PERFIL INMUNOFENOTIPICO DE CD34+ DE SUBPOBLACIONES Y SU ROL EN

EL DIAGNOSTICO Y PRONOSTICO EN LOS PACIENTES CON PACIENTES DE

SINDROMES MIELODISPLASICOS DE NOVO PARTICULARMENTE DE BAJO
GRADO

Nikolaos Gardikas, Myrofora Vikentiou, Evgenia Konsta, Christo K. Kontos,

Sotirios G. Papageorgiou,Aris Spathis,Eftinia Bazani, Anthi Bouchala, Violetta
Kapsimali, Katherina Psarra, Periklis Foukas, George Demitriadis and Vasiliki
Pappa.

Wiley Library DOI:10.1002, Cytometry Part B: Clinical Cytometry

INTRODUCCIÓN

Los síndromes mielodisplásicos ( SDM ) constituyen un grupo de transtornos

clonales de la célula madre hematopoyética, caracterizados por hematopoyesis
inefectiva y aumento en la muerte celular intramedular, que típicamente se
manifiestan con citopenias en sangre periférica y en la médula ósea hipo, hiper o
normocelular con menos de 20% de blastos.

Se sabe que aproximadamente el 20% a 30% de los pacientes con SMD tienen
predisposición a desencadenar Leucemia Mieloide Aguda ( LMA ); esto esta dado
por una expansión clonal con una inhibición de la hematopoyesis normal.

Los padecimientos pueden ocurrir de novo o ser secundarios a tratamiento con

quimioterapia citotóxica o radioterapia.

A pesar de una mejor diagnóstico y criterios para mejorar el pronóstico se necesita

tener modelos clínicos y un criterio heterogéneo para estos síndromes.

En los años recientes la citometría de flujo multicanales ha tomado mucha más

importancia y tomada como una herramienta importante para el diagnóstico de los
síndromes mielodisplásicos e identificar expresión aberrante de antígenos.

Aunque el inmunofenotipo es útil para el diagnóstico se ha propuesto la

combinación de criterios y dentro estos críterios han mostrado una discriminación
entre estos SDM y otras citopenias con una alta sensibilidad y especifícidad
aceptable.

La citometría de flujo ha sido utilizada en el dignóstico de leucemias agudas y

desordenes linfoprolifetativos, pero no existe un consenso en lo que respecta para
los SMD.
También existen estudios donde se utiliza la citometría de flujo para demostrar
anormalidades en la expresión de antígenos especifícos tales como CD 34 y CD
117, como también la expresión aberrante del CD 45.

Mientras tanto las características innmunofenotipicas del CD 34+ en médula ósea

de pacientes con SDM que se estudiaron la expansión del linaje de neutrófilos CD
34+ se encontró un bajo riesgo de SDM mientras que la expresión en la células
inmaduras con CD34+ se observó que tienen un alto riesgo para desarrollar SDM,
también como en los procesos de transformación de bajo riesgo con un cariotipo
normal o. eventualmente con un alto riesgo de SDM.

OBJETIVOS

- Identificar las causas de las alteraciones que puede provocar a nivel celular
de las células hematopoyéticas
- Conocer los antígenos aberrantes implicados en los linajes mieloides para
desarrollar SDM
- Que tipo de pacientes es suceptible para el desarrollo de un síndrome
mielodisplásicos
- Las expresiones aberrantes de antígenos de superficie son predictores de
malignidad en el linaje celular
- La citometría de flujo es una buena herramienta diagnóstica para las
malignidades hematológicas
- La médula ósea hipo, hiper o normocelular es de sospecha de algún
padecimiento hematológico que puede hacer sospechar alteración de la
célula progenitora

METODOLOGÍA

- Especímenes de médula ósea de pacientes sin tratarse de 57 hombres y

15 mujeres con una edad media de 75 años, que recientemente fueron
diagnósticados con SMD de estudiaron con el citometro de flujo de 5
canales ( colores ), que fueron derivados al. servicio de hematología .
- Muestras de sangre con EDTA y médula ósea obtenida por aguja
aspiración, las muestras de médula se conservaron en una solución
amortiguadora salina, la flourescencia usando el equipo ( Quicklysis,
Cytognos que fue analizado con el análisis CXP 2.2
 - Todos los pacientes tuvieron un diagnóstico definitivo de un SMD primario
de novo, un síndrome mieloproliferativo, todo esto fue apoyado con su
historia clínica, citomorfología y de los especímenes de médula ósea se les
hizo el análisis morfológico, y se estudio biopsias y se les realizó
citogenética.

100,000 células que fueron obtenidas de cada tubo que fueron analizados en el
instrumento Coulter FC500m ( Beckman Coulter ).

RESULTADOS

- Análisis de células CD34+, así como subpoblaciones de esta misma

población
- Subpoblación CD 34 débil expresión de CD45, se encontró un aumento
significativo en MSD comparado con el control p=0.002, causado
principalmente por el aumento observado con un riesgo aumentado de
SDM, sin embargo estas poblaciones tuvieron un incremento significativo
de la expresión de CD133+/CD90- y una significativa disminución de
precursores linfoides y eritroides ( < CD117-/TdT+) < p=0.001 y
CD64-/CD36+ p=0.012 respectivamente que quiere decir que tiene
significancia.
- Además los pacientes que tuvieron un aumento en las células
CD117+/TdT- se relacionó a un alto riesgo de desarrollar SDM p=0.013.
- Y la mayoría se relacionó CD33+/MPO- a un bajo riesgo de SMD, p=0.019,
ya que el marcador de células mieloides es MPO.
- En lo que concierne a la células progenitoras de neutrófilos disminuye de
población total, también como un incremento de CD64+/CD36-, estos
porcentajes fueron observados en los gupos de alto riesgo de SMD.
- Bajo riesgo de SMD en pacientes con cariotipo normal contra muestras
control.
- Dentro las poblaciones de células CD34+ tuvieron una reducción
significativa de apoptosis de células CD34+/CD90+ se observó en SMD,
comparados con los controles.
- En las células progenitoras de neutrófilos con un significativa reducción de
CD117 la apoptosis tardía fue comparada con controles.
CONCLUSIONES Y DISCUSIÓN

Las células hematópoyeticas se caracterizan por ser pluripotencial y la amplia

capacidad de autorenovación. Sin embargo se sabe que los SMDs son una
enfermedad de células madres, aunque aún no se saben aún no se tienen las
evidencias sólidas, sin embargo las alteraciones de las células madre y las que son
progenenitoras en pacientes con SMD pero no esta bien definido.

Este estudio definió estándares para la preparación y el procesamiento celular, se

definieron combinaciones míniminas de anticuerpos, que se necesitan para
cuantificar las células que células precursoras mieloides CD34+ y para poder
detectar los marcadores aberrantes de los precursores mieloides, células maduras,
monocitos y precursores eritroides.

En el presente estudio se empleó el método citometría de flujo con 5 colores para el

análisis basados en CD34+, particular se investigó :

a) CD 34+ y
b) células con expresión débil de CD45 los cuales tienen el propósito de ser
usados con marcadores mieloides
c) CD 34 + células precursoras de neutrófilos, los cuales representan el primer
paso de las células granulocitícas hasta alcanzar los gránulos primarios y los
cuáles ya muestran características displásicas morfológicamente y con
características fenotipícamente en los que tienen un SMD

VALIDEZ INTERNA

- Implementar nuevos criterios diagnósticos de SMD en la clínica

- Conocer las características morfológicas de las neoplasias hematológicas
- Conocer los instrumentos de citometría de flujo en el diagnóstico de SMD
- Identificar las causas fenotípicamente y así encontrar el tratamiento
oportuno
- Encontrar las causas moleculares de la alteración célular
- Conocer que las causas de los SMD no solo son ambientales sino
genéticas
VALIDEZ EXTERNA
- Las casas encargadas de producir equipos de citometría de flujo incluyan
nuevos paneles que incluyan antígenos de superficie no incluidos en los
tradicionales
- Implementar nuevos criterios en la clasificación de los SMD
- Los laboratorios encargados de enfermedades neoplásicas implementen
los nuevos equipos de diagnóstico

RESUMEN

Los síndromes mielodisplásicos son transtornos de células madre

hematopoyéticas clonales que hoy en día se tienen su etiología aun no
establecida. En la actualidad la citometría de flujo que se ha convertido útil
para el diagnóstico y pronóstico de esta enfermedad.

Se observaron porcentajes más altos de CD133+/CD90-, CD45 débil,

CD117+/TdT-.

CD45 débil y CD 33+/MPO-, precursor de neutrófilos en la células CD34+, así

como la disminución precursoras de células de estirpe linfoide y de la serie
eritroide. En un grupo de pacientes con SMD comparado con grupos control, y
se utilizó un sistema nuevo de puntuación que se baso en los hallazgos ya
mecionados que puede ser útil para poder clasificar a los pacientes con SMD
de bajo riesgo que se incluyen cariotipos normales.

Además se identificó un mayor nivel de apoptosis de las células

CD34+/CD117+ como un factor pronóstico de riesgo para una transformación
a LMA.

PUNTOS CLAVE

- El propósito fue investigar la utilidad diagnóstica de todas las

subpoblaciones dominantes CD34+, precursores de células madre usando
CD90 y CD133 como marcadores preliminares para los linfoides mediante
la expresión CD117-/TdT+.
- Los marcadores de la serie mieloide mediante el uso de marcadores HLA-
DR/CD34, MPO/CD33 y CD117+/TdT.
- Los marcadores de serie eritroide, mediante CD36+/CD 64-
- Se utilizó un panel de anticuerpos monoclonales de precursores de
neutrófilos, comparados con las diferencias encontradas entre los
porcentajes entre las subpoblaciones estudiadas.
- La escasa tinción de los neutrófilos granulocitos maduros por medio de
mielopexidasa citoplasmática MPO, como un marcador específico de los
gránulos primarios azurófilos con un standard de citoquímica e
inmunohistoquímica, que ha sido considerado como un marcador de
defecto funcional (deficiencia MPO) que es un dato de displasia.
- La MPO fue utilizada en este estudio para obtener información adicional
intracitoplasmática además de la expresión de marcadores de superficie
- Se comparó entre las médulas óseas, particularmente entre pacientes de
bajo riesgo con cariotipo normal y los controles
- Los. hallazgos más importantes fueron:
a) Para células progenitoras CD34+/ CD 45 débil, el porcentaje total de
CD34+ también como CD133+CD90-, CD117+TdT-,CD 33+MPO-, los
porcentajes fueron estadísticamente aumentados.
b) Para los precursores de neutrófilos una disminución de CD34+ con un
porcentaje también como un aumento de CD64-HLDR+ y CD 33+/MPO-,
que sugieren la existencia de marcadores anormales ( HLDR+, CD
64-,MPO-)
- El valor pronóstico de la citometría de flujo en los SMD ha sido descrito
para poder diferenciar las diferentes las diferencias entre las diferentes
clases de riesgos basados en los inúmeros de inmunofenotipicos
aberrantes.
- Además en pacientes con <5% de blastos , la presencia de progenitores
mieloides aberrantes, por citometría de flujo afecta negativamente el
pronóstico
- El rol pronóstico de CD34+,CD117+ en SMD se ha descritodescrito
previamente
- El CD117 es un marcador fidedigno para detectar células leucémicas donde
esta comprometida la línea mieloide
- La co-expresión de CD34/CD117 sugiere fuertemente el diagnóstico de
LMA y aumento en CD34 y CD 117 positivos en médula ósea en células
blásticas que puede estar asociados a un alto riesgo de tranformación
leucémica en pediátricos con SMD.

PREGUNTAS
1.- El acrónimo LMA-M5 ¿ de que subtipo de leucemia mieloide aguda es
indicativo?
a) Leucemia mielomocítica aguda
b) Leucemia mielomonocítica aguda sin maduración
c) Leucemia mielomocítica aguda
d) Leucemia mieloblástica escasamente difenciada
R= c) predominan las células de tipo monocítico. Es la forma que con mayor
frecuencia se localiza en el nivel de los ganglios linfáticos y tejidos, en
especial la piel, los monoblastos son bastante grandes, con gránulos
citoplasmáticos típicos de las células monicíticas, son positivos para la
estérasa específica; tienen núcleo redondo y en forma de herradura.

2.-¿ En la LMA se basa en el cuadro clínico y se confirma con ?

a) Tinciones
b) Cultivo celular
c) Pruenbas de laboratorio, caracterización de la citogenéticas y biología
molecular

R= c) las leucemias se confirman con todas las baterías de pruebas de

laboratorio
y hoy en día se tienen las herramientas de la biología molecular

3.- Es un marcador intracelular que solo lo contienen la serie mieloide y se

utiliza como marcador indicador de linaje

a) Heparan sulfato
b) MPO
c) Fosfatasa ácida
d) Lizosima

R= b) muy útil, se utiliza un anticuerpo anti-MPO y evidencia los maduros

de serie mieloide aunque no todos, si es positiva se podra considerar LMA