Universidad de Oriente

Núcleo Bolívar
Escuela de Ciencias de la Salud
Departamento de Parasitología y Microbiología
Asignatura: Parasitología
Área: Laboratorio de Parasitología

“PRÁCTICA 1: EXAMEN DIRECTO

Y MÉTODOS DE
CONCENTRACIÓN”

Facilitador: Profa. Katherine Bravo

 MICROSCOPÍA

Se define como el empleo de un microscopio para

aumentar de tamaño objetos demasiado pequeños para
ser observados a simple vista con el propósito de que
puedan verse con facilidad sus características.

Grupo de Microscopia de Microscopia de Microscopia de Microscopia

microorganism campo claro fluorescencia campo oscuro electrónica
os
Bacterias + + ± -

Hongos + + − -

Parásitos + + − ±

Virus - + − ±

+, utilizado con frecuencia; ± , uso limitado; -, utilizado rara vez.

 MICROSCOPIA DE CAMPO CLARO (ÓPTICA)

 Principios de la microscopia óptica

La luz visible pasa a través de la muestra y luego

atraviesa una serie de lentes que reflejan la luz de una
manera que produce un aumento de tamaño de los
microorganismos presentes en la muestra. El aumento
total alcanzado es el producto de los aumentos de las
lentes utilizadas. Para optimizar la visualización deben
considerarse los factores:

Aumento Resolución Contraste

 MICROSCOPIA DE CAMPO CLARO (ÓPTICA)

 Principios de la microscopia óptica:

Luz Lente condensadora Muestra Lente objetivo Lente ocular Ojo

Imagen aumentada
 MICROSCOPIO

 Microscopio óptico: El tipo de microscopio más

utilizado, se sirve de la luz visible para crear una imagen
aumentada del objeto. Consiste en dos sistemas de
lentes, el objetivo y el ocular, montados en extremos
opuestos de un tubo cerrado.
 MICROSCOPIO

 Partes del microscopio óptico:

A. Sistema mecánico conformado por:
-Tubo
-Revólver
-Platina
-Pie o base
-Columna o brazo
-Tornillos macrométrico y micrométricos
-Carro
-Diafragma
 MICROSCOPIO

 Partes del microscopio óptico:

B. Sistema óptico esta conformado por:
-Lentes oculares (5X, 8X, 10X, 12,5X, 20X)
Monoculares− Binoculares

-Lentes objetivos
4X ó 5X Objetivo explorador - Rojo
10X Bajo aumento – Amarillo
40X Alto aumento seco – Azul
100X Alto aumento - Inmersión - Blanco
 MICROSCOPIO

 Partes del microscopio óptico:

C. Sistema de iluminación esta conformado por:
-Condensador
-Diafragma
-Fuente de luz o lámpara
 MATERIALES USADOS EN DIAGNÓSTICO
PARASITOLÓGICO

 Láminas portaobjetos
 Láminas cubreobjetos
 Aplicadores de madera
 Solución salina fisiológica al 0,85%
 Solución de lugol
 Gasas
 Gradillas
 Tubos de ensayo
 Colorantes
 Papel celofán
 Bandejas de coloración
 EXAMEN DE HECES

 Heces fecales: Se refiere al producto final o el desecho

de los procesos digestivos.

Se elimina en un individuo adulto “sano” una cantidad

aproximada de 300 a 500 gramos de materia fecal, esto
depende mucho del tipo de alimentación y de los hábitos
intestinales de cada persona.

250-500 gramos 10-20 gramos

Recolección de la materia fecal

EXAMEN GENERAL DE HECES FECALES

 Estudio macroscópico

 Estudio bioquímico

 Estudio microscópico
EXAMEN GENERAL DE HECES FECALES

1. Estudio macroscópico
-Aspecto:
Homogéneo/ Heterogéneo

-Consistencia:
Diarreica o líquida
Blanda
Pastosa
Dura o formada
EXAMEN GENERAL DE HECES FECALES

1. Estudio macroscópico
-Color: Estercobilina
Castaño oscuro o marrón
Amarillas
Negro
Verdes- azuladas
Rojizo
Acólicas
-Olor: Indol
Sui generis o fecal
Fétido
Necrótico
EXAMEN GENERAL DE HECES FECALES

1. Estudio macroscópico
- Presencia de moco visible (Mezclado con sangre)

-Presencia de sangre aparente: Parásitos con capacidad

invasiva Entamoeba histolytica, Balantidium coli, Trichuris
trichiura y Schistosoma mansoni.

-Presencia de restos alimenticios (Lientería)

Lientérica: Heces con trozos de alimentos sin digerir.

EXAMEN GENERAL DE HECES FECALES

2. Estudio bioquímico
pH:
Reacción: Ácido/ Básica
Azucares reductores:
-Negativo
-Positivo
Hemoglobina fecal humana (sangre oculta):
-Negativo
-Positivo
Leucocitos fecales: % Polimorfonucleares.
% Mononucleares.
EXAMEN GENERAL DE HECES FECALES

3. Estudio microscópico

-Hematíes

-Leucocitos

-Flora bacteriana (Microbiota)

-Levaduras (Blastoconidios y pseudomicelios)

-Cristales (Cristales de Charcot-Leyden)

-Presencia de parásitos
EXAMEN GENERAL DE HECES FECALES

 Reporte de las formas parasitarias:

Se informara primero el estadio evolutivo del parásito
observado y luego el nombre científico correctamente
escrito.

Mayúscula Entamoeba coli

Género especie

Ejemplo: Presencia de quistes de Entamoeba coli.

Forma evolutiva de cuerpo central de Blastocystis sp.,
mayor (>) de 5 células por campo de 40X.
EXAMEN GENERAL DE HECES FECALES

 Reporte de las formas parasitarias: Subrayar en los

manuscritos.

Nota: La sigla sp significa especie o especie de, en tanto

que la sigla spp es el plural, quiere decir especies.
“Secuencia de Pasos para el Montaje del
Examen Directo de Materia Fecal”
 PROCEDIMIENTO DEL EXAMEN DIRECTO

-Examen directo de heces frescas (Botero y Restrepo, 2012)

• En una lámina portaobjeto limpia e identificada, se dispensa con
un gotero una gota de solución salina fisiológica al 0,85% en un
extremo (lado izquierdo) y en el otro extremo (lado derecho) una
gota de solución de lugol.
• Con un aplicador de madera se homogeniza la muestra fecal
contenida en el envase recolector y se toma una pequeña porción
aproximadamente 1 ó 2 mg de heces, luego esta porción se
homogeniza en la gota de solución salina fisiológica y
posteriormente sobre la gota de lugol (Se debe suspender la
alícuota de la muestra de heces primero en la Solución Salina y
luego en la solución de Lugol, NUNCA en caso contrario).
• Se coloca una lámina cubre objeto a cada preparación para luego
ser observada en el microscopio óptico con objetivo de 10X y 40X,
recorriendo la preparación de manera ordenada en forma de zig-
zag, comenzando con la solución salina para luego pasar a la
solución de lugol.
• Las observaciones de cada muestra deben ser registradas en la
hoja de reporte.
 PROCEDIMIENTO DEL EXAMEN DIRECTO

• Paso 1:
 PROCEDIMIENTO DEL EXAMEN DIRECTO

• Paso 2:
 PROCEDIMIENTO DEL EXAMEN DIRECTO

• Paso 3:
 PROCEDIMIENTO DEL EXAMEN DIRECTO

• Paso 4:
 PROCEDIMIENTO DEL EXAMEN DIRECTO

• Paso 5:
PARÁSITOS EN EXAMEN DIRECTO DE HECES
AUMENTO

Objetivo 10X
AUMENTO

Objetivo 40X
 CONSIDERACIONES DEL EXAMEN DIRECTO

 VENTAJAS:
• Método diagnóstico por excelencia.
• Fácil, económico y rápido.
Solución salina 0,85%

 DESVENTAJAS:
Lugol u otro Colorante
• Se evalúa muy poca cantidad de muestra.
• Sensibilidad y especificidad limitada.
 DIAGNÓSTICO PARASITOLÓGICO

Objetivos:
• Visualización e identificación del parásito.
• Respuesta del hospedador.
• Efectos sobre el hospedador.
 DIAGNÓSTICO PARASITOLÓGICO

Elección del método diagnóstico:

-Tipo de parásito
-Clínica del paciente
-Sospecha médica
-Disponibilidad
-Sensibilidad y especificidad del método
 DIAGNÓSTICO PARASITOLÓGICO

 Examen directo de Heces Fecales

 Métodos Auxiliares para el diagnóstico

Métodos de Concentración
-Cualitativos
-Cuantitativos

Métodos Especiales

Coloraciones
 MÉTODOS DE CONCENTRACIÓN

 Permiten evaluar una mayor cantidad de

muestra.
 Su sensibilidad y especificidad es notablemente
mayor que el examen directo.
 Existen métodos específicos para cada grupo de
parásitos.
 MÉTODOS DE CONCENTRACIÓN

 Técnica de Kato:
-Diagnóstico de huevos de helmintos.
-Sensibilidad superior al 80% para diferentes especies
parasitarias.
-Fácil, económica y rápida.
-Permite observar huevos de: Ascaris lumbricoides,
Trichuris trichiura, Ancylostomideos, entre otros.

Blanco, 2002
 MÉTODOS DE CONCENTRACIÓN

 Técnica de Kato (Rey, 2001; Botero y Restrepo, 2012):

Preparación de la solución de Kato
100 ml de glicerina.
100 ml de agua destilada.
1 ml de la solución verde de malaquita al 3%.
• Previamente se cortan trozos de papel celofán (2,5 x 3cm) y de 40- 50 micras de espesor.
Se dejan inmersos en la solución verde de malaquita al menos 24 horas antes de
utilizarlos.
• Con un aplicador de madera se toma aproximadamente 1 gramo de heces fecales y se
coloca sobre un portaobjeto limpio e identificado. Con ayuda de una pinza metálica se
procede a colocar sobre las heces el papel celofán.
• Posteriormente con ayuda de un papel toalla se hace presión con los dedos para expandir
las heces. Esto evitará la formación de burbujas y permite un mejor extendido de la
muestra, así como la eliminación del exceso de solución de verde de malaquita.
• Se deja actuar el colorante durante 15 a 20 minutos a temperatura ambiente o durante 5
minutos al lado de una fuente de calor.
• Se examina en el microscopio con objetivo de 10X en busca de huevos característicos de
los helmintos.

Blanco, 2002
 MÉTODOS DE CONCENTRACIÓN

 Técnica de Kato- Katz (Técnica cuantitativa):

Capacidad del molde: 41,7 mg

41,7 mg de heces…………………30 huevos de A. lumbricoides

1000 mg de heces………………... X
X= 1000 mg x 30 huevos
/ 41,7 mg
Factor= 24 x 30= 720 huevos/gramo de heces
 MÉTODOS DE CONCENTRACIÓN

 Técnica de Kato:
 MÉTODOS DE CONCENTRACIÓN

 Técnica por flotación de Willis Malloy:

-Diagnóstico de huevos livianos de helmintos.
-Se evalúa una gran porción de la muestra.
-Sensibilidad alta.
-Fácil, económica y rápida.
-Sensible para huevos livianos de helmintos: Huevos de
Ancylostomideos y huevos de Hymenolepis sp.

Bustamante, 2004
 MÉTODOS DE CONCENTRACIÓN
 Técnica por flotación de Willis Malloy (Melvin y Brooke, 1971):
Procedimiento de la técnica:
• Se toma aproximadamente 1 o 2 gramos de materia fecal con un aplicador de madera.
• Posteriormente se coloca la muestra en un vaso descartable de plástico y se mezcla con
10 ml de solución saturada de cloruro de sodio.
• En otro vaso descartable se filtra la mezcla con una gasa doble, agregando al vaso la
solución saturada de cloruro de sodio hasta casi llenar el borde del recipiente.
• Se coloca una lámina portaobjeto sobre el vaso de manera que el líquido haga contacto
con la lámina.
• Se espera de 5 a 10 minutos.
• Si hay presencia de huevos livianos de helmintos, estos se elevaran porque son menos
densos, se ubican hacia la superficie y se quedan adheridos a la cara interna de la lámina
de vidrio que está en contacto con la mezcla.
• Completado el tiempo estipulado, se levanta la lámina y por un proceso de eversión se
voltea en un movimiento rápido hacia afuera.
• Al líquido sobre la lámina portaobjeto se le coloca una laminilla cubreobjetos o se puede
observar directamente en el microscopio.
• Se examina la preparación al microscopio con el objetivo de 10X, buscando huevos
livianos de helmintos.

Bustamante, 2004
 MÉTODOS DE CONCENTRACIÓN

 Técnica por flotación de Willis Malloy:

 MÉTODOS DE CONCENTRACIÓN

 Técnica de sedimentación espontánea:

-Diagnóstico de huevos de helmintos y quistes de
protozoarios (E inclusive se observa trofozoítos de algunos
protozoarios).
-Sensibilidad alta.
-Fácil, económica y sencilla.
-24 horas para emitir resultado.
 MÉTODOS DE CONCENTRACIÓN

 Técnica de sedimentación espontánea:

Procedimiento de la técnica:
• En un vaso plástico desechable, agregar ¼ de solución salina fisiológica al
0,85% y añadir a la solución materia fecal.
• La materia fecal se mezcla de manera constante disgregándola por
completo.
• Una vez obtenida la mezcla, se debe filtrar haciendo pasar por medio de
una gasa “doblada en ocho”, esto para eliminar restos alimenticios grandes.
• El líquido obtenido se coloca en un vaso plástico descartable.
• Posteriormente se agrega solución salina fisiológica hasta 3/4 partes del
vaso.
• Se deja sedimentar a temperatura ambiente por 24 horas.
• Transcurrido ese tiempo, se descarta el sobrenadante y con ayuda de una
pipeta Pasteur se retira una pequeña muestra del sedimento en el fondo del
vaso y se coloca en una lámina portaobjeto, se agrega una gota de lugol y
se cubre con una laminilla, para luego ser observada al microscopio con los
objetivos de 10X y 40X.
 MÉTODOS DE CONCENTRACIÓN

 Técnica de Flotación de Faust:

-Diagnóstico de quistes de protozoarios.
-Sensibilidad moderada con respecto a otras técnicas.
-Laboriosa.
Este es un método en el cual la materia fecal se diluye en
un líquido de alta densidad y los parásitos, que
proporcionalmente son más livianos, van a la superficie.
Para esta técnica se utiliza sulfato de zinc al 33%.
 MÉTODOS DE CONCENTRACIÓN

 Técnica de Flotación de Faust:

 MÉTODOS DE CONCENTRACIÓN

 Técnica de Sedimentación de Formol-Éter

modificado por Ritchie:
-Diagnóstico de huevos de helmintos y quistes de
protozoarios.
-Sensibilidad alta.
-Laboriosa.
-Requiere de un mayor tiempo de trabajo.
Éter
-Riesgo tóxico al trabajar con éter etílico.
-Se puede observar larvas de helmintos.
Formol 10%

Sedimento
 MÉTODOS DE CONCENTRACIÓN

 Técnica de Sedimentación de Formol-Éter

modificado por Ritchie:
 MÉTODOS DE CONCENTRACIÓN

 Técnica de Baerman (Técnica especial):

-Diagnóstico de larvas de Strongyloides stercoralis y de
otros estadios larvarios de helmintos, principalmente
geohelmintos que tengan contacto con la tierra.
-Sensibilidad alta.
-Económica y sencilla.
-Tiempo estimado 90 minutos.
 MÉTODOS DE CONCENTRACIÓN

 Técnica de Baerman:
Procedimiento de la técnica:
• En un embudo colocado en un soporte vertical, que tenga en
el extremo un tubo de caucho cerrado con una pinza, se
vierte agua a temperatura de 42º C, hasta cerca del borde.
• Se coloca sobre el embudo una malla metálica o cedazo,
cubierto con una gasa doble o cuádruple, que debe hacer
contacto con el agua.
• Se ponen sobre la gasa de 8 a 10 gramos de materia fecal,
tierra o material de cultivo, la cual se deja 90 minutos.
• Pasado el tiempo se abre el extremo del tubo de caucho y se
toman unas gotas colocándolas en una lámina portaobjetos.
• Se examina al microscopio para ser observado a través de
objetivos de 10X y 40X.
 MÉTODOS DE CONCENTRACIÓN

 Técnica de MicroBaerman:
-Diagnóstico de larvas de Strongyloides stercoralis.
-Se puede observar huevos de Ancylostomideos.
-Modificación de la técnica de Baerman.
-Económica y sencilla.
-Tiempo estimado de 30 a 45 minutos.

Blanco, 2002
Cañas et al., 2002
 MÉTODOS DE CONCENTRACIÓN

 Técnica de MicroBaerman:
Procedimiento de la técnica:
• Se prepara un tubo de ensayo de aproximadamente 13x100, con
3/4 partes de agua o solución salina, se le coloca un tapón
perforado en el que se introduce una puntilla de plástico (Puntilla de
color azul capacidad 2ml), cuidando que el líquido toque el extremo
proximal de la puntilla.
• Se colocan en el interior de la puntilla aproximadamente 3 gramos
de materia fecal.
• Se introduce el tubo de ensayo en un baño de María o incubadora
durante 45 minutos.
• Pasados los 45 minutos, se retira la puntilla con la muestra, y se
centrifuga el tubo durante 3 minutos a 3500 r.p.m.
• Posteriormente se decanta el sobrenadante y se coloca unas gotas
del sedimento en una lámina portaobjetos se debe cubrir con una
laminilla.
• Se observa al microscopio 10X y 40X.
 MÉTODOS DE CONCENTRACIÓN

 Técnica de Baerman y Microbaerman:

 MÉTODOS DE CONCENTRACIÓN

 Técnica de Cultivo en Placa de Agar (Método de

Arakaki):
-Diagnóstico de larvas de Strongyloides stercoralis.
-Técnica diagnóstica internacional.
-Sensibilidad muy alta.
-Cultivo y aislamiento de larvas.
-24-48 horas a temperatura ambiente.

Blanco, 2002
MÉTODOS DE CONCENTRACIÓN

Cultivo y Aislamiento de Larvas

24 – 48 horas
Temperatura ambiente

Agregar Formalina 10%

Extraer las larvas y
observar al microscópio
 MÉTODOS DE CONCENTRACIÓN

 Técnica de Cultivo en placa de Agar:

 MÉTODOS ESPECIALES

 Técnica de Graham:
-Diagnóstico de Enterobius vermicularis.
-Helminto cuya hembra coloca los huevos a nivel de la
región perianal, en materia fecal muy rara vez se observan.
 MÉTODOS ESPECIALES

 Técnica de Graham:
- El procedimiento más eficaz para identificar los huevos es el uso de
la cinta engomada en contacto perianal, conocida como técnica de
Graham.
- Dado que es durante la madrugada que las hembras de E.
vermicularis efectúan la oviposición, es en ese momento que el
paciente presenta mayor cantidad de huevos del parásito; por esta
razón se recomienda que el enfermo sea examinado antes de bañarse
por la mañana, con objeto de aumentar la probabilidad de encontrar los
huevos.
- La técnica consiste en preparar una cinta de celofán engomada,
“diurex” o cinta adhesiva la cual se coloca en un abatelenguas de tal
forma que la parte pegajosa quede hacia afuera y sujetada con los
dedos pulgar e índice.
- Enseguida el abatelenguas se pone en contacto con el ano del
paciente; luego, la cinta se separa del abatelenguas y se coloca sobre
un portaobjetos de manera que la parte engomada se adhiera a éste.
El portaobjetos se observa bajo el microscopio sin teñir y sin
cubreobjetos.
 MÉTODOS ESPECIALES

 Técnica de Graham:

A B

A) Colocación de la cinta engomada para realizar la técnica de Graham.

B) Contacto perianal del abatelenguas para la técnica de Graham.

 MÉTODOS ESPECIALES

 Técnica de Graham:
 MÉTODOS ESPECIALES

 Preservación de muestras fecales:

Sustancias preservantes
- Alcohol polivinílico
-Dicromato de potasio 2% y al 5%
-Formol o Formalina 10%
-MIF (Merthiolate-Yodo-Formaldehido)
 MÉTODOS ESPECIALES

 Concentrado de Heces:
-Alternativa para el estudio seriado de muestras de heces.
-Aumenta la sensibilidad al aumentar el número de
muestras observadas, en intervalos de tiempo distintos (3
días diferentes).
 COLORACIONES

 Identificación de organismos

 Confirmación de diagnóstico

 Investigación y Docencia
 COLORACIONES

Coloraciones supravitales:
-Solución salina al 0,85% + Eosina.
-Solución de Lugol (Permite colorear las estructuras
internas de las formas parasitarias).
-Azul de lactofenol.
-Azul de metileno.
-Otras.
COLORACIONES

SSF LUGOL
 COLORACIONES

Coloraciones permanentes:
-Giemsa.
-Kinyoun.
-Tricrómica.
-Tricrómica de Weber.
-Azul de metileno con su variedad permanente.
 COLORACIONES

Coloraciones permanentes:
 COLORACIONES

Coloraciones permanentes:
-Hematoxilina férrica (Coloración ideal para el estudio de
las amibas, pues hace resaltar la morfología nuclear,
característica importante para la clasificación de género y
especie).
-Gomori-Grocot.
-O-Toluidina.
-Otras.
COLORACIONES
 COLORACIÓN DE KINYOUN

-Diagnóstico de Coccidios intestinales.

-Hoy día necesaria para complementar el

diagnóstico de cuadros diarreicos tanto agudos
como crónicos.
 COLORACIÓN DE KINYOUN

 Procedimiento:
• En una lámina limpia y desengrasada realizar un extendido
de la muestra de heces. Se deja secar.
• Fijar con Metanol, durante 10-15 minutos una vez que este
seco.
• Cubrir con Carbol-fucsina durante 20 minutos.
• Lavar con agua de chorro varias veces.
• Decolorar con Alcohol Ácido hasta que el frotis quede
transparente.
• Cubrir con Azul de Metileno durante 3 a 5 minutos.
• Lavar con agua corriente y dejar secar.
• Observar al microscopio con objetivo de 40X y con objetivo
de inmersión 100X.
COLORACIÓN DE KINYOUN
 MÉTODOS DIAGNÓSTICOS

• Métodos inmunológicos
– Inmunofluorescencia
– ELISA
– Quimioluminiscencia
– Aglutinación en látex
– Precipitación
MÉTODOS DIAGNÓSTICOS
 MÉTODOS DIAGNÓSTICOS

– BIOLOGÍA MOLECULAR
EN RESUMEN…

Diagnóstico parasitológico

Parásito Paciente Técnica

Enfermedad