Epidermis Embrionaria de Xenopus Como Ecosistema Celular Mucociliar para Evaluar El Efecto de Las Hormonas Sexuales en Un Contexto No Reproductivo

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Epidermis embrionaria de Xenopus como ecosistema
celular mucociliar para evaluar el efecto de las
hormonas sexuales en un contexto no reproductivo
CastilloBriceño y Kodjabachian
CastilloBriceno y Kodjabachian Frontiers in Zoology 2014, 11:9
http://www.frontiersinzoology.com/content/11/1/9
CastilloBriceno y Kodjabachian Frontiers in Zoology 2014, 11:9
http://www.frontiersinzoology.com/content/11/1/9
INVESTIGACIÓN Acceso abierto
Epidermis embrionaria de Xenopus como ecosistema
celular mucociliar para evaluar el efecto de las
hormonas sexuales en un contexto no reproductivo
Patricia CastilloBriceño* y Laurent Kodjabachian
Abstracto
Antecedentes: Aún no se ha entendido qué tan importantes son las hormonas sexuales más allá de su función en la biología
reproductiva. En este estudio, analizamos los efectos de los esteroides sexuales en la biología de la epidermis de anfibios
embrionarios, que representa un modelo fácilmente tratable de epitelio mucociliar no reproductivo (MCE). Los MCE son sistemas
integrados formados por poblaciones de células multiciliadas (MC), secretoras de moco (MS) y ricas en mitocondrias
(MR) que están moldeadas por su microambiente. Por lo tanto, MCE podría considerarse como ecosistemas a escala celular,
que se encuentran en una amplia gama de contextos, desde branquias de mejillones hasta oviductos de mamíferos.
Resultados: Mostramos que el estrógeno natural (estradiol, E2) y el andrógeno (testosterona, T), así como el estrógeno sintético
(etinilestradiol, EE2), todos indujeron una mejora significativa del número de células MC. El efecto de E2, T y EE2 se extendió a las
poblaciones de células MS y MR, en diversos grados. También modificaron el perfil de expresión de los marcadores MCE de ARN
e indujeron una variedad de fenotipos celulares "atípicos", con identidades mixtas y morfologías aberrantes, según lo revelado
por el análisis de imágenes a través de la detección confocal de biomarcadores y microscopía electrónica de barrido.
Finalmente, estas hormonas también afectaron la pigmentación del renacuajo, revelando un efecto en todo el ecosistema celular
de la piel embrionaria de Xenopus.
Conclusiones: Este estudio revela el impacto in vivo, a nivel molecular, celular, tisular y de organismo, de los esteroides
sexuales en la biogénesis del epitelio mucociliar no reproductivo, y valida el uso de Xenopus como un sistema modelo relevante
en este campo.
Palabras clave: Ecosistema celular, Ciliogénesis, Epitelio mucociliar, Esteroides sexuales, Xenopus
Introducción común a la mucosa transportadora de iones no epidérmica. Por
Un ecosistema se define como un sistema biológico ejemplo, los procesos de tráfico de Na+ en la membrana por parte de
compuesto por todos los organismos que se encuentran en células ricas en mitocondrias (MR) a través de la fosforilación del
un entorno físico particular, interactuando con él y entre sí cotransportador Na+,K+,2Cl (NKCC1) y la activación de los canales
[1]. Los tejidos animales se pueden considerar como aniónicos a picales en la piel, las branquias y los riñones en animales
ecosistemas celulares complejos compuestos por diferentes marinos. e species d e peces, se conservan en el epitelio renal y de
tipos de células que pueden verse afectados por interacciones las
v ías r espiratorias de anfibios y mamíferos [2]. Además, las
mutuas, así como por los elementos de su microambiente. características e structurales del epitelio de la mucosa animal también
Bajo esta perspectiva, la piel animal es particularmente son n otablemente s imilares a lo largo de la filogenia de los metazoos
interesante por su relación directa con los ambientes y
e ntre l os ó rganos. L os e pitelios mucociliares (MCE) tienen una
endógenos y exógenos. En animales acuáticos con piel composición c elular c omún m ínima con células secretoras de moco
mucosa, el papel protector de la epidermis como barrera (MS) y
m ulticiliadas ( MC), y
u na p oblación adicional de células MR
con a bundantes m icrovellosidades,
incluye la regulación de la homeostasis iónica por procesos mecánicos, moleculares y celulares que son c restas y/o vesículas apicales, que
juegan un papel en el equilibrio iónico/gas. Este tipo de ecosistema
celular MCE se ha informado en numerosos contextos biológicos,
* Correspondencia: pat.castillo.briceno@gmail.com
desde branquias de mejillones hasta oviductos de tetrápodos [316]
Universidad de AixMarseille, CNRS UMR 7288, IBDM, Campus de Luminy
Case 907, 13288 Marseille Cedex 9, Francia (Figura 1, archivo adicional 1). especies de Xenacoelomorpha también
© 2014 CastilloBriceño y Kodjabachian; licenciatario BioMed Central Ltd. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los
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Bivalvo
Epitelio mucociliar formado por
Turbulencia
poblaciones de células putativas
Xenoturbella MC, MS y MR.
Descubridor tunicado
Petromyzontiformes
cordados
polipteriformes
amiiformes
Actinopterygii
perciformes
vertebrados
multiciliado
cola
(MC) Anfibio
Anuro
Tetrápoda
secretor de moco
Sarcopterygii
Quelonia
(EM) amniota
Escamoso
rico en mitocondrias Sauria
aves
(SEÑOR) Mamíferos
Figura 1 Filogenia del epitelio mucociliar. El esquema incluye todos los taxones, que contienen al menos una especie que se ha informado que tiene un epitelio
mucociliar formado por poblaciones de células MC, MS y MR, o por tipos de células intermedias, independientemente del contexto del órgano o tejido.
muestran características de MCE, como la epidermis larvaria y vía de señalización, tanto en la epidermis embrionaria de Xenopus
adulta de Xenoturbella (Xenoturbellida), que está compuesta de como en el MCE respiratorio humano [12]. Aquí, aprovechamos
células MS y células MC con abundantes mitocondrias y este modelo MCE de rana para evaluar el papel de las hormonas
microvellosidades [17], y la epidermis de planaria (Platyhelminthes, sexuales en un contexto no reproductivo.
Turbellaria) compuesta de MCMS células y células sensibles a Los esteroides sexuales pueden modificar drásticamente un
iones [18,19]. Los epitelios mucociliares pueden llevar a cabo microentorno en los órganos reproductivos, por ejemplo, los
múltiples funciones biológicas, incluida la producción de corrientes andrógenos pueden fomentar la oncogénesis en la próstata [24], y
para la ingestión de alimentos [3,5] o el transporte de gametos el E2 puede impulsar la humanización de las glándulas mamarias
[15,16], el desplazamiento de animales [18], la protección contra murinas [25]. Con respecto a los efectos de los esteroides sexuales
sustancias nocivas exógenas mediante la eliminación de moco sobre la MCE, se ha estudiado principalmente en el tejido del
[ 3,13,14] o atrapamiento de moco [13], y equilibrio iónico en oviducto de los tetrápodos. Se informó que los cambios en las
respuesta a la serotonina [5] o gases [5,19]. Las características de hormonas ováricas (E2, T y progesterona) transforman la
MCE también se generan en contextos no fisiológicos, como la arquitectura y la funcionalidad de MCE vinculadas a los procesos
ciliogénesis inducida a través de la estimulación de andrógenos/ reproductivos [15,16]. Además, se demostró que E2 o T exógenos
antiestrógenos en la próstata femenina de mamíferos (glándulas mejoran la ciliogénesis en el MCE del oviducto [26,27]. Si estos
de Skene) [20], y los procesos de quistes broncogénicos/del efectos de los esteroides sexuales reflejan una función puramente
intestino anterior en el hígado, la pelvis renal y otros órganos [21,22]. reproductiva o un impacto más general en los ecosistemas
Con respecto al MCE que constituye la piel embrionaria de celulares mucociliares sigue siendo una pregunta abierta. Para
Xenopus (Amphibia), su disposición celular incluye (i) una capa abordar esta pregunta, estudiamos el efecto de los esteroides
externa de células MS (también llamadas caliciformes) intercaladas sexuales en el MCE epidérmico de embriones de Xenopus. Se
por células MC y MR, y (ii) una capa interna de células basales evaluó el efecto de tratamientos exógenos con estrógeno natural
que servir como reservorio de células indiferenciadas [11,12]. La – estradiol (E2) – como el principal estrógeno vertebrado activo, y
arquitectura de la rana MCE se puede observar a través de testosterona (T) como el principal andrógeno vertebrado, así como
marcadores de buena fe de esos tipos de células por hibridación el compuesto estrogénico sintético – etinilE2 (EE2), un fármaco
in situ (ISH) e inmunohistoquímica (IHC), y por microscopía anticonceptivo ampliamente utilizado y un contaminante común de
electrónica de barrido (SEM) [11] (Figura 2AC). Por lo tanto, se interés público debido a su impacto negativo como compuesto
ha propuesto como modelo para estudios destinados a comparar disruptor endocrino (EDC).
los principios moleculares y celulares de los epitelios especializados Aquí, se debe enfatizar que hay un número creciente de informes
ciliados y de transporte [11,23]. Por ejemplo, se informó que los sobre contaminantes EDC, incluidas las hormonas sexuales
microARN miR 449 son reguladores clave de la multiciliogénesis, naturales, presentes en las aguas superficiales, que pueden
a través de la represión de Delta/Notch bioacumularse [28] y afectar la vida silvestre y la salud pública
[2831] .
A tuba1a b:itln1 :acTuba:DAPI
B tuba1a b :atp6v1a : C RMR D Y
itln1 VMR 7%
8%
84% 72% 10%
MC 8%
EM
11%
MC SEÑOR EM MC rMR vMR EM
F tuba1a b:atp6v1a:p63:DAPI
GRAMO
tuba1a b:atp6v1a:Itln1:DAPI
Figura 2 Disposición celular dentro del epitelio mucociliar (MCE) de la epidermis embrionaria de Xenopus y explantes ectodérmicos. A,B)
Disposición típica de MCE (piel st 30) con una capa de células MS y células MC y MR intercaladas. Las poblaciones celulares se marcan mediante ISH fluorescente y/o
IHC de la siguiente manera: células MC (tuba1ab, acTuba), células MR (atp6v1a) y células MS (itln1, Itln1), y se obtienen imágenes mediante microscopía confocal.
C) Micrografía SEM de piel st 40 que muestra la disposición celular MCE con MC, MR (rMR y vMR) y una cantidad predominante de células MS. D)
Abundancia de poblaciones de células MC, MR y MS identificadas por marcadores biomoleculares en la piel en el st 30. E) Abundancia de poblaciones de células MC, rMR,
vMR y MS identificadas por SEM en la piel en el st 40. FH) Especificado (st 15, F) y diferenciado (st 30, G, H) MCE en explantes ectodérmicos que muestran una
disposición celular MC, MR y MS similar a la MCE en la piel de embriones completos; p63 (IHC) es un marcador de células basales de la capa interna de la piel.
A, B, H) pila de 2 μm de profundidad; F, G) secciones ópticas individuales a través de los explantes. H) vista superficial del explante. MC, multiciliado; rMR o vMR, con
crestas o vesículas ricas en mitocondrias; MS, secretor de moco.
Resultados Caracterización de la arquitectura MCE
esr1
0.3
epidérmica y diferenciación durante el desarrollo embrionario en
b
Xenopus En la capa externa de la epidermis diferenciada de los
0.2 tuba1ab foxj1a
embriones de Xenopus, las imágenes confocales de marcadores 150 0,45
biomoleculares específicos para células MS, MC y MR (archivo b
0.1 b
adicional 2) revelaron un predominio de células MS , que forman 100 0.30
una capa similar a una red (Figura 2A), con células MC
0.0
intercaladas (Figura 2A,B) y MR (Figura 2B). Esta disposición AFUERA 50 0.15
de MCE fue confirmada por el análisis morfológico SEM, que
también permitió diferenciar entre las células MR con crestas esr2
0 0.00
0.3 AFUERA AFUERA
(rMR) y vesículas MR (vMR) (Figura 2C, archivo adicional 2). En b
st 30, el MCE se compone de 710% de células MC, 610% de foxi1e
0.2 atp6v1a
células MR y 6688% de células MS (Figura 2D). En el st 40, 2.5 2.0 b
hay 69 % de células MC, 1328 % de células MR (614 % de b
0.1 2.0 1.5
rMR y 714 % de células vMR) y todavía una gran proporción de células MS (5982 %) (Figura 2E ).
1.5
Por lo tanto, la abundancia de células MR mostró un aumento de 1.0
0.0 1.0
2 veces entre st 30 y st 40. Cuando se explantó ectodermo ingenuo AFUERA
0.5 0.5
al inicio de la gastrulación y se cultivó de forma aislada, la
Con
arquitectura del MCE fue comparable a la de la epidermis 0.0 0.0
0.15 AFUERA AFUERA
embrionaria en equivalente etapas de desarrollo (archivo adicional
3). Esta similitud se evidenció mediante la tinción interna de p63
0.10 itln1 recortar29
(un marcador de células basales) y una capa externa de células b 1500 4
b b
MS intercaladas por células MC y MR (Figura 2FH).
0.05 3
Luego comparamos los perfiles de expresión temporal de los 1000
ARN marcadores relevantes, como (i) receptor de andrógenos (ar), 2
0.00
receptor de estrógenos 1 (esr1), esr2 y receptor de proteína AFUERA 500
1
acoplada a G 30 (gpr30); (ii) el marcador del metabolismo endocrino
y transportador de plasma, proteína 4 de unión a retinol (rbp4); (iii) gpr30 0 0
0.3 AFUERA AFUERA
los factores de transcripción relacionados con la especificación b
de células MCE para células MC (foxj1), células MS (trim29) y
0.2 cftr miR449a5p
células MR (foxi1e); (iv) el regulador de la multiciliogénesis, el 0.010 0.0003
microARN maduro 449a (xlamiR449a5p); (v) los genes b b
0.1
marcadores de MCE diferenciado (archivo adicional 2), tubulina
0.0002
alfa 1a (tuba1ab, MC), intelectina 1 (itln1, MS) y subunidad A V1 0.005
0.0
transportadora de ATPasa H + (atp6v1a, MR); (vi) el canal iónico AFUERA 0.0001
del transportador ABC, regulador de la conductancia transmembrana
rbp4
DAKOTA DEL NORTE
de la fibrosis quística (cftr), que es un transportador iónico 0.000 0.0000

importante en el epitelio mucoso de los vertebrados. Todos los 0.03 AFUERA AFUERA
ARN analizados por RTqPCR se detectaron desde el st 10 (inicio
de la gastrulación) hasta el st 45 (inicio del desarrollo gonadal) en 0.02 b
embriones completos (archivo adicional 4). Sorprendentemente, la
expresión del gen del receptor de esteroides sexuales alcanzó su 0.01
punto máximo en tailbud st 20, coincidiendo con el aumento de la
expresión de los marcadores de diferenciación MCE (archivo 0.00
AFUERA
adicional 4). En la epidermis diferenciada, los marcadores de
Figura 3 Enriquecimiento de marcadores de ARN relacionados con la
diferenciación de MCE y los receptores de esteroides sexuales, señalización de esteroides sexuales y la diferenciación del epitelio
esr1 y ar, se enriquecieron en comparación con los tejidos de mucociliar en la epidermis embrionaria de Xenopus. Análisis
embriones completos en st 30 (archivo adicional 5). Además, en la comparativo de MCE indiferenciado (U, st 11) y diferenciado (D, st 25–30)
epidermis explantada, todos los marcadores, tanto MCE como de explantes de ectodermo. Datos de RTqPCR de grupos de 20 explantes cada
uno. Los niveles de expresión se expresan en relación con odc1, excepto miR449a5p
relacionados con el sistema endocrino, se enriquecieron en
que es relativo a RNU2. Media ± SD (cajas) e IC del 95% (bigotes), los valores
epidermis MCE diferenciada (st 2530) frente a indiferenciada (st atípicos se representan como puntos. ND = no detectado, la letra "b" denota
11) (Figura 3). Este análisis inicial sugirió que el MCE epidérmico, datos significativamente diferentes de (U). ANOVA de dos vías, prueba de comparación de Bonferroni, p < 0,0
en embriones tempranos de Xenopus, es competente para responder a los esteroides sexuales.
Efectos de E2, T y EE2 en el fenotipo anatómico macroscópico de altas concentraciones (Figura 6B,C), mientras que T y EE2 mostraron
los embriones de un efecto creciente específico de la dosis sobre la proliferación celular
Xenopus La exposición a E2, T o EE2 resultó en un aumento (Figura 6B). A continuación, analizamos la abundancia de células MC,
dependiente de la dosis de la pigmentación MCE de la piel (Figura 4A), MR y MS. E2 indujo un aumento dependiente de la dosis de los tres
fácilmente discernible desde el renacuajo st 40. Hubo un aumento tipos de células en st 30 (archivo adicional 8) y st 40 (archivo adicional
general de números de melanóforos y del área pigmentada, aunque T 7). Las dosis bajas y altas de T aumentaron la abundancia de MC y
exhibió un efecto más débil que los estrógenos, E2 y EE2 (Figura 4B). MR y, en menor medida, las poblaciones de células MS en st 30
(archivo adicional 8) y st 40 (archivo adicional 7). EE2 provocó un
La anatomía de las ramas branquiales, que están completamente aumento de la cantidad de células MC y MR en st 30 (archivo adicional
cubiertas por MCE, se vio claramente afectada por los esteroides 8) y de la cantidad de células MC, rMR y MS en st 40 (archivo adicional
sexuales. Las imágenes de microscopía óptica (Figura 4C) y SEM 7). La abundancia de la población de células vMR se vio afectada solo
(Archivo adicional 6) mostraron que E2, T o EE2 indujeron una por la baja concentración de EE2 (archivo adicional 7).
hipertrofia o una maduración acelerada de las branquias. Este efecto
fue observable desde el st 40, con las alteraciones más obvias en los Para evaluar el enriquecimiento del tipo celular específico en respuesta
embriones tratados con E2. La exposición a E2 y EE2 también indujo a los esteroides sexuales, se calculó la proporción de cada población
una hipertrofia de los vasos sanguíneos dentro del primordio cardíaco como la proporción del número total de células contadas en cada
y las ramas branquiales (Figura 4C). El desarrollo general de los condición (Figuras 6D,E). Al final del st 40 del renacuajo, las tres
individuos tratados fue por lo demás normal, cuando se evaluó el hormonas causaron un enriquecimiento significativo de las células MC
tamaño corporal, el enrollamiento intestinal y la tasa de supervivencia (Figura 6E). E2 no tuvo efectos significativos en los otros tipos de
en el estadio tardío de renacuajo 50. A continuación, analizamos las células, excepto una ligera disminución del porcentaje de células MS
características específicas de MCE en respuesta a las hormonas sexuales. en el st 40. Curiosamente, las concentraciones bajas y altas de T
indujeron un enriquecimiento muy consistente de las células MR en el
E2, T y EE2 aumentan la abundancia de células MC en MCE st 30 y las células rMR en el st 40 ( Figuras 6D,E). EE2 también
embrionario de Xenopus Los aumentó el porcentaje de células MR, aunque dependiendo de las
tres esteroides sexuales indujeron un aumento en el número de células concentraciones utilizadas. T y EE2 desencadenaron una disminución
MC, como lo reveló el análisis cuantitativo SEM en st 40 (Figura 5A). comparable del porcentaje de células MS (Figuras 6D,E). El porcentaje
Este efecto superó el aumento observado en el número total de de células vMR no se vio afectado en ningún caso.
células en el MCE de los embriones tratados, lo que sugiere un impacto Los esteroides sexuales también perturbaron la disposición celular
específico de las hormonas sexuales en la biogénesis de las células dentro del MCE. En particular, E2 y EE2 provocaron la aparición de
MC. El aumento de la abundancia de células MC inducida por E2, T y células MC adyacentes, lo que nunca ocurre en condiciones normales
EE2 fue confirmado por ISH (tuba1ab como marcador de células MC, (Figura 6F, Archivo adicional 9B). El análisis SEM también reveló una
Figura 5B) antes (st 15) y después (st 30) diferenciación MCE (Figura morfología epitelial alterada general, que fue más pronunciada en los
5C, D). En la piel embrionaria de embriones completos, EE2 estimuló embriones tratados con EE2 (Figura 6F) y T (Figura 6G) (ver también
un efecto más pronunciado en el st 15 que E2 y T; sin embargo, archivo adicional 9).
después de una exposición más prolongada (st 30), el efecto fue
comparable para los tres esteroides (Figura 5C). La mejora de las Los esteroides sexuales alteran la expresión transcripcional de genes
células MC por los esteroides sexuales también fue evidente en los enriquecidos en MCE diferenciados e inducen fenotipos celulares
explantes epidérmicos (tapas), e incluso más marcado en este contexto "no típicos" en la epidermis de embriones de Xenopus. El efecto de E2
que en los embriones completos en respuesta a E2 y EE2 (Figura 5D). en los niveles de expresión de ARNm fue generalmente más débil
que los de T y EE2, medido por RT qPCR (Archivo adicional 10). Los
tres esteroides mostraron una tendencia a regular a la baja la expresión
de marcadores relacionados con la señalización endocrina. Por el
Los esteroides sexuales afectan diferencialmente el contrario, la expresión transcripcional de los ARN relacionados con la
ecosistema diferenciación de MCE se vio claramente afectada por cada hormona.
celular de MCE Los esteroides sexuales indujeron un aumento del El efecto de E2 se restringió a los marcadores de células MR, con una
número total de células en el MCE, según lo medido por SEM en st 40 ligera inhibición de foxi1e y una potenciación de atp6v1a. Sin embargo,
(Figura 5A, Archivo adicional 7), y por tinción de núcleos DAPI en st 30 tanto en los controles como en los embriones tratados, el análisis ISH
(Figura 6A ), lo que sugiere un impacto potencial en la proliferación doble reveló que esos marcadores de células MR siempre se
celular. En aras de la reproducibilidad, analizamos la piel sobre los encontraban coexpresados (Figura 7A). Curiosamente, la relación
somitas del tronco, donde la respuesta a los esteroides sexuales fue atp6v1a/foxi1e mostró un marcado aumento en las células tratadas
menos variable que en las áreas del abdomen, la cola, la cabeza y las con E2 (Figura 7B). La misma tendencia fue aparente en los embriones
aletas. Usando fosfoHistona H3 como marcador de proliferación, se tratados con T y EE2, aunque con más variabilidad en el último caso
demostró que E2 aumentaba constantemente la cantidad de células (Figura 7A,B). El otro
proliferativas tanto a niveles bajos como bajos.
A B
100
cd continua
corriente
control 80
abc de la bbc
60 a
melanóforos
recuento
de 40
20
Es
0.4 de
d
1x107M
0.3
cd
área
(AU) 0.2 antes de Cristo
E2 90% 0.1 a
0
E2 Control TEE2
1x105M 1x107M _ 1x105M _
C
100%
control
gramo
1x107M
80%
T
E2
1x105M
gramo
80%
T
1x107M
gramo
100%
EE2
EE2
1x105M
100% gramo
Figura 4 (Ver leyenda en la página siguiente).
(Vea la figura en la página anterior.)
Figura 4 Efectos de los esteroides sexuales en el fenotipo anatómico macroscópico de los embriones de Xenopus. A) Aumento de la pigmentación en la piel causado por
E2, T y EE2 a las concentraciones indicadas. Fotografías de embriones vivos anestesiados en st 45; los porcentajes que se muestran en la esquina inferior izquierda
representan las tasas de ocurrencia. Los datos son representativos de 48 embriones/condición. B) Números de melanóforos y área pigmentada de la piel asociada a E2, T y
EE2, en comparación con los controles. Media ± DE, “a” = grupo control; la significancia estadística se representa en un código de letras: a indica que no hay diferencia con
el control, todas las demás letras indican una diferencia significativa con el control, las letras compartidas indican que no hay diferencias significativas entre los
conjuntos de datos correspondientes. ANOVA unidireccional, prueba de comparación de Tukey, p < 0,05, df = 21. C) E2, T y EE2 indujeron un crecimiento excesivo
de las ramas branquiales (g, líneas discontinuas); E2 y EE2 indujeron hipertrofia de vasos sanguíneos (puntas de flecha) en ramas branquiales y anlage cardíaco. B). Los
datos son representativos de 24 embriones/condición.
Los ARN (tuba1ab, itln1, foxj1a, trim29, miR449a5p y cftr) no se En el contexto fisiológico, se ha demostrado que las
modificaron significativamente con los tratamientos con E2. Para T concentraciones endógenas de E2 y andrógenos son naturalmente
y EE2, los efectos fueron variables dependiendo de los marcadores. altas en los embriones de Xenopus laevis antes de la diferenciación
El tratamiento con T tendió a regular al alza los marcadores tuba1a sexual gonadal [32]. Además, mostramos que los genes del receptor
b, miR449a5p (MC) y atp6v1a (MR) ya regular a la baja los de esteroides sexuales tienen una expresión prominente antes del
marcadores iltn1 y trim29 (MS). El tratamiento con EE2 inhibió la inicio de la diferenciación sexual (archivos adicionales 4 y 5) y que
expresión de foxi1e y trim29, mientras que mejoró miR449a5p y están regulados al alza en MCE diferenciados (Figura 3). Por lo
no tuvo efecto sobre tuba1ab, atp6v1a, itln1 y foxj1a. tanto, proponemos que la señalización de esteroides sexuales
podría tener un papel durante el desarrollo temprano de Xenopus,
Todos los esteroides sexuales también causaron una notable independientemente del sistema reproductivo.
inducción de fenotipos celulares "atípicos". La aparición de tales En embriones estimulados con esteroides sexuales, se
fenotipos aberrantes fue mayor en E2 que en los embriones tratados conservaron las características generales de desarrollo. Sin
con T o EE2 (Figura 7C). Sin embargo, el impacto en el tejido embargo, se observaron cambios prominentes y específicos en la
general parecía ser más fuerte con EE2 y T que con E2 (archivo pigmentación de la piel (Figura 4). De acuerdo con estas
adicional 9, Figura 6F,G). observaciones, estudios previos mostraron que los estrógenos
Había una amplia gama de fenotipos "atípicos" basados en naturales pueden afectar las células que contienen melanina al
marcadores moleculares y características morfológicas (archivo aumentar su abundancia [33,34], mejorar la actividad de la tirosinasa
adicional 11). Entre ellos, encontramos células intermedias MC [34,35] y aumentar la transferencia de melanosoma a través de la
MS (Figura 7D) y MCMR (Figura 7E), células anormales similares regulación de la señalización de CFTR y ESR [35 ]. También se
a MC con cilios aparentemente internalizados o no ciliados (Figura demostró que la expresión de CFTR está regulada por los
7G), MC proliferativas (pMC) y pMR ( Figura 7H), y células similares estrógenos en el epitelio de la mucosa [36,37], lo que afecta el pH,
a MS anormales o células MR agrupadas (Figura 6G). el volumen de líquido y el transporte en el tejido [38]; en la epidermis
de tad pole, mostramos que cftr estaba regulado al alza por el EDC
En conjunto, la evidencia recopilada indica que los esteroides sintético, EE2. Además, los andrógenos se han relacionado con la
sexuales causan defectos profundos en la arquitectura MCE, la regulación de la pigmentación de la mucosa inducida por fármacos
composición celular y los perfiles moleculares. antipalúdicos [39] y de la actividad de la tirosinasa en los melanocitos
a través de la señalización de la membrana celular [40]. Por lo
tanto, nuestro estudio sugiere que la pigmentación de la piel puede
Discusión usarse como un parámetro externo obvio para evaluar la
Aquí, llevamos a cabo un estudio de caso para evaluar los efectos estimulación endocrina. Además, la medición de la pigmentación
in vivo de los esteroides sexuales en MCE en un contexto biológico de la piel junto con el análisis morfológico de branquias y vasos
no reproductivo. Aprovechando el MCE accesible de la epidermis sanguíneos parecía ser una buena prueba no invasiva para un diagnóstico rápido de
del renacuajo, hemos demostrado que los esteroides sexuales La mejora de la abundancia de células MC en el MCE del
tienen un profundo impacto en el desarrollo normal del MCE. En renacuajo de Xenopus por E2 (Figura 5AD) indica que E2 induce
particular, este estudio es el primero en informar que E2, T y EE2 esta respuesta típica no solo en el MCE reproductivo de los
aumentan la abundancia de la población de células MC en un MCE vertebrados amnióticos [16,26,27]. Esta observación también es
no reproductivo (Figura 5). Por el contrario, E2, T y EE2 indujeron consistente con la pérdida de cilios inducida por la deficiencia de
fuertes transformaciones en el MCE de renacuajo que se asemejan estrógenos en la mucosa laríngea de las ratas [41].
a las causadas por la alteración endocrina en el epitelio de la Descubrimos que la cantidad de células MC también aumenta con
mucosa genital [15,16,27]. Además, los efectos de E2 y T detectados T y EE2 (Figura 5AD). Se ha demostrado que una T mejora la
a nivel molecular, celular y tisular en embriones de Xenopus son ciliogénesis y las cantidades de células MC en la mucosa prostática
comparables a los efectos de EE2, lo que documenta el riesgo de de jerbos hembra [20], y que un aumento natural de T y E2 están
E2 y T como EDC potenciales para anfibios y otros vertebrados. vinculados a más células MC en el epitelio del oviducto de los
tetrápodos [16]. Con respecto al efecto EE2 en MC
A 100 MC B
80
st40
C C
C
60 antes de Cristo antes de Cristo
b
40 control
20
0 87%
Aumentar
(%)
50 Células totales
40 b
30
bbb
st40
20 b
abdominales
10 E2 56%
0
E2 T EE2
C 100 embriones
1x105M
1x107M
80
st
15 C
75%
60
b b b
40
20 abdominales
a
0
100 b
1x107M
80
st
30
60 b abdominales
b
62%
T
40 abdominales
20 abdominales
0
aumento
células
tuba1a
(+)
de
(%)
b
E2 T EE2 1x105M
D 69%
100 tapas st
15
80 C
60 bc antes
40
antes de Cristo
de Cristo
ab d
1x107M
20
0
88%
250 st
30 C
200
EE2
antes de Cristo
150
antes de Cristo
b
100 b
50
1x105M
abdominales
aumento
células
tuba1a
(+)
de
(%)
b
0
88%
E2 T EE2
1x107M 1x105M _
Figura 5 Efecto de los esteroides sexuales sobre la abundancia de células MC en el epitelio mucociliar de Xenopus. A) Aumento de MC y células totales por E2, T y EE2 en
la capa externa de la piel de embriones completos st 40, análisis SEM, df = 14. B) E2, T y EE2 aumentaron la densidad aparente de progenitores de MC antes de la
diferenciación de MCE (st 15), como lo revela la ISH cromogénica tuba1ab(+). Las imágenes son representativas de 24 embriones/condición. CD)
Aumento de células MC por E2, T y EE2 en explantes ectodérmicos y de piel de embriones completos (tapas), según lo medido por tinción tuba1ab (+) ISH de células
MC antes (st 15) y después (st 30) diferenciación MCE, df = 21. A,C,D) Media ± DE, “a” = grupo control; la significancia estadística se representa en un código de letras:
a indica que no hay diferencia con el control, todas las demás letras indican una diferencia significativa con el control, las letras compartidas indican que no hay
diferencias significativas entre los conjuntos de datos correspondientes. ANOVA unidireccional, prueba de comparación de Tukey, p < 0,05.
Total D E2 T EE2
A
100
80
70
b b
st
30
60 50 bb b
antes
C a
40 antes de
30 a a
de Cristo
a
Aumentar
(%)
Cristo antes de Cristo
20 a
Automóvil club británico
10
0 Enriquecimiento
celular
(%)
E2 T EE2 10 a a
bbbb
+ ++ + ++ + ++
MC SEÑOR EM
Y E2 T EE2
Células proliferativas B
250 C st
40
90 b
200 b
antes de Cristo
b
150 b 60
antes de Cristo
ba a bb _
100 b a
30 b
aumentar
(%)
50 a b
a
0 0
a
EE2 b a a a b
Enriquecimiento
celular
(%)
T
a b
Automóvil club británico
un b
E2 1x107M 1x105M _ 30
+ ++ + + ++ ++
MC rMR vMR EM
C pH3:DAPI_ F tuba1ab:atp6v1a:DAPI
control
control
1x107M
E2
EE2
1x105M
GRAMO
Figura 6 Efectos de los esteroides sexuales en el ecosistema celular MCE. A,B) Efectos del estradiol (E2), testosterona (T) y etiniloE2 (EE2) sobre la abundancia total de
células en MCE, según la tinción de núcleos DAPI (A), y sobre la cantidad total de células proliferativas (pH3 positivo /campo) (B). Análisis por microscopía confocal en
embriones en st 30, df = 21. C) Células proliferativas en MCE tratadas con E2 de explantes de ectodermo. IHC para pH3 y DAPI. Microscopía confocal, pila de 2 μm. Datos
representativos de 18 muestras/condición. D, E) Cambios en el enriquecimiento de la población celular mediados por esteroides sexuales en MCE epidérmico de Xenopus.
Datos basados en la proporción del conteo de células de cada población sobre el número total de células en st 30 (DAPI) (D) o st 40 (micrografías SEM) (E). Los datos son
representativos de 48 (st 30, imágenes confocales de fabricantes moleculares) o 24 (st 40) embriones mediante tratamiento con esteroides sexuales. +/++ concentraciones =
1x107 M / 1x105 M. MC = multiciliado, vMR o rMR = vesículas o crestas ricas en mitocondrias, MS = células secretoras de moco. A, B,D,E) Línea de base establecida para
el grupo control = 0. Media ± DE, “a” = grupo control; Código de letras: a indica que no hay diferencia con el control, todas las demás letras indican una diferencia
significativa con el control, las letras compartidas indican que no hay diferencias significativas entre las condiciones correspondientes.
ANOVA unidireccional, prueba de comparación de Tukey, p < 0,05. F) Interrupción de la disposición de la población celular causada por EE2 en embriones en st 30.
Observamos un aumento de células MC (tuba1ab, verde) y MR (atp6v1a, rojo), y la presencia de células MC adyacentes. Doble FISH y DAPI. Microscopía confocal, pila
de 2 μm, 24 embriones/condición. Paneles derechos: Aumento del número de células MC y arquitectura epitelial interrumpida causada por EE2 SEM, st 40, 16 embriones/
condición. G) Disposición y morfología MCE epidérmica perturbada provocada por T. SEM, st 40, 16 embriones/condición.
células, hay algunos informes que sugieren una posible asociación en consonancia con múltiples estudios que mostraron un aumento de
con la perturbación de la ciliogénesis en los tejidos endometriales la actividad endocítica en respuesta a la estimulación endocrina a
[42,43] y en la mucosa respiratoria después de una exposición través de la regulación de ATPasas ya través de receptores
prolongada a dosis altas [44]. En resumen, el aumento de células MC multifuncionales [4952].
desencadenado por E2 o T en MCE de órganos reproductivos en Los tres esteroides indujeron una inhibición transcripcional general
vertebrados amnióticos parece estar conservado en un tejido anfibio de los receptores de señalización de esteroides sexuales, lo que puede
no reproductivo; efecto que también es desencadenado por el esteroide ser parte de un mecanismo para hacer frente al exceso de hormonas
sintético, EE2. y/o sus derivados, como se sugiere en otros modelos [31,53]. De
Nuestro estudio reveló que E2, T y EE2 pueden afectar los acuerdo con este punto de vista, en tadpole st 2038, los niveles de
ecosistemas celulares MCE en otros aspectos además de la expresión más bajos de AR y ESR ocurrieron en el momento de los
abundancia de células MC. E2 tiene un efecto notable en la actividad picos más altos de E2 y andrógenos [32]. Con respecto a rbp4,
proliferativa de MCE (Figura 6B, C), incluso en células MC y MR nuestros resultados no respaldan su uso como marcador para distinguir
específicas (Figura 7H), que nunca ocurre en condiciones normales. la alteración endocrina estrogénica y androgénica en Xenopus laevis
Por lo tanto, es probable que E2 perturbe el desarrollo de MCE a [29]. Sin embargo, en función de su expresión, rbp4 puede estar
través de su efecto sobre la proliferación y el aumento resultante de la involucrado en la diferenciación de MCE, de acuerdo con su papel en
abundancia celular. También se ha demostrado un aumento de la el patrón de piel de pescado [54] y el papel de la señalización de
actividad proliferativa mediado por E2 en los melanocitos [34], el retinoides durante la ciliogénesis y la regeneración del epitelio
epitelio del oviducto [26], las células endoteliales de la mucosa respiratorio [55].
respiratoria [45] y las células de la mucosa mamaria [25]. Por el Un efecto espectacular de los esteroides sexuales en nuestro
contrario, T mostró más efectos dependientes del tipo de célula. estudio se refería a la inducción de nuevos fenotipos celulares
Sorprendentemente, T causó un fuerte enriquecimiento de células MR revelados por genes marcadores y análisis SEM (Figuras 6F, G y 7;
(Figura 6D, E), en común con EE2 pero no con E2. Archivo adicional 9). Fenotipos similares e identidades de células
Además, T y EE2 interrumpieron de manera similar la disposición mixtas se informaron antes como parte del proceso relacionado con el
general del ecosistema celular MCE en la piel del renacuajo (Figura sistema endocrino reproductivo en el epitelio del oviducto [15,16], en
6F, G, archivo adicional 9A, FI). Comparable a esa alteración general, la mucosa de la glándula de Skene humana [56] y en los tejidos
en la mucosa prostática femenina de jerbos, se demostró que T nefríticos del pez espinoso [57]. En conjunto, lo que sugiere un efecto
induce la proliferación celular, la diferenciación tisular, la actividad comparable entre los esteroides sexuales en los ecosistemas celulares
secretora, la displasia [46], la ciliogénesis mejorada y la diferenciación MCE a nivel celular. Esto puede implicar modificaciones del entorno
celular MC [20]. extracelular [25,58,59] y/o aumento de la plasticidad celular mediante
Los esteroides sexuales enriquecieron constantemente la expresión la inhibición de factores de diferenciación.
celular de atp6v1a (Figura 7A,B), que codifica un mediador de la En la piel de rana, notamos que los esteroides sexuales reprimieron el
acidificación intracelular antes de la endocitosis [47], lo que sugiere un factor de transcripción foxi1e, que tiene un papel fundamental durante
impacto potencial en el tráfico celular. En las células ciliadas eucariotas, la diferenciación del ectodermo, la adhesión celular y la migración [60].
la endocitosis es uno de los principales mecanismos de internalización Concluimos que la aparición de células "no típicas" es un parámetro
de los componentes ciliares durante el reciclaje y la eliminación del útil para evaluar el impacto de los EDC en la rana MCE.
material de la membrana [48]. Sugerimos que, en respuesta a los
esteroides sexuales, se produjo una endocitosis inapropiada de los Al integrar nuestros resultados, se puede argumentar que las
cilios en las células MC tuba1ab(+) que expresaron ectópicamente hormonas sexuales desencadenan cambios dramáticos pero
atp6v1a (Figura 7G). Esta vista es específicos a nivel de organismo, celular y molecular en los embriones de Xenopus.
E2 T
un mando B
1x107M 5
M 1x10 1x107 M 1x10 5
M atp6v1a: foxi1e: DAPI relación atp6v1a/foxi1e
100
b
abdominales
10 b
b
b
abdominales
a
1
0.1
E2 T mando EE2
1x107M _ 1x105M _
50 metros
C atípico
40 tuba1ab:acTuba:DAPI
Es
de
cd C
30
b b D Y F
20
ocurrencia
10
0
GRAMO
E2 T EE2
1x107M 1x105M _ etc 1 atp6v1a
H tuba1ab:atp6v1a:pH3:DAPI
Control
E2
Figura 7 Fenotipos "no típicos" inducidos por esteroides sexuales en MCE epidérmico de embriones de Xenopus. A) Señal de atp6v1a mejorada en células MR tratadas con
E2 o T. Tinción: FISH doble para atp6v1a (verde) y foxi1e (rojo) y DAPI, pila de 2 μm. B) Cuantificación del enriquecimiento de atp6v1a basado en la proporción de áreas
de señal de atp6v1a a foxi1e en células individuales, df = 69. C) Aparición acumulativa de fenotipos "no típicos" por condición.
No se detectaron fenotipos "no típicos" en los controles. D) itln1 doble "no típico": célula tuba1ab sin cilios (flecha) en un embrión tratado con EE2.
Tinción: FISH doble para itln1 (verde) y tuba1ab (rojo), IHC para acTuba y DAPI, pila de 2 μm. E) doble atp6v1a "no típica": célula tuba1ab en un embrión tratado con T, pila
de 2 μm. F,G) Vista ortogonal de una célula MC normal (B) y atp6v1a doble "no típica": célula tuba1ab con cilios internalizados en un embrión tratado con T. BD) Tinción:
Doble FISH para atp6v1a (verde) y tuba1ab (rojo), IHC para marcador de cilios acetiladotuba (acTuba) y DAPI. H) Inducción de MR y MC proliferativos (cuadrados de líneas
discontinuas), y atp6v1a doble: células tuba1ab (cuadrado). Tinción: Doble FISH para tuba1ab (verde) y atp6v1a (rojo), IHC para el marcador de proliferación fospo
histona3 (pH3) y DAPI, pila de 2 μm. A,DH) Datos del análisis de imágenes de microscopía confocal. CH) Los datos "no típicos" corresponden a un cribado de 64
embriones por condición. B,C) Media ± DE, “a” = grupo control; la significancia estadística se representa en un código de letras: a indica que no hay diferencia con el control,
todas las demás letras indican una diferencia significativa con el control, las letras compartidas indican que no hay diferencias significativas entre los conjuntos de datos
correspondientes. ANOVA unidireccional, prueba de comparación de Tukey, p < 0,05.
MC = multiciliado, vMR o rMR = vesículas o crestas ricas en mitocondrias, MS = células secretoras de moco.
(Figura 8). Las diferencias entre las respuestas impulsadas por E2, T y Las etapas (st) se definieron con base en las claves de identificación
EE2 podrían deberse a mecanismos múltiples y distintos, como la de Nieuwkoop y Faber X. laevis [65], aunque la equivalencia en horas
regulación de receptores de esteroides sexuales específicos o la posteriores a la fertilización difirió debido a la temperatura de cultivo
producción de varios metabolitos resultantes del procesamiento de (archivo adicional 3). Los embriones st 8–9 fueron disecados para
esteroides sexuales [31,53]. Sin embargo, es probable que las obtener explantes del área central del polo animal; los explantes se
respuestas comunes, como una mayor pigmentación, branquias mantuvieron 30 min. en 1× MBS en placas petri de vidrio para facilitar
demasiado grandes, mayor proliferación celular e inducción de fenotipos la cicatrización y el cierre, y posteriormente cultivadas en las mismas
"atípicos", puedan estar mediadas por un receptor multifuncional con condiciones que los embriones hermanos.
afinidad similar por las tres hormonas sexuales. En este sentido, los
receptores acoplados a proteína G de membrana (GPCR), como el Condiciones para los tratamientos con
GPR30, que fue inhibido de manera similar por E2, T y EE2, podrían esteroides sexuales Las hormonas esteroides sexuales – E2 (17β
ser buenos candidatos. Se ha demostrado que GPR30 emite señales estradiol, Sigma), T (17βHydroxy3oxo4androstene, Sigma) y EE2
en respuesta a estrógenos y andrógenos en múltiples contextos (17αethinylestradiol, Sigma) – se prepararon de la siguiente manera
[6164], aunque otros GPCR pueden mediar respuestas rápidas y no siguiendo el mismo procedimiento. Las hormonas se resuspendieron
genómicas a esteroides en vertebrados [61,62]. directamente en 0,5x MBS en un baño ultrasónico (Fisher Scientific
15046) para mejorar la disolución [31] a una concentración final de 1 ×
En conclusión, proponemos que la epidermis de los embriones de 104 M. Los embriones y las cubiertas epidérmicas del st 10 se
Xen opus puede usarse no solo como un modelo estándar del expusieron a E2, T o EE2 a 1 × 107 M y 1 × 105 M por baño,
ecosistema celular MCE, sino también como un sistema prometedor mantenido a 18 °C y recolectado en el tiempo equivalente para st 15,
para evaluaciones patológicas y ecotoxicológicas, y para estudios 30 o 40 (Archivo adicional 3) según sea necesario. Los controles se
comparativos con otros tejidos epiteliales o mucosos. modelos incubaron en 0,5x MBS y se recogieron al mismo tiempo que los
embriones tratados y los explantes ectodérmicos.
Materiales y métodos Ética
Todos Recolección y fijación de muestras
los experimentos se realizaron siguiendo la Directiva 2010/63/UE del Antes de la fijación, los embriones en todas las etapas muestreadas se
Parlamento Europeo y del Consejo del 22 de septiembre de 2010 sobre colocaron en viales de vidrio y se anestesiaron con tricaína (también
la protección de los animales utilizados con fines científicos. Todos los llamada MS222 o metanosulfonato de 3aminobenzoato de etilo,
experimentos con animales fueron aprobados por la "Direction Sigma) a 0,3 mg/ml en 0,5x MBS durante al menos menos 10 min. Los
départementale de la Protection des Populations, Pôle Alimentation, explantes se trataron en consecuencia para mantener condiciones
Santé Animale, Environnement, des Bouches du Rhône" (acuerdo idénticas.
número E 1305521). Los embriones (st 15 y 30) para la tinción del marcador biomolecular
se fijaron con una concentración final de formaldehído al 4 % v/v
durante 2 h, luego se colocaron en etanol al 100 % durante 1 h; ambos
Embriones y explantes ectodérmicos Los pasos a temperatura ambiente (RT) con agitación suave continua;
embriones de Xenopus laevis se obtuvieron de adultos criados en Luego, los embriones se colocaron en etanol fresco al 100 % a 20 °C
laboratorio (Nasco) mediante fertilización in vitro, se eliminaron de la durante al menos 24 h y hasta que se necesitaron. Los embriones (st
gelatina y se cultivaron en solución de Barth modificada (MBS) como 40) para SEM se fijaron en glutaraldehído al 3% en tampón de fosfatasa
se describió anteriormente [12], con ligeras modificaciones para 0,1 M pH 7,4 (19 ml de fosfato monosódico 0,2 M y 81 ml de fosfato
mantener un cultivo constante. condiciones, es decir, 18°C y 0,5x MBS. De ddisódico
esarrollo0,2 M) elaborado con
Estradiol (E2) testosterona EtiniloE2 esteroides sexuales
Estimulación en vivo
pigmentación de la piel MCE
Nivel de organismo Crecimiento de tejidos mucociliares y endoteliales
(Renacuajo)
Abundancia celular
Nivel de tejido Arquitectura general MCE
(Epitelio mucociliar, MCE)
Transcripción de ARN enriquecida con MCE
secretor de moco Proliferación
nivel celular multiciliado
Enriquecimiento de tipo celular
(poblaciones de células MCE) rico en mitocondrias
Fenotipos “no típicos”
itln1 Actuba incremento

Biomarcadores etc 1 tuba1a b atp6v1a inducción
de disrupción
recortar29 foxj1 foxi1e
Figura 8 Descripción general del impacto de los esteroides sexuales en el epitelio mucociliar de los embriones de Xenopus.
(0.22 μm) agua bidestilada, durante 4 h con agitación vigorosa, con oro (vacío 1 × 1012 Torr, energía del haz 3–4 keV) para
luego lavado con tampón fosfatasa y agua bidestilada filtrada, para imágenes digitales SEM inmediatas (S440, Leica) de la epidermis de
ser deshidratados sucesivamente en etanol al 25, 50 y 70% por 30 la piel, para permitir el análisis de poblaciones celulares y arquitectura
minutos cada uno; luego, los embriones se almacenaron en etanol tisular.
fresco al 70 % a 4 °C durante 1 o 2 días antes de continuar con el
procesamiento. Hibridación in situ fluorescente y cromogénica (ISH)
La ISH cromogénica de montaje completo se realizó como se
Observaciones de microscopía de campo mencionó anteriormente para los marcadores epidérmicos de X.
brillante Los embriones se observaron regularmente en un aumento laevis [11,12,66], con algunas modificaciones. Todos los productos y
de 110x de campo brillante para la evaluación del fenotipo morfológico reactivos se adquirieron de Roche o Sigma, a menos que se indique lo contrario.
macroscópico. No se detectaron diferencias obvias entre los Las sondas de ARN se sintetizaron y marcaron con digoxigenina
embriones tratados con esteroides sexuales y los de control con (DIG) o fluoresceína (FLUO) de plásmidos que contenían las
respecto a la velocidad de desarrollo o las deformidades, excepto por secuencias de hibridación apropiadas para los genes diana previstos
los cambios en la pigmentación, las ramas branquiales y los vasos tuba1ab (obsequio de Christopher Kintner, Salk Institute for Biological
sanguíneos. Para evaluar estos cambios, se anestesiaron embriones Studies, EE. UU.), itln1 ( obsequio de John Wallingford, Universidad
en st 40 y 45 (como se describe anteriormente) para obtener imágenes de Texas en Austin, EE. UU.), atp6v1a (obsequio de Nancy
estáticas de embriones vivos (Digital Sight DSL2, Nikon), las Papalopulu, Universidad de Manchester, Reino Unido) y foxi1e; el
imágenes resultantes se analizaron más. número de acceso de las secuencias es el mismo que para los
cebadores de RTqPCR (archivo adicional 12); también se sintetizaron
Procesamiento e imagen SEM sondas sentido y sirvieron como controles negativos. Brevemente,
Los embriones en etanol al 70 % se deshidrataron aún más con las muestras almacenadas en etanol a 20 °C se rehidrataron
agitación vigorosa en etanol una vez al 90 % y dos veces al 100 % progresivamente en etanol al 75 %, 50 % y 25 % en PBT (0,1 %
durante 30 minutos cada una; posteriormente se sometieron a Tween 20 en 1x PBS), y luego en PBT; luego se trataron con
secado en punto crítico con CO2 (CPD030, Balzers) a 31°C y 73 atm. trietanolamina 0,1 M (TEA) pH 8 durante 5 min. y anhídrido acético
Finalmente, las muestras fueron recubiertas por pulverización al 0,5% en TEA 0,1 M durante 10 minutos, y se lavó en
PBT; luego se trataron con proteinasa K (PK) a una concentración Women's University, Japón) para células de EM a 1:500, y
final de 2 μg/ml durante 8 min, se lavaron con PBT y se colocaron antifosfohistona H3 policlonal de conejo (06–570, Upstate
en solución blanqueadora (600 μl de agua libre de RNasa, 325 μl Biotechnology) para células mitóticas a 1:1000. Luego, las
de H2O2, 50 μl de formamida y 25 μl de SSC 20X ) bajo luz muestras se lavaron 7 veces en MABX durante 1 ha TA y durante
brillante, se lavó y se volvió a fijar en formaldehído al 4% durante 18 ha 4 °C. Después de eso, las muestras se colocaron en
20 min. Después de eso, las muestras se colocaron sucesivamente tampón de bloqueo durante 1 h a temperatura ambiente y, luego,
en una mezcla de hibridación HM (agente bloqueante Roche al 1 se incubaron durante 3 h con el anticuerpo secundario anticonejo
% p/v, SSC 20X al 25 %, Formamida al 50 %, heparina al 0,01 o antiratón apropiado hecho en burro, cabra o pollo y conjugado
%, ARN de Torula al 0,1 %, Tween 20 al 0,1 %, CHAPS al 0,1 %, con Alexafluor 488, 555. o 647 (Invitrogen), según sea necesario
5 mM EDTA pH8, en agua bidestilada) 50% en PBS y HM 100%; y con las concentraciones indicadas por el fabricante. Finalmente,
Posteriormente, las muestras se incubaron con las respectivas las muestras se lavaron y procesaron para obtener imágenes o
sondas en HM al 100 % a 60 °C durante 18 h. El día 2, las tinción adicional.
muestras se lavaron sucesivamente en HM al 50% (en 2x SSC y
CHAPS al 0,1%) a 37°C, en 2x SSC y CHAPS al 0,1% a 37°C, Tinción DAPI para núcleos
en 0,2x SSC y CHAPS al 0,1% a 60ºC. °C, MABX (0,1% Después de ISH e IHC, y justo antes del montaje, las muestras
TritonX100, ácido maleico 0,1 M y NaCl 0,15 M) 50% en 0,2× se colocaron en DAPI (Calbiochem) a una concentración final
SSC y CHAPS 0,1% a TA y, finalmente, en MABX. A continuación, de 1 μg/ml en PBS durante 15 min. a 4°C y luego se lavó dos
los embriones se colocaron en tampón de bloqueo (reactivo de veces con PBT durante 1 hora a 4°C.
bloqueo de Roche al 2 %, suero bovino fetal al 10 % y DMSO al
5 % en MABX) durante 1,5 h y luego se incubaron con anticuerpos Imágenes fluorescentes y confocales
antiDIG o antiFLUO de oveja a 4 °C durante 18 horas. h y lavado Se analizaron embriones completos mediante microscopía de
con MABX. campo brillante, fluorescente (MZ FLIII, lámpara de mercurio ebq
Para la ISH cromogénica (CISH), se omitió el tratamiento con 100, Leica) y macroconfocal (AZC2+, Nikon) para un examen
TEA. CISH se llevó a cabo con anticuerpos conjugados con general de la arquitectura epidérmica y la verificación de la calidad
fosfatasa alcalina (AP) a 1:5000 en tampón de bloqueo y se de la tinción. Luego, se explantó el tejido epidérmico sobre los
detectó con 0,5 × sustrato BMpúrpura en agua. La ISH somitas y se montó con montaje Fluoro G (Fluoprobes) y se dejó
fluorescente (FISH) se realizó con anticuerpos conjugados con secar a 4 °C antes de obtener imágenes confocales (LSM780,
peroxidasa de rábano picante (POD) a 1:500 en tampón de Zeiss). Las imágenes se adquirieron con una resolución de 8 bits/
bloqueo y se detectó con kits de fluoresceína TSA Plus o Cy3 canal y 1024 × 1024 píxeles, y se procesaron en Imagen J para
(PerkinElmer) para sondas etiquetadas con FLUO o DIG, una proyección Z de máxima intensidad y/o fusión de canales. La
respectivamente. Las muestras se incubaron con el sustrato TSA mejora de atp6v1a se calculó como la proporción de señales de
durante 1 hy luego se lavaron con MABX; luego, la reacción se atp6v1a a foxi1e por celda individual, las mediciones del área de
detuvo con H2O2 al 2% en PBS durante 0,5 h y se lavó en MABX. atp6v1a y foxi1e se obtuvieron por separado utilizando la imagen
Desde la adición del sustrato TSA hasta la toma de imágenes, J. La configuración para la adquisición y el procesamiento de
las muestras se mantuvieron protegidas de la luz. imágenes se mantuvo entre muestras del mismo experimento. .
Para ISH doble, las sondas de ARN se añadieron al mismo
tiempo, pero las reacciones de anticuerpo y sustrato se realizaron
secuencialmente. Al final, las muestras teñidas se fijaron con
formaldehído al 4 % en PBT durante 0,5 hy, luego, se lavaron en Mediciones de pigmentación
PBT y se procesaron para obtener imágenes o para tinción Las imágenes de las observaciones de microscopía de campo
adicional. brillante se analizaron para evaluar los cambios en la pigmentación
que se cuantificaron como 1) el número de melanóforos en el
Inmunohistoquímica fluorescente (IHC) área abdominal, mediante el conteo manual y la herramienta
La IHC de montaje completo se realizó como se mencionó "buscar máximos" del software Image J [67], y 2 ) el área
anteriormente en X. laevis [11,12,66], con algunas modificaciones. pigmentada total, los ojos y la glándula de cemento excluidos,
Después de la tinción con ISH, las muestras se colocaron en mediante el uso de la herramienta de umbral Image J. Ambos
tampón de bloqueo y, luego, se incubaron con el anticuerpo parámetros se midieron en embriones entre st 40 y 45 cuando la
primario respectivo para las proteínas marcadoras en las pigmentación estaba lo suficientemente definida como para ser
diluciones correspondientes en tampón de bloqueo durante 1 detectada por el software, aunque los cambios cualitativos en la
hora a temperatura ambiente y luego durante 18 horas a 4 °C. pigmentación eran fácilmente observables a partir de st 38.
Usamos monoclonal de ratón anti acetiladoTuba clon 611B1
(T7451, Sigma) para cilios a 1:1000, monoclonal de ratón anti Análisis de expresión de RNAs por PCR en tiempo real (RTqPCR)
p63 (ab111449, Abcam) para células basales a 1:100, monoclonal Muestras de tejido de embriones completos, explantes
de ratón anti Itln1 (5G7 anticuerpo, regalo de Saguro Nagata, Japón ectodérmicos y piel embrionaria se congelaron en nitrógeno líquido y se
almacenado a 80°C para su posterior procesamiento. El ARN total (ejemplos en la Figura 2). Todos estos datos se integraron para
se extrajo con el kit de aislamiento de ARN miRCURY Tejido analizar la abundancia de la población celular (cantidad de células
(Exiqon) y se trató con DNasa I (New England Bio labs) siguiendo por campo), y evaluar la contribución de cada tipo celular en función
las instrucciones del fabricante. La síntesis de la primera cadena de de su enriquecimiento con respecto al número total de células
cDNA se realizó con SuperScript II RNase H– Reverse Transcriptase (cantidad de núcleos teñidos con DAPI). Además, acTuba y pH3 se
(Invitrogen) con cebador oligodT1218 a partir de 1 μg de RNA total; utilizaron como marcadores para caracterizar características
para los ARN no codificantes, la síntesis se realizó con el kit adicionales de la actividad celular. Además, también se utilizó la
miRCURY LNA Universal RT microRNA PCR, poliadenilación y tinción de marcadores múltiples para identificar fenotipos celulares
síntesis de cDNA (Exiqon) a partir de 200 ng de ARN total, todo "no típicos" que se cuantificaron como ocurrencia acumulada. Este
siguiendo las instrucciones del fabricante. es un enfoque similar al descrito anteriormente para evaluar las
respuestas celulares heterogéneas a las perturbaciones [69].
La RTqPCR se realizó con un instrumento CFX96 (BioRad) Complementariamente, las imágenes de SEM en st 40 se analizaron
utilizando SYBR GreenER qPCR SuperMix (Invi trogen) para para evaluar la composición celular en función de las características
analizar las transcripciones de codificación y miRCURY LNA SYBR estructurales típicas de cada tipo de célula (archivo adicional 2), para
Green master mix Universal RT (Exiqon) para los ARN no codificantes. calcular el enriquecimiento de cada tipo de célula y para una
Las transcripciones analizadas fueron los marcadores endocrinos evaluación cualitativa de la arquitectura general del tejido.
relacionados ar, esr1, esr2, gpr30 (también llamado receptor de
estrógeno de proteína acoplada a G, gper) y rbp4, y los ARN de
marcadores relacionados con MCE tuba1ab, itln1 (también llamado
lectina epidérmica embrionaria de Xenopus, xeel), atp6v1a, cftr, foxj1, Análisis estadísticos
trim29, foxi1e y xlamiR449a5p. Los perfiles de expresión en embriones completos se modelaron a
Las mezclas de reacción de SYBR Green para codificar transcritos partir de 4 conjuntos de datos de lotes independientes de embriones
se incubaron durante 10 min a 95 °C, seguidas de 40 ciclos de con al menos 20 embriones por etapa (punto de tiempo) con puntos
amplificación de 15 s a 95 °C y 1 min a 60 °C, y una verificación final de tiempo de muestreo superpuestos desde st 9–50, cada punto de
del análisis de la curva de fusión (65 – 90 °C). C, en incremento a tiempo contando al menos con 2 conjuntos de datos; luego, se
0,5°C/s). Para el análisis de ARN no codificante, se aplicaron los calcularon y trazaron los puntos de la curva spline ± 95% IC. Las
mismos ajustes pero con una velocidad de rampa de 1,6 °C/s durante diferencias entre los puntos temporales se analizaron mediante
el ciclo de amplificación. Los ARN de referencia utilizados fueron ANOVA de dos vías y prueba de comparación de Bonferroni (p <
ARNm de ornitina descarboxilasa 1 (odc1, registros de Cq promedio 0,05). Se calculó el coeficiente de correlación de Spearman (r) y el
22 ± 1,1) para la expresión génica y ARN nuclear pequeño U2 respectivo valor p para cada marcador de ARN vs horas post eclosión
(RNU2, registros de Cq promedio 19 ± 0,7) para la expresión xla para estimar los cambios en los niveles de expresión asociados a la
miR449a5p. Se diseñaron cebadores específicos de X. laevis edad (solo significativo para foxi1e (r < −0.6), miR449a 5p (r > 0,8),
utilizando la herramienta PrimerBLAST [68] de las bases de datos cftr (r > 0,3), atp6v1a (r > 0,5) y rbp4 (r > 0,7) y los que están más
de secuencias disponibles públicamente o seleccionadas de estudios específicamente relacionados con los mecanismos de diferenciación
previos. Los números de acceso, las referencias y las secuencias se de MCE.
muestran en el archivo adicional 12. En todos los casos, cada PCR Para los análisis comparativos de los perfiles de expresión de ARN
se realizó por triplicado y de al menos dos experimentos de los datos de RTqPCR, los niveles de expresión se normalizaron
independientes. Se probó la calidad de cada par de cebadores, en y, luego, se analizaron mediante ANOVA de dos vías y pruebas de
todos los casos el producto de PCR produjo una sola banda del comparación de Bonferroni (p < 0,05). Los efectos de los esteroides
tamaño esperado en gel de agarosa al 1 % Sight DNA Stain (Euro sexuales se representaron como un cambio de veces en relación con
medex), tenía ≥99 % de identidad con la secuencia deseada, produjo los controles. Los análisis comparativos de la pigmentación y la
un único pico de curva de fusión y tenía una eficiencia de curva lineal dinámica de la población se realizaron mediante ANOVA unidireccional
con r > 0,95. y pruebas de comparación de Tukey (p < 0,05); los efectos de los
esteroides sexuales se representaron como cambio porcentual en
Estimación de las características de la población relación con los controles. En todos los casos, las diferencias entre
de células MCE Se utilizaron imágenes de microscopía confocal de los grupos se indicaron con letras en las figuras o tablas. Letras
embriones en st 30 teñidos con doble FISH e IHC de marcadores diferentes denotan grupos que son significativamente diferentes,
moleculares para estimar la abundancia de la población celular en por ejemplo, el grupo de datos "b" es diferente del grupo de datos
función de los tres tipos de células principales (células MC, MR y "c", mientras que un conjunto de datos etiquetado como "bc" no es
MS) que pueden diferenciarse con este enfoque (archivo adicional 2). significativamente diferente del grupo de datos "b" o del grupo de
En todos los casos, se usó tuba1ab para estimar el número de datos "c". ”. La letra “a” se usó para indicar datos que no son
células MC, mientras que se combinaron otros marcadores de genes significativamente diferentes del grupo de referencia o control en
y proteínas para obtener un conjunto de tinciones superpuestas para cada experimento. Los datos se analizaron con GraphPad Prism v.5
estimar la cantidad de otros tipos de células y características específicas. o R i386 2.15.2 [70].
Archivos adicionales compañerismo); y Agencia Nacional de Investigación (ANR COMMIT, beca de
investigación LK).
Archivo adicional 1: Detalle del contexto de órganos/tejidos en el que se ha
Recibido: 26 de agosto de 2013 Aceptado: 28 de enero de 2014
informado de un epitelio mucociliar formado por células MC, MR y MS a lo largo de los
Publicado: 6 febrero 2014
metazoos.
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Conflicto de intereses Los
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autores declaran que no tienen conflictos de intereses.
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Contribuciones de los autores
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PCB concibió el estudio, llevó a cabo la adquisición, análisis e interpretación de
y electroacupuntura en aclaramiento mucociliar en codornices anestesiadas.
datos. PCB y LK han coordinado el estudio y redactado el manuscrito. Ambos autores
Complemento BMC Altern Med 2006, 6:4.
leyeron y aprobaron el manuscrito final.
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bougainvillii (Squamata: Scincidae).
Información de los autores
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La experiencia de PCB. se basa en la biomedicina de animales acuáticos con énfasis en su
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intereses científicos de PCB. se centran en el estudio de potenciales reguladores de la Célula de tejido 2006, 38: 19–33.
biogénesis del epitelio mucoso que están relacionados con la cicatrización de heridas,
17. Nakano H, Lundin K, Bourlat SJ, Telford MJ, Funch P, Nyengaard JR, Obst M, Thorndyke MC:
la inmunidad y el sistema de control endocrino.
Xenoturbella bocki exhibe un desarrollo directo con similitudes con Acoelomorpha. Nat
LK ha desarrollado experiencia en el papel de las vías de señalización durante el
Commun 2013, 4:1537.
desarrollo embrionario de vertebrados, utilizando principalmente Xenopus laevis como 18. AlmuedoCastillo M, Salo E, Adell T: Disheveled es esencial para la conectividad neuronal y
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el punto de vista molecular, celular y evolutivo. 3253.
19. Weihrauch D, Chan AC, Meyer H, Döring C, Sourial MM, O'Donnell MJ:
Agradecimientos Excreción de amoníaco en la planaria de agua dulce Schmidtea mediterranea.
Agradecemos al personal del Imaging Facility de IBDM por su ayuda con la adquisición J Exp Biol 2012, 215:3242–3253.
de imágenes SEM y Confocal, ya Virginie Thomé por su asistencia técnica. 20. Santos FCA, FalleirosJúnior LR, Corradi LS, Vilamaior PSL, Taboga SR: Las terapias endocrinas
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Austria: R Fundación para la Informática Estadística; 2012. http://www.Rproject.org/.
doi:10.1186/17429994119
Citar este artículo como: CastilloBriceno y Kodjabachian: Epidermis
embrionaria de Xenopus como ecosistema celular mucociliar para evaluar el
efecto de las hormonas sexuales en un contexto no reproductivo. Fronteras en
Zoología 2014 11:9.
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