Extracelular 1

Machine Translated by Google
Acceso público del HHS
Manuscrito del autor
j Mech Behav Biomed Mater. Manuscrito del autor; disponible en PMC 2018 21 de enero.
Publicado en forma editada final como:
j Mech Behav Biomed Mater . 2013 diciembre; 28: 183–194. doi:10.1016/j.jmbbm.2013.06.013.
La diferenciación de osteocitos está regulada por la rigidez de la matriz
extracelular y la separación intercelular
CA Mullenab, MG Haughab, MB Schafflerc , Majeskac , y LM McNamaraa,b,* RJ
aCentro de Investigación Biomecánica (BMEC), Ingeniería Mecánica y Biomédica, NUI
Galway, Irlanda bCentro Nacional de Ciencias de la Ingeniería Biomédica (NCBES), NUI Galway,
Irlanda cDepartamento de Ingeniería Biomédica, Grove School of Engineering, City College of
Nueva York, Nueva York, Estados Unidos
Abstracto
Los osteocitos son células óseas diferenciadas terminalmente, derivadas de los osteoblastos, que son vitales
para la regulación de la formación y resorción ósea. Se ha demostrado que la rigidez de la MEC y la densidad de
siembra celular regulan la diferenciación de osteoblastos, pero aún no se comprenden las señales precisas que
inician la diferenciación entre osteoblastos y osteocitos. En este estudio, cultivamos células MC3T3E1 en (A)
sustratos de diferentes composiciones químicas y rigideces, así como (B) sustratos de composición química
idéntica pero diferentes rigideces. El efecto de la separación celular se investigó sembrando células a diferentes
densidades en cada sustrato. Se evaluó la morfología de las células, fosfatasa alcalina (ALP), mineralización de
la matriz, genes específicos de osteoblastos (colágeno tipo 1, factor específico de osteoblastos (OSF2)) y
proteínas específicas de osteocitos (proteína de matriz de dentina 1 (DMP1), esclerostina ( Sost)). Descubrimos
que la diferenciación de los osteocitos (confirmada por la morfología dendrítica, la mineralización, la reducción de
ALP, Col tipo 1 y OSF2 y el aumento de la expresión de DMP1 y Sost) aumentó significativamente en sustratos
blandos basados en colágeno, a densidades de siembra bajas en comparación con las células en sustratos más
rígidos. sustratos o los sembrados en alta densidad de siembra. Proponemos que la naturaleza física de la MEC
y la necesidad de que las células establezcan una red de comunicación contribuyen sustancialmente a un cambio
concertado hacia un fenotipo similar a un osteocito por parte de los osteoblastos in vitro.
Palabras clave
Hueso; osteoblasto; osteocito; diferenciación celular; mecánica extracelular; ambiente
1. Introducción
Los osteocitos constituyen más del 90 % de las células del hueso maduro (Boukhechba et al., 2009).
Desempeñan un papel vital en la salud del esqueleto al actuar como mecanosensores que controlan el
entorno mecánico dentro del tejido óseo y envían señales a los osteoblastos y osteoclastos para que
remodelen el tejido de modo que la fortaleza del hueso se mantenga durante toda la vida (KleinNulend et al.,
1995; Lanyon, 1993; Jee, 2001). Los osteocitos se forman cuando los osteoblastos experimentan un dramático
*Autor para correspondencia en: Universidad Nacional de Irlanda Galway, Departamento de Ingeniería Mecánica y Biomédica,
Galway, Irlanda. Tel.: +353 91 492251; fax: +353 91 563991. Laoise.McNamara@nuigalway.ie (LM McNamara).
Mullen et al. Página 2
transición fenotípica a medida que se incrustan en la matriz ósea recién depositada. Durante esta transición, su
morfología se altera de cuboide a la forma dendrítica asociada con los osteocitos, que se define por un cuerpo
celular redondeado, un núcleo grande y prolongaciones celulares largas que se extienden desde el cuerpo
celular. Estos procesos entran en contacto con las células vecinas tanto dentro como sobre la superficie del
hueso (Marotti et al., 1996; Palazzini et al., 1998; Jee, 2001) y, por lo tanto, forman sincitios funcionales al
establecer una comunicación de unión gap en estos puntos de contacto ( Donahue, 1998; Palazzini et al.,
1998). El patrón de expresión génica de las células también sufre un cambio drástico. La expresión de la
enzima marcadora de osteoblastos fosfatasa alcalina (ALP) se reduce considerablemente (Jee, 2001; Nakano
et al., 2004), junto con una reducción del colágeno tipo I (ColT1), proteína morfogenética ósea 2 (BMP2) y
osteoblastos. expresión específica del factor 2 (OSF2, también conocido como periostina) (Igarashi et al.,
2002; Santos et al., 2011; Wilde et al., 2003). La expresión de osteocalcina (Weinreb et al., 1990; Boivin et al.,
1990) y E11 (Zhang et al., 2006) aumenta, mientras que los marcadores específicos de osteocitos como PHEX
(Westbroek et al., 2002), Sclerostin (Sost ) (Poole et al., 2005) y la proteína de matriz de dentina 1 (DMP1)
(Feng et al., 2003; Rios et al., 2005) son inducidas de novo o dramáticamente reguladas al alza.
El colágeno tipo 1 y el OSF2 son marcadores de osteocitos en etapas tempranas, que se regulan
negativamente a medida que los osteoblastos comienzan a convertirse en osteocitos in vitro (Kato et al.,
1997, 2001). DMP1 se regula positivamente a medida que las células comienzan a extender los procesos y
mineralizar su matriz circundante, mientras que Sost es un marcador de osteocito en etapa tardía necesario
para la regulación de la mineralización (Atkins et al., 2009). La expresión altamente selectiva de moléculas
como (ColT1) y OSF2 en osteoblastos, y Sost y DMP1 en osteocitos ha llevado a su uso como marcadores
fenotípicos en muchos estudios (Kato et al., 2001; Gu et al., 2006; Gooi et al., 2010; Kramer et al., 2010;
Krishnan et al., 2010). Sin embargo, queda muy poca comprensión de las señales que controlan el cambio
fenotípico de osteoblastos a osteocitos.
Entre los posibles estímulos para el cambio fenotípico de osteoblasto a osteocito se encuentran cambios en la
rigidez de la matriz extracelular (ECM) de la célula. Se ha demostrado que la rigidez de la MEC regula
fuertemente una variedad de comportamientos celulares como la migración, la proliferación y la diferenciación
tanto en células osteogénicas como no osteogénicas (Pelham y Wang, 1997; Khatiwala et al., 2006b; Hsiong
et al., 2008) . Se ha demostrado que la diferenciación de MSC junto con diferentes linajes fenotípicos (es decir,
adipogénicos, miogénicos, osteogénicos) depende en parte de la rigidez del sustrato (Engler et al., 2006). En
particular, se demostró que las MSC se diferencian en células similares a los osteoblastos cuando se cultivan
en sustratos de poliacrilamida recubiertos de colágeno, con rigideces en el rango de 25 a 40 kPa, mientras que
las células adquieren las características de neuronas o mioblastos cuando se cultivan en sustratos con valores
de rigidez similares a las del cerebro (≈1 kPa) y del tejido muscular (≈11 kPa), respectivamente.
La distancia de separación de las células, controlada por la densidad de siembra celular, también puede influir
en la diferenciación de las células osteogénicas durante los experimentos de cultivo celular in vitro. La
densidad de siembra celular desempeña un papel en la regulación de la proliferación de osteoblastos y la
mineralización de la matriz en construcciones tridimensionales in vitro (Holy et al., 2000; Xiao et al., 2006),
mientras que la densidad de siembra de las células del estroma de la médula ósea humana es un factor
importante para el desarrollo de construcciones de matriz celular para la ingeniería de tejido óseo (Lode et al.,
2008). Diferenciación osteogénica de MSC en cultivo bidimensional, examinada por ALP y BMP2
También se ha demostrado que la expresión aumenta cuando las células se cultivan a una densidad de
siembra baja (3 × 104 células/cm2 ) (Kim et al., 2009). Sin embargo, hasta la fecha, la investigación sobre los
efectos de la rigidez de la MEC y la separación celular en la diferenciación osteogénica se ha centrado en la
diferenciación de osteoblastos en lugar de la transición osteoblastososteocitos. La diferenciación de osteocitos
es necesaria para la formación de tejido óseo maduro y, como tal, la comprensión de esta etapa de la vía de
diferenciación es crucial para el desarrollo de futuras estrategias de ingeniería de tejidos para el hueso.
En este estudio, probamos la hipótesis de que la diferenciación de osteocitos está regulada tanto por la rigidez de
la MEC como por la separación intercelular. Para abordar esto, empleamos cultivos in vitro de células MC3T3E1
para comparar la diferenciación celular en sustratos de diferentes composiciones químicas y rigideces, así como
en sustratos de composición química idéntica pero rigideces diferentes. El efecto de la separación intercelular se
investiga mediante el cultivo de células a densidades de siembra iniciales variadas en cada uno de los sustratos
elegidos. A continuación, se examina la diferenciación de los osteocitos cuantificando la morfología celular, la
actividad ALP y la mineralización de la matriz, así como la expresión de los genes osteogénicos ColT1, OSF2,
DMP1 y Sost.
2. Materiales y métodos
Se diseñaron experimentos para probar si las células MC3T3E1 (una línea celular preosteoblástica)
experimentarían cambios fenotípicos asociados con la transición osteoblastoosteocitos in vivo, en condiciones
experimentales específicas que investigaron el papel de la composición de la MEC, la rigidez de la MEC y la
densidad de siembra celular. Se evaluaron los cambios morfológicos en las células MC3T3E1, prestando especial
atención al desarrollo de las células dendríticas. La actividad de ALP se cuantificó mediante un ensayo colorimétrico,
la mineralización se evaluó mediante un ensayo de rojo de alizarina/cloruro de cetilpiridinio, mientras que la
expresión de los genes Col Tipo I, OSF2, DMP1 y Sost se cuantificó mediante RTPCR.
2.1. Diseño experimental: experimentos de rigidez del sustrato y densidad de siembra
Los estudios preliminares investigaron el efecto de una variedad de diferentes sustratos y densidades de
siembra en la morfología de MC3T3E1. Los resultados de estos estudios se utilizaron para seleccionar las
condiciones experimentales descritas aquí. Las células MC3T3E1 se colocaron en placas a densidades de
siembra de 103 o 104 células/cm2 y se cultivaron en: (a) colágeno neutralizado con NaOH (Col), (b) colágeno
etilcarbodiimida reticulado con (3dimetilaminopropil)
nortecon
(NEDAC)
aOH reticulado
a 2,5 mM
c(on
ColEDAC1),
EDAC anorte
12,5
(neutralizado
c) cmolágeno
M (ColEDAC2),
nceutralizado
on NaOH
(d)
′
colágeno neutralizado con ácido acético (ColAA), (e) matrigel delgado (MatThin), ( d) matrigel grueso (MatThick)
y (f) plástico de cultivo de tejidos sin recubrimiento (plástico TC). Se permitió que las células crecieran en todos los
sustratos durante 1, 4, 9, 14 o 21 días, respectivamente. Se analizaron pocillos por triplicado para cada condición
para cuantificar la morfología celular, la expresión de ALP, la mineralización de ECM y la expresión génica. Las
células MLOY4 se cultivaron durante 4 días en colágeno neutralizado con ácido acético (ColAA) como control
positivo (Kato et al., 1997).
2.2. Cultivo de células
En este estudio se utilizaron dos líneas de células óseas. Las células MC3T3E1 son una línea celular de
osteoblastos derivados de murinos, que pueden expresar grandes cantidades de ALP, colágeno tipo 1 y OSF2 (Hurley et al.,
1993; Oshima et al., 2002). Las células son capaces de diferenciarse en osteocitos y mineralizar su
matriz circundante (Sudo et al., 1983). Se consideran un buen modelo de osteoblastos primarios (Quarles et
al., 1992). Para estos estudios, las células MC3T3E1 se mantuvieron en medio de Eagle modificado alfa (α
MEM) complementado con suero bovino fetal al 10 %, 100 U/ml de penicilina estreptomicina y 100 μg/ml de L
glutamina (todo Sigma Aldrich) antes de todos los experimentos. .
Las células MLOY4 son una línea celular de origen murino que comparte numerosas características con
osteocitos primarios como alta producción de osteocalcina y E11 y baja expresión de fosfatasa alcalina y
OSF2, así como la extensión de numerosos procesos dendríticos por célula (Kato et al., 1997; Bonewald,
1999). Se cultivaron células MLOY4 a 5 × 103 células/cm2 en colágeno tipo 1 a 0,15 mg/ml en ácido acético
y se cultivaron en MEM de Dulbecco suplementado con suero bovino fetal al 5 %, suero bovino fetal al 5 %
(Sigma Aldrich), 100 U /mL penicilina estreptomicina y 100 μg/mL Lglutamina según lo recomendado por Kato
et al. (1997).
2.3. Preparación de sustratos ECM
El colágeno de cola de rata tipo 1 (Life Technologies) se neutralizó con NaOH (Sigma Aldrich) a 18,4 μM/mg
de colágeno y se diluyó con solución salina tamponada con fosfato (PBS) al 10 % (Sigma Aldrich) y H2O
destilada al 68 % . Luego, la mezcla se pipeteó en volúmenes de 150 μL sobre cubreobjetos de 13 mm de
diámetro (Sarstedt) y se incubó durante 30 min a 37 °C, antes de enjuagarse dos veces con PBS estéril. Esto
dio como resultado la formación de un recubrimiento suave, espeso, similar a un gel, sobre los cubreobjetos
(Col). Para producir sustratos de diferentes rigideces mecánicas pero idéntica densidad de ligando, los sustratos
se entrecruzaron con EDAC (Sigma Aldrich) mediante incubación a 19 μM/mg de colágeno (ColEDAC1) o 95
μM/mg de colágeno (ColEDAC2) EDAC durante 3,5 h a temperatura ambiente. como se describió anteriormente
(Haugh et al., 2011). Luego, los sustratos se enjuagaron con PBS y se incubaron en PBS fresco durante 3 h a
temperatura ambiente para eliminar cualquier EDAC restante antes de lavarlos dos veces con H2O destilada
estéril.
El colágeno de cola de rata tipo 1 también se neutralizó con ácido acético (Sigma Aldrich) a 2,34 μM/mg de
colágeno y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente para crear un recubrimiento delgado de colágeno
(ColAA) de densidad de ligando idéntica a la de los sustratos de colágeno neutralizados con NaOH descritos
anteriormente. . Esta mezcla se pipeteó sobre cubreobjetos de 13 mm de diámetro en volúmenes de 150 μL y
se dejó incubar a temperatura ambiente durante 60 min. Luego se eliminó el exceso de líquido y los sustratos
se enjuagaron dos veces con PBS estéril antes de sembrar las células.
Matrigel (Sigma Aldrich) se diluyó 1:3 en αMEM y se colocó en placas sobre cubreobjetos de 13 mm en
volúmenes de 200 μL. Luego, los cubreobjetos se incubaron durante 30 min a 37 °C o 1 min a temperatura
ambiente para crear sustratos gruesos (1,5 mm: MatThick) y delgados (40 μm: MatThin). De nuevo, los
sustratos se lavaron dos veces con PBS estéril antes de sembrar las células.
2.4. Medición de la rigidez del sustrato por microscopía de fuerza atómica (AFM)
Las mediciones de rigidez del sustrato se realizaron utilizando un microscopio de fuerza atómica (AFM)
Agilent 5500. Se utilizó una punta piramidal de pirexnitruro de ángulo de cara de 30°. Se obtuvieron
curvas de fuerzadistancia de cada uno de los siguientes sustratos: Col, ColEDAC1,
ColEDAC2, ColAA y TC. Estas curvas se utilizaron luego para calcular la rigidez del material de
acuerdo con la siguiente ecuación:
(1)
dónde mies el Módulo de Young, es vla relación de Poisson, α es el ángulo de la cara de la punta, d es el

F yes
la profundidad de penetración de la punta mlediante
a fuerza
la medida en el control AFM. F es calculado
siguiente ecuación:
(2)
dónde k es la constante de resorte del voladizo y es el mXovimiento piezoeléctrico medido. La
k , prueba
constante de resorte
se calculó
(52
eNncontrando
/m). Usando
la efrecuencia
sta ecuación,
de rlesonancia
a rigidez del
del
sustrato
voladizo
se
durante
midió clinco
a
veces en tres ubicaciones diferentes en cada sustrato y los valores se promediaron para generar un
valor de rigidez para cada sustrato medido. La precisión de los métodos AFM utilizados en este trabajo
se confirmó probando una muestra de silicio de rigidez conocida de 1 MPa (que se muestra en la Fig.
2).
2.5. Análisis morfológico del fenotipo celular
Los cultivos se fijaron utilizando paraformaldehído al 4% (Fluka) en tampón , ′bis(2
nortenorte
piperazinaácido etanosulfónico (PIPES) (Sigma Aldrich) después de 1, 4, 9 o 14 días de cultivo. Las
células se permeabilizaron con TritonX100 (Sigma Aldrich), se diluyeron al 0,05% en PBS y luego se
incubaron en faloidinaTRITC según el protocolo del fabricante (Life technologies) para teñir el
citoesqueleto de actina. A continuación, las células se contratiñeron con dilactato de DAPI (Sigma
Aldrich) y se enjuagaron con PBS antes de montarlas en medio de montaje DPX (Sigma Aldrich) para
obtener imágenes.
Las imágenes se tomaron con un microscopio de fluorescencia invertido Olympus IX50 en diferentes lugares
de los cubreobjetos con un aumento de 10 ×, lo que proporciona un área de imagen de 0,62 cm2. En total, se
tomaron 15 imágenes en cada punto de tiempo, para cada condición (cinco en cada cubreobjetos duplicado).
Los procesos celulares se definieron como características celulares ubicadas en la membrana celular que
tenían un diámetro de sección transversal de no más de 1 μm y se extendían por una distancia de al menos 5 μm.
Usando esta clasificación, las morfologías celulares se cuantificaron de la siguiente manera: (1) las desparramar
alineado
células no tenían procesos celulares y exhibieron una morfología dispersa, (2) los
procesos
las cpélulas
ero no tenían células
exhibieron una alineación preferencial en una dirección particular (definida por una relación de eje corto a
ramificado
eje largo de menos de 0.5), (3) las células exhibieron
el cuerpo clargos
elular yp equeño
delgados
y a
los
sociados
procesos
con
celulares
los osteocitos,
y (4) las células mostraron una morfología extendida con procesos que stransicional
e extienden desde
La figura
el cuerpo
1 muestra
celular.
un
ejemplo de cada descripción morfológica asignada. Las células MLOY4 cultivadas durante 4 días en colágeno
neutralizado con ácido acético se analizaron de acuerdo con el mismo sistema de clasificación y se usaron como
control positivo.
2.6. Cuantificación del número de células
El número de células se cuantificó a través de un kit de ensayo Hoechst 33258 de acuerdo con
el protocolo del fabricante (Abcam). Hoechst marca con fluorescencia el ADN de doble cadena que luego se
puede detectar utilizando un lector de placas (Perkin Elmer 2030).
2.7. Cuantificación de la actividad ALP
La actividad de ALP se analizó en células sembradas en plástico Col, ColEDAC1, ColEDAC2 y TC.
Col y ColEDAC1 se eligieron porque tenían el mayor porcentaje de células dendríticas por análisis
morfológico. Se eligió ColEDAC2 porque es químicamente idéntico a ColEDAC1.
Esto permitió examinar el efecto de la rigidez del sustrato independientemente de las diferencias químicas
en los sustratos. Se usó plástico TC como sustrato de control. La actividad ALP intracelular se midió
utilizando un ensayo ALP colorimétrico (Sigma Aldrich) como se describió anteriormente (Birmingham et
al., 2012), en los cuatro puntos de tiempo, para todas las condiciones. Brevemente, las células se lisaron
congelándolas a 80 °C, descongelándolas a temperatura ambiente y raspándolas mecánicamente del
sustrato. El ensayo ALP utiliza fosfato de nitrofenilo
pagcuando
(NPP),
se
qdue
esfosforila
cambia scu
on
longitud
ALP.
pagonda
Edl e
cdambio
oe
nda
emisión
dee
n
ela
misión
sle
ongitud
midió ad e
540 nm en un lector de placas (Perkin Elmer 2030). A continuación, los resultados se normalizaron al número
de células determinado mediante el ensayo de Hoescht descrito anteriormente. También se analizaron medios
de cultivo celular de los mismos sustratos (Col, ColEDAC1, ColEDAC2 y plástico TC) para cuantificar la
producción de ALP extracelular. Los medios se cambiaron 24 h antes de que los medios de cultivo celular se
recogieran y analizaran utilizando el ensayo de fosfato de nitrofenilo descrito anteriormente. Se usaron medios
en blanco como control de fondo, para asegurar que cualquier fosfato
ofosfato
pag calcio dee
n slos
odio
medios
y 200 (m
140
g/L
mdg/L
e cloruro
de
de calcio en αMEM) no influyera en las diferencias generales entre los grupos.
Estos experimentos buscaron analizar los cambios en la producción de ALP a lo largo del tiempo como un
indicador de la transición de osteoblastos a osteocitos. Se sabe que las células MC3T3E1 inmaduras
inicialmente producen niveles bajos de ALP, pero a medida que estas células se diferencian en osteoblastos
maduros, aumentan la producción de ALP y, finalmente, a medida que se diferencian en osteocitos, disminuyen
la producción de ALP (MikuniTakagaki et al., 1995).
2.8. Mineralización
La mineralización de la matriz extracelular por las células MC3T3E1 se analizó después de 4, 9 y 14 días
mediante un ensayo de rojo de alizarina/cloruro de cetilpiridinio (Sigma Aldrich), como se describió anteriormente
(Birmingham et al., 2012; Brennan et al., 2012; Stanford et al., 1995), sobre sustratos específicos (Col,
ColEDAC1, ColEDAC2, TC plastic). Se retiraron los medios y las células se enjuagaron dos veces en PBS
antes de incubarlas con una solución de rojo de alizarina al 2 % (Sigma Aldrich) durante 20 min en un balancín
orbital. Se eliminó la solución y se lavaron los sustratos.
tres veces en H2O desionizada para eliminar el rojo de alizarina no unido. A continuación, las células se
incubaron con solución de cloruro de cetilpiridinio al 10 % (Sigma Aldrich) en un balancín orbital durante 20 min
a temperatura ambiente para desintegrar el rojo de alizarina unido. Se midió la absorbancia de estas muestras
a 562 nm usando un lector de placas (Perkin Elmer 2030) para determinar la deposición de calcio. Los medios
MC3T3E1 se usaron como control para garantizar que los niveles informados de calcio se debieron a la
actividad celular en lugar de a los componentes de los medios (200 mg/l de cloruro de calcio en α MEM).
2.9. La expresion genica
La expresión de genes específicos de osteoblastos (colágeno tipo 1, OSF2) y específicos de osteocitos (DMP1,
Sost) se analizó mediante RTPCR en sustratos específicos (Col, ColEDAC1, ColEDAC2) después de 14 y 21 días de
cultivo. Estos sustratos se eligieron en función de los resultados de los estudios morfológicos, ya que las células
cultivadas en Col y ColEDAC1 a 103 células/cm2 tenían los niveles más altos de formación de dendritas indicativos
de diferenciación de osteocitos, mientras que las células cultivadas en ColEDAC2 y/o sembradas en placas a 104
células/ cm2 fueron predominantemente extendidos indicativos
de diferenciación de osteoblastos.
Las células se lisaron usando 1 mL de reactivo TRI antes de la separación de fases mediante la introducción de 200
μL de cloroformo. El ARN se precipitó con etanol al 70% y luego se lavó con un kit de aislamiento de ARN ENZA de
acuerdo con el protocolo del fabricante (Omega Biotek) y se disolvió en 30 μL de agua libre de ARNasa (Qiagen). La
calidad del ARN se midió usando un espectrómetro Nanodrop (Thermoscientific) antes de convertirlo en ADNc usando
un kit de síntesis de ADNc (Omega Biosciences) y un termociclador Gene Amp 9700 A (Applied Biosystems).
La RTPCR se realizó en un analizador StepOne plus (Applied Biosystems) usando sondas Taqman (Applied
Biosystems) para colágeno tipo 1 (Mm00801666_g1) y OSF2 (Mm00450111_m1) en las células recolectadas
después de 14 días de cultivo y DMP1. (Mm00803833_g1) y Sost (Mm04208528_m1) en células recolectadas
después de 21 días de cultivo.
Los datos de RTPCR se analizaron utilizando el método 2−ΔΔCt (Livak y Schmittgen, 2001), con GAPDH
(Mm03302249_g1) como gen de mantenimiento y todas las reacciones se realizaron por triplicado biológico y
técnico.
2.10. análisis estadístico
Todos los experimentos se realizaron por triplicado biológico (en =3). Las morfologías celulares fueron
norte
comparación con el control positivo (células MLOY4 cultivadas en ColAA) y un control negativo (células MC3T3E1
cultivadas en plástico TC). Significación estadística de los efectos de la rigidez del sustrato y la densidad de siembra
en la célula La morfología se determinó usando un Welch para encontrar la t prueba
pagvalores de la diferencia entre cada media. Se utilizó el criterio de Pierce para
determinar valores atípicos estadísticos en ALP y datos de mineralización, mientras que Student's t se utilizó la prueba
determina la diferencia estadística en ALP, mineralización y experimentos de expresión génica.
3. Resultados
3.1. Propiedades mecánicas AFM
El plástico TC tenía una rigidez de 80,1±4,8 MPa, mientras que el silicio, probado como control de rigidez
conocida, se midió como 1,18±0,2 MPa. Col fue el sustrato más blando con una rigidez de 9,7 ± 0,3 Pa. Como se
esperaba, la rigidez del sustrato aumentó en función de la concentración del agente de reticulación. ColEDAC1 y
ColEDAC2 tenían rigideces de 286±22,1 Pa y 957±12,0 Pa, respectivamente. ColAA tenía una rigidez similar a
ColEDAC2 a 921 ± 9,6 Pa. Todos los sustratos tenían rigideces significativamente diferentes entre sí con la excepción
de los sustratos ColEDAC2 y ColAA, que no mostraron una diferencia significativa (<0,05). Estos resultados
pag
se resumen en la Fig. 2. Matrigel es líquido a temperatura ambiente, por lo que no se pudo medir la rigidez de estos
dos sustratos.
3.2. Análisis morfológico del fenotipo celular
Después de 14 días, el 70,1 % de las células MC3T3E1 cultivadas en el control de plástico TC se clasificaron como
propagadas con un 24,5 % de procesos celulares extendidos. Las células cultivadas en sustratos basados en
colágeno de rigidez rígida (ColEDAC2) o intermedia (ColEDAC1) a una densidad de siembra inicial alta mostraron
un patrón morfológico similar con aproximadamente el 56 % de las células clasificadas como diseminadas y el 31
% exhibiendo procesos celulares en ambas condiciones de cultivo. Se observó un porcentaje más bajo de células
extendidas (46,0 %) en el sustrato más blando con la densidad de siembra más alta de 104 células/cm2. La
,smientras
densidad de iembra qmue
ás
ebl 3aja
de
d1e
6,8% 03 ccélulas/cm2
las een
élulas sobre ColEDAC2
sustratos porolongaron
stos plástico Tlos
C tpambién
rocesos ecxhibió
predominantemente
elulares.
Células cultivadas en
una morfología extendida con más del 63 %. de las células se clasificaron como extendidas y menos del 28 %
extendiendo los procesos celulares en ambas condiciones de cultivo. Por el contrario, las células cultivadas en los
sustratos más blandos (Col) o de rigidez intermedia (ColEDAC1) a 103 células/cm2 eran predominantemente
similares a los osteocitos con más del 50 % de extensión de los procesos celulares en ambas condiciones de cultivo,
mientras que menos del 37 % de las células cultivadas en estas condiciones se clasificaron como propagación.
Alrededor del 47 % de las células de control MLOY4 se clasificaron como extendidas, mientras que el 48,6 % procesó
células extendidas. En la Fig. 5 se muestran imágenes de muestra de células MC3T3E1 en plástico Col y TC. Se
cultivaron células MLOY4 durante 4 días en ColAA como control positivo con el 50,3 ± 2,7 % de estas células
clasificadas como dendríticas, véanse las Figs. 3 y 4.
3.3. Actividad ALP de las células.
Tanto la actividad de la fosfatasa alcalina intracelular como la extracelular aumentaron continuamente en células
MC3T3E1 cultivadas en plástico TC y ColEDAC2 durante la duración del cultivo para ambas densidades de
siembra, véanse las Figs. 5 y 6. Todas las células cultivadas a la mayor densidad de siembra de 104 células/cm2
en todos los sustratos también mostraron un aumento en la actividad de ALP durante la duración del cultivo. De
manera similar, la expresión de ALP aumentó significativamente hasta los 9 días de cultivo en células MC3T3E1
cultivadas a una densidad de siembra baja (103 células/cm2 ) en los dos sustratos más blandos (Col y ColEDAC1).
La expresión en células en estos dos sustratos a la densidad de siembra más baja de 103 células/cm2 se reguló
luego después de 14 días de cultivo (aunque este cambio no fue estadísticamente significativo).
3.4. Mineralización
Los resultados de la mineralización de la MEC a lo largo del tiempo causada por MC3T3 cultivados en los diferentes
sustratos se presentan en la Fig. 7. No se observó un aumento en la producción de minerales a lo largo del tiempo
por parte de las células MC3T3E1 en plástico de cultivo de tejidos a 103 o 104 células / cm2 . observado.
Del mismo modo, en el sustrato de colágeno más rígido (ColEDAC2) con una densidad de siembra de 103
células/cm2, no se observó ningún cambio significativo en la mineralización con el tiempo. Sin embargo, se
observó un aumento significativo del día 4 al día 9 en este sustrato con una densidad de siembra de 104
células/cm2 . Los niveles más altos de mineralización se observaron en Col y ColEDAC1 cuando las células
se cultivaron a 103 células/cm2 . Un aumento en la mineralización durante
También se observó el tiempo en estas condiciones de cultivo. Un aumento en la mineralización con el tiempo.
también se observó en ColEDAC1 con una densidad de siembra de 104 células/cm2 . Sin embargo, los niveles de
la mineralización bajo esta condición fue significativamente menor que en Col o ColEDAC1 con una densidad de
siembra de 103 células/cm2 .
3.5. La expresion genica
Los resultados de la expresión génica de las células MC3T3E1 se muestran en la Fig. 8. Las células MC3T3E1
cultivadas en ColEDAC1 a 103 células/cm2 se eligieron como control para medir la expresión relativa de todos los
genes examinados. La expresión de colágeno tipo 1 fue más baja en las células cultivadas en ColEDAC1 a la
densidad de siembra más baja. También se observaron niveles bajos de expresión de colágeno tipo 1 en células
cultivadas en Col y ColEDAC2 a la mayor densidad de siembra de 104 células/cm2 de células/cm2 de sustrato
(Col) a 103 células/cm2 . , ver Fig. 8. OSF2 fue más bajo en células cultivadas en ColEDAC1 a 103
, con un bajo nivel de expresión también observado en células cultivadas en los más blandos
La expresión de DMP1 después de 21 días de cultivo fue más alta en
células cultivadas en ColEDAC1 a 103 células/cm28, mientras que Sost se detectó en cantidades mínimas en
células cultivadas en ColEDAC1 en ambas densidades de siembra, pero no en células cultivadas en otros sustratos.
4. Discusión
Los resultados de este estudio muestran que las células MC3T3E1 progresan a lo largo del linaje osteogénico
para convertirse en células similares a los osteocitos cuando se cultivan en sustratos de colágeno blando a una
densidad de siembra baja (103 células/cm2), como lo indican los cambios fenotípicos asociados con la diferenciación
osteocítica temprana ( morfología dendrítica, reducción de la expresión de ALP, mineralización de la MEC).
Además, la regulación negativa de los genes específicos de osteoblastos Col tipo 1 y OSF2, así como el aumento
de la expresión de DMP1, un gen regulado positivamente durante la diferenciación de osteoblastos a osteocitos,
y el marcador de osteocitos de etapa tardía Sost pueden inducirse en células MC3T3E1 a través de cultivo en
sustratos basados en colágeno de aproximadamente 286 Pa a una densidad de siembra inicial de 103 células/
cm2 . Por el contrario, las células cultivadas en sustratos más rígidos a base de colágeno,
o con una alta densidad inicial de siembra celular, proliferaron y mostraron la morfología extendida, una expresión
continuamente alta de ALP, bajos niveles de mineralización de ECM y altos niveles de colágeno tipo 1 y expresión
de OSF2 asociada. con el fenotipo osteoblástico. En conjunto, estos hallazgos muestran que las propiedades
mecánicas y de composición de la MEC, así como la necesidad de que las células establezcan una red de
comunicación, contribuyen en gran medida a la diferenciación de los osteocitos.
El uso de las líneas celulares MLOY4 y MC3T3E1 es una posible limitación de este estudio.
Sin embargo, se ha demostrado que ambas líneas celulares son excelentes representantes de osteocitos
primarios y osteoblastos respectivamente (Sudo et al., 1983; Kato et al., 1997; Quarles et al., 1992; Bonewald,
1999). Las células MLOY4 exhiben niveles bajos de actividad ALP, que no cambia con el tiempo (Kato et al.,
1997). No se usaron osteoblastos/osteocitos primarios debido a las dificultades en el aislamiento y caracterización
celular (Hentunen, 2010) y la necesidad de un gran número de células para satisfacer las numerosas condiciones
experimentales y puntos de tiempo en nuestro diseño de estudio. Además, la expresión de Sost y DMP1 está
regulada a la baja en los osteocitos primarios cuando se cultivan en matrices de fibronectina o colágeno no
mineralizado (Yang et al., 2009), y por esta razón se consideraron inapropiados para nuestros experimentos con
sustratos basados en colágeno.
Cabe señalar que estas células no expresaron niveles significativos de Sost, que es un marcador de
osteocito en etapa tardía, involucrado en la regulación de la formación ósea. Sin embargo, la expresión
de Sost solo se ha inducido previamente in vitro en la línea celular MC3T3E1 mediante la adición de
factores de crecimiento osteogénicos (Mattinzoli et al., 2012; Uchihashi et al., 2013), e in vivo no se expresa
hasta después de ha comenzado la mineralización (Poole et al., 2005). Nuestros resultados muestran trazas
de expresión de Sost en células cultivadas en el sustrato ColEDAC1, pero no en ningún otro sustrato.
Además, no se ha informado previamente de una mayor expresión de DMP1 sin la adición de factores de
crecimiento osteogénicos o la aplicación directa de tensión mecánica (Krishnan et al., 2010; Mattinzoli et al.,
2012). Los resultados presentados aquí muestran un aumento significativo en la expresión de DMP1 y
trazas de Sost cuando las células se cultivan en sustratos basados en colágeno blando (286 Pa) a una
densidad de siembra inicial baja (103 células/cm2 ) . Estos hallazgos resaltan la importancia de las
propiedades mecánicas del sustrato incluso en ausencia de factores osteogénicos de uso común.
Se ha inducido la diferenciación de osteocitos en células MC3T3E1 mediante el tratamiento con
factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF2) (Gupta et al., 2010), o mediante el cultivo de células en
sustratos basados en colágeno en presencia de factores osteogénicos (Uchihashi et al. al., 2013). Se ha
demostrado que la migración celular, la formación de adherencias focales y la deposición de calcio por parte
de las células MC3T3E1 dependen de la rigidez del sustrato (Khatiwala et al., 2006a). Además, se ha
demostrado que la mineralización de las células madre embrionarias aumenta en sustratos más rígidos
(Evans et al., 2009), mientras que quizás lo más interesante es que el cultivo de células mesenquimatosas
pluripotentes en un sustrato ECM relativamente rígido (40 kPa) favoreció la diferenciación osteoblástica,
mientras que el cultivo en un sustrato más flexible (1 kPa) condujo a una vía de diferenciación neural (Engler
et al., 2006). Sin embargo, estudios previos solo han examinado la diferenciación de células madre/
osteoprogenitores a osteoblastos y ningún estudio ha monitoreado la diferenciación de osteocitos en función
de la rigidez de la MEC. En el estudio actual, mostramos por primera vez la importancia de la rigidez de la
ECM para regular la transición de preosteoblastos a osteocitos tempranos.
Si bien se ha demostrado previamente que la diferenciación de osteoblastos mejora en sustratos
más rígidos (20–40 kPa (Engler et al., 2006; Kong et al., 2005)), nuestros estudios sugieren que la
diferenciación temprana de osteocitos está de hecho gobernada por sustratos más blandos ( <300 Pa). Los
osteocitos in vivo se forman cuando ciertos osteoblastos se incrustan en el osteoide recién formado, que es
una matriz de colágeno blanda no mineralizada (FranzOdendaal et al., 2006; Dallas y Bonewald, 2010), y
simultáneamente sufren los cambios morfológicos asociados con diferenciación de osteocitos (Doty, 1981).
Las células comienzan a regular negativamente ciertos genes específicos de osteoblastos, como el colágeno
tipo 1 y OSF2, mientras que la regulación positiva ocurre en DMP1 (Yang et al., 2004; Rios et al., 2005), y
el gen específico de osteocito Sost ( Yang et al., 2009; Winkler et al., 2003). Es interesante señalar a partir
de los resultados de nuestro estudio que las células que mostraban los rasgos de diferenciación de osteocitos
se cultivaron en sustratos blandos basados en colágeno. Proponemos que este sustrato proporciona un
entorno mecánico extracelular similar al osteoide (Engler et al., 2006), y que este entorno mecánico es
necesario para la transición de osteoblastos a osteocitos in vivo. Sin embargo, se desconocen las
propiedades mecánicas precisas del osteoide, ya que el tejido representa una capa delgada de
aproximadamente 350 nm de profundidad (Engler et al., 2006) y, como tal, existen importantes desafíos para
obtener muestras para pruebas mecánicas ex vivo. Aplicar métodos como la nanoindentación para evaluar
propiedades mecánicas in situ, sería inapropiado ya que la rigidez de una muestra delgada se verá afectada por el
tejido óseo mineralizado circundante (Oliver y Pharr, 1992).
Estudios previos han establecido la importancia de la densidad de siembra para la diferenciación de BMSC en
osteoblastos; La actividad de ALP en células estromales de médula ósea de rata fue mayor cuando las células
se sembraron a una densidad de siembra inicial más baja de 3 × 104 por cm2 , en comparación
104 por cm2
con
(Kim
14,9
et
×a l.,
2009). Se demostró que la formación de hueso en andamios de HA implantados, en placas con células de médula
ósea de cabra, aumentó cuando las células se sembraron en placas a densidades de siembra más altas, hasta
47,8 × 106 células/cm3 en medios osteogénicos durante 7 días antes de la implantación (Wilson et al., 2002). Las
células de osteosarcoma MG63 cultivadas a densidades de siembra iniciales bajas en andamios de colágeno 3D
mostraron tasas significativamente más altas de expresión de ALP que aquellas con densidades de siembra más
altas a los 2 días (Bitar et al., 2007). Los resultados presentados aquí muestran cambios similares en la expresión
de ALP a lo largo del tiempo debido a la densidad de siembra celular inicial, aunque estos estudios previos se
realizaron con diferentes fenotipos celulares, y también la rigidez del sustrato y las densidades de siembra fueron
un orden de magnitud mayor que las utilizadas en este estudio. .
Ya se ha planteado ampliamente la hipótesis de que los osteocitos prolongan los procesos para facilitar
la comunicación intercelular (Donahue, 1998; Palazzini et al., 1998). Es intrigante especular que el efecto
combinado de la rigidez del sustrato y la densidad de siembra celular observado aquí está impulsado por la
necesidad de que los osteocitos establezcan una red de comunicación. La red de osteocitos es similar a la de
las neuritas y se informó anteriormente que la formación de neuritas aumenta en sustratos en el rango de 250 a
500 Pa (Georges et al., 2006; Estell, 2012). Por lo tanto, proponemos que la formación de dendritas esté
impulsada por la rigidez de la ECM y la separación intercelular en una variedad de fenotipos. A las células
osteoblásticas sobre sustratos más rígidos les resulta más fácil proliferar, lo que permite la formación de uniones
comunicantes entre cuerpos celulares sin necesidad de establecer procesos celulares (Yamaguchi et al., 1994;
Yellowley et al., 2000).
Sin embargo, las células en sustratos más blandos podrían no proliferar lo suficiente debido a la mecánica del
sustrato y, después de un tiempo, podrían recurrir a procesos de extensión para establecer una red de
comunicación con las células vecinas.
Se sabe que varias moléculas candidatas están involucradas en la transición osteoblastoosteocitos, en particular
pequeñas GTPasas, incluidas Rac, Rho y CDC42, que rigen la propagación celular, la migración y la extensión de
los procesos celulares (Huveneers y Danen, 2009; TanakaKamioka et al. ., 1998; Kamioka et al., 2007; McNamara
et al., (2009)). La pérdida de actividad de ALP, como se observó en este estudio, implica no solo un cambio en la
expresión génica, sino también la pérdida o inactivación de enzimas preexistentes en los osteoblastos. Tales
pérdidas podrían ocurrir por el desprendimiento de vesículas derivadas de la membrana o por la escisión enzimática
de la propia enzima (Dean et al., 1996; Xie, 1995). Finalmente, las señales difusibles también pueden desempeñar
funciones importantes en la transición osteoblastoosteocitos; Recientemente se ha demostrado que la estimulación
sostenida de células osteoblásticas con oncostatinaM, un miembro de la familia IL6, podría inducir una amplia
gama de cambios en la expresión génica compatibles con la formación de osteocitos en osteoblastos cultivados
(Brounais et al., 2008).
Mullen et al. Pagina 12
5. Conclusión
Estos experimentos representan la primera investigación sobre los efectos tanto de la rigidez del sustrato
como de la densidad de siembra celular en la transición osteoblastososteocitos y arrojan luz sobre las
señales externas (rigidez del sustrato y separación intercelular) necesarias para la diferenciación de los osteocitos.
Por primera vez, se ha inducido a las células preosteoblásticas MC3T3 a experimentar la diferenciación
de osteocitos, sin la adición de factores de crecimiento ni la aplicación de carga mecánica, cuando se
cultivan en sustratos blandos basados en colágeno, siempre que la separación intercelular requiera la
formación del proceso. Además, para que las células se diferencien aún más a lo largo de la vía osteogénica,
hasta el nivel de un osteocito temprano, se debe utilizar una rigidez óptima de aproximadamente 286 Pa.
Proponemos que esto simula el entorno in vivo de las células, donde los osteoblastos se desarrollan en
osteoide, una matriz blanda basada en colágeno, y posteriormente se diferencian cuando se incrustan dentro
de esta matriz. Saber cómo afecta el entorno mecánico al desarrollo de los osteocitos es un paso vital en la
recreación de tejido óseo viable para la implantación.
Expresiones de gratitud
La línea celular MLOY4 se recibió como un amable regalo de la profesora Lynda Bonewald (Facultad de Odontología,
Universidad de Missouri, Kansas City, MO). Los autores desean agradecer la financiación del Consejo Europeo de
Investigación (ERC), Subvención n.º: 258992 (BONEMECHBIO), Instituto Nacional de Artritis y Enfermedades
Musculoesqueléticas y de la Piel (NIAMS), Instituto Nacional de Salud (NIH), Subvención n.º: AR041210 y AR057139, y
la Beca de Investigación de la Facultad de Ingeniería e Informática NUI Galway.
Referencias
Atkins GJ, Welldon KJ, Wijenayaka AR, Bonewald LF, Findlay DM. La vitamina K promueve la mineralización, la
transición de osteoblastos a osteocitos y un fenotipo anticatabólico mediante mecanismos independientes y
dependientes de la carboxilación γ. American Journal of Physiology: fisiología celular. 2009; 297:C1358–C1367. [PubMed:
19675304]
Birmingham E, Niebur GL, Mchugh PE, Shaw G, Barry FP, Mcnamara LM. La diferenciación osteogénica de las células madre
mesenquimales está regulada por células de osteocitos y osteoblastos en un nicho óseo simplificado.
Células y Materiales Europeos. 2012; 23:13–27. [PubMed: 22241610]
Bitar M, Brown RA, Salih V, Kidane AG, Knowles JC, Nazhat SN. Efecto de la densidad celular en
diferenciación osteoblástica y degradación de la matriz de andamios biomiméticos de colágeno denso.
Biomacromoléculas. 2007; 9:129–135. [PubMed: 18095652]
Boivin G, Morel G, Lian JB, AnthoineTerrier C, Dubois PM, Meunier PJ. Localización de osteocalcina endógena en hueso de rata
neonatal y su ausencia en cartílago articular: efecto del tratamiento con warfarina.
Archivos de Virchows. 1990; 417:505–512.
Bonewald LF. Establecimiento y caracterización de una línea celular tipo osteocito, MLOY4. Diario de
Metabolismo Óseo y Mineral. 1999; 17:61–65. [PubMed: 10084404]
Boukhechba F, Balaguer T, Michiels JF, Ackermann K, Quincey D, Bouler JM, Pyerin W, CARLE GF, Rochet N. Diferenciación
primaria de osteocitos humanos en un sistema de cultivo 3D. Revista de investigación ósea y mineral. 2009; 24:1927–1935.
[PubMed: 19419324]
Brennan O, O'Brien FJ, Mcnamara LM. Los antagonistas de los receptores de estrógeno más estrógeno alteran la
producción de minerales por parte de los osteoblastos in vitro. Investigación hormonal y metabólica. 2012; 44:154.
Brounais B, Chipoy C, Mori K, Charrier C, Battaglia S, Pilet P, Richards CD, HEYMANN D, Rédini F, Blanchard F. Oncostatin
M induce la pérdida ósea y sensibiliza el osteosarcoma de rata al efecto antitumoral de la midostaurina in vivo. Investigación
clínica del cáncer. 2008; 14:5400–5409. [PubMed: 18765531]
Dallas SL, Bonewald LF. Dinámica de la transición de osteoblasto a osteocito. Anales de la Academia de Ciencias de Nueva
York. 2010; 1192: 437–443. [PubMed: 20392270]
Dean D, Boyan B, Muniz O, Howell D, Schwartz Z. Los metabolitos de la vitamina D regulan la matriz vesicular
contenido de metaloproteinasas de una manera dependiente de la maduración celular. Internacional de tejidos calcificados.
1996; 59:109–116. [PubMed: 8687979]
Donahue HJ. Comunicación intercelular de la unión de brechas en el hueso: una base celular para el punto de ajuste del
mecanostato. Internacional de tejidos calcificados. 1998:62.
Doty S. Evidencia morfológica de uniones comunicantes entre células óseas. Internacional de tejidos calcificados.
1981; 33:509–512. [PubMed: 6797704]
Engler AJ, Sen S, Sweeney HL, Discher DE. La elasticidad de la matriz dirige la especificación del linaje celular.
Celúla. 2006; 126:677–689. [PubMed: 16923388]
Estell, EG. Ingeniería biológica. Universidad de Maine; 2012. Rigidez y adhesividad del sustrato
Influir en el crecimiento axonal de las neuronas.
Evans ND, Minelli C, Gentleman E, Lapointe V, Patankar SN, Kallivretaki M, Chen X, Roberts CJ, Stevens MM. La rigidez del
sustrato afecta los eventos de diferenciación temprana en las células madre embrionarias.
Células y Materiales Europeos. 2009; 18:1–14. [PubMed: 19768669]
Feng H, Lu YE, Tsutsui Xie, Kunieda Castranio, Bonewald Scott, Mishina. La proteína de matriz de dentina 1 (Dmp1) se expresa
específicamente en tejidos mineralizados, pero no blandos, durante el desarrollo.
Revista de Investigación Dental. 2003; 82:776–780. [PubMed: 14514755]
FranzOdendaal TA, Hall BK, Witten PE. Enterrado vivo: cómo los osteoblastos se convierten en osteocitos.
Dinámica del desarrollo. 2006; 235:176–190. [PubMed: 16258960]
Georges M, Meaney Sawyer, Janmey. Matrices con cumplimiento comparable al del tejido cerebral
seleccionar crecimiento neuronal sobre glial en cultivos corticales mixtos. Revista Biofísica. 2006; 90:3012– 3018.
[PubMed: 16461391]
Gooi JH, Pompolo S, Karsdal MA, Kulkarni NH, Kalajzic I, Mcahren SHM, Han B, Onyia JE, Ho
PWM, Gillespie MT, Walsh NC, Chia LY, Quinn JMW, Martin TJ, Sims NA. La calcitonina altera el efecto anabólico de la
PTH en ratas jóvenes y estimula la expresión de esclerostina por parte de los osteocitos.
Hueso. 2010; 46:1486–1497. [PubMed: 20188226]
Gu G, Nars M, Hentunen T, Metsikkö K, Väänänen H. Los osteocitos primarios aislados expresan uniones gap funcionales in vitro.
Investigación de células y tejidos. 2006; 323:263–271. [PubMed: 16175387]
Gupta RR, Yoo DJ, Hebert C, Niger C, Stains JP. Inducción de un fenotipo similar a un osteocito por el factor de
crecimiento de fibroblastos2. Comunicaciones de investigación bioquímica y biofísica. 2010; 402:258–264. [PubMed:
20934405]
Haugh MG, Murphy CM, Mckiernan RC, Altenbuchner C, O'Brien FJ. Las propiedades mecánicas y de reticulación influyen
significativamente en la unión, proliferación y migración celular dentro de los andamios de glicosaminoglicanos de colágeno.
Ingeniería de Tejidos Parte A. 2011; 17:1201–1208. [PubMed: 21155630]
Hentunen, T. Línea celular MLOY4 como herramienta para estudiar las funciones reguladoras de los osteocitos. RSCI;
Dublín: 2010.
Santo CE, Shoichet MS, Davies JE. Ingeniería de tejido óseo tridimensional in vitro utilizando
andamios biodegradables: investigando la densidad de siembra celular inicial y el período de cultivo. Revista de
Investigación de Materiales Biomédicos. 2000; 51:376–382. [PubMed: 10880079]
Hsiong SX, Carampin P, Kong HJ, Lee KY, Mooney DJ. La etapa de diferenciación altera el control de la matriz de las células
madre. Revista de Investigación de Materiales Biomédicos Parte A. 2008; 87A:145–156.
Hurley MM, Abreu C, Harrison JR, Lichtler AC, Raisz LG, Kream BE. El factor de crecimiento de fibroblastos básico inhibe la
expresión del gen del colágeno tipo I en células osteoblásticas MC3T3E1. Revista de Química Biológica. 1993; 268:5588–
5593. [PubMed: 8449921]
Huveneers S, Danen EHJ. Señalización de adhesión: diafonía entre integrinas, Src y Rho. Diario de
Ciencia Celular. 2009; 122:1059–1069. [PubMed: 19339545]
Igarashi M, Kamiya N, Ito K, Takagi M. Localización in situ y expresión in vitro del ARNm del factor 45 de osteoblastos/
osteocitos durante la diferenciación de células óseas. El diario histoquímico. 2002; 34:255–263. [PubMed: 12588003]
Je, WSS. Fisiología integrada del tejido óseo: anatomía y fisiología. En: Cowin, SC., editor. Manual de mecánica ósea. 2. Prensa
CRC, LLC; Boca Ratón: 2001.
Kamioka H, Ishihara Y, Ris H, Murshid SA, Sugawara Y, TakanoYamamoto T, Lim SS. Los cultivos primarios de osteocitos
de pollo conservan las uniones comunicantes funcionales entre los osteocitos y entre
osteocitos y osteoblastos. Microscopía y Microanálisis. 2007; 13:108–117. [PubMed: 17367550]
Kato Y, Boskey A, Spevak L, Dallas M, Hori M, Bonewald LF. Establecimiento de un osteoide
Célula similar a preosteocitos MLOA5 que se mineraliza espontáneamente en cultivo. Revista de investigación
ósea y mineral. 2001; 16:1622–1633. [PubMed: 11547831]
Kato Y, Windle JJ, Koop BA, Mundy GR, Bonewald LF. Establecimiento de una línea celular tipo osteocito, MLOY4.
Revista de investigación ósea y mineral. 1997; 12:2014–2023. [PubMed: 9421234]
Khatiwala CB, Peyton SR, Putnam AJ. Propiedades mecánicas intrínsecas de la matriz extracelular
afectar el comportamiento de las células preosteoblásticas MC3T3E1. American Journal of Physiology—
Fisiología celular. 2006a; 290:C1640–C1650. [PubMed: 16407416]
Khatiwala, CB., Peyton, SR., Putnam, AJ. La diferenciación osteogénica de las células Mc3t3E1 reguladas por la
rigidez del sustrato requiere la activación de mapk. Actas de la Sexta Reunión Anual del Instituto Americano de
Ingenieros Químicos, Adhesión y Migración Celular; San Francisco, CA. 2006b. pag. 338a
Kim K, Dean D, Mikos AG, Fisher JP. Efecto de la densidad de siembra celular inicial en la expresión temprana de
señales osteogénicas de células estromales de médula ósea de rata cultivadas en discos de poli (fumarato de
propileno) reticulado. Biomacromoléculas. 2009; 10:1810–1817. [PubMed: 19469498]
KleinNulend J, Der Plas VAN, Semeins A, Ajubi C, Frangos N, Nijweide J, Burger EP. Sensibilidad de los osteocitos al
estrés biomecánico in vitro. El Diario FASEB. 1995; 9:441–445. [PubMed: 7896017]
Kong HJ, Polte TR, Alsberg E, Mooney DJ. Las mediciones de FRET de las fuerzas de tracción celular y la agrupación
a escala nanométrica de los ligandos de adhesión variaron según la rigidez del sustrato. Actas de la Academia
Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América. 2005; 102:4300–4305. [PubMed: 15767572]
Kramer I, Halleux C, Keller H, Pegurri M, Gooi JH, Weber PB, Feng JQ, Bonewald LF, Kneissel M.
La señalización de Wnt/βcatenina de osteocitos es necesaria para la homeostasis ósea normal. Biología
Molecular y Celular. 2010; 30:3071–3085. [PubMed: 20404086]
Krishnan V, Dhurjati R, Vogler E, Mastro A. Osteogénesis in vitro: de preosteoblastos a osteocitos.
Biología celular y del desarrollo in vitro— Animal. 2010; 46:28–35. [PubMed: 19826885]
Lanyon LE. Osteocitos, detección de tensiones, modelado y remodelado óseo. tejido calcificado
Internacional. 1993:53. [PubMed: 7688649]
Livak KJ, Schmittgen TD. Análisis de datos de expresión génica relativa mediante PCR cuantitativa en tiempo real
y el método 2−ΔΔCT. Métodos. 2001; 25:402–408. [PubMed: 11846609]
Lode A, Bernhardt A, GELINSKY M. Cultivo de células estromales de médula ósea humana en andamios
tridimensionales de colágeno mineralizado: influencia de la densidad de siembra en la colonización,
proliferación y diferenciación osteogénica. Revista de Ingeniería de Tejidos y Medicina Regenerativa. 2008;
2:400–407. [PubMed: 18756590]
Marotti G, Palazzini S, Palumbo C, Ferretti M. Evidencia ultraestructural de la existencia de una red dendrítica en las
células del linaje osteogénico: el nuevo concepto de cableado y transmisión de volumen en el hueso. Hueso.
1996; 19 (Suplemento 3): 151S.
Mattinzoli D, Corbelli PMA, Ikehata M, Zennaro C, Armelloni S, Li M, Giardino L, Rastaldi MP. Un nuevo modelo de
osteocitogénesis in vitro inducida por tratamiento con ácido retinoico. Células y Materiales Europeos. 2012;
24:403–425. [PubMed: 23160992]
McNamara LM, Majeska RJ, Weinbaum S, Friedrich V, Schaffler MB. Unión de los procesos celulares de los
osteocitos a la matriz ósea. El Registro Anatómico: Avances en Anatomía Integrativa y Biología Evolutiva. 2009;
292:355–363.
MikuniTakagaki Y, Kakai Y, Satoyoshi M, Kawano E, Suzuki Y, Kawase T, Saito S. Matrix
mineralización y la diferenciación de células similares a osteocitos en cultivo. Revista de investigación
Nakano Y, Beertsen W, Vandenbos T, Kawamoto T, Oda K, Takano Y. Localización específica del sitio de dos
fosfatasas distintas a lo largo de la membrana plasmática de los osteoblastos: fosfatasa alcalina no específica de
tejido y ATPasa de calcio de membrana plasmática. Hueso. 2004; 35:1077–1085. [PubMed: 15542032]
Oliver WC, Pharr GM. Una técnica mejorada para determinar la dureza y el módulo elástico utilizando experimentos de
indentación de detección de carga y desplazamiento. Revista de Investigación de Materiales. 1992; 7:1564–1583.
Oshima A, Tanabe H, Yan T, Lowe GN, Glackin CA, Kudo A. Un mecanismo novedoso para la regulación de la
diferenciación de osteoblastos: la transcripción de periostina, un miembro de la familia de fasciclina I, está regulada
por el factor de transcripción bHLH, twist. Revista de bioquímica celular. 2002; 86:792– 804. [PubMed: 12210745]
Palazzini S, Palumbo C, Ferretti M, Marotti G. Estructura celular del estroma y relaciones en
espacios perimedulares de los huesos del eje del embrión de pollo. Anatomía y Embriología. 1998; 197:349– 357.
[PubMed: 9623668]
Pelham RJ, Wang YL. La locomoción celular y las adherencias focales están reguladas por la flexibilidad del sustrato.
Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América. 1997; 94:13661–13665.
[PubMed: 9391082]
Poole KES, Bezooijen VAN, Loveridge RL, Hamersma N, Papapoulos H, Löwik SE, Reeve J, CW.
La esclerostina es un producto de secreción retardada de los osteocitos que inhibe la formación de hueso. El Diario
FASEB. 2005; 19:1842–1844. [PubMed: 16123173]
Quarles LD, Yohay DA, Lever LW, Caton R, Wenstrup RJ. Distinto proliferativo y diferenciado
Etapas de células murinas MC3T3E1 en cultivo: un modelo in vitro de desarrollo de osteoblastos. Revista de
investigación ósea y mineral. 1992; 7:683–692. [PubMed: 1414487]
Ríos HF, Dusevich LYV, Eick D, Bonewald LF, Feng JQ. DMP1 es esencial para la formación y función de los osteocitos.
Revista de interacciones musculoesqueléticas y neuronales. 2005; 5:325–327. [PubMed: 16340123]
Santos A, Bakker A, Willems H, Bravenboer N, Bronckers A, KleinNulend J. Carga mecánica
estimula la producción de BMP7, pero no de BMP2, por parte de los osteocitos. Internacional de tejidos calcificados.
2011; 89:318–326. [PubMed: 21842277]
Stanford CM, Jacobson PA, Eanes ED, Lembke LA, Midura RJ. Mineral apatítico de formación rápida en una línea celular
osteoblástica (UMR 10601 BSP). Revista de Química Biológica. 1995; 270:9420–9428.
[PubMed: 7721867]
Sudo H, Kodama HA, Amagai Y, Yamamoto S, Kasai S. Diferenciación y calcificación in vitro en un
nueva línea celular osteogénica clonal derivada de calvaria de ratón recién nacido. El Diario de Biología Celular.
1983; 96:191–198. [PubMed: 6826647]
TanakaKamioka K, Kamioka H, Ris H, Lim SS. La forma de los osteocitos depende de los filamentos de actina y los
procesos de los osteocitos son proyecciones únicas ricas en actina. Revista de investigación ósea y mineral.
1998; 13:1555–1568. [PubMed: 9783544]
Uchihashi K, Aoki S, Matsunobu A, Toda S. Migración de osteoblastos en gel de colágeno tipo I y
diferenciación a células similares a osteocitos dentro de una matriz mineralizada autoproducida: un sistema novedoso
para analizar la diferenciación de osteoblastos a osteocitos. Hueso. 2013; 52:102–110. [PubMed: 22985890]
Weinreb M, Shinar D, Rodan GA. Patrón diferente de fosfatasa alcalina, osteopontina y
expresión de osteocalcina en hueso de rata en desarrollo visualizado por hibridación in situ. Revista de investigación
Westbroek I, de Rooij KE, Nijweide PJ. El anticuerpo monoclonal específico de osteocito MAb OB7.3 está dirigido
contra la proteína phex. Revista de investigación ósea y mineral. 2002; 17:845–853.
[PubMed: 12009015]
Wilde J, Yokozeki M, Terai K, Kudo A, Moriyama K. La expresión divergente del ARNm de periostina en el ligamento
periodontal durante el movimiento dental experimental. Investigación de células y tejidos. 2003; 312:345–351. [PubMed:
12761672]
Wilson CE, Dhert WJA, Blitterswijk Van, Verbout AJ, CA, de Bruijn JD. Evaluación de construcciones de ingeniería de
tejido óseo en 3D con diferentes densidades de siembra utilizando el ensayo alamarBlue™ y el
formación
efecto sobre
de lha
ueso in
vivo. Revista de ciencia de materiales: materiales en medicina. 2002; 13:1265– 1269. [PubMed: 15348675]
Winkler DG, Sutherland MK, Geoghegan JC, Yu C, Hayes T, Skonier JE, Shpektor D, Jonas M,
Kovacevich BR, StaehlingHampton K, Appleby M, Brunkow ME, Latham JA. control de osteocitos
de la formación ósea a través de la esclerostina, un nuevo antagonista de BMP. EMBO J. 2003; 22:6267–6276.
[PubMed: 14633986]
Xiao Z, Zhang S, Mahlios J, Zhou G, Magenheimer BS, Guo D, Dallas SL, Maser R, Calvet JP,
Bonewald L, Quarles LD. Estructuras similares a cilios y policistina1 en osteoblastos/osteocitos y anomalías
asociadas en la esqueletogénesis y la expresión de Runx2. Revista de Química Biológica.
2006; 281:30884–30895. [PubMed: 16905538]
Xie L. StreptolysinO induce la liberación de fosfatasa alcalina anclada a glicosilfosfatidilinositol de las células ROS mediante
vesiculación independientemente de la acción de la fosfolipasa. Revista Bioquímica.
1995; 305:529–537. [PubMed: 7832771]
Yamaguchi DT, Ma D, Lee A, Huang J, Gruber HE. Aislamiento y caracterización de uniones gap en la línea celular osteoblástica
MC3T3E1. Revista de investigación ósea y mineral. 1994; 9:791–803.
[PubMed: 8079655]
Yang IK, LUY, Guo D, Harris MA, GluhakHeinrich J, Bonewald LF, Feng JQ, Rowe DW, Harris SE.
Estudio in vitro e in vivo de vías de señalización mecánica específicas de osteocitos. Revista de interacciones
musculoesqueléticas y neuronales. 2004; 4:386–387. [PubMed: 15758272]
Yang MAH, Heinrich Jelica Gluhak, Dayong Guo, Bonewald Lynda F, Stephen, Harris E. Gene
firmas de expresión de un modelo de células de osteoblastos cuboidales y preosteoblastos fibroblastoides en comparación
con el modelo de células de osteocitos MLOY4. Hueso. 2009; 44:32–45. [PubMed: 18973839]
Yellowley CE, Li Z, Zhou Z, Jacobs CR, Donahue HJ. Uniones comunicantes funcionales entre células osteocíticas y
osteoblásticas. Revista de investigación ósea y mineral. 2000; 15:209–217. [PubMed: 10703922]
Zhang K, BAC, Ye L, Kotha S, Dallas M, Lu Y, ZHAO S, Harris M, Harris SE, Feng JQ, Bonewald LF. Expresión selectiva de
E11/gp38 en osteocitos: regulación por tensión mecánica y papel en la elongación de las dendritas. Biología Molecular
y Celular. 2006; 26:845–853.
Figura 1.
Ejemplos de cada morfología utilizada para realizar el análisis morfológico de las células en
cada sustrato. Todas las células se tiñeron con rodaminafalodina.
Figura 2.
Mediciones de rigidez del sustrato por microscopía de fuerza atómica. Las barras de error indican la
desviación estándar de las mediciones repetidas. (a) Diferencia estadística de todos los demás valores. (b)
Diferencia estadística de Col, ColEDAC1, plástico TC y silicio.
Fig. 3.
Porcentaje de células que muestran la morfología dendrítica típica de los osteocitos después de 14 días
de cultivo en cada sustrato a una densidad de siembra inicial de 103 células/cm2 o 104 células/cm2 . Las
barras de error indican la desviación estándar de los pocillos repetidos. (a) Diferencia estadística con el
, pagpositivo
control negativo (MC3T3 en plástico TC a 104 células/cm2 <0,01). (b) Diferencia estadística
(MLOY4
con
en
eCl colAA
ontrol
a 104 células/cm2 <0,01). , pag
Figura 4.
Muestre morfologías de (A) plástico TC a 104 células/cm2 durante 14 días y (B) Col a 103
células/cm2 durante 14 días.
Figura 5.
Actividad de ALP extracelular a lo largo del tiempo de MC3T3 en: Col, ColEDAC1, ColEDAC2, plástico TC, medida a partir de medios extraídos de pocillos en el momento de la
recolección. Las barras de error indican la desviación estándar de los pocillos repetidos. (a) Diferencia estadística desde el punto de tiempo anterior de la misma condición
(<0.01). (b) Diferencia estadística con respecto al control (MC3T3 en plástico de cultivo tisular a 104 células/cm2 ) y mismo punto de tiempo (<0,01).
pag
pag
Figura 6.
Actividad ALP intracelular a lo largo del tiempo de MC3T3 en: Col, ColEDAC1, ColEDAC2, plástico TC. Las barras de error indican
la desviación estándar de los pocillos repetidos. * Valor atípico estadístico. (a)
Diferencia estadística desde el punto de tiempo anterior de la misma condición (<0.01). (b) Diferencia estadística
pag con respecto al control
(MC3T3 en plástico de cultivo tisular a 104 células/cm2 ) y mismo punto de tiempo (<0,01).
pag
Figura 7.
Mineralización de ECM a lo largo del tiempo causada por cultivos de MC3T3 en: Col, ColEDAC1, ColEDAC2, TC. Las barras de error indican la desviación estándar de
los pocillos repetidos. * Valor atípico de los datos estadísticos. (a) Diferencia estadística desde el punto de tiempo anterior (<0.05). (b) Diferencia estadística con respecto al
control (MC3T3 en plástico de cultivo tisular a 104 células/cm2 ) en el mismo punto de tiempo (<0,05). pag
pag
Figura 8.
Expresión génica en MC3T3 cultivadas en: Col, ColEDAC1, ColEDAC2 durante 14 (colágeno tipo 1, OSF2) o
21 (DMP1, Sost) días. Las barras de error indican la desviación estándar. (a)
Diferencia estadística de Col a la misma densidad de siembra. ( b ) Diferencia estadística de ColEDAC1 a la misma
densidad de siembra. (c) Diferencia estadística a partir de una densidad de siembra de 103 células/cm2 en el mismo
sustrato (<0,05). pag

Extracelular 1

Cargado por

Información del documento

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Extracelular 1

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

Machine Translated by Google

CA Mullenab, MG Haughab, MB Schafflerc , Majeskac , y LM McNamaraa,b,* RJ

dónde mies el Módulo de Young, es vla relación de Poisson, α es el ángulo de la cara de la punta, d es el

También podría gustarte