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FACULTAD DE MEDICINA

GUÍA DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

PRÁCTICA No: 003


NIVEL: Tercero
TEMA: Técnica de siembra para hongos y bacterias

LUGAR DE LA PRÁCTICA: Laboratorio de Microbiología. Facultad de Ciencia y


Tecnología
HORARIO: martes y jueves (9:00 a 11:00) y miércoles (11:00 a 13:00)
RESPONSABLE: Ing. María Fernanda Rosales

INTRODUCCIÓN:
El proceso de colocar las bacterias u otros microorganismos cultivables en medios de
cultivo, recibe el nombre de siembra; esta operación la podemos realizar a partir de
muestras biológicas (orina, pus, secreciones, etc.), de análisis para control de calidad
(alimentos, aguas, cosméticos, medicamentos, etc.), procedente de muestras
ambientales (agua, suelo, etc.) o de un cultivo microbiano a otro; si la realizamos de un
cultivo a otro la denominación subcultivo o repique.
Existen técnicas adecuadas para realizar estos cultivos, mediante el uso de algunos
elementos importantes para realizar siembras, como: el mechero (de alcohol o de
Bunsen), el asa bacteriológica (asa de argolla), o micológica (asa recta), cámaras de
flujo laminar o el espacio adecuado en condiciones asépticas y los medios de cultivo
ya preparados y atemperados a 37oC, esta última observación es importante tenerla
en cuenta, ya que los microorganismos objeto de estudio y presentes en las muestras
o cultivos, deben evitar ser estresados con cambios bruscos de temperatura o por
otros factores (incluida la composición del medio de cultivo).
Contando con estos implementos, es posible iniciar adecuadamente el proceso de
cultivar o subcultivar muestras o aislamientos previamente obtenidos.
TÉCNICAS DE SIEMBRA.
La técnica más usada en el laboratorio de microbiología es probablemente la
transferencia de microorganismos de un ambiente a otro con el propósito de
cultivarlos. Para determinar los caracteres de cultivo de las bacterias, hongos y otros
cultivables, es preciso obtenerlas en cultivo axénico (o cultivo puro).
Existen varios métodos para aislar las bacterias en cultivo puro con el fin de evaluar
sus características en estos medios.
Se entiende por cultivo puro, una población de células las cuales todas proceden de
una misma célula. Existe gran variedad de técnicas por medio de las cuales las
diferentes especies en una muestra natural pueden ser aisladas en cultivo puro.

TECNICAS DE SIEMBRA EN CAJAS PETRI.


Siembra en cajas de Petri por la técnica de agotamiento, aislamiento o de estría
cruzada.
Es un buen método para el aislamiento de colonias (obtención de colonias aisladas);
mediante esta técnica buscamos obtener colonias separadas a partir de un inóculo.

Siembra en cajas de Petri por la técnica de siembra en cuadrantes.


El objetivo de esta técnica, es el de diluir el inoculo a medida que se realizan estrías
en la superficie del agar.
Siembra en cajas de Petri por la técnica de siembra masiva.
Este método es muy utilizado para obtener un gran número de microorganismos
(incremento de inoculo), en la superficie de un agar. Esta técnica de siembra utiliza un
hisopo, el cual se pasa por toda la superficie de la placa en distintas direcciones y
finalmente por el borde para que, el crecimiento de los microorganimos sea total en la
superficie de la placa.

Siembras en cajas de Petri por la técnica de punción.


Método de siembra utilizado para observar el crecimiento de hongos y así más
adelante establecer su morfología; así como, para la transferencia o subcultivo de
cepas previamente almacenadas y/o conservadas. Consiste en tomar parte de micelio
con un asa micológica (o asa recta), y por una punción suave en el centro de la caja
inocular el microorganismo a estudiar. Dependiendo del objetivo, pueden hacerse
múltiples picaduras en el agar (varios puntos de siembra).
TECNICAS DE SIEMBRA EN MEDIOS CONTENIDOS EN TUBOS
La siembra de medios contenidos en tubos requiere mayor cuidado, puesto que un
solo organismo contaminante del aire supera en crecimiento al microorganismo de
interés, por lo tanto se deben tener las siguientes precauciones:
 Mantener inclinado el tubo que contiene el cultivo que se va a transferir, de
modo que los microorganismos del aire caigan en las paredes externas del
tubo y no en la boca de este.
 Los tapones se deben mantener en la mano contraria a aquella que contiene el
tubo, sosteniéndolos entre el dedo menique, el anular y el dedo del corazón.
Nunca deben colocarse sobre la mesa de trabajo o algún otro lugar,
 Flamear la boca del tubo antes de cerrarlo después de la siembra o
inoculación.
 Esterilizar el asa adecuadamente (toda la porción que entra en contacto con el
medio de cultivo)
 Sumergir el asa en el medio de cultivo, sin tocar las paredes del tubo.
 Enfriar el asa en una parte del medio, sin deteriorar el mismo
 Después de realizar la siembra esterilizar el asa y flamear nuevamente la boca
del tubo.
 Siempre trabaje con material abierto, en cámara de flujo laminar o en su
defecto con mecheros Bunsen.
 En las siembras por picadura y mixtas, evite romper el medio de cultivo, así
como, utilice asas totalmente rectas.

Siembra en tubo por estría simple.


Se realiza en un tubo con medio solido inclinado (en bisel o pico de flauta), y
deslizando el asa sobre la superficie expuesta del agar de manera que se marquen
surcos o estrías (fig. 5 A)
Siembra mixta en tubos.
Se realiza sobre medios inclinados o en bisel, haciendo una picadura hasta el fondo
del tubo con asa recta y luego haciendo una siembra en estria sobre la superficie
expuesta del agar, deslizando el asa por la superficie en bisel marcando las estrías, de
tal manera que, con el asa cargada se realizan los dos tipos de siembra y sin retirarla
del tubo (fig. 5B)
Siembra en tubos por picadura.
Se designa con este nombre a la siembra que se realiza con asa recta en tubos con
medios sólidos y semisólidos generalmente sin inclinar. Se realiza introduciendo el asa
cargada con el microorganismo al medio de cultivo por el centro de la superficie y
llegando con el extremo del asa al fondo del tubo (fig 5C y 5D).
Siembra en tubo en medio líquido.
Para transferir material a partir de un medio liquido o solido a otro líquido, puede
usarse el asa bacteriológica (de argolla), o en algunos casos, pipetas estériles o
hisopos. Cuando se usa asas bacteriológicas, inocular el microorganismo en el medio
liquido haciendo rotar el mango (fig 5E)

O c

Nota: en cualquier siembra que Usted realice debe marcar previamente las cajas Petri
o los tubos de manera clara, completa, legible, con la identificación respectiva y la
fecha. Para análisis clínico, marcar siempre las cajas en la base de la caja Petri. Luego
de realizada la siembra, Usted debe proporcionar la temperatura y el tiempo adecuado
para la proliferación o crecimiento bacteriano, para ello dispone de la incubadora.
Recuerde que las cajas Petri se incuban invertidas, si el inoculo no se ha adsorbido,
espere 10 minutos, si este tiempo no es suficiente incube las cajas con la tapa arriba
por 30 minutos antes de invertirlas. Lo anterior, tiene como objetivo impedir que el
agua de condensación que pueda formarse en la tapa de la caja, caiga sobre el medio
dispersando el crecimiento bacteriano y evitando la formación clara de las colonias.
RESULTADOS DE APRENDIZAJE:

Resultados de aprendizaje de la Resultados de aprendizaje de la


carrera relacionados con la materia materia
(Asignados por la Junta Académica) (Definidos por el docente a partir de los
resultados asignados por la Junta
Académica)
Practicar las diferentes técnicas de  Habilidad para realizar siembras
siembra para el desarrollo de cultivos y de microorganismos en medio
subcultivos de hongos y bacterias. sólidos y medios líquidos.

Desarrollar en los estudiantes la  Determinar adecuadamente las


capacidad de selección de una técnicas para realizar la siembra
metodología específica, de acuerdo a de los microorganismos.
los criterios proporcionados, para la
aplicación de las técnicas de siembra de
acuerdo al microorganismo y al objetivo
de la prueba.

MATERIALES/REACTIVOS:

 4 Cajas Petri con agar PDA  1 mechero Bunsen


 4 cajas Petri con agar Nutritivo  1 cultivo bacteriano en caja Petri
con agar Nutritivo de 24 horas.
 4 tubos con 5 ml de Caldo  1 cultivo fúngico en caja Petri con
Nutritivo agar PDA de 3 días
 4 tubos con agar SIM  Etanol al 70%
 2 tubos con agar nutritivo en bisel  Toallas desechables
 1 tubo con agar PDA en bisel  1 rollo de parafilm
 2 hisopos estériles en tubo  1 rollo de cinta scotch
taparosca
 1 asa bacteriológica  2 incubadoras de 35+/- 2oC y
25oC
 1 asa micológica

METODOLOGÍA:
De acuerdo a la fundamentación teórica de esa guía, a las indicaciones del profesor y
al material de trabajo, efectúe las siembras listadas a continuación:
1. Siembre por picadura en tubos de agar sin inclinar (rectos) (bacteria)
2. Siembre por estría en tubos de agar inclinado (bacteria)
3. Siembre por técnica mixta en tubos de agar inclinado (bacteria)
4. Siembre por agotamiento (aislamiento o estría cruzada), en cajas Petri
conteniendo agar Nutritivo (bacteria).
5. Siembre por la técnica de cuadrantes, en cajas Petri conteniendo agar Nutritivo
(bacterias)
6. Siembre por la técnica masiva y con hisopo, en la superficie de una caja Petri
con agar Nutritivo (bacteria)
7. Siembre en tubos de caldo Nutritivo, utilizando asa bacteriológica (bacteria)
8. Siembre por punción cajas de agar PDA (hongo)
9. Siembre por punción tubos de agar PDA inclinado (hongo)

CUESTIONARIO.
1. Cuál es el objetivo o finalidad de una siembra por agotamiento?
2. Mencione brevemente el proceso de purificación de un aislamiento bacteriano
obtenido en agares.
3. Explique brevemente la metodología para realizar en placa profunda y placa en
superficie.

EVALUACIÓN:

Resultados de Resultados de aprendizaje Evidencias


aprendizaje de la de la materia
carrera relacionados (Definidos por el docente a
con la materia partir de los resultados
(Asignados por la Junta asignados por la Junta
Académica) Académica)
Desarrollar habilidades  Aplicar los  Adiestramiento en
en laboratorio para las conocimientos la practica
diferentes técnicas de adquiridos en
siembra de laboratorio.
microorganismos.

Evidencia de Calificación I Calificación II Calificación II Examen


aprendizaje aporte aporte aporte final
Control de 0.5 0.5 0.5 1
lectura
lecciones 2 2 2
Práctica 0.5 0.5 0.5

Como se toman varias lecciones durante las prácticas de cada parcial se promedian
para obtener el puntaje correspondiente.

Bibliografía:

 Aquiahuatl Ramos, M.A. y Pérez Chabela, M. L. 2004. Manual de prácticas del


Laboratorio de Microbiología General. Universidad Autónoma Metropolitana,
unidad Iztapalapa. México. Departamento de Biotecnología. 116p.
 Madigan M.T, Martinko J.M., Parker J. Brock. Biología de los Microorganismos.
Madrid (España). Pearson Educación. 2004. 1096 p
 Merck. Manual de Medios de Cultivo. Editorial Merck, Alemania. 1994
 Rojas-Triviño, Alberto. 2011. Conceptos y prácticas de microbiología general.
Universidad Nacional de Colombia, Sede Palmira. Colombia

Elaborado por: Ing. Ma. Fernanda Rosales M.