UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS – ESPE

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y LA AGRICULTURA

CARRERA DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA

“ PURIFICACIÓN E INMOVILIZACIÓN ENZIMÁTICA”

INTEGRANTES:
ARIAS LISETTE
MARTÍNEZ GABRIELA
POAQUIZA ANDREA

TUTOR:
RODRIGO ÁVALOS

NRC: 10105

SANGOLQUÍ – ECUADOR
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Índice
Título…………………………………………………………………………………………..3
Resumen……………………………………………………………………………………….3
Abstract………………………………………………………………………………………..3
Introducción…………………………………………………………………………………...3
Antecedentes…………………………………………………………………………..3
Justificación…………………………………………………………………………...4
Objetivos……………………………………………………………………………………....4
Objetivo General………………………………………………………………………4
Objetivos Específicos………………………………………………………………….5
CAPÍTULO I. Purificación enzimática………………………………………………………..6
1.1. Generalidades……………………………………………………………………..6
1.2. Métodos de purificación…………………………………………………………..7
1.2.1. Electroforesis……………………………………………………………7
1.2.1.1. Electroforesis de frente móvil…………..……………………7
1.2.1.2. Electroforesis de zona ………………….……………...…….7
1.2.1.3. Electroforesis en gel de Poliacrilamida……………….………8
1.2.1.4. Electroforesis en gel de agarosa………..……………………..8
1.2.1.5. Isoelectroenfoque…………..………..….…………………….8
1.2.2. Cromatografía…………………………………………………………...9
1.2.2.1. Cromatografía de afinidad…………………………………….9
1.2.2.2. Cromatografía de interacción hidrofóbica…………..……….10
1.2.2.3. Cromatografía de fase reversa………………………….……10
1.2.2.4. Cromatografía Líquida de alta eficiencia……………………11
1.2.2.5. Separación por precipitación………………………………...11
1.2.3. Precipitación………………………………………………………..….12
1.2.3.1. Precipitación salina………………………………………….12
1.2.3.2. Precipitación isoeléctrica……………………………………12
1.2.3.3. Precipitación con solventes orgánicos………………………13
1.2.3.4. Precipitación con polímeros no iónicos……………….…….13
1.2.4. Ultrafiltración……………………………………………………...…..13
1.2.4.1. Untrafiltración microporosa………………………………....14
1.2.4.2. Ultrafiltración de difusión…………………………………...14
1.2.5. Manipulación genética ….…………………………………………….14
CAPÍTULO II. Inmovilización enzimática ...………………………………………………..15
2.1. Generalidades……………………………………………………………………15
2.2. Métodos de inmovilización enzimática………………………………………….15
2.2.1. Por retención Física……………………………………………………15
2.2.1.1. Atrapamiento……………..……………..…………………..15
2.2.1.2. Inclusión en membranas …………………………………...15
2.2.2.Por unión Química……………………………….……………….……16
2.2.2.1. Unión a soportes………………………..……………………16
2.2.2.2. Adsorción……….…………..……………………………….16
2.2.2.3. Unión covalente ……….……………………………………17
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2.2.2.4. Reticulado……………………………………………………17
2.2.3. Efectos de la inmovilización………………………………………..…18
2.2.4 Efectos en la actividad enzimática ..…………………………………..18
2.2.4.1. Pérdida total……………………………..…………………...18
2.2.4.2. Pérdida parcial …………….………………………………..18
2.3 Comparación de diferentes métodos de inmovilización………………………...19
Conclusiones…………………………………………………………………………………19
Referencias Bibliográficas…………………………………………………………………...20
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Título:
Purificación e inmovilización enzimática
Resumen:
El presente trabajo muestra una visión general de la purificación e inmovilización enzimática,
exponiendo los diversos métodos que se tienen para lograr el objetivo de obtener una enzima pura y
con una actividad enzimática relativamente alta. Entre los métodos más importantes para la
purificación enzimática abarcados están aquellos que se basan en los principios de la electroforesis,
cromatografía, precipitación, ultrafiltración y manipulación genética. Mientras que los métodos para
la inmovilización considerados se basan en técnicas físicas y químicas, tratando también a manera
general cómo afecta la inmovilización enzimática en la actividad que las enzimas poseen para
transformar sus respectivos sustratos en productos finales.

Palabras clave: Actividad enzimática, cromatografía, electroforesis, precipitación,

ultrafiltración, manipulación genética.
Abstract:
The present work shows an overview of enzyme purification and immobilization, exposing
the various methods available to achieve the goal of obtaining a pure enzyme with a
relatively high enzymatic activity. Among the most important methods for enzyme
purification covered are those based on the principles of electrophoresis, chromatography,
precipitation, ultrafiltration and genetic manipulation. While the methods for immobilization
considered are based on physical and chemical techniques, addressing also in a general way
how enzyme immobilization affects the activity that enzymes possess to transform their
respective substrates into final products.

Keywords: enzyme activity, chromatography, electrophoresis, precipitation, ultrafiltration,

genetic manipulation.

Introducción:
Antecedentes:
El origen de la producción de enzimas se remonta hacia el siglo XIX en Dinamarca y Japón,
donde se produjeron las primeras preparaciones de renina a partir del estómago de terneros y
de amilasa de origen fúngico (Carrera, 2003).

Las enzimas son proteínas especializadas capaces de acelerar la velocidad de una reacción
química, promoviendo así la transformación de diferentes moléculas en productos específicos
(Acebal & De la Mata, 2019). Las plantas han sido la fuente tradicional de ciertas enzimas, a
partir del látex producido por la papaya, o de algunas proteasas aisladas de la higuera y la
piña, la cebada malteada de enzimas vegetales (Carrera, 2003).

Desde la obtención de enzimas a nivel industrial, la calidad de estas ha sido uno de los
inconvenientes más estudiados, y es que la utilidad o aplicación que se vaya a dar al producto
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depende de la efectividad del mismo y del proceso. Así, la elección del método de
purificación enzimática depende del aspecto económico del proceso, y también del ambiente
bio-compatible que permite la aplicación de criterios sin comprometer el producto (Rojas,
2009).

Las enzimas inmovilizadas se definen como enzimas físicamente confinadas a una cierta
región definida de espacio con retención de su actividad catalítica, y que puede ser usado de
modo continuo (Datta, Christena y Rajaram, 2013), y es que su manifiesto se estableció desde
principios del siglo pasado. Los intentos de inmovilizar una enzima no se realizaron sino
hasta la segunda mitad del siglo pasado, con la inmovilización de carboxipeptidasa, diastasa,
pepsina, y ribonucleasa. Así, en 1969 se dio la primera aplicación industrial de estas enzimas,
la resolución óptica de DL-aminoácidos usando aminoacilasa inmovilizada (Rojas, 2002).

Justificación:
Para la implementación de la tecnología enzimática, además de disponer de la fuente de la
enzima, es necesario recurrir a métodos de purificación e inmovilización que faciliten su
aplicación a nivel industrial, los cuales serán incluidos y explicados detalladamente dentro de
esta investigación bibliográfica.

Es importante destacar que la aplicación de estos procesos requiere de una serie de pasos que
se deben seguir de tal manera que se aprovechen las propiedades bioquímicas de la enzima,
los cuales deben ser monitoreados adecuadamente para evaluar el rendimiento de cada uno de
los procesos.

Cabe recalcar que existe una sola secuencia de técnicas,sin embargo, existen diferentes tipos
de cada una de ellas, las cuales deberán ser seleccionadas según algunos factores como:
naturaleza de la fuente de la enzima, dificultad en cuanto a ruptura celular según el tipo de
célula, estabilidad de la enzima, rapidez y calidad del producto a obtener, además de los
costos del proceso general (Huerta, 2011).

La importancia de esta revisión bibliográfica radica en ampliar nuestro entendimiento, como

estudiantes de la carrera de Ing. En Biotecnología, de los métodos de purificación e
inmovilización enzimática, con el fin de sacar el mayor provecho del campo de la
Enzimología en el área profesional, para así conjuntamente con la Biotecnología, contribuir
con la creciente industria y aportar a la ciencia en nuestro país.

Objetivos:
General:
Realizar una investigación bibliográfica acerca de la purificación e inmovilización
enzimática, enfoque en metodología y aplicación en el campo biotecnológico.
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Específicos:
● Investigar la purificación e inmovilización de las enzimas en fuentes bibliográficas
confiables.
● Describir los diferentes métodos de purificación e inmovilización de las enzimas.
● Conocer sobre las aplicaciones y utilidad de la purificación e inmovilización de las
enzimas a escala industrial para futuras aplicaciones.
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CAPÍTULO I
Purificación enzimática
1.1. Generalidades de la purificación enzimática
La purificación enzimática conlleva varios procesos complejos únicos para cada proteína, en
donde el proceso total depende de la naturaleza bioquímica (estabilidad y actividad
enzimática), uso de la enzima (analítica e industrial), complejidad del proceso de purificación
referente a costos tecnológicos. Es importante purificar una enzima de un sustrato para lograr
eliminar las moléculas no importantes o indeseables para el fin, puesto que cada proteína
necesita de un tratamiento distinto para evitar su desnaturalización (Hurtado, 2005).

Al realizar una metodología de purificación se deben tomar en cuenta varios factores como
son los factores físicos y químicos que nos permitan la máxima productividad y aminorar
costos, analizar los rendimientos de manera ascendente, la capacidad del procesamiento de
manera ascendente, aprovechar condiciones y características de la muestra fina.

Fig. 1 Características de una purificación enzimática.

El extracto donde se afirma que está la enzima, está compuesto por numerosas moléculas que
se necesitará eliminar para la purificación de la enzima. Para saber por cual método proceder,
dependerá de la fuente biológica, el pH, la concentración y de sus características
fisicoquímicas (Campbell, et al, 2003).

Existen numerosos métodos, desde los clásicos como el fraccionamiento proteico, la

filtración mediante geles, como la electroforesis, hasta la transición de sustancias de una fase
a otra, cromatografía o precipitación de la enzima. La elección de la técnica es un proceso de
prueba y error, sin embargo la naturaleza de la enzima nos puede ayudar para la selección de
un método, y el seguimiento ordenado de pasos facilitará el proceso, principalmente se toma
en cuenta la eliminación de ácidos nucleícos, eliminación de partículas sólidas y finalmente el
aumento de la concentración.
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1.2. Métodos de purificación enzimática

1.2.1. Electroforesis
Se la realiza sobre soportes de papel, gel de almidón, agar o dextrano. Existen distintos tipos
de electroforesis según su funcionamiento (Morales, 2008).

1.2.1.1 Electroforesis de frente móvil

Se utiliza para separar proteínas de bajo peso molecular se utiliza para compuestos
ionizados sometidas a un campo eléctrico y se movilizan hacia el polo de carga
opuesta, es decir, las que se encuentran cargadas positivamente se dirigen al cátodo y
las cargadas negativamente, al ánodo (Morales, 2008).

Fig.2 Aparato de electroforesis de frente móvil.

1.2.1.2 Electroforesis de zona

En este tipo de electroforesis, el corrimiento de la muestra se hace sobre un soporte de
papel sólido que generalmente es celulosa. Solo se requiere una pequeña cantidad de
muestra, lo que aumenta su resolución ya que se presenta en discretas zonas o bandas.
Se requiere de una fuente de alimentación que proporciona el campo eléctrico
formado por los dos electrodos y generando una diferencia de potencial. Una cubeta
en la cual se sitúan los electrodos y el soporte electroforético (Morales, 2008).

Fig.3 Modelo de un mecanismo de electroforesis.

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1.2.1.3 Electroforesis en gel de Poliacrilamida

Es un método que se aplica a proteínas y en ciertas ocasiones a ácido nucleicos. Se
recomienda que si se lleva a cabo en geles se lo realice en poliacrilamida ya que
aumenta la resolución de las bandas en comparación con los geles de agarosa, la
característica principal de los geles que se utilizan es de porosidad variables regulable
y se compone de acrilamida y bis-acrilamida. El campo eléctrico influye en la
velocidad de migración en función de la carga y la masa que presenten las proteínas,
ya que las proteínas más grandes se mueven más lentamente y esto a su vez se ve
influenciado por el tamaño del poro (Morales, 2008).

Fig.4 Modelo de Electroforesis en gel de Poliacrilamida

1.2.1.4 Electroforesis en gel de agarosa

Su utilidad radica en la separación de moléculas de alto peso molecular, su porosidad en
comparación con los geles de poliacrilamida es mucho mayor a pesar de su regulación con la
concentración. Las proteínas se movilizarán a través del gel por el campo eléctrico generado
(Morales, 2008).

Fig.5 Electroforesis en gel de agarosa.

1.2.1.5 Isoeléctroenfoque
El Isoelectroenfoque es un tipo de electroforesis que se emplea para separar moléculas
cargadas. Una proteína tiene grupos cargados de ambas polaridades, por lo que presenta un
punto isoeléctrico (pI) que corresponde al valor de pH al cuál la molécula posee carga neta (z)
igual a cero (zwitterion), y por lo tanto es inmóvil en un campo eléctrico.

Se establece un gradiente de pH en el gel de poliacrilamida, que puede tener forma de cilindro

o lámina, realizando una electroforesis de una mezcla de polianfolitos (polímeros pequeños
con múltiple carga). El gel suele tener urea, de concentración cercana a 6M, que a diferencia
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del SDS no posee carga y no puede afectar en forma directa la carga neta de las proteínas. Se
coloca la muestra (mezcla de proteínas obtenida) en un buffer de baja fuerza iónica y con la
aplicación de una diferencia de voltaje, las proteínas cargadas se desplazan hasta alcanzar un
pH equivalente a su punto isoeléctrico

Al aplicar la diferencia de potencial las proteínas que se encuentran en regiones de pH inferior

a su punto isoeléctrico estarán cargadas positivamente, y migran hacia el cátodo; mientras que
aquellas que se encuentran en regiones de pH más altos que su punto isoeléctrico tendrán
carga negativa y migrarán hacia el ánodo (Martínez, 2012).

Fig.6 Isoelectroenfoque o electroforesis bidimensional

1.2.2. Cromatografía
La cromatografía describe un procedimiento químico en el que se separa una mezcla en sus
componentes individuales mediante una fase móvil y una fase estacionaria. La fase estacionaria
consta, según el procedimiento, de materia sólida o un líquido, y la fase móvil de un líquido o gas. La
cromatografía usa diferentes procedimientos, que según el campo de aplicación tiene sus ventajas y
desventajas. Los procedimientos más importantes son la cromatografía en papel, la cromatografía en
capa fina, la cromatografía en columna y la cromatografía de gases (encontrará una breve descripción
al final de la página). Las aplicaciones prácticas de la cromatografía se encuentran por ejemplo en la
producción, donde se usa la cromatografía para la limpieza y aislamiento de sustancias. Por otro lado,
en la analítica química se usa la cromatografía para separar mezclas en compuestos homogéneos
(PCE, 2018).

1.2.2.1. Cromatografía de afinidad

La cromatografía por afinidad es un tipo de cromatografía de líquidos que se basa en
la unión reversible entre un analito de interés y un ligando específico, inmovilizado en
un soporte sólido inerte. Cuando la muestra pasa por la columna, sólo son retenidas
las moléculas que se unen de manera selectiva al ligando por afinidad y las que no se
unen avanzan con la fase móvil. Después, los analitos retenidos pueden ser arrastrados
cambiando las condiciones de la fase móvil (Fiehlds, 2019). Los ligandos por afinidad
característicos son anticuerpos, inhibidores de enzimas, o compuestos más generales,
como las lectinas (que se enlazan a polisacáridos). Se fijan mediante enlaces
covalentes a la fase estacionaria químicamente activada (Fiehlds, 2019). Se utiliza
 10

principalmente con fines preparativos en análisis cuantitativos, pues permite aislar

con rapidez biomoléculas en estudios bioquímicos.

Fig.7 Principio de la cromatografía de afinidad

1.2.2.2. Cromatografía de interacción hidrofóbica
La cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) es una de las principales técnicas
utilizadas para la separación y purificación de proteínas en procesos biotecnológicos.
En HIC, las proteínas se unen reversiblemente a ligandos hidrofóbicos que se
encuentran inmovilizados en el soporte cromatográfico, debido a la presencia de una
elevada concentración de sal. La elución se logra disminuyendo la fuerza iónica en la
fase móvil, formando un gradiente decreciente (Mahan, 2009).

Fig.8 Principio de la cromatografía de interacción hidrofóbica

La figura representa una proteína unida a un ligando y la expulsión del agua ordenada.
La estructura de los enlaces de hidrógeno del agua líquida es perturbada por la
presencia de solutos no polares. Las moléculas de agua forman un caparazón
alrededor del ligando hidrofóbico y la superficie de la proteína hidrofóbica donde la
estructura del enlace de hidrógeno es más ordenada que en la mayoría del solvente.

1.2.2.3. Cromatografía de fase reversa

La cromatografía en fase reversa (RPC) permite separar moléculas en base a su
polaridad. El principio de la cromatografía en fase reversa es semejante al de la
cromatografía en capa fina. Sin embargo, aquí la fase estacionaria es de partículas de
sílica químicamente modificadas con hidrocarburos saturados, insaturados o
aromáticos de diferentes tipos. Esto convierte a la fase estacionaria en una matriz
apolar. Por lo tanto, para este tipo de cromatografías se emplean mezclas de solventes
polares, tales como agua, acetonitrilo, acetato de etilo, acetona y alcoles alifáticos
(UNAM, 2013).
 11

Fig.9 Principio de la cromatografía de interacción hidrofóbica

1.2.2.4. Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia

La cromatografía líquida (HPLC), es una técnica utilizada para separar los
componentes de una mezcla. Consiste en una fase estacionaria no polar (columna) y
una fase móvil. La fase estacionaria es sílica que se ha tratado con RMe2SiCl . La
fase móvil actúa de portador de la muestra. La muestra en solución es inyectada en la
fase móvil. Los componentes de la solución emigran de acuerdo a las interacciones
no-covalentes de los compuestos con la columna. Estas interacciones químicas,
determinan la separación de los contenidos en la muestra. La utilización de los
diferentes detectores dependerá de la naturaleza de los compuestos a determinar
(Miranda & Martín, 2012).

Fig.10 Equipo de cromatografía líquida de alta eficiencia.

1.2.2.5. Separación por precipitación (solubilidad diferencial)

La precipitación es una de las técnicas usualmente usadas como un paso de separación
durante las primeras etapas de un proceso de purificación, y normalmente es seguida
por otro tipo de separaciones, como la cromatografía. Proceso por el cual se provoca
una alteración de alguna propiedad del solvente original, el resultado es la
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precipitación de la proteína. Depende de la composición y distribución de los

aminoácidos periféricos; los aminoácidos hidrofóbicos tienden a encontrarse en el
interior de la molécula, mientras que los hidrofílicos en la superficie; la estructura
tridimensional y en entorno de la propia proteína como la temperatura, pH, fuerza
iónica son factores que alteran la solubilidad (Lupano, 2013).

1.2.3. Precipitación
1.2.3.1. Precipitación salina
La precipitación salina o salting-out es la técnica que aprovecha las características de
las sales para fraccionar proteínas, es decir, la proteína es deshidratada con alta
concentración de sales para ocasionar su precipitación. Al quedar en libertad las
regiones hidrofóbicas para combinarse intermolecularmente, estas forman agregados
y precipitan más rápido (Rodríguez, 2009).
Las sales comúnmente utilizadas incluyen al sulfato amónico –(NH4)2SO4– y el
cloruro sódico –NaCl– (Rodríguez, 2009)

Fig.11 Método de precipitación salina o salting-out

1.2.3.2. Precipitación isoeléctrica

La naturaleza anfotérica de las proteínas hace que tenga carga negativa a pH altos y
una carga neta positiva a pH bajos. El pH isoeléctrico al cual la carga neta de la
proteína es cero, permite que la molécula sea incapaz de desplazarse en un campo
eléctrico (Tejeda et al., 2011). Cuando la proteína alcanza el punto isoeléctrico, las
cargas positivas y negativas se neutralizan y la repulsión electrostática no se da.
En esta técnica las proteínas migran hasta la zona del gel donde el pH es igual al
punto isoeléctrico (pI) de la proteína. Se utiliza un gel de poliacrilamida (PAGE) en
gradiente de pH (Rodríguez, 2009).
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Tabla.1 Punto isoeléctrico de las principales proteínas

1.2.3.3. Precipitación con solventes orgánicos

Esta técnica se basa en la disminución de la solubilidad por adición de solventes
orgánicos. La adición de un solvente orgánico ligeramente polar a una solución
acuosa de proteína produce agregados de moléculas proteicas que tienden a precipitar
(Tejada et al., 2011). Esto se da porque el solvente presenta una constante dieléctrica
menor que la del agua, lo que produce un incremento en las fuerzas de atracción entre
cargas opuestas y una disminución en el grado de ionización de los radicales de la
proteína, y por ende una disminución de la solubilidad de ésta (Rodríguez, 2009). Es
de vital importancia escoger correctamente el solvente para evitar la desnaturalización
de la proteína, por lo tanto se debe conocer si son inflamables, no debe reaccionar con
la proteína y debe ser un buen agente precipitante (Tejeda et al., 2011).
1.2.3.4. Precipitación con polímeros no iónicos
La precipitación aplicando polímeros neutros, de alto peso molecular, solubles en
agua y soluciones con viscosidad moderada en vez de sales o solventes, excluyen a las
proteínas de la solución y reduce la cantidad efectiva de agua disponible para su
solvatación. Un ejemplo de estos polímeros es el polietilenglicol (PEG) (Tejada et al.,
2011).
1.2.4. Ultrafiltración
La ultrafiltración es un proceso de membrana para separar enzimas en función al tamaño de
las moléculas a través de la membrana en respuesta a una fuerza impulsora de presión dada.
La separación provoca que las especies más grandes que los poros de la membrana sean
retenidos por completo mientras que las especies más pequeñas pasan libremente. Las
membranas semipermeables de ultrafiltración tienen un tamaño de poro medio entre 10 y 500
Å (Ramos & Malcata, 2017). Por lo tanto, separa los disolventes de los solutos de distintos
tamaños. El resultado de la eliminación del disolvente de una solución es la concentración o
el enriquecimiento del soluto. La dilución y la reconcentración repetidas o continuas se
utilizan para eliminar sales o purificar enzimas solubles en agua, dado que no involucran
agentes químicos y no generan desnaturalización térmica (Schratter, 2004)
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1.2.4.1. Ultrafiltración microporosa

La ultrafiltración por microporo consta de un filtro convencional con membrana
rígida y con orificios pequeños de 500-5000 Å por donde atraviesan moléculas muy
pequeñas mientras las grandes quedan retenidas. Cuando en estos filtros penetran
moléculas de tamaño medio los filtros quedan taponados lo que reduce la capacidad
de filtración y hace la discriminación peor (Scawen & Melling, 1991).
1.2.4.2. Ultrafiltración de difusión
La ultrafiltración de difusión se basa en el transporte de solventes y solutos por
difusión molecular por gradiente de concentración. Este proceso requiere una cantidad
de energía cinética considerable y es activado térmicamente. Además, es importante
que la membrana esté hidratada y que haya afinidad entre el polímero y el solvente
(Scawen & Melling, 1991).
1.2.5. Manipulación genética
Para purificar enzimas mediante manipulación genética y cromatografía de afinidad se deben
realizar 6 pasos generales (Acebal & De la Mata,2019).

1. Aislar y modificar el gen de una proteína, el cual se quiere purificar

2. Expresar el gen recombinante en una bacteria apropiada
3. Preparar un soporte gelificado con un grupo químico que se una a la proteína
recombinante
4. Cultivar la bacteria recombinante, expresando así la proteína
5. Aplicar un extracto acelular de la bacteria a la columna, de tal manera que la proteína
se una al gel
6. Aplicar una solución con un ion que desplace a la proteína del gel.

Fig.12 Purificación de enzimas por manipulación genética.

 15

CAPÍTULO II
Inmovilización enzimática
2.1. Generalidades de la Inmovilización enzimática:
Es el proceso que se encarga de confinar, ubicar o localizar a la enzima en un sector o región
definida del espacio, dando lugar a formas insolubles que mantienen o limitan su actividad
catalítica, por lo que pueden ser reutilizadas repetidamente.

También se entiende a la inmovilización enzimática como el proceso por el cual se restringen,

ya sea parcial o completamente, los grados de libertad del movimiento de enzimas, células,
orgánulos, y otros componentes biológicos (Datta, Christena y Rajaram, 2013).

2.2 Métodos de Inmovilización Enzimática

2.2.1 Por retención física

Fig.13 Métodos de retención física de inmovilización enzimática.

2.2.1.1 Atrapamiento
Es la retención física de la enzima en cavidades interiores de una matriz porosa y
sólida, que se forma por prepolímeros foto entrecruzados o de tipo poliacrilamida
colágeno, alginato, carragenato, o incluso resinas de poliuretano (Cebrían, 2020). El
proceso requiere la suspensión de la enzima en una solución del manómetro, que una
vez realizada, se iniciará la polimerización ya sea por variación de temperatura o por
la adición de reactivos químicos. Finalmente, el atrapamiento se realiza en geles (más
resistentes) o en fibras.

2.2.1.2 Inclusión en membranas

● Microencapsulación
Consiste en mantener las enzimas rodeadas de membranas semipermeables
(permanentes o no permanentes) que limitarán el paso de la enzima, más no el de
moléculas de sustrato y producto. Del proceso, se obtienen simultáneamente
microcápsulas de forma esférica en tamaños de 1-100 um de diámetro con gran
variedad de enzimas
 16

● Reactores de membrana
En el proceso se utilizan membranas permeables al producto final, permeables o no
permeables al sustrato inicial, e impermeables a la enzima. El proceso hace uso de
reactores o sistemas que contienen enzimas atrapadas, cuyo desarrollo es de gran
interés industrial (Datta, Christena y Rajaram, 2013).

2.2.2 Por unión química

Fig.14 Métodos de retención química de inmovilización enzimática.

2.2.2.1 Unión a soportes

Con el fin de que la inmovilización aumenta la afinidad al sustrato, el intervalo del pH
óptimo y disminuya la inhibición y las contaminaciones microbianas, en la
inmovilización de unión química a soportes, se debe procurar que el soporte tenga
resistencia mecánica necesaria para actuar en el reactor, y que así sea fácilmente
separable del medio líquido. Estos factores mencionados son determinantes en cómo
el biocatalizador reaccionara en su momento, así como la posibilidad de una
reutilización del soporte (Datta, Christena y Rajaram, 2013).

Existen algunos materiales conocidos y mayoritariamente utilizados como soportes, y

estos deben poseer algunas características, ya sea que difieran en ellas:
● Tamaño
● Densidad
● Porosidad y forma (Cilindro, hojas, fibras, y esfera

2.2.2.2 Adsorción
Método que consiste en la capacidad de la enzima de unirse a un soporte sin la
necesidad de interacciones iónicas, fuerzas de Van der Waals, o puentes de hidrógeno,
se ve influenciada por cuatro principales factores (Datta, Christena y Rajaram, 2013):
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● pH del medio: Influye tanto en la naturaleza como en el número de cargas que

presenta la proteína y el sólido, mayoritariamente en su superficie.
● Fuerza iónica: Causa la desorción de la enzima cuando su valor aumenta, esto
debido a que los iones inorgánicos adquieren mayor fuerza para unirse al
soporte, en relación a la que tiene la proteína.
● Diámetro del poro: Para que sea un valor significativo en la adsorción, este
debe cumplir dos veces el tamaño del eje mayor de la enzima.
● Cofactores: Deben existir iones que actúan como cofactores para que así
puedan incrementar la carga enzimática del derivado.

El método de adsorción tiene una ventaja significativa en comparación a los otros

mencionados, ya que su preparación es de bajo costo y sencilla de realizar, además
que no realiza cambios en la especificidad de la enzima, evitando procesos
innecesarios, además de que, en este proceso, los derivados son estables en medios
con bajo contenido de agua (Datta, Christena y Rajaram, 2013).

2.2.2.3 Unión covalente

El método se fundamenta en la activación de grupos químicos del soporte, de tal
manera que reaccionan con nucleófilos de las proteínas. Aminoácidos (aa) como
lisina, cisteína, tirosina e histidina, se usan comúnmente para la formación de enlaces
con el soporte, mientras que el resto de aa, no intervienen en la unión covalente ni se
exponen hacia el exterior de la superficie proteica debido a su característica
hidrofóbica (Fajardo, Osuna, Velasquez, & Escalante, 2011).

En técnica contiene ventajas ya que la manipulación de sus derivados inmovilizados

es sencilla, la carga enzimática es constante aún después de la inmovilización, sus
derivados son reutilizables en reactores en continuo, empaquetados, y de lecho
fluidizado, y además se obtiene resistencia a la desactivación por temperatura,
disolventes y pH (Datta, Christena y Rajaram, 2013).

2.2.2.4 Reticulado
La técnica de cross-linking, entrecruzamiento, o reticulado, consiste en el uso de
reactivos bifuncionales que generan uniones intermoleculares entre las moléculas de
la enzima, dando como resultado a enzimas con enlaces intermoleculares irreversibles
que son muy resistentes a condiciones extremas de temperatura y pH. Algunos de los
reactivos que se emplean debido a su característica bifuncional son dialdehídos,
diimeinoésteres, diisocianatos, sales de bisdiazonio y diaminas activadas con
carbodiimida (Cebrían, 2020).

Por otra parte, existe el co-reticulado, que elimina las pérdidas de actividad
enzimática causadas por efectos difusionales. Este proceso se hace mediante
entrecruzamiento de las enzimas con una proteína rica en residuos de lisina, que
además no tenga actividad. Otra técnica para evitar el co-reticulado, es posteriormente
 18

a la inmovilización por adsorción sobre resina de intercambio iónico, añadir el

reactivo bifuncional (Fajardo, Osuna, Velasquez, y Escalante, 2011).

2.2.3 Efectos de la inmovilización

La inmovilización de las enzimas afecta de manera significativa en su
comportamiento, desde su estabilidad, hasta la influencia del pH, sustratos, productos,
inhibidores, cofactores, activadores en la enzima como sistema heterogéneo (Arroyo,
2015).

Estos factores intervienen en el proceso catalítico al encontrarse en interfase, es decir

en el medio de reacción y en la fase de soporte con la enzima. Así, la inmovilización
influye en la actividad enzimática, tanto de manera difusional como estética y de
microentorno, tema que se tratará con mayor profundidad en el siguiente apartado.

2.2.4 Efectos de la inmovilización en la actividad enzimática

La actividad enzimática, según Arroyo (2015), se ve afectada después de la
inmovilización hasta terminar en 2 maneras distintas, ya sea una pérdida total, o
pérdida parcial.

2.2.4.1 Pérdida total

● Se impide el paso del sustrato al centro activo, esto debido al tipo y forma en
que se une al soporte.
● Sucede una variación en la reacción de los grupos reactivos del soporte, que de
manera equívoca reaccionan con aminoácidos que forman parte del centro
activo esencial para la actividad catalítica de la enzima.
● Se obtienen cambios conformacionales de la enzima, aquellos que son
inactivos.
● Durante el proceso experimental se dan condiciones causantes de
desnaturalización o desactivación de la enzima.

2.2.4.2 Pérdida parcial

La pérdida parcial es causada mayoritariamente por efectos difusionales, estéricos o
del microentorno, y electrostáticos.
● Difusionales: Se impide la difusión de los sustratos hacia el centro activo de
la enzima, esto por resistencias, ya sea externas o internas.
● Externas: El sustrato debe atravesar una película líquida estacionaria que
rodea al soporte, en el caso que este sea insoluble. Se da cuando existe un
gradiente de concentración a través de la zona de difusión causado por una
menor concentración de sustrato que del resto de la disolución, esto en casos
de soportes no cargados. Así, los valores de Km de enzimas inmovilizadas son
aparentes en todas las ocasiones.
● Internas: Efecto causado debido a la necesidad de los sustratos de atravesar el
interior del gel, microcápsula, fibra o poro del soporte donde se encuentra la
enzima inmovilizada.
 19

Se puede reducir el impacto de estos efectos disminuyendo el tamaño del

biocatalizador, aumentando la concentración de sustrato, o incluso incrementando la
agitación y flujo en el reactor.
● Electrostáticos: Cuando el sustrato y el soporte tienen la misma carga, estos
se repelen mutuamente, reacción contraria si las cargas son distintas, de tal
manera que el valor de Km se reduce por debajo del obtenido en disolución.
● Estéricos: Es causado por sustratos con pesos moleculares elevados, donde el
tamaño del sustrato disminuye la actividad enzimática drásticamente.
● Microentorno: Sucede en casos donde el soporte contiene grupos cargados
eléctricamente, modificando el entorno común a la enzima a uno diferente e
inusual, desplazando el valor del pH óptimo de la catálisis enzimática, y
agrandando el intervalo de pH funcional.

2.3 Comparación de diferentes métodos de inmovilización

Con el fin de comparar los métodos de inmovilización mencionados, se analizará su
capacidad y facilidad de preparación, fuerza de unión, actividad enzimática obtenida,
regeneración del soporte, coste del proceso, estabilidad, validez, y resistencia microbiana,
como muestra la siguiente tabla:

Tabla 1. Comparación de métodos de inmovilización

De la tabla anterior, se puede concluir que los métodos que proporcionan

biocatalizadores estables y duraderos son, por lo general, de preparación más difícil y
de mayor coste, mientras que aquellos cuyos derivados presentan pérdida de actividad
y deben reponerse son, por el contrario, más sencillos y de coste menor.

Conclusiones
Se obtuvo información sobre los métodos de purificación e inmovilización de enzimas en
artículos y capítulos de libros que se encuentran en bases de datos científicas como
Springerlink o ScienceDirect aportando de esta manera información confiable sobre los
métodos de inmovilización y purificación descritos.
Se describió los métodos de inmovilización enzimática con fundamentos en técnicas como la
cromatografía, electroforesis, precipitación, ultrafiltración y manipulación genética; siendo los más
 20

utilizados aquellos que implican la precipitación puesto que son mucho más baratos, sin embargo no
son aplicables para todas las enzimas.

La purificación e inmovilización enzimática son muy importantes a nivel industrial, pues muchos de
los procesos necesitan cierto grado de pureza enzimática para alcanzar la cantidad de producto
requerido para su comercialización.

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 FICHA TÉCNICA FICINA
Arias Lisette1, Martínez Gabriela2, Poaquiza Andrea3
Departamento de Ciencias de la Vida y la Agricultura/Ingeniería en Biotecnología/Universidad de las
Fuerzas Armadas ESPE

Ficina (Devaraj et al., 2008).

Nombre común
Otros nombres Debricin; higueroxyl delabarre; ficaina (PubChem, 2016)
Peso molecular 23-26 kDa (López et al., 1994).
Clasificación Hidrolasa (RCSB Proteine Bank, 2016).

Estructura

Fig. 1 Estructura 3D.

Fuente: (NCBI/CBB/Structure, 2016).

Reacción

Fig. 2. Reacción catalizada por ficina

Fuente: (Bertoluzzo et al., 2008)

Sitio activo
Fig. 3. Comparación de la secuencia de aminoácidos del sitio activo de la Ficina y la Papaína
Fuente: (López et al., 1994).
 El sitio catalítico de la ficina contiene un grupo sulfhidrilo que se acila durante la reacción entre
la enzima y el sustrato (Hammond & Gutfreund, 1959). La ficina reacciona con el sustrato en
tres pasos: la rápida formación de un complejo enzima-sustrato suelto; el grupo -SH del centro
activo de la enzima es acilado por el grupo carbonilo del sustrato; la descomposición de la enzima
acilante produce enzimas y productos (Liener, 1970).

Mecanismo de
reacción

Fig. 4. Mecanismo de reacción que sucede en el sitio activo de la enzima

Fuente: (Metrione, 1963).
Cofactor No requiere (Miyazawa et al., 1994).
Número EC 3.4 (Zare et al., 2013).
Número CAS 9001-33-6 (Chem Book, 2017).

Matriz Látex de Árboles del género Ficus: Ficus glabrata, Ficus Elastica y Ficus carica (López et al.,
1994).
Hidroliza péptidos, amidas y ésteres, y ha sido también denominada “pepsina vegetal”. Se ha
utilizado en la digestión de proteínas, para el ablandamiento de carnes y en la fabricación de
Sustrato
quesos (Bertoluzzo et al., 2008).

Cistatina de la clara de huevo de gallina, yodoacetamida, ácido yodoacético, N-etilmaleimida,

Inhibidores cloruro de mercurio, DFP (Diisopropil fluorofosfato), TLCK (N-p-tosil-lisina clorometilo
cetona), TPCK (N-tosil-L-fenilalanina clorometil cetona) (Fisher Scientific, 2021).
Activador Requiere la activación por agentes reductores, la inclusión de 4 mM de cisteína en los
tampones de ensayo da resultados satisfactorios (Singleton & Buttle, 2013).
Temperatura
65°C se inactiva totalmente a los 80°C (Liener, 1970)
óptima
5-8 (Liener, 1970)
pH óptimo
La ficina puede inhibir el deterioro de las frutas, por lo que puede utilizarse como
conservante de alimentos naturales como verduras, frutas, camarones, etc. Tiene una amplia
gama de aplicaciones en medicina, alimentación, industria ligera, cosmética, piensos e
investigación en ciencias de la vida. La ficina se utiliza principalmente para la resistencia
al frío de la cerveza (hidrólisis de la proteína en la cerveza para evitar la turbidez causada
por la refrigeración); ablandamiento de la carne (hidrólisis de la proteína muscular y el
colágeno para ablandar la carne); regulador de la masa durante el horneado; fabricación de
queso como coagulante de emulsión (sustituye al cuajo). Separación del caparazón del
cangrejo de la carne para conseguir el descascarillado mecanizado, y también para separar
la carne de la almeja de sus órganos internos. También puede utilizarse como aditivo para
pesticidas y cosméticos (Liener, 1970).

Aplicaciones

Fig. 5. Aplicaciones Ficina

Fuente: (Badui, 2013)
El látex de los árboles de higo contienen lisozimas, quitinasa y peroxidasa, enzimas que junto
Funciones con la ficina podrían contribuir a proteger a los árboles de los parásitos (Yujra & Giménez,
2011).
 BIBLIOGRAFÍA

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Devaraj, K. B., Kumar, P. R., & Prakash, V. (2008). Purification, Characterization, and Solvent-Induced Thermal Stabilization of

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Yujra, J., & Giménez, A. (Asesor). (2011). Caracterización del contenido de proteinas y de la actividad proteolítica del latex

proveniente de especies de Ficus spp., nativas de Bolivia y Perú [Thesis].

http://repositorio.umsa.bo/xmlui/handle/123456789/18167

Zare, H., Moosavi-Movahedi, A. A., Salami, M., Mirzaei, M., Saboury, A. A., & Sheibani, N. (2013). Purification and autolysis
of the ficin isoforms from fig (Ficus carica cv. Sabz) latex. Phytochemistry, 87, 16-22.

https://doi.org/10.1016/j.phytochem.2012.12.006
Métodos de Purificación
e Inmovilización
Enzimática
ARIAS LISETTE
MARTÍNEZ GABRIELA
POAQUIZA ANDREA
 Objetivos
General:
Realizar una investigación bibliográfica acerca de la purificación e inmovilización
enzimática, enfoque en metodología y aplicación en el campo biotecnológico.

Específicos:
● Investigar la purificación e inmovilización de las enzimas en fuentes
bibliográficas confiables.
● Describir los diferentes métodos de purificación e inmovilización de las
enzimas.
● Conocer sobre las aplicaciones y utilidad de la purificación e inmovilización de
las enzimas a escala industrial para futuras aplicaciones.

Siglo XIX en Dinamarca y Japón
Método de purificación enzimática
Proteínas especializadas capaces
de acelerar la velocidad de una
reacción química, promoviendo así
la transformación de diferentes
moléculas en productos específicos
Las plantas han
sido la fuente
tradicional de
ciertas enzimas
Antecedentes
● Aspecto económico del proceso
● Ambiente bio-compatible
● Aplicación de criterios sin
comprometer el producto
Enzimas inmovilizadas
Los intentos de inmovilizar una enzima
no se realizaron sino hasta la segunda
Físicamente confinadas a una
mitad del siglo pasado, con la
cierta región definida de espacio
inmovilización de carboxipeptidasa,
con retención de su actividad
diastasa, pepsina, y ribonucleasa
catalítica
Desde la obtención de enzimas a nivel
industrial, la calidad de estas ha sido uno
de los inconvenientes más estudiados, y es
que la utilidad o aplicación que se vaya a
dar al producto depende de la efectividad
del mismo y del proceso
 Justificación
La implementación de la tecnología enzimática, además
de disponer de la fuente de la enzima, requiere métodos
de purificación e inmovilización para facilitar su aplicación
a nivel industria.

La aplicación de estos procesos requiere de una serie de

pasos a seguir de tal manera que se aprovechen las
propiedades bioquímicas de la enzima.

Esta revisión bibliográfica busca describe los diferentes

métodos de purificación e inmovilización enzimática con el
fin entender las técnicas aplicables en la Enzimología y
contribuir con la creciente industria.
 01
Purificación
Enzimática
 Generalidades de la purificación enzimática
● Naturaleza bioquímica (estabilidad y actividad enzimática)
Procesos complejos únicos Depende de:
● Uso de la enzima (analítica e industrial)
para cada proteína
● Complejidad del proceso de purificación referente a costos tecnológicos

Factores físicos y químicos: Existen numerosos métodos,

● Máxima productividad y desde los clásicos como el
aminorar costos fraccionamiento proteico, la
● Analizar los rendimientos filtración mediante geles, como la
electroforesis, hasta la transición
de manera ascendente
de sustancias de una fase a otra,
● La capacidad del cromatografía o precipitación de
procesamiento de la enzima. La elección de la
manera ascendente técnica es un proceso de prueba y
● Aprovechar condiciones error, sin embargo la naturaleza
● Características de la de la enzima nos puede ayudar
muestra fina. para la selección de un método

El extracto donde se afirma que está la enzima, está compuesto por numerosas moléculas que se
necesitará eliminar para la purificación de la enzima. Para saber por cual método proceder, dependerá de
la fuente biológica, el pH, la concentración y de sus características fisicoquímicas
 02
Métodos de
Purificación

Electroforesis de
frente móvil
Separar proteínas de bajo
peso molecular se utiliza
para compuestos ionizados
sometidas a un campo
eléctrico y se movilizan
hacia el polo de carga
opuesta, es decir, las que
se encuentran cargadas
positivamente se dirigen al
cátodo y las cargadas
negativamente, al ánodo
ELECTROFORESIS
Electroforesis de Electroforesis en gel Electroforesis en
zona de Poliacrilamida gel de Agarosa
Se aplica a proteínas y en Su utilidad radica en la
El corrimiento de la muestra separación de moléculas de
ciertas ocasiones a ácido
se hace sobre un soporte de alto peso molecular, su
nucleicos. Se lleva a cabo en
papel sólido que porosidad en comparación
geles se lo realice en
generalmente es celulosa. Se con los geles de
poliacrilamida ya que
requiere una pequeña poliacrilamida es mucho
aumenta la resolución de las
cantidad de muestra, lo que mayor a pesar de su
bandas. El campo eléctrico
aumenta su resolución, regulación con la
influye en la velocidad de
presenta discretas zonas o concentración. Las proteínas
migración en función de la
bandas. Una cubeta en la se movilizarán a través del gel
carga y la masa que
cual se sitúan los electrodos por el campo eléctrico
presenten las proteínas
y el soporte electroforético generado
 Isoelectroenfoque
Una proteína tiene grupos cargados de ambas
polaridades, por lo que presenta un punto isoeléctrico
(pI) que corresponde al valor de pH al cual la
molécula posee carga neta (z) igual a cero
(zwitterion), y por lo tanto es inmóvil en un campo
eléctrico.
● Emplea para separar moléculas cargadas.
● Se establece un gradiente de pH en el gel de poliacrilamida
● El gel suele tener urea, de concentración cercana a 6M
● Buffer de baja fuerza iónica y con la aplicación de una diferencia de
voltaje
● Proteínas cargadas se desplazan hasta alcanzar un pH equivalente a
su punto isoeléctrico

Al aplicar la diferencia de potencial las proteínas que se encuentran en

regiones de pH inferior a su punto isoeléctrico estarán cargadas
positivamente, y migran hacia el cátodo; mientras que aquellas que se
encuentran en regiones de pH más altos que su punto isoeléctrico tendrán
carga negativa y migrarán hacia el ánodo
Cromatografía de afinidad
Cromatografía de líquidos que se basa en la unión
reversible entre un analito de interés y un ligando
específico, inmovilizado en un soporte sólido inerte. Cuando
la muestra pasa por la columna, sólo son retenidas las
moléculas que se unen de manera selectiva al ligando por
afinidad y las que no se unen avanzan con la fase móvil.
Después, los analitos retenidos pueden ser arrastrados
cambiando las condiciones de la fase móvil
Cromatografía de interacción
hidrofóbica
Es una de las principales técnicas utilizadas para
la separación y purificación de proteínas en
procesos biotecnológicos. En HIC, las proteínas se
unen reversiblemente a ligandos hidrofóbicos que se
encuentran inmovilizados en el soporte
cromatográfico, debido a la presencia de una
elevada concentración de sal. La elución se logra
disminuyendo la fuerza iónica en la fase móvil,
formando un gradiente decreciente
Cromatografía de Fase
Reversa
Permite separar moléculas en base a su
polaridad. El principio de la cromatografía en
fase reversa es semejante al de la cromatografía
en capa fina. Sin embargo, aquí la fase
estacionaria es de partículas de sílica
químicamente modificadas con hidrocarburos
saturados, insaturados o aromáticos de
diferentes tipos.
 Cromatografía
Líquida de Alta
Eficiencia
Es una técnica utilizada para separar los
componentes de una mezcla. Consiste en una fase
estacionaria no polar y una fase móvil. La fase
estacionaria es sílica que se ha tratado con
RMe2SiCl. La fase móvil actúa de portador de la
muestra. La muestra en solución es inyectada en la
fase móvil. Los componentes de la solución emigran
de acuerdo a las interacciones no-covalentes de los
compuestos con la columna. Estas interacciones
químicas, determinan la separación de los
contenidos en la muestra.
Separación por precipitación
Proceso por el cual se provoca una
alteración de alguna propiedad del solvente
original, el resultado es la precipitación de
la proteína. Depende de la composición y
distribución de los aminoácidos periféricos;
los aminoácidos hidrofóbicos tienden a
encontrarse en el interior de la molécula,
mientras que los hidrofílicos en la
superficie; la estructura tridimensional y en
entorno de la propia proteína como la
temperatura, pH, fuerza iónica son
factores que alteran la solubilidad
 Precipitación

Solventes
Salina Isoeléctrica Polímeros
orgánicos
Deshidratada proteína a El punto isoeléctrico Disminución de Los polímeros
altas concentraciones impide a la molécula excluyen a las
de sales solubilidad por adición
desplazarse en un de solventes orgánicos proteínas de la
campo eléctrico solución
Ultrafiltración
Separar enzimas en función al tamaño de las moléculas a través de la
membrana en respuesta a una fuerza impulsora de presión

Ultrafiltración microporosa
Filtro convencional con membrana rígida y con orificios pequeños de
500-5000 Å

Ultrafiltración de difusión
Transporte de solventes y solutos es por difusión molecular por gradiente de
concentración.
Manipulación Genética
1. Aislar y modificar el gen de una
proteína, el cual se quiere purificar
2. Expresar el gen recombinante en una
bacteria apropiada
3. Preparar un soporte gelificado con un
grupo químico que se una a la proteína
recombinante
4. Cultivar la bacteria recombinante,
expresando así la proteína
5. Aplicar un extracto acelular de la
bacteria a la columna, de tal manera que
la proteína se una al gel
6. Aplicar una solución con un ion que
desplace a la proteína del gel.
 03
Métodos de
Inmovilización
Proceso por el cual se restringen, ya sea
parcial o completamente, los grados de
libertad del movimiento de enzimas,
células, orgánulos, y otros componentes
biológicos

Generalidades de la
Inmovilización enzimática

Es el proceso que se encarga de confinar, ubicar o

localizar a la enzima en un sector o región definida
del espacio, dando lugar a formas insolubles que
mantienen o limitan su actividad catalítica, por lo
que pueden ser reutilizadas repetidamente.
Por Retención Física Atrapamiento: Es la retención física de
la enzima en cavidades interiores de
una matriz porosa y sólida. El proceso
requiere la suspensión de la enzima en
una solución del manómetro químicos.

Inclusión en membranas

Microencapsulación: consiste en
mantener las enzimas rodeadas de
membranas semipermeables que
limitarán el paso de la enzima, más no
el de moléculas de sustrato y producto.

Reactores de membrana: En el proceso se

utilizan membranas permeables al producto
final, permeables o no permeables al
sustrato inicial, e impermeables a la enzima.
El proceso hace uso de reactores o sistemas
que contienen enzimas atrapadas, cuyo
desarrollo es de gran interés industrial
Por Unión Química
Unión a soportes: Soporte debe
tener resistencia mecánica necesaria
para actuar en el reactor, y que así
sea fácilmente separable del medio
líquido

Adsorción: consiste en la capacidad de

la enzima de unirse a un soporte sin la
necesidad de interacciones iónicas,
fuerzas de Van der Waals, o puentes
de hidrógeno, se ve influenciada por
cuatro principales factores: pH, fuerza
iónica, diámetro del poro y cofactores

Unión covalente: Se fundamenta en la

activación de grupos químicos del
soporte, de tal manera que reaccionan
con nucleófilos de las proteínas.

Reticulado: Usa reactivos bifuncionales

que generan uniones intermoleculares
entre las moléculas de la enzima, dando
como resultado a enzimas con enlaces
intermoleculares irreversibles muy
resistentes a condiciones extremas de
temperatura y pH.
 Efectos de la inmovilización
Actividad enzimática
Pérdida Total

- Impide el paso del sustrato al

centro activo.
- Variación en la reacción de grupos
Comportamiento reactivos del soporte, que de Actividad
manera equívoca reaccionan con enzimática
de la enzima aminoácidos del centro activo
Estabilidad
esencial para la actividad catalítica. Pérdida Parcial
- Cambios conformacionales de la
Influencia del pH Sustratos La pérdida parcial es causada por
enzima, inactivos.
Productos efectos:
- Durante el proceso experimental
Inhibidores Difusionales
se dan condiciones causantes de
Cofactores Estéricos
desnaturalización o desactivación
Activadores Microentorno
de la enzima.
Electrostáticos.
Estos factores intervienen en el
proceso catalítico
 Actividad
enzimática
Pérdida Parcial

Difusionales Estéricos
Impide la difusión de sustratos Causado por sustratos con pesos
al centro activo, por resistencias, moleculares elevados, donde el
externas o internas. tamaño del sustrato disminuye la
Externas: Gradiente de concentración a través de actividad enzimática
la zona de difusión causado por menor drásticamente.
concentración de sustrato que del resto de la
disolución, esto en casos de soportes no cargados.

Internas: Efecto causado debido a la necesidad de

los sustratos de atravesar el interior del gel,
microcápsula, fibra o poro del soporte donde se
encuentra la enzima inmovilizada.

Electrostáticos
Cuando el sustrato y soporte tienen la
misma carga, estos se repelen mutuamente.
Reacción contraria si las cargas son
distintas, de tal manera que el valor de Km
se reduce por debajo del obtenido en
disolución.
Microentorno
Casos donde el soporte contiene grupos
cargados eléctricamente, modificando el
entorno común de la enzima a uno
diferente e inusual, desplazando el valor
del pH óptimo y agrandando el intervalo
de pH funcional.
Comparación de diferentes métodos de inmovilización

Los métodos que proporcionan bio catalizadores estables y duraderos son,

por lo general, de preparación más difícil y de mayor coste, mientras que
aquellos cuyos derivados presentan pérdida de actividad y deben reponerse
son, por el contrario, más sencillos y de coste menor.
 Conclusiones
● Se obtuvo información sobre los métodos de purificación e inmovilización de
enzimas en artículos y capítulos de libros que se encuentran en bases de
datos científicas como Springerlink o ScienceDirect aportando de esta manera
información confiable sobre los métodos de inmovilización y purificación
descritos.
● Se describió los métodos de inmovilización enzimática con fundamentos en
técnicas como la cromatografía, electroforesis, precipitación, ultrafiltración y
manipulación genética; siendo los más utilizados aquellos que implican la
precipitación puesto que son mucho más baratos, sin embargo no son aplicables
para todas las enzimas.

● La purificación e inmovilización enzimática son muy importantes a nivel industrial,

pues muchos de los procesos necesitan cierto grado de pureza enzimática para
alcanzar la cantidad de producto requerido para su comercialización.
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