Técnicas de Diagnóstico Genético

61.2
 ¿Qué tipo de
¿Para qué sirve? (tipo ¿Qué tipo de
Nombre de alteraciones/mut Explique brevemente la metodología con Explique brevemente
de alteración/mutación alteraciones/mutacio
la técnica que detecta)
aciones no la que trabaja cómo se interpreta:
nes puede detectar?
podrá detectar?

Hibridación La hibridación genómica La utilización del microarray Será incapaz de Esta técnica utiliza dos muestras de ADN, la muestra de Si hay la misma cantidad de
genómica comparativa de matrices cromosómico o CMA está detectar alteraciones control y la muestra que deseamos evaluar, se aísla el ADN en ambas muestras (no
comparativa (HCG) es un método para que tengan balance ADN de ambas muestras y se desnaturalizan sus hay variación en la cantidad de
recomendada por las
medir el contenido relativo en su material material genético):
distintas guías cadenas, posteriormente se marcan las muestran con un
fluorescencia amarilla.
de dos muestras de ADN internacionales como genético, osea que fluorocromo de distinto color, y se mezclan las cadenas Si hay más ADN en la muestra
genómico utilizando no exista una para que hibriden.
primera línea diagnóstica en problema que en la muestra de
micromatrices e hibridación pérdida o ganancia. referencia (ganancia):
pacientes con retraso
de ácidos nucleicos. Esta Después de marcar las muestras con fluorescencia, se fluorescencia roja.
técnica es invaluable para madurativo/ discapacidad
agregan a un portaobjetos de vidrio con distintos espacios Si hay más ADN en la muestra
identificar diferencias en el intelectual, trastorno del de referencia que en la
que contienen “sondas” o oligonucleótidos
número de copias de ADN espectro autista y/o complementarios, que varían desde áreas de interés muestra problema (pérdida de
de partes del genoma múltiples anomalías (25-85 pares de bases), hasta clones genómicos (80,000 material genético):
(variaciones del número de congénitas fluorescencia verde
- 200,000 pares de bases).
copias) entre dos especies,
entre dos individuos o entre En general detecta Tras la hibridación, en función de la fluorescencia de cada
diferentes tejidos en un microduplicaciones o una de las moléculas de ADN resultantes, podremos
sujeto. Con el objetivo de microdeleciones determinar para cada fragmento si existe alguna
detectar anomalías que no son posibles de diferencia en el número de copias de la muestra que
cromosómicas, asociadas a detectar con el cariotipo queremos analizar.
desórdenes genéticos convencional.
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Nombre ¿Qué tipo de
(tipo de alteraciones/mut Explique brevemente la Explique brevemente cómo se
de la alteraciones/mutacione
alteración/mutación que aciones puede metodología con la que trabaja interpreta:
técnica detecta)
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detectar?

Cariotipo Es la organización de Anomalías Esta prueba no nos permite Las células generalmente se obtienen Se tiene que examinar el tamaño, la
los cromosomas de estructurales: ver si un individuo presenta de la sangre, líquido amniótico o forma y realizar un conteo de los
alteraciones genéticas vellosidades coriales si se realiza el cromosomas presentes en un número
una especie, célula, - Deleciones
“pequeñas” como las estudio a un feto. específico de células.
órgano, tumor etc., - Translocaciones mutaciones puntuales o Después se hace un cultivo de estas También se analiza cada cromosoma
permite conocer el equilibradas o duplicaciones/deleciones de células hasta que el cultivo celular ha homólogo.
número y la estructura desequilibradas unos pocos pares de bases. producido un suficiente número de Después se identifica el número de
de los cromosomas; -Duplicaciones ● no detecta alteraciones células en división, para esto se utilizan cromosomas y su estructura para
permite el diagnóstico - Inversiones pequeñas menores a factores de crecimiento para estimular identificar anomalías que nos puedan
3Mb. la mitosis, después se añade colchicina dar indicios de alguna enfermedad
de síndromes y Anomalias
para que se detenga la mitosis y no se cromosómica.
patologías que numéricas: llegue hasta la metafase. Después se
implican - Monosomías somete a las células a un choque
anormalidades dentro -Trisomías hipotónico mediante el cual
de los cromosomas, -Triploidía conseguimos que la célula aumente su
que pueden causar o -Tetraploidía volumen sin romperse para facilitar la
visualización de los cromosomas, por
no fenotipos
último se realiza una fijación celular
determinados. donde se fija los cromosomas para
poder visualizar la eucromatina y
heterocromatina.
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¿Qué tipo de Explique brevemente la
Nombre de (tipo de alteraciones/mutacio Explique brevemente cómo
alteraciones/mutacio metodología con la que
la técnica alteración/mutación nes no podrá se interpreta:
que detecta)
nes puede detectar? trabaja
detectar?
PCR-RFLP Reconocimiento de Detecta Principalmente: No detecta: Esta técnica utiliza a las Utiliza endonucleasas de restricción,
mutaciones puntuales, -Deleciones -Sólo se pueden amplificar 6 endonucleasas de restricción de las cuales esciden enlaces
deleciones o inserciones -Duplicaciones genes a la vez. origen bacteriano, las cuales tienen la fosfodiéster de una molécula de ADN
pequeñas previamente -Inserciones -Tienes que saber la capacidad de escindir los enlaces de doble cadena al reconocer una
identificadas en una secuencia del gen que fosfodiéster de una molécula de DNA secuencia palindrómica específica de
secuencia de DNA. deseas amplificar. de doble cadena al reconocer una 6-8 nts (se lee igual de derecha a
secuencia palindrómica específica de izquierda y viceversa)
entre 6 a 8 nucleótidos de longitud. Se utiliza una electroforesis donde se
Existe una gran variedad de enzimas ponen MPM (marcadores de peso
de restricción y cada una reconoce moleculares que conocen el tamaño
una secuencia blanco específica para de los fragmentos), un control y el
generar el corte. El sitio de restricción paciente y se compara cuantas rayas
puede estar presente o ausente en la hay (las rayas representan
secuencia de DNA normal o bien una secuencia de pb).
generarse o perderse por la presencia
de una mutación, lo que determina el *Es importante conocer el patrón de
patrón de restricción de los RFLP. restricción o corte presente tanto en la
secuencia normal, como en la mutada
para la interpretación de los genotipos
con base a los RFLP resultantes.
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de alteración/mutación que utaciones mutaciones
la técnica detecta)
que trabaja cómo se interpreta:
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detectar? detectar?

Test de Para detectar la metilación de
Metilación citosinas, la cual es una
Mediante modificación del ADN
PCR asociada a generalmente a
un silenciamiento
transcripcional; Puede
detectar el estado de
metilación de cualquier grupo
de sitios CpG dentro de una
isla CpG, su sensibilidad le
permite detectar <0.1% de
alelos metilados en un locus
específico
Detecta No podría Se requiere de dos sets de primers que son usados Las bandas de control nos
principalmente el detectar, antes de la modificación bisulfito del DNA y que se ayudan a verificar que los
patrón de mutaciones superponen uno o más dinucleotidos de CpG, uno de primers utilizados
metilación de la genomicas como estos primers hibrida y amplifica el ADN metilado ( y cumplieron su propósito,
mientras que las bandas de
región 15q11-13 poliploidía, retiene las citosinas después del tratamiento con
la muestra nos indican si se
en SPW a manera haploidía, bisulfito), mientras que el otro primer es
realizó la amplificación de
de deleciones, aneuploidía, complementario del ADN no metilado (Uracilos en las los alelos metilados y no
imprinting y mixoploidias porciones que antes ocupaban las citosinas); las metilados al solo
disomía reacciones de PCR se realizan de forma independiente amplificarse el alelo metilado
uniparental (DUP). y sus productos se detectan mediante electroforesis en
gel Si existe un patrón anormal
También le de metilación de ADN que
permite detectar Se basa en la capacidad del ADN para modificar su muestra solo la presencia de
metilación de las secuencia de bases cuando se trata con bisulfito, el ADN imprinting por vía
islas CpG en el tratamiento consigue convertir las bases citosinas en materna (se encuentre
altamente metilado) en la
cáncer humano. uracilos; excepto las que se encuentran metiladas,las
región SPW del cromosoma
cuales permanecerán inalteradas. De este modo se
15 confirmaría el
permite diferenciar el ADN que se encuentra metilado diagnóstico.
del que no lo está.
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sirve? (tipo de alteraciones/ ¿Qué tipo de
Nombre de Explique brevemente la metodología Explique brevemente cómo
alteración/muta mutaciones alteraciones/mutaciones
la técnica con la que trabaja se interpreta:
ción que puede no podrá detectar?
detecta) detectar?

Amplificación Utilizado para Detección de Dificultad para detectar Se realiza mediante la extracción del DNA: Como resultado de la electroforesis
de sondas detectar deleciones o mosaicismos, debido a que el 1.- Hibridación (base con base): Análisis de se obtiene una serie de picos que
dependiente cambios en el duplicaciones resultado de las células diferentes regiones de DNA se ordenan según el tamaño de las
de ligandos número de génicas normales puede enmascarar el 2.- Ligación (unión de las bases): Ligación sondas, donde la intensidad de
múltiples cortes grandes, resultado de las anormales, ya mediante una ligasa termoestable, las dos partes cada pico va a representar la
genómicos, su identificar que el resultado del MLPA de la sonda deben haberse unido al ADN cantidad de ADN que se ha
aplicación es la alteraciones procede de la media de todas correcto para que se puedan ligar y pase a ser amplificado, la cuál será
detección de epigenéticas y las células de las cuáles se funcional. proporcional con la cantidad de
deleciones y cuantificar de haya extraído el ADN. 3.- Amplificación (PCR): Participa la ADN ADN que hay en la muestra.este
duplicaciones en manera parcial polimerasa, los dNTPs y los primers resultado se debe comparar con
distintas partes el transcriptoma (universales) para amplificar las sondas. El controles, en esta comparación se
del ADN primer forward está marcado con fluorescencia podrá observar deleciones (picos
lo que permite ver el resultado de la PCR más bajos) o duplicaciones (picos
mediante la electroforesis capilar. más altos)en este caso tenemos
4.- Electroforesis capilar: Se obtiene una serie una deleción de los exones 46-50
de picos que se ordenan según el tamaño de las del gen DMD
sondas , donde la intensidad de cada pico va a
representar la cantidad de ADN que se ha
amplificado.

¿Para qué sirve? (tipo
Nombre de
de alteración/ mutación
la técnica que detecta)
Secuenciación Secuenciación diagnóstica de
por método de un único gen. Pruebas de una
Sanger variante de secuencia familiar
(Caso 7) específica (pruebas genéticas
predictivas en parientes de
riesgo, pruebas de portador
para los padres, cuando un
hijo tiene un trastorno
autosómico recesivo, pruebas
prenatales de variantes
familiares conocidas; y análisis
de segregación, para ayudar a
interpretar la patogenicidad de
una variante). Para confirmar
variantes identificadas
mediante secuenciación de
nueva generación.
¿Qué tipo de ¿Qué tipo de
alteraciones/ alteraciones/
Explique brevemente la metodología Explique brevemente cómo se
mutaciones mutaciones
con la que trabaja interpreta:
puede no podrá
detectar? detectar?
Detecta diversos Puede no detectar ● Amplificación del ADN (mediante una PCR). En el cromatograma se leen las bases en
tipos de variantes: mosaicismos. ● Preparación de la muestra: añadir el ADN orden de izquierda a derecha y de arriba
● Silenciosa amplificado a las 4 reacciones independientes abajo. Este orden corresponde del extremo 5'
● Con cambio que se van a preparar, cada una con: 1 ADN del ADN secuenciado al extremo 3'. Hay qué
de sentido polimerasa, 1 primer, 1 nucleótido marcado, el tener en cuenta características clave sobre
● Sin sentido resto de los nucleótidos no marcados y 1 un cromatograma “ideal”:
● “Truncating” dideoxinucleótido. ● Debe tener picos espaciados
● Deleciones ● Acción de la ADN polimerasa: propicia síntesis de uniformemente, cada uno con un solo
● Inserciones nuevas cadenas de DNA, se aumenta la color.
● “Splicing” temperatura de las reacciones. Provocando ● La altura de los picos debe estar
separación de las 2 cadenas del DNA. Se deja dentro de un orden de magnitud
enfriar para favorecer la unión de los primers. La similar. Los picos grandes no deben
DNA polimerasa añade los nucleótidos marcados superar en más de 3 veces la altura
hasta que se inserte un dideoxinucleótido. de los picos pequeños.
● Electroforesis capilar: se separan los fragmentos, ● Los picos de ruido de la línea de
de la cual se obtienen cadenas de ADN de base deben ser mínimos e,
diferentes tamaños y que tienen en el último idealmente, no existir en absoluto.
nucleótido una marca fluorescente. Permiten ● El “automatic base-caller” asigna una
ordenar las secuencias de nucleótidos de los base a cada pico basándose en el
fragmentos de ADN desde el más pequeño hasta color de la fluorescencia que se
el más grande. emitió durante la ejecución de la
● Cromatograma secuenciación.
Nombre ¿Para qué sirve? ¿Qué tipo de ¿Qué tipo de
(tipo de Explique brevemente la Explique brevemente cómo
de la alteraciones/mutaciones alteraciones/mutacion
alteración/mutación metodología con la que trabaja se interpreta:
técnica que detecta)
puede detectar? es no podrá detectar?

FISH Sirve para la detección, Microdeleción: pérdida de bases Se debe de saber que se Técnica de diagnóstico genético que Se crean cadenas de ADN
Hibridació visualización y sobre nitrogenadas de DNA, las cuales no está buscando, ya que sólo utiliza citogenética convencional más (secuencias de nucleótidos)
n in situ pueden ser detectadas por análisis detecta un área específica
todo estudio de genética convencional mediante el artificial de una secuencia
con cromosómico convencional. del genoma, y no podría
secuencias afectadas de empleo de una sonda (fragmento de específica de nucleótidos que se
fluorescen DNA específicas de los detectar otras alteraciones
cia
Duplicación: mutación en la que se
que pudiera haber en ADN homólogo a la secuencia blanco) tiñe con un material fluorescente. El
cromosomas de núcleos producen una o más copias de un
alguna otra área. marcada con un fluorocromo, la cual va ADN del paciente se desnaturaliza
en metafase o interfase. segmento de ADN
dirigida hacia un lugar específico del para separar las cadenas, y
Esta técnica nos permite Aneuploidías: cambio en el número ADN, esta sonda al hibridarse con su mediante antígenos, el ADN
identificar e deleciones, cromosómico del cariotipo. cadena complementaria emite artificial teñido del material
anomalías numéricas, fluorescencia que puede ser observada fluorescente se une a la cadena del
Inversiones: cuando hay roturas
estructurales, también es por medio de un microscopio de ADN analizado, y emite una
dentro del mismo cromosoma, el
útil al realizar epifluorescencia. fluorescencia. Si alguna secuencia
segmento gira 180º y se vuelve a unir
tratamientos de dando pie a mutaciones de ADN no fluoresce, significa que
fecundación in vitro para
no se encuentra esa secuencia o
detectar anormalidades Mosaicismos: se refiere a cuando en
gen específico (hubo una deleción).
en los cromosomas. el material genético de diferentes
células y estas difieren en el número
de cromosomas.

EQ #5
 ¿Para qué sirve? ¿Qué tipo de
¿Qué tipo de Explique brevemente la
Nombre de (tipo de alteraciones/mutacio Explique brevemente cómo
alteraciones/mutacio metodología con la que
la técnica alteración/mutación nes no podrá se interpreta:
que detecta)
nes puede detectar? trabaja
detectar?

FiSH Se puede usar para Anormalidades No pueden detectar Utiliza marcadores fluorescentes Los cromosomas que no son
identificar la cromosómicas sutiles anomalías de que se unen a partes específicas objetivos del marcador se verán de
reordenamiento de los ácidos nucleicos un color homogéneo pero el
ubicación de un gen
cromosómico como segmento específico se pinta de
específico en un Mutaciones duplicaciones, deleciones otro color si se encuentra presente
cromosoma, el específicas en células o inversiones usualmente rojo o verde
número de copias del para diferenciar si
gen o cualquier están afectadas por
anormalidad en los cáncer o no
cromosomas.