4 oz. 12.9
1.100 23.6 1 gal 24.0 oz. 13.6
1.105 24.7 1 gal 25.6 oz. 14.3
1.110 25.8 1 gal 26.4 oz. 14.9
1.115 26.9 1 gal 28.0 oz. 15.6
1.120 28.0 1 gal 29.6 oz. 16.3
1.125 29.1 1 gal 30.4 oz. 17.0
1.130 30.2 1 gal 32.0 oz. 17.7
1.135 31.3 1 gal 33.6 oz. 18.3
Ejemplo: Supongamos que el vino comenzó a 1.096 y terminado en 0.992. ¿Había terminado
en 1.000, el alcohol por el volumen sería del 13%.
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En la siguiente tabla presenta los números que pueden ser agregados para el número inicial de
PA para obtener un más preciso alcohol final por número de volumen.
Tabla 2. Alcohol Potencial durante la fermentación
Final SG Potential
Alcohol
1.000 0.0
0.998 0.3
0.996 0.6
0.994 0.8
0.992 1.1
0.990 1.4
Supongamos que el vino comenzó a 1.096 y terminó en 0.992. Por extrapolación, podemos ver
que 1.096 rinde un PA de aproximadamente 13%. La última lectura muestra en 0.992 agregar
1,1%. Así, el vino debe tener un ABV de 14.1% alcohol por volumen.
Ajuste los valores si la temperatura no corresponde al calibrado para la tabla
Consultas
Consulte la tabla de correcciones de temperatura para la lectura del hidrómetro.
Consulte otros métodos para determinar alcohol etílico. Explique las ventajas y desventajas
para su uso.
Referencias
WINNICK, Determinación de Etanol en la sangre. Cámara de Winnick. 1984.
Cornelius S. Ough, Chemicals used in making wine, C&EN, January 5, 1987
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PRÁCTICA 1. EFECTO DEL NUTRIENTE EN LA FERMENTACIÓN

Introducción
Los procedimientos de fabricación de vino de uva en casa son bastante hacia adelante. Jugo de
uva simplemente se inocula con un paquete de levadura cultura de arrancador comprado en un
supermercado. Fermentación primaria dura aproximadamente una semana; durante ese tiempo
la mayoría del azúcar presente en el jugo se convierte en etanol y levadura las células, con la
evolución del dióxido de carbono.
Las células de levadura exceso entonces se extraen el jugo junto con otros sedimentos, y una
lenta fermentación secundaria está permitida proceder a desarrollar el sabor final. Puede
agregarse azúcar a la original debe alcanzar la graduación deseada o modificar el sabor. El tipo
de vino se puede clasificar según el color del vino. Otra clasificación se basa en el contenido
inicial de azúcar, que se enumeran en la tabla 1
Objetivo
General
Evaluar el efecto del medio de crecimiento en la fermentación.
Específico
Estudiar el efecto de la concentración del azúcar en la fermentación
Microburetas frutas (uvas)
Soporte universal Azúcar
Erlenmeyers de 50 ml Levadura Saccharomyces ellipsoide
Balones aforados de 250 y 500 ml, Pipetas de
1, 5 y 10 ml, Beakers
Balanza
Sistema de sifón
Procedimiento
Fermentación
1. Preparación de cultivo de levadura starter.
Mezclar 1g de levadura en 100ml de jugo de uva.

Incubar durante 24h.
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Nota: La levadura liofilizada puede ser adicionada directamente al sistema de

fermentación en un nivel de 1 g por cada 4L. Para mejores resultados, primero
suspender 1g de levadura en 10ml de agua a 35°C.
2. Fermentación primaria.
1. Adicionar suficiente azúcar al jugo de uvas para preparar 4 sustratos en un 1L.
Sustrato Concentración (g/L) azúcar

A 0.0
B 100.0
C 200.0
D 300.0
2. Medir las condiciones iniciales de los sustratos: La gravedad específica, PAo y

°Brix
3. Inocular cada medio con 20ml del cultivo starter. En el sistema de sifón (Figura 1)
Tapón Manguera estéril
Jugo Agua destilada
Figura 1. Sistema de sifón para la fermentación
4. Fermentar a temperatura ambiente por una semana
3. Fermentación secundaria.
1. Al final de la primera semana, decantar y filtrar el jugo.
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2. Medir el valor PA2 con el hidrómetro. Estimar el contenido de alcohol:
𝑃𝐴2 − 𝑃𝐴𝑜
3. Eliminar el sedimento e higienizar la botella de fermentación

4. Montar el sistema de sifón.
5. Fermentar por otras dos semanas.
6. Realizar el procedimiento de filtración
7. Medir PAf
8. Elaborar el informe final.
Tabla de datos
Lectura de las condiciones de la fermentación en cada periodo.
Fermentación primaria Fermentación secundaria Final

Sustrato DE PAo °Brix AR% DE PA2 °Brix AR% DE PAf °Brix AR%
A
B
C
D
Cálculos
Realice todos los cálculos que realizo para la fermentación.
Pesaje de la fruta.
Rendimiento
Volumen de jugo, dilución.
Pesaje de azúcar.
Grafique los resultados de cada etapa de fermentación
Consultas
Explique la ruta metabólica de los azucares.
Explique la reacción de la fermentación alcohólica
¿Cuál sería el efecto inhibidor que ejerce el azúcar y los productos (concentración
alcohol) en el microorganismo?
¿Cuál es el grado máximo de etanol que se puede obtener en una fermentación?
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Referencias
Cornelius S. Ough, Chemicals used in making wine, C&EN, January 5, 1987.
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PRÁCTICA 2. EVALUACIÓN DE CULTIVOS LÁCTICOS

Introducción
Las Bacterias lácticas tienen la capacidad de fermentar la lactosa contenida en la leche a ácido
láctico, como es el caso de Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc y Pediococcus. Esta
capacidad bacteriana puede ser explotada industrialmente para obtener productos como el
Yogurt y el Kumis. El Yogurt es un producto obtenido por la simbiosis entre el Lactobacillus
bulgaricus y Streptococos thermophylus; los cuales se pueden obtener de la leche desnatada
concentrada por evaporación.
Una de las etapas más importantes del proceso de obtención del producto fermentado es el
cultivo, ya que aporta a la leche las bacterias acidolácticas responsables del proceso de
acidificación. Este cultivo consta exclusivamente de especies termofílicas; que para el caso
del yogurt son : L. bulgáricus y St. Thermophylus. El cultivo no debe contener especies no
termofílicas. La producción de cada una de las especies varía a lo largo del proceso; al
comienzo es de 1:1 a 2:5. Durante la incubación se favorece el desarrollo de St. Thermophylus
hasta el punto de alcanzar una proporción de 5:1 que se equilibra nuevamente al final del
proceso. Por otra parte, el L. bulgaricus proporciona el aroma característico del yogurt.
Objetivo
General
Evaluar la fermentación acido láctica en un medio con lactosa como fuente de carbono
Específico
Fermentar leche fresca con un cultivo de Lactobacillus bulgaricus y Streptococos

thermophylus hasta obtener las características de un yogurt.
Evaluar el comportamiento de la acidez, pH, relación cocos/bacilos y viscosidad del cultivo
Calcular los rendimientos (YP/S , YX/S) del proceso
Balanza NaOH 0,1 N
Frascos tapa rosca de 250 ml, Bureta Fenolftaleina 2%
Erlenmeyer de 500 ml Azul de metileno
Pipetas de 5 y 10 ml; Pipetas de 1 ml Leche descremada en polvo
Tubos de ensayo Cultivo Láctico de Yogurt
pHmetro; Baño María; Cámara de Neubauer Agua destilada estéril
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Procedimiento
Preparación del Cultivo
En 3 frascos con tapa rosca reconstituir 200 ml de leche en polvo descremada (8%,
12%, y 16%)
Sustrato pH Acidez (%) °Brix

Lactosa
8%
12%
16%
Pasteurizar en baño maría a 80ºC por 30 minutos.
Los gramos de leche en polvo se calculan con la siguiente ecuación:
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑥 %𝑠𝑢𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜

𝑙𝑒𝑐ℎ𝑒 𝑒𝑛 𝑝𝑜𝑙𝑣𝑜 (𝑔) =
100 − %ℎ𝑢𝑚𝑒𝑑𝑎𝑑 𝑙𝑒𝑐ℎ𝑒 𝑒𝑛 𝑝𝑜𝑙𝑣𝑜
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑎𝑔𝑢𝑎 = 𝑉𝑢𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 − 𝑔 𝑑𝑒 𝑙𝑒𝑐ℎ𝑒 𝑒𝑛 𝑝𝑜𝑙𝑣𝑜
Enfriar a 43 ºC.
Inocular cada concentración con 3% de cultivo de yogurt. ¡AGITAR BIEN!
Incubar a 43 ºC por 3 horas. ¡ NO AGITAR!
Refrigerar a 4 ºC por 2 horas. ¡ NO AGITAR!
Actividad del Cultivo Madre
Medir el pH cada 30 minutos con ayuda de un pHmetro.
Medir la acidez cada 30 minutos tomando 9 ml del cultivo, adicionar 2 gotas de

fenolftaleina al 2%. Titular con NaOH 0,1 N hasta que persista el color rosa pálido por
30 segundos. Expresar la acidez en porcentaje de ácido láctico:
ml NaOH gastadox0,1Nxmeq − g ácido láctico

% Ácido Láctico = 𝑥100
𝑚𝑙 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎
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Relación Cocos – Bacilos. Realizar conteo en cámara de Neubauer cada 60 minutos y

observar la relación coco - bacilo en cada intervalo de tiempo. (Incluir una gota de azul
de metileno en la dilución para colorear las bacterias)
Rendimientos (YX/S, YP/S). Realizar los balances de masa respectivos y encontrar el

rendimiento de Sustrato en biomasa (YX/S) y sustrato en producto (YP/S), considerando
que para una concentración de 12,5 % de sólidos existen 4,7% de lactosa.
Tabla de datos
Datos del seguimiento del cultivo:
Tiempo(min) pH Acidez (%) °Brix Recuento

0
30
60
90
120
150
180
Cálculos
Haga los cálculos asociados a cada uno de los parámetros de seguimiento del cultivo.
Establezca una relación entre incremento de sólidos vs Acidez a través de una gráfica.
Establezca una relación entre incremento de sólidos vs pH a través de una gráfica.
Establezca una relación entre incremento de sólidos vs Recuento a través de una
gráfica.
Calcule los respectivos rendimientos para cada intervalo de tiempo y muestre los
rendimientos globales de la fermentación.
Consultas
¿Qué problema representa el hecho de encontrar levaduras, en alto porcentaje, en productos

como el yogurt?
¿Qué efecto tiene en el pH y la acidez en el aumento de sólidos dentro de un cultivo láctico?
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Elaboré un mapa conceptual de compare las fermentaciones homofermentativa y

heterofermentativa incluyendo microorganismos, materias primas, productos y condiciones
ambientales.
Referencias
FUNDACIÓN JORGE TADEO LOZANO. Guías para las prácticas de laboratorio de la

asignatura: Microbiología Industrial. Santa fe de Bogotá. D.C. 1994.
GARCÍA, Mariano et all. Biotecnología alimentaria. Limusa. México. 1993.
ICTA. Cultivos Lácticos y Productos fermentados. UNIVERSIDAD NACIONAL DE
COLOMBIA. Vicerrectoría. Académica. Santa fe de Bogotá. 1995.
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PRÁCTICA 3. EVALUACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE VINO

Introducción
La historia de la fermentación se remonta más allá de nuestros conocimientos. El hombre, tal

como lo conocemos; es decir, el hombre que trabaja y lucha, aparece en la escena con una
jarra de vino. Su realidad vinícola se aproxima más a nuestra experiencia de vida con la
expansión de la dominación griega, iniciada 1000 años a. C., fue entonces cuando el vino llegó
por primera vez a los países en los que se sentaría su verdadero hogar: Italia y Francia. Los
últimos noventa años han presenciado la revolución industrial de los licores y, sobre todo, en
los últimos 25 años el fundamento científico de la elaboración de los licores ha clasificado la
situación de tal modo que técnicas que antes parecían imposibles hoy son fáciles de realizar.
Los microorganismos que intervienen en la fermentación del vino son principalmente

levaduras del género Saccharomyces, y dentro de este género, la especie que ha sido
tradicionalmente utilizada es S. Cerevisiae. Var. Ellipsoideus
La fabricación del vino más que ciencia es un arte. Aunque la uva es la fruta comúnmente
más usada, también pueden usarse muchas otras frutas como los melocotones, ciruelas,
manzanas y duraznos para la fabricación de vinos. Los procedimientos de fabricación del vino
de uva casero son bastante sencillos. Simplemente se inocula el jugo de la uva con un cultivo
iniciador de levaduras adquirido en un supermercado. La fermentación primaria tarda
aproximadamente una semana; durante ese tiempo la mayoría del azúcar originalmente
presente en el jugo se convierte en etanol por acción de las células de levadura, al mismo
tiempo se produce dióxido de carbono. El exceso de células de levadura son posteriormente
removidas del mosto de uva junto con otros sedimentos, y una fermentación secundaria más
lenta permite desarrollar el sabor final del vino. Puede adicionarse azúcar (sacarosa o glucosa)
para lograr alcanzar el porcentaje de alcohol deseado o para modificar el sabor del vino. El
tipo de vino puede ser clasificado según el color del vino. Otra clasificación está basada en el
contenido de azúcar presente en el producto final, como se muestra en la tabla 1.
Tabla 1. Clasificación de vinos según el contenido de azúcar.

TIPO DE VINO GRAVEDAD ESPECÍFICA CONT. DE AZÚCAR (%P/P)
Vino Seco 1.085 – 1.100 21 – 25
Vino semi dulce 1.120 – 1.140 29 – 33
Vino Dulce 1.140 – 1.160 33 - 37
Objetivo
General
Evaluar el efecto del contenido de azúcar (Fructosa) en el proceso de la fermentación del vino
Específico
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Elaborar un medio compuesto por mosto (jugo) de uva y un azúcar.
Evaluar el comportamiento de la biomasa, acidez, pH, alcohol, azúcares reductores
Estudiar el efecto de la concentración del azúcar en la fermentación
Fermentador estéril de 1 L. (Erlenmeyer) 4 Kg. de Uvas o corozo, manzana, mango, piña,
Manguera estéril maracuyá
Gasa estéril Fructosa
Cinta de enmascarar y bisturí Levadura para vino (Saccharomyces cerevisiae)
Rollo de papel aluminio Azufre en polvo o Metabisulfito de sodio
Beaker de 500 ml Agua destilada
Colador
Mortero grande
Pipetas estériles de 1, 5 y 10 ml.
Baño maría
Tubos de ensayo estériles
Procedimiento
Seleccionar las uvas alto grado de madurez (12 – 15 ºBrix) y sanidad. Lavar la uva con
abundante agua. Quitar manualmente las pepas de la fruta. Macerar manualmente (Usar
guantes) en un recipiente grande para sacar el jugo de la uva (mosto).
Curar el fermentador, previamente limpio y estéril, con sulfuroso. Pesar 1 gr. de Azufre y
cubrirlo con un pedazo de algodón alrededor de una varilla delgada. Quemar el azufre y
flamear en el interior del fermentador con los gases sulfurosos para evitar la posterior
contaminación del vino. Evitar un exceso de sulfuroso en el fermentador que pueda alterar las
características organolépticas. En su defecto, se puede usar Metabisulfito de sodio al 1,5%
para el curado del fermentador esparciendo esta solución por toda la superficie del recipiente.
Preparación del medio
Verter el mosto de uva en el fermentador, adicionar agua en relación 2:1 (Mosto : Agua).
Adicionar la cantidad de fructosa correspondiente a cada ensayo y agitar. (Ver tabla).
Ensayo Conc. de Fructosa adicionada (gr/L)

1 50
2 100
3 200
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Pasteurizar el mosto en baño maría a 65ºC durante 20 minutos. Agitar suavemente 2 o

3 veces para distribuir el calor.
Enfriar en baño de hielo hasta temperatura ambiente (28 – 30ºC)
Fermentación inicial
Inocular el mosto con un preinóculo de Levadura S. Cerevisiae para vino (2%).

Adicionar al fermentador y agite hasta disolver.
Tapar el fermentador con la gasa estéril (Bien ajustada) y conectar la manguera como
se muestra en la figura.
Muestreo
Tapón Manguera estéril
Jugo Agua destilada
Figura 2. Sistema de fermentación
Permitir que se realice la fermentación primaria por un periodo de 8 días.
Luego de los 8 días, realizar un frotis del velo de crecimiento y colorear con azul de
lactofenol, observe la morfología; realice una siembra en agar malta; incube durante 5
días a temperatura ambiente y anote los resultados obtenidos.
Fermentación secundaria
Realizar un trasciego del mosto (separar el vino del sedimento acumulado en el fondo
del fermentador, evitar la agitación) a otro fermentador en las mismas condiciones de
esterilidad y curado.
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Ajustar nuevamente todos los accesorios y continuar con la fermentación secundaria

por un periodo.
Al cabo de los 8 días, realizar otro trasciego y finalmente dejar fermentar por 2
semanas más.
Adecuación del producto
Filtrar el vino obtenido, lo más higiénicamente posible con ayuda de un papel filtro y
utilizando una bomba de vacío.
Pasteurizar a 65ºC por 20 minutos. Posterior enfriamiento a 4ºC.
Degustar el vino y anotar sus características sensoriales.
Envasar el restante en botellas de vidrio oscuro y permitir su envejecimiento.
NOTA: Todo material que entre en contacto con el caldo de fermentación debe estar
previamente estéril para evitar una contaminación. Utilice siempre el mechero para sacar las
muestras.
Tabla de datos
Determinar en el proceso: recuento, azúcares reductores, porcentaje de alcohol etílico, pH y

acidez expresada en ácido láctico.
Lectura de las condiciones de la fermentación en cada periodo. Tener en cuenta:
Fermentación primaria:
Empieza de Día 0 a Día 8
Fermentación secundaria:
Empieza de Día 8 a Día 16
Fermentación final:
Empieza de Día 16 a Día 30 (dos semanas)
Fermentación primaria Fermentación secundaria Final

Día DE PAo °Brix AR% pH Día DE PA2 °Brix AR% pH Día DE PAf °Brix AR% pH
0 8 16
2 10 20
4 12 24
6 14 28
8 16 30
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Cálculos
Realice todos los cálculos para la fermentación

Pesaje de la fruta.
Rendimiento
Volumen de jugo, dilución.
Pesaje de azúcar.
Grafique los resultados de cada etapa de fermentación:
Concentración de Azúcar adicionada vs. %Alcohol.
Concentración de Azúcares reductores vs. %Alcohol.
Realice los balances de masa de cada proceso.
Calcule los rendimientos de sustrato en producto (Yp/s) puntuales
Incluya costos - beneficios.
Grafique las variables de la fermentación en función del tiempo
Interrogantes:
¿Identifique las fases de crecimiento del microorganismo?
En el proceso total, ¿cuantas fases lag o exponencial se repiten?
¿En cuál concentración de azúcar se dan los cambios más rápido?
¿Qué tipo de grafica se debe hacer para determinar los parámetros de Monod?
Consultas
¿Qué microorganismos han sido mejorados para la producción de vino?
Esquematice un diagrama de flujo con el proceso industrial de vinos
¿Cuáles son los principales defectos físicos de los vinos?
¿Qué análisis organolépticos le haría a un vino?
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¿Qué diferencia existe entre un vino espumoso y un vino tradicional?
¿Qué exigen las normas ICONTEC para la calidad de los vinos?
Referencias
Fundación Jorge Tadeo Lozano. Guías para las prácticas de laboratorio de la asignatura:
Microbiología Industrial. Santa fe de Bogotá. D.C. 1994.
García, Mariano et al. Biotecnología alimentaria. Limusa. México. 1993.
Wang, Nam Sun. Biochemical Engineering Laboratory Manual. University of Maryland.

Lee, Byong. Fundamentos de Biotecnología de los Alimentos. Acribia S.A. Zaragoza. 2000.
Ward, Owen P. Biotecnología de la fermentación. Acribia S.A. Zaragoza, 1991.
Vogt, Ernest. El vino. Obtención, Elaboración y Análisis. Zaragoza. Acribia. 1986.
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PRÁCTICA 4. CINÉTICA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO
Introducción
El conocimiento de la cinética del cultivo permite predecir el desarrollo de la fermentación y

evaluar rendimientos y productividades, datos importantes en el diseño de estrategias de
producción y optimización de procesos. Las células consumen los nutrientes requeridos para
crecimiento y los convierten en nuevas células y productos metabólicos. La velocidad de
estos procesos varía con el desarrollo del cultivo. A medida que las células crecen se
acumulan en el medio los productos finales del metabolismo celular. Frecuentemente, estos
componentes alteran el pH y la reología del medio; factores decisivos sobre la actividad
celular y los mecanismos de transporte.
El procedimiento apropiado para una fermentación batch es, primero que todo, inocular un
frasco pequeño de caldo nutriente con un cultivo puro; ya sea de una caja de petri, tubo de
cultivo líquido o tubo inclinado con agar sólido. El frasco inoculado debe agitarse
constantemente a temperatura controlada. Una vez alcanzada la fase de crecimiento, se
inocula una pequeña cantidad de medio de cultivo de este frasco a otro de mayor volumen.
Este proceso se repite una o dos veces más con el objetivo de adaptar la cepa microbiana a las
condiciones y nutrientes del medio a utilizar en el estudio de la cinética fermentativa. Un
proceso similar se lleva a cabo a nivel industrial, de tal manera que se van aumentando los
volúmenes de medio para, finalmente, ser inoculado al fermentador de mayor volumen.
Cuando se trabaja con cultivos puros, se debe operar con el cuidado de evitar la contaminación
que puede presentarse por cualquier exposición al aire, agua, tacto, etc.; de tal manera que,
todo elemento que entre en contacto con el interior del fermentador debe ser previamente
esterilizado.
Objetivo
General
Estudiar la cinética del crecimiento de Saccharomyces cerevisiae en fermentación batch
sumergida
Específico
Determinar la cinética de crecimiento, de consumo de sustrato y formación de producto.
Determinar experimentalmente los parámetros cinéticos de la ecuación de Monod.
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Erlenmeyer de 1L Levadura (Saccharomyces cerevisiae)
Agitador magnético C6H12O6 (Glucosa anhidra)
Manguera de venoclisis estéril NaNO3
Jeringas desechables de 5 ml K2HPO4
Tapones de caucho con orificios MgSO4.7H2O
Balanza analítica KCl
Tubos de ensayo previamente secos por 24 horas. FeSO4.7H2O
Bisturí CaCl2
Silicona (NH4)2SO4
Procedimiento
IMPORTANTE: el procedimiento general es común si hay cambios en la cepa y/o el medio de cultivo.
Tener presente ajustar las condiciones ambientales si se modifica el microorganismo.
Preparación del preinóculo
Inocular aproximadamente 2 gr. de levadura en 300 ml de medio de cultivo (diseñado

según necesidades nutricionales de la levadura y utilizando los nutrientes disponibles).
Agitar. Incubar a 28-30 ºC por 18 – 24 horas.
Diseño, Formulación y preparación del medio nutriente.
Utilizando la composición de una levadura típica y la disponibilidad de los nutrientes

antes mencionados, diseñar el medio de crecimiento que será utilizado para la
producción de 8 gr de levadura /L de medio. (Traer cálculos listos).
Introducir los nutrientes en un fermentador (erlenmeyer) de 1 L, adicionar agua
destilada hasta completar 720 ml (Tener en cuenta el 2% de pérdidas en la
esterilización). Agitar muy bien con una varilla de vidrio; si es necesario, se debe
calentar un poco mientras se agita.
Tapar el fermentador con una gasa y esterilizar en autoclave a 121ºC, 15 PSI durante
15 minutos.
Inoculación y Fermentación
Inocular el fermentador con 80 ml de preinóculo (10% del volumen final). Realizar

este paso lo más asépticamente posible.
Instalar los accesorios del fermentador aerobio; (ver figura).
Realizar la fermentación a 28ºC, 300 rpm, y 1,5vvm (Volumen de aire por volumen de
medio por minuto) durante 36 horas continuas.
Determinar cada 2 horas: Peso seco celular (X) y Concentración de Glucosa (S).
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Muestreo
Bomba de
Aire
Trampa de
gases
Agitador
magnético
Figura 3. Sistema de fermentación
Tabla de datos
Haga seguimiento de todas las variables de la fermentación. Ponga en práctica los procesos
previos.
Periodo Variables
0
1
2
3
4
n
Recomendaciones
Organice previamente con sus compañeros la distribución de espacios y tiempos en el

trabajo práctico. Lleve una tabla organizada de registro de datos y distribuyan
homogéneamente los turnos de trabajo.
Cálculos
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Haga y reporte todos los cálculos requeridos para montar el sistema de fermentación y
grafique en función del tiempo: Log. [X], [S] y [P].
Determinar experimentalmente los parámetros cinéticos de la ecuación de Monod:

Velocidad específica de crecimiento (max.), Constante de saturación (Ks) y el
rendimiento de sustrato en biomasa (Yx/s).
Aplicar los métodos integral y diferencial (utilizar las relaciones lineales de
Lineweaver-Burk, Langmuir y Eadie-Hofstee) de análisis del modelo de Monod en la
fase exponencial del crecimiento microbiano.
Consultas
¿Qué se entiende por crecimiento diáuxico? Explique.

¿Qué otro modelos se usan para modelar el crecimiento microbiano?
Compárelos con el modelo de Monod.
¿Cuáles son los modelos de formación de producto?
Plantear los balances de masa en un reactor tipo batch.
Referencias
Duarte, Alberto. Introducción a la Ingeniería Bioquímica. Universidad Nacional de Colombia.

Departamento de Ingeniería Química. 1995.
Duarte, Alberto. Evaluación de los parámetros cinéticos de la ecuación de Monod. En:

Revista Ingeniería e Investigación. Universidad Nacional de Colombia.
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PRÁCTICA 5. EVALUACIÓN DE LA FERMENTACIÓN ACÉTICA
Introducción
La fermentación acética es la oxidación del alcohol etílico a ácido acético por bacterias que
tienen esta capacidad y muestran un alto rendimiento como el Acetobacter aceticum, A.
Schuzenbachii y A. Curvum. El vinagre es una solución acuosa de ácido acético, se obtiene
mediante la fermentación por oxidación de una solución diluida de etanol. El proceso
metabólico se basa en la conversión, bajo acción de la alcohol deshidrogenasa, en acetaldehído
y del acetaldehído hidratado en ácido acético por la acción de la acetaldehído deshidrogenasa:
C2H5OH ----→ CH3CHO + H2O CH2CH(OH)2 ----→ CH3COOH + H2O
Consecuentemente se requieren 2 etapas; una anaerobia de producción de etanol con levaduras

y otra aeróbica para su oxidación con Acetobacter sp. El vinagre es descrito como un producto
derivado por fermentación con un contenido mínimo de 4% (p/p) de ácido acético y
característico sabor derivado de la materia prima utilizada. Así existen vinagres de frutas,
miel, malta, vino, sidra, etc; siendo los tres últimos los más comunes. Como producto de
partida para su obtención se recomienda el etanol, que se obtiene por fermentación de las
levaduras como Saccharomyces cerevisiae. En la segunda fase el alcohol producido es
oxidado por las bacterias acéticas formándose ácido acético, poco aldehído, ésteres y acetona
que le comunican sabor.
En los procesos modernos, se emplean casi que exclusivamente, como materia prima,
alcoholes baratos que proceden de industrias de fermentación o alcohol etílico sintético en
solución acuosa de 4 a 11 volúmenes, enriquecido con melaza de caña o remolacha, fuentes
inorgánicas, oligoelementos y biocatalizadores.
Objetivo
General
Evaluar el proceso de obtención de vinagre de frutas
Específico
Determinar la cinética de crecimiento, de consumo de sustrato y formación de producto.
Determinar experimentalmente los parámetros cinéticos de la ecuación de Monod.
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Licuadora Plátanos, bananos y mangos bien
Cuchillos maduros (4 Kg. de cada uno)
Coladores NaOH 0,1N
Recipientes grandes Fenolftaleína
Frasco de vidrio con tapa (Fermentador) Sobre de levadura (Saccharomyces
Gaza cerevisiae)
Beakers Cepa de Acetobacter sp.
Erlenmeyers de 100 ml Reactivos para determinar alcohol
Pipetas estériles de 1, 5 y 10 ml
Portaobjetos
Buretas
pHmetro
60 cm de manguera de 1/2” de diámetro
Procedimiento
Seleccionar frutas con un alto índice de madurez, libres de enfermedades y ataque de insectos.
Licuar, a baja velocidad, la fruta que ha sido previamente lavada y pelada hasta obtener 3
litros de zumo. Si es necesario, adicione agua en relación 2:1 (Zumo:Agua).
Pasteurizar los 3 litros de zumo de fruta a 65ºC por 20 minutos. Enfriar a 28 -30ºC en un baño
de hielo a 4ºC. Uno de los grupos debe trabajar con la flora nativa de la fruta; por lo tanto no
debe pasteurizar, como tampoco inocular.
Diluir 2 gr. de levadura comercial en 300 ml de mosto, agitar bien.

Inocular la dilución de levaduras en el resto del mosto, agitar bien. Determinar la
concentración de alcohol, acidez expresada en ácido acético y pH inicial.
Realizar un orificio de 1 pulgada de diámetro a la tapa del fermentador, introducir la manguera

de desfogue y rellenar el espacio con gasa bien ajustada. Realizar una trampa de gases. Tapar
bien el fermentador y permitir que ocurra la fermentación alcohólica durante 8 días a 28-30
ºC.
Finalizado el tiempo de fermentación alcohólica, determinar la concentración de alcohol
alcanzada (debe estar entre 10 – 14%, si es necesario estandarice utilizando alcohol etílico) , el
pH final (debe estar entre 3-4, ajustar si es necesario). Determinar estas variables cada 4 días
una vez empezado el proceso.
Finalizada esta etapa, el líquido claro se transvasa e inocula con Acetobacter aceti. (diluir esta
bacteria en un 5% del mosto y agitar bien).
Tapar el fermentador con una gasa para dejar entrar oxígeno al proceso. Permitir que se dé la
fermentación acética hasta alcanzar un 4-5% de ácido acético (aproximadamente 2 semanas).
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Filtrar el vinagre obtenido con papel filtro o un cedazo fino y determinar %de acidez, pH,
alcohol residual y examen microscópico (realice un frotis de la Acetobacter en medio YGC).
Pasteurizar a 65ºC por 20 minutos. Enfriar inmediatamente en un baño de hielo a 4ºC.

Envasar en botellas de vidrio transparente previamente esterilizadas.
Tabla de datos
Haga seguimiento de todas las variables de la fermentación. Ponga en práctica los procesos
previos.
Periodo Variables
0
1
2
3
4
n
Cálculos
Haga y reporte todos los cálculos requeridos para montar el sistema de fermentación y
grafique en función del tiempo: Log. [X], [S] y [P] (Fermentación alcohólica y
acética).
Modele los parámetros de la fermentación.
Realice los balances de masa del fermentador.
Calcule los rendimientos obtenidos para este proceso, según la fruta utilizada.
Consultas
¿Qué controles deben realizarse a lo largo del proceso de acetificación y por qué?
¿Qué alteraciones pueden presentarse durante el proceso de elaboración del vinagre de
frutas?. ¿Cómo se pueden evitar estas alteraciones?. Explique.
¿Qué parámetros de calidad exige el ministerio de salud en materia de vinagre de
frutas?
Referencias
FUNDACIÓN JORGE TADEO LOZANO. Guías para las prácticas de laboratorio de la
asignatura: Microbiología Industrial. Santa fe de Bogotá. D.C. 1994.
Página 44 de 48
GARCÍA, Mariano et all. Biotecnología alimentaria. Limusa. México. 1993.
LEE, Byong. Fundamentos de Biotecnología de los Alimentos. Acribia S.A. Zaragoza. 2000.
Página 45 de 48
SUPLEMENTO. EL INFORME FINAL

Durante el desarrollo de la asignatura se desarrollará una estrategia didáctica encaminada a
relacionar los aspectos ACADEMICOS-INVESTIGATIVOS-EXPERIMENTALES-
LABORALES de forma integral a través de la ejecución del programa de prácticas que se
consolida con la presentación de un informe final del laboratorio ejecutado.
Ejemplo informe de laboratorio
1. Título.
Obedece al nombre de la guía ejecutada.
2. Autores.
Se lista en orden alfabético los integrantes del grupo: apellido, nombre y al final el
nombre del grupo.
3. Introducción.
Es un bosquejo general de los antecedentes y objetivos que se buscaron en la
aplicación de la guía. Debe hacerse uso de referencias, por lo tanto, deben aparecer
citaciones asociadas a lo que se quiere desarrollar.
4. Materiales y métodos.
Se listan las herramientas usadas durante la ejecución de la práctica. Normalmente
debe ser igual a la propuesta en la guía de inicio. Si se hacen modificaciones debe
listarse.
5. Cálculos y expresión de resultados.
El resultado final de la aplicación de la metodología investigativa se calcula a partir de

los datos experimentales (pesadas, volúmenes, señal instrumental, etc). De las
repeticiones obtenidas de cada dato se evalúa a error haciendo uso de la estadística
descriptiva (media, desviación estándar y coeficiente de variación).
Se muestran los cálculos adiciones que debieron realizarse para llevar a cabo el
procedimiento, tales como: diluciones, cambios en la pesada, temperaturas, tiempos,
cambios en concentraciones, entre otros.
6. Resultados y discusión.
En este apartado se consolidan los resultados derivados de los cálculos y expresión de
resultados, sea mediante tablas, gráficos, esquemas, modelos y aplicación de normas.
Haciendo uso de lo anterior el estudiante debe establecer la discusión soportándose en
sus conocimientos y en las referencias bibliográficas.
Página 46 de 48
7. Conclusiones.
Las conclusiones son la parte final del trabajo investigativo y constituyen una
proposición que responde los objetivos propuestos al inicio del trabajo experimental.
Una conclusión responde un objetivo; es decir, debe formularse una conclusión por
cada objetivo planteado.
8. Bibliografía.
Se listan las referencias que se han utilizado para el desarrollo de la tarea experimental.
Todas y cada una de las referencias listadas en este ítem, debe estar citada en el cuerpo
del informe final.
La forma de referenciar y citar debe seguir una norma específica.
Página 47 de 48
Versiones
FECHA VERSI CAMBIOS APROBADA POR:

ÓN
Julio/20 0 Versión original Comité Curricular Acta XX de
15 2015
Página 48 de 48

Prácticas Bioingeniería Ia - Ingeniería Agroindustrial

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Este manual de laboratorio, dirigido a estudiantes de Ingeniería de Alimentos y otras

BIOSEGURIDAD Y BUENAS PRÁCTICAS

Desde el primer momento en que el estudiante entra a un laboratorio donde se trabajen

b) De orden del laboratorio:

c) De orden del trabajo microbiológico:

1. Estudiar, con anterioridad, las técnicas y protocolos de las prácticas y experimentos de

INDICACIONES METODOLÓGICAS Y DE ORGANIZACIÓN

1. Planteamiento de la tarea experimental.

2. Análisis de la tarea (interpretación).

3. Propuestas de vías de solución (teórico-experimental, experimental, teórico, virtual

4. Ejecución del experimento.

5. Análisis e interpretación de resultados.

Metodología de estudio de las guías prácticas.

1. Fundamento del método.

COMPLEMENTO 1. TÉCNICAS PARA MEDICIÓN DE BIOMASA

El crecimiento microbiano se pude considerar como el aumento ordenado de todos los

Para determinar el número total de células de un cultivo, el método de elección es el recuento

Desarrollar la habilidad para medición la biomasa microbiana que interviene en los

Aplicar la técnica de recuento en cámara de Neubauer y de medición de biomasa por densidad

Comparar con otros métodos utilizados para la medición de la biomasa microbiana.

Preparación del cultivo madre.

Preparación de las soluciones problema.

Cada dilución de levadura será medida con las siguientes técnicas:

Medición de la biomasa microbiana por conteo directo en cámara de Neubauer.

Posteriormente se coloca en la platina de un microscopio compuesto y se enfoca el enrejado

Figura 1. Cámara de Neubauer

Tenga en cuenta los siguientes aspectos:

Medición de la biomasa microbiana por densidad óptica

Agitar muy bien. Realizar la lectura de absorbancia en el espectrofotómetro a 540nm.

Medición de la biomasa microbiana por peso seco celular.

1. Recuento cámara de Neubauer.

Haga los cálculos y reporte la dilución.

2. Recuento por densidad óptica.

Haga los cálculos y reporte la dilución.

Calcular el volumen de la cámara de recuento teniendo en cuenta las dimensiones de los

Calcular el No. células/L para cada concentración

Elabore una gráfica de g de células/L vs No. células/L y g de células/L vs Absorbancia.

Aplicar un ajuste con el modelo lineal y validar con R2.

Elabore el informe final (Suplemento).

Consulte y explique otros métodos utilizados para la medición de la biomasa microbiana.

BAYONA, Martín. Microorganismos de Interés Industrial. Manual de Laboratorio. Pontificia

SCRAGG, Alan. Biotecnología para Ingenieros. Sistemas biológicos en procesos

WANG, Nam Sun. Biochemical Engineering Laboratory Manual. University of Maryland.

COMPLEMENTO 2. DETERMINACIÓN DE AZÚCARES

Este es un método conveniente y relativamente barato, aunque su especificidad es

La determinación de azúcares reductores es efectuada sobre 1 ml de la muestra convenientemente

1. Adicionar 1 ml del reactivo DNS

El reactivo DNS es altamente tóxico, cancerígeno y abortivo. Mucho cuidado al manipularlo.

Tubo Concentración final Absorbancia (575 nm)

Grafique la curva de calibración de concentración vs Absorbancia para la determinación de

Aplicar un ajuste con el modelo lineal y validar con R2.

Elabore el informe final (Suplemento).

Consulte otros métodos utilizados para la determinación de azúcares reductores y glucosa.

¿Qué ventajas y desventajas presentan para su uso en biotecnología?

MILLER, G. L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar.

WANG, Nam Sun. Biochemical Engineering Laboratory Manual. University of Maryland.

COMPLEMENTO 3. DETERMINACIÓN DE ALCOHOL

La determinación de la cantidad de etanol en los productos obtenidos a partir de la