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Curso:
Biotecnología
Docente:
Dr. Herbert H. Soto Gonzales
Estudiantes:
Noemi Esther Escobar Ferro
Joshelin Shantal Alarcón Mamani
Maria Fernanda Anayhuaman
Rosalinda Apaza Apaza
Ruth Mayra Apaza Foraquita
Ciclo: VII
Fecha: 01/12/2021
UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA
Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental
Tabla de contenido
Resumen......................................................................................................................................... 3
I. INTRODUCCION ....................................................................................................................... 4
II. OBJETIVOS............................................................................................................................... 5
2.1. Objetivo general ................................................................................................................... 5
2.2. Objetivos específicos ............................................................................................................ 5
III. MARCO TERICO ................................................................................................................... 6
3.1 Definimos el PCR.................................................................................................................... 6
3.2 Componentes de la PCR ......................................................................................................... 6
3.3 Funcionamiento de la reacción .............................................................................................. 8
3.3.1 Desnaturalización........................................................................................................... 8
3.3.2 Hibridación ..................................................................................................................... 8
3.3.3 Extensión ....................................................................................................................... 9
3.4 Análisis del producto de amplificación ................................................................................. 10
3.5 PCR a tiempo real ................................................................................................................ 11
3.5.1 Captura de la señal de fluorescencia .............................................................................. 12
3.5.2 Análisis de resultados.................................................................................................... 12
IV. MARCO METODOLOGICO................................................................................................... 14
4.1. Materiales y Procedimiento ........................................................................................... 14
4.1.1. Materiales.............................................................................................................. 14
4.1.2 Procedimiento ....................................................................................................... 20
5 RESULTADO ........................................................................................................................... 26
6 CONCLUSIONES ..................................................................................................................... 27
7 BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................................ 28
Anexos .......................................................................................................................................... 29
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Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental
Resumen
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I. INTRODUCCION
En el presente informe, se tiene por objeto dar a conocer las funciones,
instrucciones, partes y el uso del PCR. Hasta el momento nosotros estudiantes de
la carrera de Ingeniera de ambiental, no hemos tenido la oportunidad de ver
directamente este material, así como también no lo hemos podido utilizar, pero por
medio de este trabajo se construirá un PCR de tiempo real y un PCR convencional
en la cual nos ayudará a conocer sus funciones de cada parte de ambos de los PCR.
La Reacción de cadena polimerasa (PCR) “es una técnica utilizada en biología
molecular que permite conseguir una gran cantidad de copias de unfragmento de
ADN, partiendo de una cantidad ínfima de esta biomolécula.”
(González, 2020)
La PCR se basa en una actividad enzimática que sucede de forma normal
en las células de nuestro organismo. En las células, las ADN polimerasas son
capaces de replicar el ADN nuclear, para obtener dos copias idénticas, que después
serán repartidas a las células hijas en la mitosis. (González, 2020). Este a la vez
para detectar cualquier microorganismo presente en pacientes infectados con algún
virus, bacterias, etc. El campo de la automatización hoy en día se ha amplificado,
pero a la vez ha hecho de la vida de las personas más útil y con más capacidad,
esta técnica permite conocer nuevas técnicas que nos ayudara a mejorar la calidad
ambiental, para las futuras generaciones. Podemos encontrar ciertas diferencias
entre ambos PCR. La PCR en tiempo real es una técnica que combina la
amplificación y la detección en un mismo paso, al correlacionar el producto de la
PCR de cada uno de los ciclos con una señal de intensidad de fluorescencia.
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II. OBJETIVOS
2.1. Objetivo general
El objetivo de este trabajo es elaborar dos maquetas el PCR convencional,
el PCR a tiempo real para conocer sus funciones y componentes.
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Una enzima capaz de generar una copia de ADN a partir del ADN molde: una
ADN polimerasa. La reacción se lleva a cabo en un tampón apropiado para
el funcionamiento de la enzima polimerasa. Además, como cofactores de la
polimerasa se añaden cationes divalentes, generalmente en forma de cloruro
de magnesio (MgCl2).
Nucleótidos libres: las enzimas ADN polimerasas van a crear una cadena
complementaria a la cadena molde mediante la incorporación de nucleótidos
al extremo 3’ libre del cebador que se ha unido a la cadena molde. Los
nucleótidos se añaden en forma de desoxirribonucleósidos trifosfato
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3.3.1 Desnaturalización.
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3.3.3 Extensión.
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Los primeros que sentaron las bases para desarrollar la PCR en tiempo real
fueron Higuchi y colaboradores, en 1992, al videograbar en tiempo real la
incorporación de bromuro de etidio al ADN durante cada ciclo de la PCR realizada
bajo luz UV. Desde entonces, el objetivo de la PCR en tiempo real ha sido detectar
y cuantificar las secuencias específicas de ácidos nucleicos mediante el uso de
reporteros fluorescentes en la reacción.
Las características representan grandes ventajas de la PCR en tiempo real,
ya que el producto de amplificación es monitoreado conforme transcurre la reacción
sin que haya la necesidad de que sea manipulado en un gel de agarosa para
conocer si la reacción fue exitosa como sucede en la PCR punto final.
La nomenclatura que se usa también es diferente, si utilizamos ADN
genómico entonces hablamos de una qPCR (quantitative PCR), si, por lo contrario,
primero obtenemos ADNc y luego hacemos la PCR, nos referimos a una RT-qPCR.9
Actualmente, la PCR en tiempo real es el método más sensible para detectar y
cuantificar los ácidos nucleicos.
Aun teniendo una cantidad muy pequeña de templado, el sistema garantiza
una alta sensibilidad, especificidad y eficiencia. Una de sus aplicaciones más usadas
es para cuantificar cambios muy pequeños en la expresión génica mediante la
detección de los niveles del ARNm procedente de células o tejidos. La cantidad de
ARNm que puede detectar la reacción puede ser a partir de concentraciones bajas
a diferencia de la PCR, punto final que necesita una mayor concentración.
Los ingredientes químicos en la PCR en tiempo real, son los mismos
utilizados en la PCR punto final, sólo que generalmente la enzima, dNTP’s, Mg +, el
buffer y el sistema reportero de fluorescencia para detectar los productos
amplificados se venden juntos en una solución conocida como «Master mix», el agua
es proporcionada por separado y también es libre de nucleasas.
Los primers deben ser diseñados especialmente para garantizar una alta
especificidad y para que generen amplicones de un tamaño que oscile entre 100-
150 pb; si éstos son más grandes, la eficiencia de la reacción disminuye
considerablemente. Para evitar estos problemas, una alternativa es diseñar los
primers, utilizando programas informáticos disponibles, o comprarlos ya validados
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paso importante del análisis es elegir el tipo de cuantificación que se usará para
determinar la amplificación precisa del blanco génico; este procedimiento depende
de los intereses del investigador. Para ello existen dos tipos de cuantificación: la
absoluta y la relativa. La primera generalmente se utiliza para conocer el número
exacto de copias amplificadas del blanco o la concentración precisa de ácidos
nucleicos en una muestra. En la práctica, este tipo de cuantificación se usa para
medir la carga viral o bacteriana en diferentes tejidos. La segunda se aplica cuando
se desean evaluar los cambios en la expresión de genes en distintos estados
fisiológicos. Estos cambios se basan en los niveles del ARNm del gen blanco
comparados con un gen de referencia (gen housekeeping) que no cambia su
expresión a pesar de que los estados fisiológicos se modifiquen por diversas causas.
Los datos son expresados como relativos al gen de referencia y generalmente son
referidos como el número de veces en el que aumentaron o decrementaron los
niveles de ARNm o en su caso, si no hubo cambios. Cualquiera que sea el tipo de
cuantificación que se elija, casi todos los softwares de los equipos están posibilitados
para llevar a cabo los análisis matemáticos y estadísticos que se requieren en cada
tipo de cuantificación.
Figura 3: Curva de amplificación. En el eje «Y» se muestra la cantidad de fluorescencia y en el eje «X»
los ciclos de la reacción. La amplificación se detecta en cada ciclo de la reacción, midiendo el incremento
de la fluorescencia que es proporcional al aumento de ADN.
Figura 4: . Se puede observar un único pico de amplificación que corresponde a la curva de disociación o
curva melting que indica la especificidad de la reacción, es decir, que los amplicones que se formaron son
del tamaño esperado. La línea de abajo corresponde al control negativo, el cual no amplificó.
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Plumón:
Es un instrumento de escritura, parecido al
bolígrafo, que contiene su propia tinta y
cuyo uso principal es escribir sobre
superficies distintas al papel.
Silicona Liquida:
Es un pegamento especial para
manualidades, con el que conseguirás un
pegado inmediato en materiales como
telas, goma eva, fieltro, cartón, madera,
plásticos, gomas difíciles y otros materiales.
Esta silicona fría es apta para materiales
porosos y no porosos
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Regla:
Es un instrumento de medición con forma
de plancha delgada y rectangular. Incluye
una escala graduada longitudinal, y puede
ser rígida, semirrígida o flexible. Suele estar
construida de madera, metal o material
plástico, entre otros materiales.
Cartón:
Es un material formado por varias capas de
papel superpuestas, a base de fibra virgen
o de papel reciclado. El cartón es más
grueso, duro y resistente que el papel.
Algunos tipos de cartón son usados para
fabricar embalajes y envases, básicamente
cajas de diversos tipos.
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Terokal
Cartón goma de barra
Tijera
Papel lustre
Regla
FIGURAS DESCRIPCION
TEROKAL
Sirve para la unión de los sustratos más
Figura N°5: terokal difíciles en la industria del calzado como
cuero, cercos de suela y caucho a cuero y
plantas de caucho. (terokal record 56, s.f.)
Fuente: tekno
CARTON
Su uso se ha extendido a todos los sectores
Figura N°6: cartones
de la industria y ha contribuido al cuidado y
conservación del medio ambiente gracias a
la relativa facilidad con la que es reciclado.
(benefico de carton, s.f.)
Fuente: cyecsa
GOMA EN BARRA
Figura N°7: goma en barra
se utiliza para pegar fotografías, cartón,
papel y cartulina. (pegamento de barra , s.f.)
Fuente: papelería
tecnica
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TIJERA
Figura N°8: tijera
es utilizada para cortar diferentes tipos de
materiales. (tijera, s.f.)
Fuente: wikipedia
PAPEL LUSTRE
Figura N°9: papel Sirve para hacer manualidades en
lustre escolares, para la creación de origamis,
envolturas, celebraciones, fiestas,
disfraces, regalos, composiciones, forrar
cuadernos, así como para imprimir
fotografías. (cristian, 2020)
Fuente: peruflex
REGLA
Figura N°10: regla
Fuente:wikipedia
4.1.2 Procedimiento
4.1.2.1 Procedimiento de la PCR convencional
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Fuente:Propia
Fuente: Propia
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Figura N°14: dando forma y forrando la caja de cartón aun PCR
Fuente: Propia
Seguidamente comenzamos a
diseñar la tapa le dimos la forma
como en un lado tiene la dorma que
se inclina hacia abajo se nota como
forma de una inclinacion y tambien lo Fuente: Propia
hemos forrado con hojas A4 color
blanco
Fuente: Propia
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Fuente: Propia
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Fuente: Propia
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Fuente: Propia
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Fuente: Propia
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5 RESULTADO
Se puede observar en las imágenes los resultados de la realización de la maqueta tanto
del PCR convencional y de Tiempo Real; se tuvo un resultado satisfactorio.
PCR Convencional PCR de Tiempo Real
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6 CONCLUSIONES
Al realizar la maqueta tanto del PCR del tiempo real y convencional nos sirvió
para indagar sobre el tema, así mismo para saber que función cumple, que analiza
y las diferencias que existe entre ambas.
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7 BIBLIOGRAFÍA
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Anexos
Termociclador PCR en tiempo real
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