UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA

UNIDAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

CARRERA DE MEDICINA

BIOLOGIA MOLECULAR Y
GENETICA
TECNICAS MOLECULARES: “ANALISIS
DE LA HIBRIDACION DE ACIDOS
NUCLEICOS Y SECUECIACION”

BQ.F. FREDDY CASTILLO SOLANO Mgs.

 LAS TECNICAS DE HIBRIDACION PERMITEN
DETECTAR FRAGMENTOS ESPECIFICOS DE DNA O
RNA MENSAJERO
• “La hibridación depende de la capacidad de complementariedad de las
moléculas de DNA y RNA para asociarse específicamente unas con otras
por medio de los pares de bases”.
• Como sabemos las moléculas de DNA de doble cadena pueden
desnaturalizarse en cadenas sencillas por calentamiento en solución salina.
• Si la temperatura baja las cadenas complementarias se re-asociaran
(HIBRIDACION).
• Existen 2 métodos muy sensibles ara detectar una secuencia de DNA o RNA
dentro de una mezcla compleja. Esta técnica combina la ELECTROFORESIS y
LA HIBRIDACION CON UNA SONDA DE DNA que puede estar etiquetada con
un FLUOROFORO, CROMOFORO O ENZIMA, de manera RADIACTIVA
 SOUTHERN BLOT
• Fue desarrollada por Edwin M. Sothern, al que debe su nombre (SOUTHERN
BLOT)
• Es una técnica muy simple y fácil de realizar que detecta fragmentos de
DNA, separados por tamaño mediante electroforesis en gel.
• Se realiza mediante una separación electroforética del DNA con su
transferencia a un soporte solido o FILTRO (NAILON o NITROCELULOSA)
• “Esta técnica ha contribuido de forma notable a aumentar el potencial de la
hibridación como herramienta analítica, constituyendo hoy en día en
BIOQUIMICA CLINICA un método habitual de análisis del DNA extraído de
muestras de sangre, esputos, tejido y células”
 SOUTHERN BLOT
• “LA TECNICA ES CAPAZ DE DETECTAR
UN FRAGMENTO DE RESTRICCION EN
UNA MEZCLA ALTAMENTE COMPLEJA
de FRAGMENTOS PRODUCIDAS POR LA
ESCICION DEL GENOMA HUMANO
CON ENZIMAS DE RESTRICCION”
• Grandes moléculas de DNA de 200 pb
a mas de 20kb pueden ser separadas
por ELECTROFORESIS EN GEL DE
AGAROSA.
• Moléculas mas Pequeñas de DNA de
10 a 1000pb pueden ser separadas en
por ELECTROFORESIS EN GEL DE
POLIACRILAMIDA
 SOUTHERN BLOT
• Cuando el DNA es fragmentado por digestión con enzimas de restricción, la
mezcla de DNA es muy compleja.
• No obstante “ES POSIBLE IDENTIFICAR UN FRAGMENTO PARTICULAR DE DNA
COMO UNA BANDA QUE ES CAPAZ DE HIBRIDAR CON UNA SONDA
ESPECIFICA DE DNA”.
• Los fragmentos de DNA que son complementarios a las sondas se hibridan y
su localización en el filtro puede ser revelada por auto radiografía (para
sondas radio etiquetadas) o por imagen fluorescente
SOUTHERN BLOT
 SOUTHERN BLOT

• La técnica de
Southern blot implica
cinco etapas bien
diferenciadas:
1. SEPARACION
ELECTROFORETICA
2. DESNATURALIZACION
3. TRANSFERENCIA
4. HIBRIDACION
5. DETECCION
SOUTHERN BLOT
 SOUTHERN BLOT
INSENSIBILIDAD ANDROGENICA

• Detección por transferencia Southern de una

DELECIÓN EN EL GEN DEL RECEPTOR
ANDROGÉNICO LIGADO AL X.

• La INSENSIBILIDAD ANDROGÉNICA se presenta

en una persona que genéticamente tiene
cromosomas XY, pero que por anomalías
genéticas es resistente a los andrógenos.

• Tiene una prevalencia de 5/10000.

• Trastorno Recesivo ligado al X (Mutación Xq11-

12).
 PRUEBAS GENETICAS BASADAS EN ANALISIS DE ENZIMAS
DE RESTRICCION: DIAGNOSTICO PRENATAL DE ANEMIA
FALCIFORME

POLIMORFISMO DE UN SOLO NUCLEOTIDO O SNP:

“Variación en una única pareja de nucleótidos en un a
molécula de DNA detectada durante el análisis genómico,
presente en al menos el 1%”.

RFLP “Variación en la longitud de los fragmentos de DNA

generados por endonucleasas de restricción”, estos se
producen por mutaciones que crean o suprimen sitios de
corte para las enzimas de restricción.

Son útiles como marcadores

genéticos!!!
 APLICACIONES: ANALSIS CON
SONDAS DE OLIGONUCLEOTIDOS
ESPECIFICA DE ALELO (ASO)
• “En algunas enfermedades génicas, una misma mutación que afecta a tan
solo uno o ha unos pocos pares de bases es responsable de una proporción
significativa de casos de la enfermedad”.
• Ejemplo: “ANEMIA FALCIFORME”, en la que la modificación de una sola
base convierte un GLUTAMATO EN VALINA EN LA BETA-GLOBINA y la
deleción en el gen que codifica el REGULADOR DE LA CONDUCTANCIA
TRANSMEMBRANA DE LA FIBROSIS QUISTICA (GEN CFTR), da lugar a la
“FIBROSIS QUISTICA”.
• UNA SONDA DE OLIGONUCLEOTIDOS SINTETIZADA PARA CORRESPONDER DE
MANERA PRECISA CON LA SECUENCIA NORMAL DEL DNA DE UN GEN
(Oligonucleotido con especificidad de Alelo, ASO).
• Lo anterior se puede aplicar a una secuencia complementaria Mutante
 PRUEBAS GENETICAS BASADAS SONDAS DE OLIGONUCLEOTIDOS
ESPECIFICAS DE ALELO: DIAGNOSTICO DE FIBROS QUISTICA

La fibrosis quística es un trastorno

autosómico recesivo asociado con un
defecto en la PROTEINA REGULADORA DE
LA CONDUCTANCIA TRANSMEMBRANA DE
LA FIBROSIS QUISTICA (CFTR)

Deleción ΔF508 Aprox. 70% de los casos !!!

 APLICACIONES: ANALSIS CON
SONDAS DE OLIGONUCLEOTIDOS
ESPECIFICA DE ALELO
• “El análisis con sondas ASO permite la identificación
precisa de una determinada secuencia de DNA y
puede distinguir:
1. Entre INDIVIDUOS PORTADORES DE LA SECUENCIA NORMAL
de DNA en ambos cromosomas,
2.PORTADORES DE LA SECUENCIA MUTANTE en ambos
cromosomas,
3.Individuos PORTADORES DE LA SECUENCIA NORMAL EN UN
CROMOSOMA Y DE LA SECUENCIA MUTANTE EN EL OTRO.
 NORTHERN BLOT
• “La transferencia Northern es el método estándar
para determinar el tamaño y la abundancia de un
mRNA derivado de un determinado gen en una
muestra de RNA.”
• El RNA no puede ser cortado con las enzimas de
restricción
• Sin embargo los transcritos son de distinta longitud
dependiendo del tamaño y numero de exones
existentes en los distintos genes.
• El RNA celular total obtenido de un determinado tipo
celular se separa según su tamaño mediante
electroforesis en gel de agarosa.
• Puede ser necesaria su desnaturalización (Por
ejemplo: con Formaldehido) antes de la
electroforesis.
• Permite comparar cantidades de un mRNA particular
en células bajo diferentes condiciones.
NORTHERN BLOT
SOUTHERN,NORTHERN Y
WESTERN BLOT
 SECUENCIACION
• La técnica mas usada para el análisis de
secuencias de DNA es la secuenciación
SANGER
• El método de la secuenciación de SANGER
aprovecha ciertos análogos químicos de los
4 nucleótidos conocidos como
DIDEOXINUCLEOTIDOS (ddA, ddC, ddG y
ddT), debido a que carecen de un grupo
hidroxilo 3´ terminal en su desoxirribosa.
• “Si se incorporan en una cadena creciente
de DNA, los nucleótidos dideoxi no permiten
que la enzima DNA polimerasa se una a la
siguiente base complementaria al DNA
molde original que esta siendo secuenciada,
interrumpiendo asi la CADENA DE DNA en
formación”
SECUENCIACION
SECUENCIACION
SECUENCIACION
SECUECIACION: AUTOMATIZACION
• “Un viernes por la noche conducía, como era mi costumbre, desde Berkeley
hasta Mendocino, donde tenía una cabaña lejos de todo en el bosque. Mi
novia, Jennifer Barnett, estaba dormida. Yo estaba pensando. Dado que los
oligonucleótidos ya no eran tan difíciles de fabricar, ¿no sería lo
suficientemente simple como para poner dos de ellos en la reacción en
lugar de uno solo de forma tal que uno de ellos se uniera al filamento
superior y el otro al filamento inferior con sus tres primeros extremos
adyacentes a las bases opuestas del par de bases en cuestión”

• -Kary Mullis, Premio Nobel de Quimica, 1993