Bioquímica

1. Titulación de aminoácidos y determinación del punto isoeléctrico de una proteína

1
Barrios María Alejandra, Gil Luis Adrian, Salgado Tatiana, Hernandez Andres Felipe
  2 Oscar Javier Yépez Rendón 
1,2
Corporación Tecnológica de Bogotá - CTB
1
Estudiantes Bioquimica - GN, 2 Profesor

Bogotá, D. C., 17 de febrero de 2023

2. Objetivos

2.1. Objetivo general:

Realizar el seguimiento físico químico de la titulación de aminoácidos monomericos y en

forma proteínica para identificar sus principales características de comportamiento acido -
base y de carga molecular a medida que se diseña la curva de titulación de los
aminoácidos analizados. Posterior al desarrollo analítico anterior se constataran los datos
obtenidos contra la literatura de aminoácidos y poli péptidos correspondiente

2.2. Objetivos específicos

 Determinar el pH inicial de la solución de aminoácido a estudiar.

 Realizar una titulación por el método potenciométrico
 Estimar el punto isoeléctrico de sustancias químicas en solución
 Aplicar conceptos previamente estudiados en clase y compara los resultados obtenidos con
la bibliografia

3. Marco teórico.

3.1 Amino acido.

Los aminos ácidos son moléculas orgánicas constituidas principalmente por carbono,
hidrogeno, oxígeno y nitrógeno. Los aminoácidos son hidrofilicos porque en sus extremos
moleculares poseen grupos amino y carboxílico lo cual genera polaridades contrarias para
producir reacciones de condensación conformando polipéptidos y posteriormente
proteínas.
Los aminoácidos son en total 20 moléculas distintas que conforman las proteínas de
todos los organismos. (FEDUCHI, 2010)
3.2 Sustancia anfotérica.

Las moléculas anfóteras son aquellas que por sus características periódicas y moleculares
se pueden comportar como ácidos o como bases siendo donadoras o aceptores de
hidrogeniones, Los aminoácidos dependiendo del pH de la solución en que se encuentre
pueden actuar como ácidos o bases de Lewis haciendo las veces de anfóteros. La
característica anfoterica de los aminoácidos deriva de los grupos funcionales residuales
que se encuentran en los extremos de sus cadenas alifáticas como es el caso de los
péptidos o de los aminoácidos simples. (FEDUCHI, 2010)

Imagen 1Caracter anfótero de los aminoácidos.

3.3 Valores de Pka de los aminoácidos.

Los 20 aminoácidos poseen en su totalidad 2 valores de pka similar a los ácidos

débiles dipróticos. El primer valor de pka siempre corresponde a la desprotonación del
ácido carboxílico presente en la molécula de cada aminoácido y el segundo valor de pka
corresponde a la desprotonación y perdida de carga positiva del grupo amino presente en
cada estructura molecular década aminoácido.

7 de los 20 aminoácidos poseen un valor de pka adicional correspondiente a la

desprotonación que sufre uno de sus grupos funcionales presente en la cadena lateral
del aminoácido lo cual convierte a este aminoácido en características similares a un ácido
débil triprótico (FEDUCHI, 2010)
 Imagen 2 Valores de pKa correspondiente a los 20 aminoácidos básicos.

3.4 Curva de titulación:

Es la curva que expresa la variación de reacción entre un ácido y una base en términos
del logaritmo inverso de la concentración de hidrogeniones presentes en el medio de
solubilización, producto de la reacción de neutralización entre ácidos y bases. (chang,
2010)

Imagen 3 Ejemplo de curva de titulación acido base para un ácido dipróticos. (chang,
2010)
3.5 Solución amortiguadora.

Es una solución que posee en equilibrio cationes como los hidrogeniones y aniones
como contraparte sin que reaccionen de manera mutua, a este fenómeno se le conoce
como par conjugado o ion común.

Esta particularidad permite que en la solución se dispongan cationes ácidos que

neutralizan o reaccionan con iones contrarios que se agreguen a la solución. Los
aniones que se encuentran en solución permitirán que se neutralicen los iones de
cargas positivas que sean agregados a la solución. Lo anterior permite mantener el pH
de la solución de manera estable a pesar de las agregaciones de analitos que alteran
el pH. (chang, 2010)

Imagen 4 Zona buffer de una titulación acido base.

3.6 Punto isoeléctrico.

Es el punto dentro de una curva de titulación acido-base donde las cargas moleculares
de un mismo aminoácido se encuentran divididas en 50 % positivas y el otro 50 %
como cargas negativas concediendo el estado de zwitterion a las moléculas de los
aminoácidos. El cambio de estado de carga molecular se puede desplazar con facilidad.
(FEDUCHI, 2010)

3.7 Clasificación de aminoácidos.

Los aminoácidos se pueden clasificar según la estructura y carga polar de sus cadenas
laterales, algunos aminoácidos presentan carácter apolar por la gran cantidad de
 enlaces covalentes mientras que otros presentan carácter polar a determinados pH. Lo
anterior se concede características antipáticas o hidrofilias. (FEDUCHI, 2010) Página 60

CLASIFICACIÓN AMINOÁCIDOS.

Aminoácidos hidrofóbicos. Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Trp, Met
Aminoácidos polares sin carga. Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln
Aminoácidos ionizables a pH fisiológico. Glu, Asp, Lys, Arg, His

3.8 Composición de la leche entera.

Leche entera.
Cantidad
Componente. Unidad.
.
Agua 88.1 gramo
Energía 60 kcal
Proteína 3.28 gramo
Lípidos totales (grasas) 3.2 gramo
Carbohidrato, por diferencia 4.67 gramo
Azúcares, total incluyendo NLEA 4.81 gramo
Calcio, Ca 123 miligramos
Magnesio 12 miligramos
Fósforo, P 101 miligramos
potasio, K 150 miligramos
sodio, sodio 38 miligramos
zinc, zinc 0.41 miligramos
Cobre, Cu 0.001 miligramos
Selenio, Se 1.9 µg
tiamina 0.056 miligramos
Riboflavina 0.138 miligramos
niacina 0.105 miligramos
vitamina B-6 0.061 miligramos
Colina total 17.8 miligramos
Vitamina B12 0.54 µg
Vitamina A, RAE 32 µg
retinol 31 µg
caroteno, beta 7 µg
Vitamina E (alfa-tocoferol) 0.05 miligramos
Vitamina D (D2 + D3) 1.1 µg
Vitamina K (filoquinona) 0.3 µg
 Ácidos grasos, saturados totales 1.86 gramo
SFA 4:0 0.067 gramo
SFA 6:0 0.054 gramo
SFA 8:0 0.034 gramo
SFA 10:0 0.084 gramo
SFA 12:0 0.097 gramo
SFA 14:0 0.303 gramo
SFA 16:0 0.857 gramo
SFA 18:0 0.309 gramo
Ácidos grasos, monoinsaturados
0.688 gramo
totales
MUFA 16:1 0.047 gramo
MUFA 18:1 0.694 gramo
MUFA 20:1 0.004 gramo
Ácidos grasos poliinsaturados
0.108 gramo
totales
AGPI 18:2 0.115 gramo
AGPI 18:3 0.012 gramo
AGPI 20:4 0.004 gramo
AGPI 2:5 n-3 (EPA) 0.001 gramo
AGPI 22:5 n-3 (DPA) 0.002 gramo
Colesterol 12 miligramos
Tabla 1 Composición de la leche según USDA de EEUU. (DEPARTAMENTO DE
AGRICULTURA DE EE. UU., 2022)

Imagen 5 Contenido de aminoácidos en la leche según USDA EEUU (DEPARTAMENTO

DE AGRICULTURA DE EE. UU., 2022)
 3.9 Proteínas

Una proteína es la unión de varios monómeros de aminoácidos distintos por medio de

enlaces covalentes de condensación entre el grupo alfa amino y el grupo alfa carboxílico
de otro aminoácido. Las proteínas constituyen gran parte de las macromoléculas de los
organismos como las enzimas y son esenciales para el desarrollo y funcionamiento
regular de los organismos vivos.

Las proteínas se pueden clasificar en 4 niveles estructurales que son estructura primaria,
estructura segundaria, estructura terciaria y estructura cuaternaria. La clasificación de
proteínas depende de su complejidad estructural que presenta como por ejemplo la unión
de 2 o más aminoácidos simples en forma lineal, el plegamiento de múltiples cadenas
proteínicas de un mismo tipo o de distinto tipo. (FEDUCHI, 2010) Página 76 y 77

3.10 ¿Que es la caseína y para que se usa?

La caseína es una proteína de alto valor biológico, que se encuentra en la leche en forma
de un complejo soluble de calcio y fósforo. Representa el 80% de las proteínas de la leche
de vaca, y es necesaria para la absorción de calcio y fosfato en el intestino.

Contiene, además, aminoácidos esenciales, un alto porcentaje de glutamina, al que se le

atribuyen propiedades beneficiosas para la musculatura y para el sistema inmunitario del
organismo. La caseína se emplea en la industria para la fabricación de pinturas
especiales y en el apresto de tejidos, la clarificación de vinos, la elaboración de preparados
farmacéuticos y la fabricación de plásticos. El punto iso electrico de la caseina es de 4.6
a este pH, la caseína se encuentra en su punto de menor solubilidad, debido a la reducción
de repulsiones intermoleculares, por lo que precipita. (DEPARTAMENTO DE
AGRICULTURA DE EE. UU., 2022)

CURVA DE CALIBRACIÓN DE AMINOACIDOS Y DETERMINACIÓN DEL PUNTO ISOELECTRICO

Calibrar el pHmetro

Preparar 100 mL de solución 0,1 M

del aminoácido1*

Agregar 25 mL de solución del

aminoácido en un Erlenmeyer

Cargar la bureta con NaOH 0,25 M

 Agregar 0,5 M del titulante.

Agitar el Erlenmeyer y medir pH

Continuar titulando hasta pH 12

Realizar 3 titulaciones

1*
Antes de aforar la solución, ajustar el pH a 1,5 con HCl 3 M.

DETERMINACIÓN DEL PUNTO ISOELECTRICO DE LA CASEÍNA

Agregar 160 mg de caseína en un

vaso de precipitado de 100 mL

Agregar 8 mL de agua destilada y 2

mL de NaOH 1 M.

Agitar hasta disolver la caseína

Agregar 5 mL de ácido acético 1 M

Medir el pH 1*

Trasferir a un balón aforado de 50

mL

Adicionar 1 mL de la solución en
10 tubos de ensayo 2*
 Con la escala cuantitativa de
cruces, determinar el mayor grado
de turbidez

Determinar la absorbancia de cada

tubo

1*
El pH debe estar más o menos neutro, si no, ajustar con ácido acético o hidróxido de sodio.
2*
Los volúmenes de solución son los siguientes:

Acetato de sodio 0,1 Ácido acético Ácido acético

Tubo M (mL) 0,1M (mL) 0,01M (mL)
1 0,50 9,5 -
2 1,0 9,0 -
3 1,5 8,5 -
4 2,0 8,0 -
5 3,0 7,0 -
6 4,0 6,0 -
7 6,0 4,0 -
8 8,0 2,0 -
9 6,0 - 4,0
10 8,0 - 2,0
11 (Blanco) 6,0 2,0 2,0

FICHAS DE SEGURIDAD:

Nombre Hidróxido de sodio

Formula NaOH
Masa molar 39,99713 g/mol
Clasificación Base
Densidad  2,13 g/cm³
Punto de ebullición 1.388 °C
Hidrosolubilidad Soluble
1 B (H314) Corrosión o irritación cutáneas
Frases H
1 (H318) Categoría Lesiones o irritación ocular graves Categoría
Frases P P273 Evitar su liberación al medio ambiente
 Pictogramas

Nombre Ácido clorhídrico

Formula HCl
Masa molar 36,46 g / mol
Estado Líquido
Densidad 1,16 g / mL
Punto de fusión -50 °C
Hidrosolubilidad Miscible en cualquier proporción
H290 Puede ser corrosivo para los metales
H314 Provoca quemaduras graves en la piel y lesiones oculares
Frases H
graves
H335 Puede irritar las vías respiratorias
P280 Llevar guantes/ropa de protección/equipo de protección
Frases P
para los ojos/la cara/los oídos/...

Pictogramas

Nombre Glicina
Formula C₂H₅NO₂
Masa molar 75,07 g /mol
Estado sólido
Densidad 1,161 g /cm³ a 20 °C (ECHA)
Punto de fusión >233 °C (descomposición)
Hidrosolubilidad 250 g /l a 25 °C (ECHA)
Frases H N/A
Frases P N/A

Pictogramas

Nombre L-Lisina monohidrato

Formula C₆H₁₄N₂O₂ · H₂O
Masa molar 164,2 g /mol
 Estado sólido
Densidad no determinado
Punto de fusión ~215 °C
Hidrosolubilidad no determinado
Frases H N/A
Frases P N/A
Pictogramas N/A

Nombre L-Fenilalanina
Formula C₉H₁₁NO₂
Masa molar 165,2 g /mol
Estado sólido
Densidad 1,343 g /cm³ a 20 °C
Punto de fusión 270 – 284 °C (ECHA)
Hidrosolubilidad 25,02 g /l a 20 °C (ECHA)
Frases H N/A
Frases P N/A
Pictogramas N/A

Nombre Caseína
Formula C81H125N22O39P
Masa molar 20 - 25 kDa
Estado sólido
Densidad Densidad no determinado
Punto de fusión 280 °C
Hidrosolubilidad parcialmente soluble
Frases H N/A
Frases P N/A
Pictogramas N/A

Nombre Ácido acético

Formula C₂H₄O₂
Masa molar 60,05 g /mol
Estado líquido
Densidad 1,04 g /cm³ a 25 °C
Punto de fusión 16,64 °C (ECHA)
Hidrosolubilidad 602,9 g /l a 25 °C (ECHA)
H226 Líquidos y vapores inflamables
Frases H H314 Provoca quemaduras graves en la piel y lesiones oculares
graves
Frases P P210 Mantener alejado del calor, de superficies calientes, de
chispas, de llamas abiertas y de cualquier otra fuente de ignición.
No fumar
 P280 Llevar guantes/prendas/gafas/máscara de protección
P301+P330+P331 EN CASO DE INGESTIÓN: Enjuagar la boca. NO
provocar el vómito
P303+P361+P353 EN CASO DE CONTACTO CON LA PIEL (o el pelo):
Quitar inmediatamente toda la ropa contaminada. Enjuagar la
piel con agua [o ducharse]
P305+P351+P338 EN CASO DE CONTACTO CON LOS OJOS:
Enjuagar con agua cuidadosamente durante varios minutos.
Quitar las lentes de contacto cuando estén presentes y pueda
hacerse con facilidad. Proseguir con el lavado
P310 Llamar inmediatamente a un CENTRO DE
TOXICOLOGĺA/médico

Pictogramas

Nombre Acetato de sodio

Formula C₂H₃O₂Na
Masa molar 82,03 g /mol
Estado sólido
Densidad 1,53 g /cm³ a 20 °C
Punto de fusión 324 – 328 °C (descomposición lenta)
Hidrosolubilidad >365 g /l a 20 °C
Frases H N/A
Frases P N/A
Pictogramas N/A