LYSINE ACETYLATION DECREASES ENZYME ACTIVITY AND PROTEIN LEVEL

OF ESCHERICHIA COLI LACTATE DEHYDROGENASE

JENIFER PAOLA RAMÍREZ CASAS

FUNDACIÓN UNIVERSITARIA DEL ÁREA ANDINA

FACULTAD DE ENFERMERÍA
PROGRAMA DE CIENCIAS DE LA SALUD Y EL DEPORTE
BIOQUIMÍCA
 ARMENIA
2022

CONTENIDO

1. PRESENTACIÓN DEL ARTÍCULO.............................................................................4

1.1 Objetivo general de los autores................................................................................4
1.2. Objetivo específico de los autores:...........................................................................4
1.3. Metodología..............................................................................................................4
1.3.1. Experimentos de expresión, purificación y estabilidad de proteínas................6
37.1 C.............................................................................¡Error! Marcador no definido.
1.3.2. Western Blotting...............................................................................................9
1.3.3. Ensayos de actividad de la LdhA....................................................................10
1.3.4. Acetilación y desacetilación in vitro...............................................................10
2. RESULTADOS.............................................................................................................11
2.1. Acetilación no enzimática de LdhA...........................................................................11
2.2. Acetilación enzimática de LdhA............................................................................12
2.3. Efecto de las fuentes de carbono en la acetilación de LdhA..................................13
2.4. La acetilación de lisina disminuye la actividad de LdhA.......................................16
2.5. La acetilación de lisina disminuye los niveles de proteína LdhA..........................17
3. PROPUESTA................................................................................................................19
4. CONCLUSIONES:........................................................................................................20
5. BIBLIOGRAFÍA...........................................................................................................21
 CONTENIDO DE ILUSTRACIONES.

Ilustración 1. Plásmido recombinante [3]...............................................................................6

Ilustración 2. Purificación de proteína con la columna Ni-NTA His-Bind (Novagen) [4].....8
Ilustración 3. Esquema del uso de la electroforesis en gel [7]................................................9
Ilustración 4. Esquema de la electrotransferencia de las proteínas a una membrana [7]......10
Ilustración 5. Mecanismo no enzimático de la acetilación de E. coli [2].............................11
Ilustración 6. Acetilación de LdhA en cepas Pta y AckA [2]...............................................12
Ilustración 7. Acetilación de LdhA después del tratamiento con AcP in vitro durante
tiempos variables [2].............................................................................................................12
Ilustración 8.Acetilación de LdhA en cepas pat y cobB [2].................................................13
Ilustración 9. Acetilación de LdhA después del tratamiento con pat y CobB in vitro [2]....13
Ilustración 10. Los efectos de diferentes fuentes de carbono en la acetilación de LdhA en
cepas de tipo salvaje y pat knockout de E. coli [2]...............................................................14
Ilustración 11.Los efectos de diferentes concentraciones de glucosa en la acetilación de
LdhA [2]................................................................................................................................14
Ilustración 12. Concentraciones de AcP y acetato en diferentes condiciones en la cepa de E.
coli de tipo silvestre [2].........................................................................................................15
Ilustración 13. Concentraciones de AcP y acetato en diferentes condiciones en cepa pat
knockout [2]..........................................................................................................................15
Ilustración 14.Efecto del tratamiento con Pat y CobB sobre la actividad de LdhA [2]........16
Ilustración 15.Efecto del tratamiento con AcP para variar duraciones en la actividad de
LdhA [2]................................................................................................................................17
Ilustración 16. Actividad de LdhA en células cultivadas en diferentes concentraciones de
glucosa [2].............................................................................................................................17
Ilustración 17.Niveles de acetilación en cepas de tipo salvaje, pat knockout y pat
sobreexpresadas [2]...............................................................................................................18
Ilustración 18. Niveles de proteína LdhAen tipo salvaje, pat knockout y sobreexpresión de
pat después del tratamiento con cloranfenicol [2] ...............................................................18

CONTENIDO DE TABLAS
Tabla 1. Cebadores utilizados en este estudio [2]...............................................................................5
Tabla 2. Plásmidos y cepas utilizadas en este estudio [2].......................................................6
Tabla 3. Condiciones de cultivo para las bacterias de E. coli.................................................7

1.1 PRESENTACIÓN DEL ARTÍCULO

Para la presentación del artículo seleccionado, se tuvieron en cuenta la siguiente

información:
Nombre del artículo: Lysine acetylation decreases enzyme activity and protein level of
Escherichia coli lactate dehydrogenase.
Revista en donde fue publicado el artículo: Engineering Microbiology
Autores: MinLiu, Meitong Huo, Likun Guo, Yingxin Fu, Mo Xian, Ginseng Qi, Wei Liu y
Guang Zhao.
Volumen: 2
Número: 4
Número de páginas: 7
Año de publicación: 2022
Disponible en línea en: https://doi.org/10.1016/j.engmic.2022.100045

Al leer el artículo científico, me encontré interesada por él, ya que el lactato es un producto
que puede ser utilizado para distintas áreas de la industria y la medicina. Además, al
investigar sobre la metodología y términos hallados en la discusión del artículo, comprendí
con mayor claridad el porque es necesario ver en la carrera asignaturas con la microbiología
y la bioquímica.

2.1 Objetivo general de los autores

Estudiar los mecanismos subyacentes a la regulación de la función LdhA 1 por acetilación
de lisina en Escherichia coli, con el fin de alcanzar una mayor compresión de dichos
mecanismos.

2.2. Objetivo específico de los autores:

Caracterizar los efectos de la acetilación de lisina sobre la actividad enzimática y la

estabilidad de la proteina de E.coli LdhA.

2.3. Metodología

1
Siglas que hacen referencia a la enzima Lactato deshidrogenasa A.
En este estudio, se empleó la técnica PCR2 para construir los plásmidos3, y en la digestión,
se uso una enzima de restricción4. En la técnica de PCR, se usó de distintos cebadores
(tabla 1), que como se sabe, son una secuencia corta de nucleótidos que proporciona un
punto de partida para la síntesis de ADN. El objetivo de aplicar esta técnica, es la de
amplificar una secuencia de ADN millones y miles de millones y producir suficientes
copias de ADN [1]. Una vez se obtuvieron el ADN, se hizo digestión con enzimas de
restricción y se clonó en plásmidos.

Tabla 1. Cebadores utilizados en este estudio [2].

En el procedimiento de clonación de ADN, los investigadores tomaron los genes o

fragmentos de ADN que obtuvieron del anterior procedimiento, y lo insertaron, en
fragmentos circulares de ADN o plásmidos (ver tabla 2). La inserción se realizó con
enzimas de restricción y ligasas para obtener un ADN recombinante5.

Los autores introdujeron los plásmidos recombinantes (ver ilustración 1) en bacterias de E.

coli BL21 (DE3), con el objetivo de que estas, fabricarán la proteína que codifica el
fragmento de ADN insertado en los plásmidos. Aquí, usaron una selección con antibióticos
para la identificación de las bacterias que incorporaron los plásmidos. Finalmente,
cultivaron las bacterias portadoras de plásmido en gran cantidad y las usaron como fabricas
para la expresión de la proteína LdhA, que luego, recolectaron y purificaron. Este último
paso, se explicará con más detalle en el numeral 1.2.1.

2
Técnica de la biología molecular conocida como Reacción en Cadena de la Polimerasa.
3
Moléculas pequeñas de ADN.
4
Proteína aislada a partir de bacterias que cortan secuencias de ADN en sitios específicos de la
secuencia.
5
ADN ensamblado de fragmentos provenientes de múltiples fuentes.
 Tabla 2. Plásmidos y cepas utilizadas en este estudio [2].

Ilustración 1. Plásmido recombinante [3].

2.3.1. Experimentos de expresión, purificación y estabilidad de proteínas.

2.3.1.1. Cultivos de las bacterias E. coli.

Las cepas bacterias de E. coli se cultivaron con antibióticos adecuados y teniendo en

cuenta las condiciones de la tabla 3, y luego, se transfirieron los cultivos en medio LB
fresco en glucosa al 2% por dilución 1:50 para incubarlos bajo las mismas condiciones.
 Cuando la absorbancia del cultivo alcanzó una OD6006 de aproximadamente 0.6, se
añadieron 100 µM de IPTG7 para la inducción del promotor T78 y las células se
cultivaron a 30 °C durante 18 h.

Tabla 3. Condiciones de cultivo para las bacterias de E. coli.

Condiciones de incubación Especificaciones y valores

Medio LB (Luria-Bertani)
Jornada de crecimiento Nocturna
Temperatura 37 °C

2.3.1.2. Recolección y purificación de las proteínas producidas por las bacterias

de E. coli.

Los cultivos de E. coli se recolectaron por centrifugación y se resuspendieron en PBS 9

(pH:7.5). Se empleó altas presiones para la lisis de las células, y luego, estas fueron
centrifugadas y purificadas usando una columna Ni-NTA10 His·Bind (Novagen), según las
instrucciones del fabricante (ver ilustración 2). Por último, se emplearon las proteínas
purificadas para la acetilación y los experimentos de actividad enzimática.

6
Densidad óptica medidas a 600 nm de longitud de onda.
7
Siglas de isopropil-𝛽-d-tiogalactopiranósido.
8
Cuando se añade el inductor IPTG, se induce el gen de la polimerasa de T7, proteína que
transcribe a gran nivel el gen que los investigadores clonaron.
9
Siglas de phosphate buffered saline o solución tampón fosfato salino. Esta es una solución
acuosa y salina que contiene cloruro sódico, fosfato sódico, cloruro de potasio y fosfato de
potasio.
10
Su compuesto es el ácido nitrilotriacético de níquel.
 Ilustración 2. Purificación de proteína con la columna Ni-NTA His-Bind (Novagen)
[4].
2.3.1.3. Experimentos de estabilidad.

Fueron cultivadas las cepas en medio LB que contenía 2% de glucosa. Después de la

inducción con IPTG durante 1,5 h, las cepas se trataron con 200 µg/mL de Chloromycetin11
durante tiempos variables. Las muestras tratadas fueron calibradas de acuerdo a la
absorbancia OD600. Luego, las células fueron recolectadas por centrifugación y se
resuspendieron en PBS. Los tampones de carga de proteína fueron adicionadas a las
muestras resuspendidas antes de la incubación a 100 °C por 15 minutos. Por último, las
proteínas extraídas fueron almacenadas hasta su uso en el análisis SDS-PAGE y Western
blot.

11
Es un antibiótico que tiene como principio activo el Cloranfenicol.
 2.3.2. Western Blotting

Los autores usaron la técnica de laboratorio Western Blot para detectar la proteína LdhA en
las muestras almacenadas en el anterior procedimiento. Como se explica en el artículo, esta
técnica implica el uso de electroforesis (ver ilustración 3) en gel para separar las proteínas
de LdhA de la muestra [2] [5]. En este caso, el gel empleado es 12% SDS-PAGE, cuyo uso
está dirigido a la separación de las proteínas de LdhA presentes en la muestra en función de
su peso molecular [6]. Esta separación se basa en la distinta velocidad de migración de las
proteínas a través de un gel de poliacrilamida al aplicar un campo eléctrico [6].

Ilustración 3. Esquema del uso de la electroforesis en gel [7].

El paso siguiente fue transferir las muestras de proteínas a las membranas de PVDF 12 para
su manipulación por 1,5 h a 15 V (ver ilustración 4). Las membranas fueron bloqueadas por
1 h a una temperatura ambiente usando el reactivo rápido de Western Blot (Beyotime,
China). Las membranas fueron incubadas durante la noche a 4 °C con el anticuerpo
primario de anti-acetillisina monoclonal de ratón (EASYBIO, China, 1:2000), para
propiciar su unión con la proteína LdhA [8].

12
Siglas de polyvinylidene difluoride o fluoruro de polivinilideno.
 Ilustración 4. Esquema de la electrotransferencia de las proteínas a una membrana
[7].
A continuación, las membranas se incubaron por 1 h con anticuerpo anti-ratón combinadas
con peroxidasa de rábano (EASYBIO, China, 1:10,000) como anticuerpo secundario,
siendo este, el que se une con el anticuerpo primario y se conjuga con una molécula
informadora que permite la visualización de la proteína LdhA [9]. Después de lavar el
exceso de proteína por tres veces con PBS con Tween20, las señales se detectaron
utilizando la quimioluminiscencia mejorada (ECL), según las instrucciones del fabricante.
Lo anterior, permite la visualización de la señal de los conjugados que se detecta mediante
el dispositivo de imágenes [10].
2.3.3. Ensayos de actividad de la LdhA.

Los ensayos de actividad de LdhA se realizaron en un tampón de fosfato 100 mM (pH 7,5),
NADH 1 mM, piruvato 1 mM y proteína purificada 40 nM. Las tasas de reacción se
determinaron a una absorbancia de 340 nm usando un multimodo lector de microplacas
(Spark, Tecan).
2.3.4. Acetilación y desacetilación in vitro

La acetilación mediada por acetiltransferasa Pat se realizó in vitro. La mezcla de reacción

contenía Tris-HCl 50 mM (pH 7,8), 0,1 mM EDTA, glicerol al 10%, ditiotreitol 1 mM,
butirato de sodio 10 mM, Acetil-CoA 0,3 mM, 80 g de acetiltransferasa y 40 g de LdhA en
un volumen de 200 litros. Las mezclas de reacción se incubaron a 37 °C durante 1 h. La
acetilación mediada por AcP se evaluó in vitro mezclando 50 g de LdhA con
concentraciones variables de AcP en volúmenes de 100 L e incubación a 37 °C durante
tiempos variables.
La desacetilación in vitro mediada por desacetilasa CobB. Las mezclas de reacción
contenían HEPES 40 mM (pH 7,0), MgCl2 6 mM, MgCl2 1 mM NAD+, ditiotreitol 1 mM,
glicerol al 10 %, 80 g de CobB y 40 g de LdhA en volúmenes de 200 L. Las mezclas de
reacción se incubaron a 37 °C durante 1 h. Después de las reacciones enzimáticas, las
muestras se usaron para análisis de transferencia Western y ensayos enzimáticos.

3.1 RESULTADOS.

2.1. Acetilación no enzimática de LdhA

Como se explicó en la metodología, se determinó la acetilación de la lisina primero con la

técnica Western Blot usando un anticuerpo anti-acetillisina monoclonal. Cabe señalar, que,
la acetilación de la lisina se realiza a través de mecanismos enzimáticos y no enzimáticos
[2]. En el mecanismo no enzimático, el donante del grupo acetilo es AcP, un intermediario
en la vía de la Pta-AckA13 (ver ilustración 5), con la concentración intracelular de AcP
previamente hallada ha de ser mayor en un ackA mutante y menor en un pta-ackA doble
mutante que en la cepa de tipo silvestre [2].

Ilustración 5. Mecanismo no enzimático de la acetilación de E. coli [2].

Para estudiar si la concentración de AcP afecta la acetilación de LdhA in vivo, los

investigadores utilizaron cepas knockout para pta y ackA construido por transducción
mediada por vir P1. Los niveles de acetilación de LdhA, los compararon en la cepa de tipo
silvestre y las cepas mutantes individuales. Como se esperaba, la acetilación de LdhA

13
Siglas de las enzimas fosfotransacetilasa-acetato quinasa
disminuyó 0,13 veces en el pta mutante y aumentó 1,89 veces en el mutante ackA
(ilustración 6). Según los autores, estos resultados demuestran que la modulación de la vía
Pta-AckA puede alterar los niveles de AcP y afectan aún más el estado de acetilación de
LdhA.

Ilustración 6. Acetilación de LdhA en cepas Pta y AckA [2].

Para estudiar si AcP puede acetilar directamente LdhA in vitro, la proteína LdhA purificada
se incubó con concentraciones variables de AcP y en tiempos variables. El nivel de
acetilación de LdhA aumentó con el tiempo de incubación, y mayores concentraciones de
AcP, aumentaron la acetilación de LdhA durante la misma duración del tratamiento
(ilustración 7). La acetilación de LdhA aumentó de manera dependiente de la dosis de AcP
y del tiempo. Estos hallazgos, como lo expresan los autores, demuestran que LdhA puede
ser acetilado por un mecanismo no enzimático mediado por AcP (ilustración 5). La
acetilación dependiente de AcP es el mecanismo predominante para la acetilación de
proteínas en E. coli.

Ilustración 7. Acetilación de LdhA después del tratamiento con AcP in vitro durante
tiempos variables [2].

3.2. Acetilación enzimática de LdhA

En E. coli, pat y CobB la acetiltransferasa y la desacetilasas, respectivamente, son
predominantes en la acetilación de proteínas enzimáticas. Por lo tanto, se evaluó los roles
de pat y CobB en la modificación de LdhA tanto in vivo e in vitro. En primer lugar, se
construyó mutantes knockout pat y cobB y se compararon los niveles de acetilación de
LdhA entre los dos mutantes y la cepa de tipo silvestre. Como se muestra en la ilustración
8, los niveles de acetilación de LdhA disminuyeron 0,47 veces después de la eliminación de
pat y sin cambios en la cepa knockout cobB (ilustración 8). Entonces, se purificó las
proteínas pat y CobB proteínas y se incubaron individualmente con LdhA in vitro. El
tratamiento con pat aumentó la acetilación de LdhA en 1,81 veces, mientras que CobB
tratamiento no tuvo efecto sobre la acetilación de LdhA, lo que corrobora los hallazgos en
la in vivo (ilustración 9). Estos resultados demuestran que E. coli LdhA puede ser acetilado
por pat. Además, CobB no pudo desacetilar LdhA.

Ilustración 8.Acetilación de LdhA en cepas pat y cobB [2]

Ilustración 9. Acetilación de LdhA después del tratamiento con pat y CobB in vitro
[2].

3.3. Efecto de las fuentes de carbono en la acetilación de LdhA

Los autores probaron la hipótesis de que el tipo y la concentración de las fuentes de

carbono determinan el metabolismo del acetato de E. coli, el cual afecta la concentración
intracelular del donante del grupo acetilo, AcP. Para probar lo anterior, se tuvo que
purificar la proteína LdhA a partir de células de E. coli cultivadas en medio LB
suplementado con glucosa o glicerol y sometido a Western blotting para medir el estado de
acetilación. Como se muestra en la ilustración 10, la suplementación con glucosa o glicerol
mejoró notablemente el nivel de acetilación de la proteína LdhA, observándose más LdhA
acetilada en células cultivadas con glucosa que con la misma concentración de glicerol. Sin
embargo, el nivel de acetilación de la proteína LdhA fue similar entre células cultivadas en
glucosa al 1% o al 2%.

Ilustración 10. Los efectos de diferentes fuentes de carbono en la acetilación de LdhA

en cepas de tipo salvaje y pat knockout de E. coli [2].

Una concentración de glucosa del 1% puede ser suficiente para la acetilación máxima de
LdhA. Para determinar si el nivel de acetilación de LdhA depende de la concentración de
glucosa, se evaluó varias concentraciones adicionales. La glucosa mejoró el nivel de
acetilación de la proteína LdhA de una manera dependiente de la dosis para una
concentración que oscila entre 0% y 1%, sin cambios en el nivel de acetilación de LdhA
observado para la concentración de glucosa entre 1% y 2% (ilustración 11).

Ilustración 11.Los efectos de diferentes concentraciones de glucosa en la acetilación de

LdhA [2].

Se midió las concentraciones de AcP y acetato en cepas de tipo silvestre y pat knockout
cultivadas con diferentes fuentes de carbono. Se observó resultados similares en estas dos
cepas con concentraciones muy bajas de AcP observadas después cultivo con tres fuentes
de carbono diferentes. Sin diferencias significativas en las concentraciones de AcP, son
observadas entre las tres condiciones. Los niveles de acetato se correlacionaron
positivamente con el nivel de acetilación de LdhA (ilustración 12 y 13).

Ilustración 12. Concentraciones de AcP y acetato en diferentes condiciones en la cepa

de E. coli de tipo silvestre [2].

Ilustración 13. Concentraciones de AcP y acetato en diferentes condiciones en cepa

pat knockout [2].

De acuerdo con los anteriores resultados, los autores indican que la acetiltransferasa, pat,
puede no jugar un papel importante en la regulación de la acetilación de LdhA en respuesta
a los cambios en la fuente de carbono. Además, afirman que los efectos de la fuente de
carbono en la acetilación de lisina dependen predominantemente del flujo de carbono a
través del glicólisis y las acumulaciones de metabolitos, procesos que están regulados por
mecanismos no enzimáticos.
Por otra parte, en el artículo, se afirma que la acetilación de lisina representa una respuesta
celular al flujo de carbono y está estrechamente relacionado con el metabolismo de
desbordamiento. Por lo tanto, la acetilación de lisina de LdhA juega un papel importante en
la regulación de la producción de lactato y distribución del flujo de carbono en respuesta a
diferentes tipos de fuentes de carbono y concentraciones [2].

3.4. La acetilación de lisina disminuye la actividad de LdhA

Para probar el efecto de la acetilación de lisina sobre la actividad de LdhA, los

investigadores midieron la actividad enzimática de LdhA después del tratamiento con Pat,
CobB o AcP. El incremento de la acetilación de LdhA en respuesta al tratamiento con Pat,
disminuyó la actividad de LdhA por 20%, mientras que la actividad de LdhA después del
tratamiento con CobB fue similar al control sin ningún tratamiento (ilustración 14), ya que
CobB no pudo desacetilar LdhA (ilustración 9). Además, el tratamiento de AcP disminuyó
la actividad de LdhA, con mayores reducciones observadas con el aumento en la duración
del tratamiento.

Ilustración 14.Efecto del tratamiento con Pat y CobB sobre la actividad de LdhA [2].

La actividad de LdhA disminuyó al 79,7 % y al 68,5 % después del tratamiento con AcP 20
mM durante 30 min y 60 min, respectivamente (ilustración 15). También, en el estudio se
midió la actividad de LdhA en células de E. coli cultivadas en presencia o ausencia de
glucosa. Como la glucosa aumentó el nivel de acetilación de LdhA in vivo, la
suplementación con glucosa redujo la LdhA. Actividad (ilustración 16). Estos resultados
demuestran que la acetilación de lisina puede inhibir la actividad general de LdhA.
Ilustración 15.Efecto del tratamiento con AcP para variar duraciones en la actividad
de LdhA [2].

Ilustración 16. Actividad de LdhA en células cultivadas en diferentes concentraciones

de glucosa [2].

3.5. La acetilación de lisina disminuye los niveles de proteína LdhA

Los autores estudiaron el efecto de acetilación de lisina en los niveles de LdhA, la proteína
LdhA fue expresada en cepas de E. coli de tipo silvestre, pat knockout y pat
sobreexpresadas. Se usó cloranfenicol para inhibir aún más la traducción de proteínas con
el fin de observar la estabilidad de la proteína LdhA existente. Como se muestra en la
ilustración 17, la eliminación de pat aumentó los niveles de acetilación de LdhA y la
sobreexpresión de pat disminuyó los niveles de acetilación de LdhA.
 Ilustración 17.Niveles de acetilación en cepas de tipo salvaje, pat knockout y pat
sobreexpresadas [2].

Después del tratamiento con cloranfenicol, los niveles de proteína LdhA permanecieron sin
cambios durante 12 h en las cepas mutantes pat y de tipo silvestre. Sin embargo, los autores
observaron una disminución constante en los niveles de proteína LdhA a lo largo del
tiempo en la cepa que sobreexpresa pat (ilustración 18). El nivel de acetilación de LdhA en
la cepa que sobreexpresa pat disminuyó 0,26 veces y 0,13 veces después del tratamiento
con cloranfenicol durante 4 h y 12 h, respectivamente. Estos resultados, de acuerdo con los
autores, demuestran que la acetilación de lisina disminuye los niveles de proteína de LdhA
al promover su degradación.

Ilustración 18. Niveles de proteína LdhAen tipo salvaje, pat knockout y

sobreexpresión de pat después del tratamiento con cloranfenicol [2] .

Los niveles de proteína LdhA mostraron diferencias significativas entre las tres cepas en el
momento de la adición de cloramfenicol. Los niveles de proteína LdhA fueron
sustancialmente más altos en la cepa pat knockout y sustancialmente más bajos en la cepa
que sobreexpresa pat en comparación con la cepa de tipo salvaje, por lo que los
investigadores concluyen, que, la acetilación de lisina puede afectar los niveles de proteína
LdhA a través de otros mecanismos.
Una vez que se conoce los resultados a los que llegaron los autores, se puede afirmar que
los logros de la investigación son:
- La acetilación de E. coli ocurre a través de mecanismos enzimáticos y no
enzimáticos.
- El tipo de fuente de carbono y la concentración afectan el estado de la acetilación de
la lisina de LdhA a través de un mecanismo no enzimático.
- La acetilación de lisina de E.coli LdhA es irreversible.

4.1 PROPUESTA.

Lo que espera es establecer a que concentración de la fuente de carbono (glucosa), se

obtiene la mayor cantidad de proteína, ya que esto permitirá poder obtener cantidades
significativas de la proteína de lactato deshidrogenasa A para aplicaciones a nivel
industrial. El objetivo de la investigación sería:
Objetivo: Determinar el efecto de la concentración de la glucosa en la acetilación de Lactato
deshidrogenasa A de Escherichia coli.

Método y materiales
Se deben elegir cebadores, plásmidos y cepas de bacterias de E. coli de buena calidad, con
el objetivo de poder construir plásmidos recombinantes y expresar la proteína de interés
(LdhA). La construcción del plásmido, se debe realizar con la técnica de PCR y una enzima
de restricción. Además, se debe hacer la eliminación de genes cromosómicos en la E. coli a
traves de la transducción mediada por vir P1.
Cultivo de cepas de E. coli.
Las cepas bacterias de E. coli se cultivan con antibióticos adecuados y teniendo en cuenta
las condiciones de la tabla 3, y luego, se transfiere los cultivos en medios LB fresco en
lactosa al 2%, 3% y 4% por dilución para incubarlos bajo las mismas condiciones. Cuando
la absorbancia del cultivo alcance una OD60014 de aproximadamente 0.6, se añadirá 100 µM
de IPTG15 para la inducción del promotor T716 y las células se cultivan a 30 °C durante 18
h.

14
Densidad óptica medidas a 600 nm de longitud de onda.
15
Siglas de isopropil-𝛽-d-tiogalactopiranósido.
16
Cuando se añade el inductor IPTG, se induce el gen de la polimerasa de T7, proteína que
transcribe a gran nivel el gen que los investigadores clonaron.
 Tabla 4. Condiciones de cultivo para las bacterias de E. coli.

Condiciones de incubación Especificaciones y valores

Medio LB (Luria-Bertani)
Jornada de crecimiento Nocturna
Temperatura 37 °C

Recolección y purificación de las proteínas producidas por las bacterias de E. coli.

Los cultivos de E. coli se recolectan por centrifugación y se resuspenden en PBS17 (pH:7.5).

Se emplea altas presiones para la lisis de las células, y luego, estas fueron centrifugadas y
purificadas usando una columna Ni-NTA18 His·Bind (Novagen), según las instrucciones del
fabricante (ver ilustración 2). Por último, se emplea las proteínas purificadas para la
acetilación y los experimentos de actividad enzimática.

5.1 CONCLUSIONES:

- De acuerdo a lo comprendido y analizado en el artículo, se considera que no existe

ningún tipo de incoherencia entre los elementos que lo conforman, ni
contradicciones entre los objetivos, los resultados, la discusión y la conclusión.
Adicionalmente, los autores construyeron un articulo de buena calidad y realizaron
el estudio teniendo en cuenta cumplir con el objetivo planteado.
- La metodología planteada por los autores del estudio es pertinente para lo que
querían lograr, ya que al analizar el artículo e investigar las fuentes bibliográficas
citadas, se encuentra que las técnicas y métodos empleados son los adecuados en la
investigación de mecanismos de reacción y tratamiento de muestras biológicas.
- A pesar de que, en el estudio, se demostró y se descubrió cosas nuevas acerca de la
acetilación de la lisina de LdhA, los autores consideran que aun falta mucho por
comprender acerca de la regulación de acetilación de proteínas.
- Con respecto al objetivo específico planteado por los autores, se puede afirmar que,
los autores cumplieron con el objetivo, pues en los resultados demuestran los
efectos de la acetilación sobre los niveles de proteína LdhA, cuando se promueve la
degradación de la proteína, se selecciona ciertas bacterias, se usa ciertas fuentes de
carbono y enzimas.
- Es viable seguir investigado sobre el tema, porque quedó demostrado en este
estudio, y otros que se revisaron, que aún se requieren más estudios para dilucidar
completamente los mecanismos que revelen el efecto de la acetilación en los niveles
17
Siglas de phosphate buffered saline o solución tampón fosfato salino. Esta es una solución
acuosa y salina que contiene cloruro sódico, fosfato sódico, cloruro de potasio y fosfato de
potasio.
18
Su compuesto es el ácido nitrilotriacético de níquel.
 de LdhA. Además, se debe tener en cuenta todas las aplicaciones que podría tener
los nuevos descubrimientos en las áreas de medicina, la agroquímica, la cosmética,
la farmacéutica y la industria del plástico.
-

6.1 BIBLIOGRAFÍA

[1] Khan Academy, «Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).,» [En línea]. Available:
https://es.khanacademy.org/science/ap-biology/gene-expression-and-regulation/
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