Laboratorio de Microbiologia UNFV

PRESENCIA DE MICROORGANISMOS EN EL MEDIO
AMBIENTE
I.1. FUNDAMENTO:
AGAR NUTRITIVO
El Agar nutritivo es un medio de cultivo usado normalmente como rutina
para todo tipo de bacteria. Es muy útil porque permanece solido incluso a
relativas altas temperaturas. Además, el crecimiento bacteriano en este
agar lo hace en la superficie, por lo que se distinguen mejor las colonias
pequeñas.
AGAR SANGRE
Es adecuada para aislar y cultivar diferentes microorganismos de difícil
crecimiento (Kingella kingae, Cardiobacterium hominis). Al añadir sangre
descubrimos la actividad hemolítica y como aísla bacilos tuberculosos.
También puede usarse para la preparación de antígenos
CARACTERÍSTICAS DE LAS COLONIAS Y REACCIONES DE

HEMÓLISIS.
 Hemólisis alfa: Lisis parcial de los glóbulos rojos. Se observa un

halo de color verdoso alrededor de la colonia en estudio. Es debido a
la oxidación de la hemoglobina a metahemoglobina (compuesto de
color verdoso) por el peróxido de hidrógeno generado por los
microorganismos.
 Hemólisis beta: lisis total de los glóbulos rojos. Se observa un halo

claro, brillante alrededor de la colonia en estudio.
 Hemólisis gamma: ausencia de lisis de los glóbulos rojos. El medio

de cultivo no presenta modificaciones de color y aspecto alrededor
de la colonia en estudio.
I.2. RESULTADOS
PRÁCTICA DE MICROBIOLOGÍA MÉDICA - UNFV
AGAR NUTRITIVO
AGAR SANGRE
EXPERIMENTO N°2:
TÉCNICAS DE AISLAMIENTO DE MICROOGANISMOS
2.1 FUNDAMENTO
SIEMBRA
Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porción de muestra
(inóculo) en un medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano, para
su desarrollo y multiplicación. Una vez sembrado, el medio de cultivo se incuba
a una temperatura adecuada para el crecimiento.
TÉCNICAS DE SIEMBRA
a) SIEMBRA POR ESTRIA: Tomar una muestra con el asa de siembra y

sembrar en ZIGZAG en el tubo de agar sólido inclinando empezando por la
superficie más profunda del medio.
b) SIEMBRA POR PUNTURA: Con una aguja de platino, tomar una pequeña
cantidad de una colonia sembrar en el agar semisólido ó sólido introduciendo la
aguja en forma vertical.
c) SIEMBRA POR INOCULACIÓN: Con una asa de siembra, previamente

esterilizada a la llama, tomar una cantidad suficiente de inoculo o muestra e
introducirla hasta el fondo del tubo líquido, sin tocar las paredes del mismo.
Flamear la boca del tubo antes y después de la siembra para evitar
contaminaciones. Rotular e incubar.
d) SIEMBRA POR DISPERSIÓN AGOTAMIENTO: Tomar una asada de

muestra y colocarla en un extremo del medio sólido, realizar movimientos del
ZIG ZAG hacia el centro de la placa. Luego girar la placa 60° y hacer el mismo
procedimiento, tomando solo una vez la asada de la muestra. Finalidad:
obtener colonias aisladas.
CULTIVO MIXTO: cultivo en laboratorio que contiene dos o más cepas de

organismos.
2.2. RESULTADOS
PLACA PETRI ESTÉRIL CON AGAR NUTRITIVO

PLACA PETRI NO ESTÉRIL CON AGAR NUTRITIVO

TUBOS DE CALDO NUTRITIVO

EXPERIMENTO N°3
CULTIVO DE ORGANISMOS ANAEROBIOS
3.1. FUNDAMENTO
AGAR INCLINADO
El agar es una sustancia similar a la gelatina que se extrae de las algas rojas,
es usado comúnmente para cultivar microorganismos. Se le agregan varios
nutrientes para favorecer el crecimiento bacteriano y se coloca tanto en placas

planas como en tubos de ensayo. Cuando se coloca en un tubo de ensayo, el
agar está en forma líquida. Estos luego son colocados en ángulo para que se
enfríen y solidifiquen, creando una superficie inclinada, o un agar inclinado.
La superficie inclinada del agar les da a las bacterias una mayor superficie
donde pueden crecer dentro del tubo de ensayo. Más aún, los medios de agar
inclinado se colocan en tubos que pueden ser tapados, lo que minimiza la
pérdida de agua. Esto es importante debido al alto contenido de humedad de

los medios de agar.
Los medios de agar inclinado pueden usarse para cultivar e identificar células
bacterianas. Es difícil intentar identificar bacterias desde una muestra grande,
ya que éstas son pequeñas y pueden ser difíciles de encontrar. Sin embargo,
cuando se colocan sobre un agar inclinado, las células bacterianas se dividirán
rápidamente y en varias horas habrán producido suficientes células que
pueden ser examinadas bajo el microscopio. También esta forma de agar es útil
para el mantenimiento de los cultivos bacterianos, mejor que apilar placas de
Petri. Se pueden colocar fácilmente muchos cultivos en tubos de ensayo y
luego ubicarlos en gradillas para guardarlos en el refrigerador.
CALDO DE TIOGLICOLATO
Las sustancias reductoras como tioglicolato de sodio y cisteína proporcionan

una anaerobiosis suficiente y debido a los grupos -SH- de estos compuestos,
se neutralizan los efectos bacteriostáticos de los derivados mercuriales,
arsenicales y de otros metales pesados. La presencia de una baja cantidad de
agar, retarda la dispersión de CO2 y O2.
3.2. RESULTADOS
EXPERIMENTO N°1:
TINCIÓN SIMPLE
1.1. FUNDAMENTO
La tinción simple se basa en la afinidad del colorante por los componentes
celulares. La tinción puede ser uniforme o presentar algunos gránulos en su
interior. Utiliza un solo colorante (violeta de genciana, azul de metileno, fuscina
diluida).La tinción simple se utiliza para destacar el microorganismo completo
para que se vean las formas y las estructuras celulares básicas. En las
tinciones simples se usa un único reactivo, que preferentemente es de tipo
básico y contiene un cromógeno (compuesto que da color al tinte) con carga
positiva, ya que la pared celular de las bacterias posee componentes con carga
negativa que atraen y enlazan el cromógeno. Se utilizan solamente para
incrementar el contraste; todas las células absorberán el colorante y quedarán
teñidas del mismo color. Por tanto, la tinción simple mejora la observación de la
célula completa. Se fija el espécimen, se añade el colorante y se deja el tiempo

adecuado para que se absorba, se retira el exceso de colorante y la
preparación ya está lista para ser observada. Si se utiliza un mordiente
(sustancia química utilizada para intensificar la coloración), hay que añadirlo
justo antes del colorante.
1.2. RESULTADO
EXPERIMENTO N° 2
TINCIÓN DIFERENCIAL
2.1. FUNDAMENTO
COLORACIÓN GRAM
El cristal violeta (colorante catiónico) penetra en todas las células bacterianas
(tanto Gram positivas como Gram negativas) a través de la pared bacteriana. El
lugol es un compuesto formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de
potasio) y Sl (Siulterio), los cuales están presente para solubilizar el yodo, y
actúan de mordiente, haciendo que el cristal violeta se fije con mayor
intensidad a la pared de la célula bacteriana. El I2 entra en las células y forma

un complejo insoluble en solución acuosa con el cristal violeta..
La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la

decoloración, ya que en la misma es soluble el complejo I2/cristal violeta. Los
organismos gram positivos no se decoloran, mientras que los gram negativos sí
lo hacen.
Para poner de manifiesto las células gram negativas se utiliza una coloración
de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o
la fucsina. Después de la coloración de contraste las células gram negativas
son rojas, mientras que las gram positivas permanecen violetas.
La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la técnica. Sirve para

hacer una tinción de contraste que pone de manifiesto las bacterias gram
negativas. Al término del protocolo, las gram positivas se verán azul-violáceas y
las gram negativas, se verán rosas (si no se hizo la tinción de contraste) o rojas
(si se usó, por ejemplo, safranina).
TINCIÓN DE ZIEHL-NEELSEN
Es una técnica de tinción diferencial rápida y económica, usada para la

identificación de bacterias ácido-alcohol resistentes (BAAR), como M.
tuberculosis o el Phylum Apicomplexa (coccidios intestinales) entre otros.
Las paredes celulares de ciertas bacterias contienen ácidos grasos (ácidos
micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la
propiedad de resistir la decoloracíón con alcohol-ácido, después de la tinción
con colorantes básicos. Por esto se denominan ácido-alcohol resistente. Las
micobacterias como Mycobacterium tuberculosis y M. marinum se caracterizan

por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia. La coloración clásica de
Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared
bacteriana que contiene ceras. Al suspender el calentamiento y enfriar con
agua, provoca una nueva solidificación de lo ácidos grasos de modo que el
colorante ya no puede salir de las bacterias. Por otro lado, el calentamiento
aumenta la energía cinética de las moléculas del colorante lo cual también
facilita su entrada a las bacterias. Las bacterias que resisten la decoloración

son de color rojo y las que no, se ven de color azul ya que se utiliza azul de
metileno como tinción de contraste.
2.2. RESULTADO
EXPERIMENTO N° 3:
DEMOSTRACIÓN DE GRÁNULOS METACRÓMATICOS
3.1. FUNDAMENTO
Los gránulos metacromáticos conocidos como volutina son materiales de

reserva de polifosfato se distribuyen el citoplasma preferentemente en el
extremo del bácilo. Se denomina gránulos metacromáticos por el efecto de

cambio de color que presentan ante la presencia de un colorante básico.
CULTIVO DE CORYNOBACTERIUM
Crecen principalmente en agar sangre formando pequeñas colonias
COLORANTE ALBERT
Es una técnica de tinción que se utiliza para la identificación del genero

corynobacterium ya que mediante esta tinción se puede observar los gránulos
metacromáticos característico de esta especie. Esta constituida por verde
malaquita, un colorante básico que tiñe débilmente a la bacteria pero que tiene
fuerte afinidad por los gránulos metacromáticos.
SOLUCIÓN YODADA DE LUGOL

Es necesario para formar el complejo colorante – yodo de las bacterias gram

positivas. Actúan como una mordiente haciendo que el colorante se fije con
mayor intensidad a la bacteria.
3.2. RESULTADO
EXPERIMENTO N°4
TINCIÓN NEGATIVA
4.1 FUNDAMENTO
La tinción negativa es el reverso del procedimiento de tinción usual: las células
se dejan sin teñir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se
ve, por tanto, es el perfil de las células. La sustancia utilizada para la tinción
negativa es un material opaco que no tiene afinidad por los constituyentes
celulares y que simplemente rodea las células, tal como la tinta china (que es
una suspensión de partículas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante
negro insoluble en agua). La tinción negativa es un modo satisfactorio de
aumentar el contraste de las células en la microscopia óptica, pero su máxima
utilidad está en revelar la presencia de cápsulas alrededor de las células
bacterianas.
4.2. RESULTADO
BIBLIOGRAFIA
https://es.scribd.com/doc/80998594/Tincion-Simple
https://sites.google.com/a/goumh.umh.es/practicas-de-
microbiologia/indice/identificacion-bacteriana/capacidad-hemolitica
https://books.google.com.pe/books?
id=q1gALTKvynsC&pg=PA29&lpg=PA29&dq=practica+de+microbiologia+e
nzimas+bacterias+:+hemolisinas&source=bl&ots=Uf-
yYlgdog&sig=xItu77rtpZfBQTSoWo2qgUSKhNg&hl=es&sa=X&ved=0ahUK
Ewj3rNS5muHaAhWql-
AKHQd9BWU4ChDoAQg3MAM#v=onepage&q=practica%20de
%20microbiologia%20enzimas%20bacterias%20%3A
%20hemolisinas&f=false
EXPERIMENTO N° 1:
HIDROLISIS DEL ALMIDÓN
1.1. FUNDAMENTO
La molécula del almidón es muy compleja y para su asimilación por las

bacterias, estas deben descomponerla (hidrolizarla) en sustancias más simples
y fácilmente asimilables. Un gran número de bacterias son capaces de elaborar

una enzima amilasa que hidroliza el almidón con formación de maltosa. La
maltosa puede ingresar a la célula para ser utilizada. La enzima amilasa es
también una enzima extracelular, por lo tanto la demostración de la hidrólisis
del almidón puede hacerse tanto en medio líquido como en medio sólido.
En el medio sólido( sobre las placas) al agregar la solución de lugol ,se formará
un color azul si no hubo hidrólisis; la aparición de una zona clara alrededor de
las colonias significa la hidrólisis del almidón.
Cuando la bacteria no hidroliza el almidón todo el medio permanece azul. Para

evidenciar la formación ácido será necesario agregar un indicador apropiado al
medio de cultivo. La hidrólisis del almidón puede ser evidenciada en ausencia
de bacterias, ya que la amilasa es una enzima extracelular. Para el efecto un

filtro libre de gérmenes se agrega una solución del almidón al 0.2%, se incuba
por 24 horas a 37°C. Adicionar la solución de lugol y comprobar los resultados
anteriores.
1.2. RESULTADOS
EXPERIMENTO N° 2:
HIDROLISIS DE LA GELATINA
2.1. FUNDAMENTO
Ciertas bacterias elaboran una enzima extracelular que tiene la propiedad de

hidrolizar la gelatina, esta enzima es conocida como Gelatinasa. La presencia
de gelatinasa puede ser demostrada inoculando un cultivo bacteriano en un
medio conteniendo gelatina.
La prueba se realiza a temperatura a la cual la gelatina se mantenga en estado
sólido por si misma (por ejemplo a 37°C de temperatura)
La presencia de líquido significa que la gelatina ha sido hidrolizada

(liquefactada). Por el contrario, si el medio permanece sólido es señal de que la
bacteria no posee la enzima gelatinasa.
2.2. RESULTADOS
EXPERIMENTO N° 3:
PRODUCCCIÓN DE HEMOLISINAS
3.1. FUNDAMENTO
Muchos microorganismos son capaces de crecer en agar sangre y cuando lo

hacen responden de diferente manera según realicen o no la lisis de los
glóbulos rojos (hemólisis) producida por la acción de una enzima llamada
hemolisina
Podemos diferenciar tres tipos de hemólisis:
Hemólisis alfa: es una hemólisis parcial y la zona de crecimiento aparece
rodeada de un halo de color verdoso.
Hemólisis beta: en este caso la hemólisis es total y el halo que rodea a las
colonias es totalmente transparente.
Hemólisis gamma (no hemólisis): el microorganismo en cuestión no es capaz
de realizar la hemólisis y por tanto no existe halo alrededor de la colonia.
3.2. RESULTADO
EXPERIMENTO N°4 :
DEMOSTRACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE LA COAGULASA

4.1 FUNDAMENTO
La coagulasa es una enzima que coagula el plasma oxalatado o citratado en
presencia de un factor contenido en muchos sueros. Este factor sérico
reacciona con la coagulasa para generar esterasa como actividades de
coagulación, de una manera semejante a la activación de la Protrombina hasta
Trombina.
• Se realiza para comprobar la facultad de la bacteria de coagular el plasma por

acción de la enzima coagulasa, la cual aumenta la velocidad de coagulación
del plasma. El resultado final es la formación de un coágulo de fibrina.
– Prueba en lámina (detecta factor de aglutinación o coagulasa ligada).
– Prueba en tubo (detecta coagulasa libre y ligada).
• La prueba de coagulasa en tubo es definitiva, y la prueba de coagulasa en
lámina puede ser usada como una técnica de tamizaje rápida para la
identificación de S. aureus. Todas las pruebas negativas en lámina deben

repetirse utilizando la técnica en tubo.
4.2 RESULTADOS
EXPERIMENTO N° 5
FERMENTACIÓN DE CARBOHIDRATOS
5.1 FUNDAMENTO
Este medio se utiliza para determinar la capacidad de los bacilos

gramnegativos para fermentar lactosa, sacarosa y glucosa, así como para
determinar su capacidad de producir H2S (ácido sulfhídrico).
Fermentación de los Carbohidratos:
El medio contiene dos cámaras de reacción, en la parte inclinada se fermenta
la sacarosa y la lactosa y en la parte profunda se fermenta la glucosa. Se
puede fermentar los 3 carbohidratos o uno de ellos depende de la bacteria que

se estudie.
Producción de Sulfuro de Hidrógeno:
Si la bacteria tiene la enzima tiosulfatasa, reacciona con el tiosulfato de Na
como una fuente de azufre para la producción del sulfuro de hidrógeno, el cual
es incoloro, pero al reaccionar con sales de hierro, en este caso citrato férrico,
se produce un precipitado de color negro. Para que esto ocurra debe haber un
pH ácido, lo cual se consigue con la fermentación de la glucosa.
Producción de Gas:
El primer paso es la fermentación de la glucosa, uno de cuyos productos
terminales es el ácido fórmico.
Si la bacteria tiene la enzima deshidrogenasa fórmica, el ácido fórmico es
descompuesto en CO2 y H2.
5.2 RESULTADOS
EXPERIMENTO N°6:
REDUCCIÓN DE ACIDO SULHIDRICO

6.1 FUNDAMENTO
La actividad de las bacterias sobre aminoácidos que contienen azufre,

frecuentemente produce liberación de sulfhídrico, lo cual se demuestra
empleando sales de metales pesados como el hierro. El sulfhídrico reacciona
con tales metales dando una coloración oscura al medio de cultivo.
Para detectar la capacidad de producir sulfhídrico, utilizamos también el medio

de TSI , el medio contiene tiosulfato de sodio como sustrato necesario para la
producción de sulfhídrico, citrato de hierro y amonio como fuente de iones de
Fe+3 que se combinan con el ácido sulfhídrico y producen sulfuro de hierro que
se observa como un precipitado en el medio de color negro.
6.2 RESULTADO
EXPERIMENTO N°7
DEMOSTRACIÓN DE PRODUCCIÓN DE INDOL

7.1. FUNDAMENTO
El indol es un compuesto que se genera mediante la desaminación reductiva

del triptófano y esta reacción es llevada a cabo por algunas bacterias que
poseen las enzimas denominadas en su conjunto triptofanasas. Para detectar
la producción de indol se utiliza el medio Caldo triptófano y la lectura de la
prueba se realiza con el reactivo de Kovacs (alcohol isoamilo, p-
dimetilaminobenzaldehído y ácido clorhídrico

concentrado) con el que el indol producido
reacciona generando una coloración rosa
intensa.
7.2. RESULTADO
EXPERIMENTO N°8:
DETECCIÓN DE CATALASA
8.1 FUNDAMENTO
Pone de manifiesto la presencia del enzima catalasa en una bacteria. Esta

enzima es capaz de descomponer el peróxido de hidrógeno (agua oxigenada)
en agua y oxígeno, con la consiguiente aparición de burbujas.
Catalasa positivo: se produce la aparición de burbujas que corresponde a la

liberación de oxígeno, lo que indica que la bacteria tiene el enzima catalasa.
Catalasa negativo: no se producen burbujas por tanto la bacteria no posee
dicho enzima.
8.2. RESULTADO
EXPERIMENTO N°9:
REDUCCIÓN DEL AZUL DE METILENO
9.1 FUNDAMENTO
La cadena respiratoria de la bacteria se localiza en la membrana plasmática y

es fácilmente accesible a los aceptores de electrones .si se interrumpe la
oxigenación del cultivo de una bacteria y se incorpora el indicador redox, como
aceptor artificial de electrones, es posible estimar cualitativamente la actividad
metabólica de esa población bacteriana, por el cambio de color del indicador.
Uno de estos aceptores es el azul de metileno, en su forma oxidada de color

azul, pero al recibir electrones ,en este caso ,de componentes de la cadena
respiratoria bacteriana, se reduce y pasa a su forma incolora.
9.2 RESULTADO
Bibliografía
https://books.google.com.pe/books?
id=vwB0fgirgN0C&pg=PA209&lpg=PA209&dq=reducci
%C3%B3n+del+azul+de+metileno+en+un+caldo+nutritivo&source=bl&ots=xZq
hA1rgvd&sig=4Y8T5If3SkEx53fXwqgzS0AVvAk&hl=qu&sa=X&ved=0ahUKEwi
VttuWuu_aAhVNtVMKHQQNBAoQ6AEIIzAA#v=onepage&q=reducci%C3%B3n
%20del%20azul%20de%20metileno%20en%20un%20caldo
%20nutritivo&f=false
https://sites.google.com/a/goumh.umh.es/practicas-de-
microbiologia/indice/identificacion-bacteriana/capacidad-hemolitica
EXPERIMENTO N°1:
DETERMINACIÓN DE LOS REQUERIMIENTOS MÍNIMOS PARA

EL CRECIMIENTO BACTERIANO
FUNDAMENTO
El estudio de los microorganismos es un trabajo complicado ya que por su
diminuto tamaño no se pueden estudiar de manera individual, en este sentido,
el estudio de los microorganismos involucra el trabajo con poblaciones y para
lograr obtener dichas poblaciones, es indispensable cultivar a nuestros

microorganismos en medios que satisfagan todas sus necesidades
metabólicas; cosa que muchas veces es muy complicado. Con la finalidad de
evaluar estas dificultades, se realizó una práctica para determinar los diferentes
requerimientos nutricionales para ciertas especies bacterianas. En primer lugar
se evaluó la necesidad de una fuente de carbono, luego la capacidad de
crecimiento en medio mínimo y completo, y finalmente se determinó los

requerimientos mínimos de algunos microorganismos
El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de

medios de cultivo. Se licúa completamente a la temperatura del agua hirviendo
y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mínimas excepciones no tiene
efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que
crecen en él.
RESULTADO
EXPERIMENTO N°2:
MEDIOS DE CULTIVO SELECTIVOS Y DIFERENCIALES

FUNDAMENTO
MEDIOS DE CULTIVO
Mezcla de elementos nutrientes que se usan para permitir el crecimiento de los
microorganismos. Se clasifican en base a los siguientes criterios:
a) Estado físico: Sólidos: contiene agar y se puede observar el crecimiento de
colonias Líquidos: no contienen agar, el crecimiento se evidencia por turbidez
Semisólidos: contienen agar diluido, el crecimiento se evidencia por turbidez.
b) Presentación: En placas En tubos

c) Contenido de nutrientes: Medios de enriquecimiento: son aquellos que
contienen nutrientes específicos para favorecer el desarrollo de un
microorganismo en particular. Se usan cuando se sospecha que el
microorganismo buscado está en baja cantidad o mezclado con otras especies.
Medios de apoyo: contienen nutrientes que permiten el crecimiento de la
mayoría de los microorganismos, (siempre que no tengan exigencias
especiales). Ej: agar tripticasa. Medios selectivos: permiten el crecimiento de

los microorganismos buscados porque contienen compuestos que inhiben el
crecimiento de los demás. Por ejemplo la adición de cristal violeta impide el
crecimiento de la mayoría de las bacterias Gram positivas.
Medios diferenciales: contienen componentes que ponen en evidencia
características metabólicas del microorganismo que se está cultivando,
permitiendo así diferenciarlo. Por ejemplo medios adicionados de sangre para

evidenciar la producción de hemolisinas, o adicionados de azúcares.
Medios selectivos /diferenciales: mezcla de los dos anteriores. Estos medios
contienen un compuesto que inhibe el crecimiento de un determinado grupo de
microorganismos y además un componente que pondrá en evidencia alguna
característica metabólica. Ej. Agar Mac Conkey favorece el crecimiento de
bacterias Gram negativas y además diferencia entre aquellas Gram negativas
que fermentan lactosa, (cuyas colonias se observarán fucsia) y las que no lo

hacen (colonias blancas), porque contiene lactosa y un indicador de pH.
Medios especiales: son medios que contienen compuestos y nutrientes
especiales para cubrir las necesidades de cultivo de bacterias bien
determinadas. Estos medios facilitan el aislamiento de dichas bacterias - Para
el aislamiento de Staphylococcus: Medio agar manitol - cloruro de sodio
(Chapman). - Para el aislamiento de Bordetella pertussis: Medio de Bordet-
Gengou. - Para el aislamiento de Mycobacterias; medio de Lowenstein-Jensen.

Medio para bacterias anaeróbicas: en general se pueden usar los medios para
microorganismos aeróbicos, pero adicionándolos con algún compuesto químico
reductor para mantener el ambiente de anaerobiosis, como por ejemplo el
tioglicolato de sodio.
RESULTADOS
EXPERIMENTO N°3:
EVALUACIÓN DE ANTIBIOTICOS POR EL MÉTODO DISCO

DIFUSIÓN
FUNDAMENTO
Antibiograma: son métodos in Vitro que determinan la susceptibilidad de los microorganismos

a una variedad de agentes antimicrobianos, bajo condiciones de laboratorio específica y
estandarizada.
Concentración Mínima Inhibitoria (CIM): Es la menor concentración de una gama de diluciones

de antibiótico que provoca una inhibición de cualquier crecimiento bacteriano visible.
Antibióticos: Son sustancias químicas producidas por organismos vivientes, o sintetizados en el
laboratorio capaces de inhibir en pequeñas cantidades los procesos vitales de

microorganismos, destruyendo e impidiendo su desarrollo y reproducción.
Método de Difusiòn en Disco (Baeur-Kirby)
Es el más difundido.
Prueba la inhibición o resistencia de los microorganismos, enfrentándolos con los

medicamentos que se encuentran impregnados en pequeños discos.
. Medio de cultivo utilizado Mueller Hinton Su reproducibilidad aceptable. Baja concentración

de inhibidores, condición crítica para evaluar sulfonamidas, trimetoprim y tetraciclina. >El
crecimiento satisfactorio de patógenos no exigentes. ya gran experiencia en estudios de
susceptibilidad.
Factores que influyen en el Agar pH: E l rango de pH va de 7,2 a 7,4 . variación de cationes
divalentes: Ca y Mg: Afectan los halos de inhibición para aminoglucósidos y tetraciclinas en
Pseudomonas aeruginosa . Profundidad del Agar : La profundidad recomendada de la capa de
agar es de 3 a 5 mm.
Preparación del Inóculo Se prepara el inóculo con ajuste a la turbidez McFarland 0,5 que
corresponde aun diámetro de1.5 x10 UFC/ML, directo en caldo de colonias frescas en agar no
selectivo.
Inoculación de la placa Con un hisopo estéril en tres direcciones inocule toda la placa (giros de
60°).
Aplicación de sensidiscos separación: los discos deben de estar separados24 mm (del centro de
un sensidisco al otro más cercano). Cantidad: 12 unidades en placas de 150mm y 5 unidades en
placas se 100mm.
Lectura e interpretación de los resultados Categorías de interpretaron: Sensible : El

microorganismo presenta un gran área de inhibición causada por el fármaco. 95% éxito
Intermedio : Se presenta un halo de inhibición mas reducido. Resistente: Presenta muy poco o
casi nada de halo.
Medición de los halos Después de incuba las placas del antibiograma se procederá a la lectura
de este. Se usa una regla y se mide el radio del halo de inhibición partiendo de desde donde
está el disco de antibiótico hasta donde se inhibió el crecimiento. La longitud obtenida después
se compararán con estándares que nos dirán si el medicamento será efectivo o no en el
tratamiento.

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PRESENCIA DE MICROORGANISMOS EN EL MEDIO

CARACTERÍSTICAS DE LAS COLONIAS Y REACCIONES DE

 Hemólisis alfa: Lisis parcial de los glóbulos rojos. Se observa un

 Hemólisis beta: lisis total de los glóbulos rojos. Se observa un halo

 Hemólisis gamma: ausencia de lisis de los glóbulos rojos. El medio

TÉCNICAS DE AISLAMIENTO DE MICROOGANISMOS

a) SIEMBRA POR ESTRIA: Tomar una muestra con el asa de siembra y

c) SIEMBRA POR INOCULACIÓN: Con una asa de siembra, previamente

d) SIEMBRA POR DISPERSIÓN AGOTAMIENTO: Tomar una asada de

CULTIVO MIXTO: cultivo en laboratorio que contiene dos o más cepas de

PLACA PETRI ESTÉRIL CON AGAR NUTRITIVO

PLACA PETRI NO ESTÉRIL CON AGAR NUTRITIVO

TUBOS DE CALDO NUTRITIVO

CULTIVO DE ORGANISMOS ANAEROBIOS

nutrientes para favorecer el crecimiento bacteriano y se coloca tanto en placas

pérdida de agua. Esto es importante debido al alto contenido de humedad de

Las sustancias reductoras como tioglicolato de sodio y cisteína proporcionan

célula completa. Se fija el espécimen, se añade el colorante y se deja el tiempo

intensidad a la pared de la célula bacteriana. El I2 entra en las células y forma

La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la

La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la técnica. Sirve para

Es una técnica de tinción diferencial rápida y económica, usada para la

micobacterias como Mycobacterium tuberculosis y M. marinum se caracterizan

facilita su entrada a las bacterias. Las bacterias que resisten la decoloración

DEMOSTRACIÓN DE GRÁNULOS METACRÓMATICOS

Los gránulos metacromáticos conocidos como volutina son materiales de

extremo del bácilo. Se denomina gránulos metacromáticos por el efecto de

Es una técnica de tinción que se utiliza para la identificación del genero

SOLUCIÓN YODADA DE LUGOL

Es necesario para formar el complejo colorante – yodo de las bacterias gram

HIDROLISIS DEL ALMIDÓN

La molécula del almidón es muy compleja y para su asimilación por las

y fácilmente asimilables. Un gran número de bacterias son capaces de elaborar

Cuando la bacteria no hidroliza el almidón todo el medio permanece azul. Para

de bacterias, ya que la amilasa es una enzima extracelular. Para el efecto un

Ciertas bacterias elaboran una enzima extracelular que tiene la propiedad de

La presencia de líquido significa que la gelatina ha sido hidrolizada

Muchos microorganismos son capaces de crecer en agar sangre y cuando lo

DEMOSTRACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE LA COAGULASA

• Se realiza para comprobar la facultad de la bacteria de coagular el plasma por

identificación de S. aureus. Todas las pruebas negativas en lámina deben

Este medio se utiliza para determinar la capacidad de los bacilos

puede fermentar los 3 carbohidratos o uno de ellos depende de la bacteria que

REDUCCIÓN DE ACIDO SULHIDRICO

La actividad de las bacterias sobre aminoácidos que contienen azufre,

Para detectar la capacidad de producir sulfhídrico, utilizamos también el medio

DEMOSTRACIÓN DE PRODUCCIÓN DE INDOL

El indol es un compuesto que se genera mediante la desaminación reductiva

dimetilaminobenzaldehído y ácido clorhídrico

Pone de manifiesto la presencia del enzima catalasa en una bacteria. Esta

Catalasa positivo: se produce la aparición de burbujas que corresponde a la

REDUCCIÓN DEL AZUL DE METILENO

La cadena respiratoria de la bacteria se localiza en la membrana plasmática y

Uno de estos aceptores es el azul de metileno, en su forma oxidada de color

DETERMINACIÓN DE LOS REQUERIMIENTOS MÍNIMOS PARA

lograr obtener dichas poblaciones, es indispensable cultivar a nuestros

crecimiento en medio mínimo y completo, y finalmente se determinó los

El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de

MEDIOS DE CULTIVO SELECTIVOS Y DIFERENCIALES

b) Presentación: En placas En tubos

especiales). Ej: agar tripticasa. Medios selectivos: permiten el crecimiento de

permitiendo así diferenciarlo. Por ejemplo medios adicionados de sangre para

que fermentan lactosa, (cuyas colonias se observarán fucsia) y las que no lo

Gengou. - Para el aislamiento de Mycobacterias; medio de Lowenstein-Jensen.