BIOQUÍMICA II:

“BIOLOGÍA MOLECULAR”

Paula Rodríguez Rodríguez

MEDICINA 1. URJC
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 BLOQUE II:

“BIOLOGÍA MOLECULAR”

TEMAS:

TEMA 1.1: ÁCIDOS NUCLEICOS: ADN Y ARN

TEMA 1.2: ÁCIDOS NUCLEICOS COMO SOPORTE DEL MENSAJE GENÉTICO

TEMA 2: REPLICACIÓN DEL ADN

TEMA 3: REPARACIÓN DEL ADN

TEMA 4: RECOMBINACIÓN DEL ADN

TEMA 5: TRANSCRIPCIÓN

TEMA 6: TRADUCCIÓN

TEMA 7: MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES DE LAS PROTEÍNAS

TEMA 8: INGENIERÍA GENÉTICA I. TÉCNICAS DE ANÁLISIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS

TEMA 9: INGENIERÍA GENÉTICA II. VECTORES DE CLONACIÓN Y CONSTRUCCION DE GENOTECAS

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TEMA 1.1: ÁCIDOS NUCLEICOS: ADN Y ARN

Los ácidos nucleicos están formados por nucleótidos. Los nucleótidos son las moléculas sillares de los
ácidos nucleicos. ADN por desoxirribonucleótidos y el ARN por ribonucleótidos.

En todos los nucleótidos tenemos un grupo fosfato que se va a unir a una molécula de azúcar, pentosa
(ribosa o desoxirribosa) por el carbono en posicion 5” de la ribosa. Por otra parte tenemos la base
nitrogenada que se va a unir a la ribosa por el carbono de la posición 1’’.

Importante dos enlaces: un enlace que une

grupo fosfato a la ribosa y el que une la
ribosa con la base que es el enlace B-N-
glucosídico.
Existen otros nucleótidos además de los que
forman parte de los ácidos nucleicos como el
cGMP o el cAMP (son cíclicos).

COMPOSICIÓN

Bases nitrogenadas: son compuestos formados por C y N, aromáticos y heterocíclicos. Son moléculas
planas:
• Purinas: Adenina y Guanina. Enumeración anticlock, se unen a la ribosa por el N 9 mediante el
enlace B-N-9-glucosídico (dando lugar a un nucleósido).
• Pirimidínica: Citosina, Timidina (ADN) y Uracilo (ARN). Partimos del N en posición 1” y sigue en
dirección del reloj (clockwise). Se unen a la ribosa por la posición 1 N mediante el enlace B-N-1-
glucosídico (dando lugar a un nucleósido).

El uracilo se forma también en el DNA pero el Uracilo en el ADN es muy inestable. Sin embargo la timidina
está metilada por eso es más estable y aparece en el ADN. En el DNA el uracilo inmediatamente se metila
y pasa a ser timidina. En el RNA no se produce tan fácilmente esa metilación por lo que permanece como
RNA.

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Pentosas: son azúcares, monosacáridos de 5 átomos de carbonos. Pueden ser:
• Ribosa: el nucléotido es un ribonucleotido.
• Desoxirribosa: el nucleótido es un desoxirribonucleotido.
Hay que tener en cuenta que en las pentosas, los cinco átomos de carbono no se encuentran en el mismo
plano, sino que hay átomos de carbono que sobresalen y hay otros que se meten por debajo del plano.
De esta manera podemos encontrarnos con dos conformaciones: 3’-endo, 2-endo o 3’-exo, 2’- exo. Endo
significa que el átomo de carbono está por encima del plano, y exo que el átomo está por debajo del
plano.

3-
Molécula de ácido fosfórico: se encuentra en forma de ion fosfato (PO4 ). Está unido al carbono 5’ de la
pentosa por un enlace fosfodiéster.

La unión de una B.N y una pentosa, se realiza mediante un enlace N-glucosídico, y da lugar a un
nucleósido. Dicho enlace se establece entre el C1 de la pentosa y el N1 de la base si es pirimidínica, o el
N9 si es púrica, con la pérdida de una molécula de agua.

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En las cadenas de nucleótidos, éstos se encuentran unidos por un enlace fosfodiéster
entre un grupo hidroxilo (-OH) del C3 d
́ e un nucleótido, y un grupo fosfato del C5 d
́ el
siguiente.

Todos los nucleótidos de una cadena tienen la misma orientación relativa. La cadena
polinucleotídica es unidireccional 5 ́ 3 .́ Esta orientación se refiere a los extremos de
la cadena, no a la orientación de los enlaces fosfodiéster individuales que unen los
nucleótidos que la forman.

Cada cadena de nucleótidos tiene una polaridad específica y extremos libres en 5 ý 3 .́

El extremo 5 ć arece de nucleótido en su posición, así como el extremo 3 q
́ ue también
carece de nucleótido en su posición; de ahí que se denominen extremos libres.

RESUMEN
Los nucleótidos son ésteres fosfóricos de los nucleósidos. Se forman por unión de un nucleósido con una
molécula de ácido fosfórico, que le confiere un carácter fuertemente ácido al compuesto.

Pentosa + base = enlace N-Glucosídico → Nucleósido

Nucleósido + ac.fosfórico = enlace ester → Nucleótido
Nucleótido + nucleótido= enlace fosfodiéster → Cadena A.N

NOMENCLATURA

Los nucleósidos se nombran añadiendo al

nombre de la base nitrogenada la
terminación:
• - OSINA si es púrica. Adenosina y
Guanosina.
• - IDINA si en pirimidínica. Citidina,
Uridina y Timidina.
Si la pentosa es la desoxirribosa se le añade el
prefijo DESOXI-.

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ADN

BASES MOLECULARES DE CHARGAFF, WATSON Y CRICK

- Rigidez del enlace fosfodiéster (covalente): restricción de rotación en esa parte de la molécula.
- Favorecimiento de la conformación anti del enlace glicosídico (entre azúcar y base nitrogenada)
(la parte voluminosa de la base queda en posición opuesta a la ribosa). Lo contrario sería la
posición sin en la que la parte voluminosa queda en la misma dirección que la ribosa. La posición
‘sin’ implica DNA levógiro y la anti dextrógiro. En el caso de las bases pirimidínicas que no tienen
parte voluminosa, se utiliza la posición del oxigeno para determinar qué tautómero es. Si el
oxigeno está en la misma posición que la ribosa hablamos de posición sin, y por el contrario
hablaremos de posición anti cuando el oxígeno quede orientado hacia la parte contraria.
- Predominio de los tautómeros oxo y amino de las bases: un tautómero es la conformación de
la molécula que posee electrones en movimiento. Los dobles enlaces pueden estar de formas
distintas dando lugar a las dos conformaciones tautoméricas. Las fórmulas de los tautómeros son
las mismas pero lo que cambian son los grupos funcionales.

MODELO DE LA DOBLE HÉLICE DE ADN DE WATSON Y CRICK (1953)

Fue establecido por Watson y Crick en 1953, aprovechando los trabajos previos de Chargaff, Wilkins y
Franklin. Puede resumirse en los siguientes puntos:
• Desde el ADN se transmite la información genética.
• ADN está formado por dos cadenas de polinucleótidos, enrolladas alrededor de un eje
imaginario, formando una Doble hélice. El enlace fosfodiester de 5’-fosfato a 3’OH confieren
polaridad 5’ → 3’.
• El enrollamiento es Dextrógiro (dcha) alrededor de un eje central, lo que va a permitir que se
produzca una vuelta completa de 34 A y de 10 pares de base formando un surco mayor y otro
surco menor. Además, el enrollamiento es Plectonémico (dos cadenas no pueden separarse sin
desenrollarse).
• Los planos de sus anillos son paralelos entre sí y perpendiculares al eje imaginario de la doble
hélice.
• Doble hélice de ADN, donde el esqueleto (azúcar y fosfato) se encuentra hacia el exterior y en el
interior quedan las bases nitrogenadas enfrentadas entre sí.
• Las cadenas se encuentran en direcciones opuestas y por tanto son antiparalelas.
• Las bases nitrogenadas se encuentran enfrentadas en el interior (zona hidrófoba)
interaccionando mediante puentes de hidrógeno y el grupo fosfato y pentosa quedan hacia el
exterior (zona hidrofílica).

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 • Las bases que han quedado hacia dentro se van a
unir A-T (mediante dos enlaces de hidrógeno) G-C
(mediante tres enlaces de hidrógeno) que son
enlaces débiles y no vamos necesitar tanta fuerza
para romperlos (es lo primero que se va a
romper). La concentración de A es igual a la C de T
y la concentración de G es igual a la de C.

Complementariedad entre ambas cadenas: sus bases

nitrogenadas están enfrentadas formando puentes de
hidrógeno entre ellas. A//T----------C///G (Puentes de
hidrógeno, según sus grupos polares).

Regla de chargaff: comoo consecuencia de estos emparejameintos en el DNA, siempre habrá la misma
cantidad de bases púricas y pirimidínicas. Más concretamente, habrá la misma cantidad de T y A, y de C y
G.

VARIACIONES AL MODELO DE WATSON Y CRICK: ESTRUCTURAS DEL ADN (A, B Y Z)

Forma B: es la estructura de DNA descrita por Watson y Crick. Es la estructura más estable que puede
adoptar el ADN y es el punto de referencia estándar para los estudios de las propiedades del ADN.

Forma A: predomina en disoluciones relativamente pobres en agua y solo se ha detectado en dos

contextos biológicos: un segmento muy corto en el sitio activo de la ADN polimerasa y en esporas de
algunas baterías Gram +. Sus características son las siguientes:
• Doble hélice dextrógira pero sus bases nitrogenadas no forman un plano perpendicular al eje,
sino que está inclinado.
• Hélice es más gruesa, estrecha y compacta
• El número de pares de bases por vuelta es 11, en lugar de los 10,5 del ADN-B.
• Se forma por deshidratación de la forma B. Predomina en disoluciones relativamente pobres en
agua.
• El plano de los pares de bases de la forma A tiene una inclinación de unos 20º con respecto al eje
de la doble hélice. Estos cambios estructurales hacen que el surco ancho sea más profundo y el
surco estrecho sea más superficial.
• La conformación del azúcar es C-3’ endo (en la forma B es C-2’ endo).

Forma Z: supone una desviación más radical con respecto a la B. Sus características son:
• Hay una clara rotación hacia la izquierda de la hélice
(doble hélice levógira)- lo que lo diferencia de las otras.
• Contiene 12 pares de bases por vuelta.
• Estructura es más delgada y alargada.
• Las purinas adoptan una forma sin, y las pirimidinas
adoptan la conformación anti.
El surco mayor no es casi perceptible, y el surco menor
es estrecho y profundo.
Predominan los enlaces entre Citosina y guanina
alternados.

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Otras estructuras secundarias son:
• Virus: cadenas de ADN sencillas, circulares o lineales.
• Bacterias: ADN bicaternario circular

DESNATURALIZACIÓN Y RENATURALIZACIÓN

Los valores extremos de pH y temperatura provocan la desnaturalización del DNA de doble hélice. Se
produce la rotura de los puentes de hidrógeno que mantenían las bases unidas, y se desenrolla la doble
hélice, dando lugar a dos hebras sencillas separadas. La desnaturalización No rompe ningún enlace
covalente del DNA, únicamente los puentes de hidrógeno.

La renaturalización del DNA puede ser un proceso rápido de un solo paso, cuando existe un segmento del
DNA que se mantiene unido. Sin embargo, cuando las dos hebras están totalmente separadas, el proceso
se divide en dos: un primer paso muy lento, en el que las dos hebras se reconocen al azar para formar un
fragmento corto de doble hélice complementaria, y un segundo paso más rápido en el que las bases no
apareadas restantes se van apareando sucesivamente como en una cremallera para formar la doble
hélice.

Los nucleótidos libres en disolución tienen una gran absorción de la luz UV, pero cuando las bases se
apilan, la absorción disminuye, y aún disminuye más cuando se forma la doble cadena. Esto se conoce
como efecto hipocrómico y se relaciona con la renaturalización.

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La desnaturalización, sin embargo produce el efecto contrario, es decir, un aumento de la absorción de
luz UV, denominado efecto hipercrómico. Las cadenas de adn no absorben lo mismo si se encuentran en
forma de doble hélice o desnaturalizada. el efecto de hipercromicidad dice que cuando se encuentra como
banda simple, tiene una mayor absorbancia. (absorbe mayor cantidad de luz)
La transición de un ADN de doble cadena, a un ADN dividido en sus dos cadenas sencillas puede seguirse,
midiendo la absorción de la luz UV de 260 nm.

La cadena a medida que aumenta la temperatura va absorbiendo mayor cantidad hasta que llega un
momento que a más temperatura es incapaz de absorber más.
Temperatura intermedia = mitad de la absorbancia relativa que puede emitir la cadena de DNA
(temperatura de fusión). El DNA se encuentra semidesnaturalizado (la mitad de la molécula está
desnaturalizada).
Podemos modificar la temperatura de fusión en base a las fuerzas iónicas que se encuentran dentro, es
decir, cambiando las sustancias del medio en el que se encuentra. Al añadir NaCl podemos aumentar la
temperatura de fusión. a mayor fuerza iónica (mayor número de iones en el medio), mayor temperatura.

La temperatura de fusión (Tm – melting temperature) es la

temperatura a la cual la mitad de la molécula de doble hélice de DNA
está desnaturalizada (separada). A mayor fuerza iónica mayor es la Tm.
Esto se consigue con tampones iónicos del tipo NaCl o citrato sódico.
De forma contraria, añadiendo fosfato haríamos que la temperatura de
fusión disminuya.
Es característica y diferente para cada cadena de DNA. Cuanto mayor
es el contenido de G y C, mayor es el punto de fusión. En una doble
hélice de DNA en la que abundan G y C será necesaria más temperatura
para desnaturalizar la hebra, ya que estas dos bases están unidas por 3
puentes de hidrógeno.

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GRADOS DE LIBERTAD DE GIRO

1. Debido al enlace N-beta-glucosídico sin (izquierda) o anti (derecha).

2. Debido a las uniones entre el grupo fosfato y el azúcar (ribosa o desoxirribosa dependiendo de
la molécula) permite cierto grado de libertad de giro (6 grados de libertad).

3. Debido a la rotación de la ribosa. Depende del azúcar, según el plano en el que se encuentre. Si
tenemos una hoja de papel y la apoyamos en nuestra mano podemos coger una esquina y
levantarla o bajarla por lo que deja de estar en el mismo plano que el original. Esto nos lo permite
el C en posición 2´ y 3´.
En posición endo = 2´y 3´endo si se encuentran hacia
arriba o si se encuentran hacia abajo hablamos de
moléculas en posición 2´y 3´exo.

4. Pirimidinas : sin-anti y purinas: sin-anti.

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ORGANIZACIÓN DEL ADN EN LOS ORGANISMOS

SUPERENRROLLAMIENTO DEL DSDNA CIRCULAR

- DsDNA: Double strand DNA. Es el DNA de doble cadena o bicatenario.

- SsDNA: Single strand DNA. Es el DNA de cadena sencilla o monocatenario.

El DNA se encuentra unido a histonas - lo que va a permitir una compactación del DNA que se produce
porque este es capaz de superenrollarse.

Existen diferentes grados de superenrollamiento. Un círculo relajado puede estar aplastado sobre una
superficie plana, mientras que una molécula superenrollada no puede estarlo ya que además de la torsión
de las cadenas de DNA (una alrededor de la otra) una molécula superenrollada, comporta un plegamiento
de orden superior, que se denomina estructura terciaria de un polímero.
Denominamos superenrollamiento positivo al que va a derechas y negativo al que va a izquierdas.

Los DNAs circulares no tienen extremos 5´ y 3´ libres. Los círculos que forman pueden ser pequeños o
inmensos, formados por una sola cadena o por dos cadenas entrelazadas en una doble hélice en su forma
B. Sin embargo, no todas las moléculas de DNA son circulares, hay algunas lineales (como la del
bacteriófago T2 o el DNA humano lineal que es gigante).

Las girasas y las topoisomerasas cambian la topología del DNA, y permiten que cambie su estructura para
superenrollarse:
• Topoisomerasas: enzimas que cortan y empalman. Relajan o generan superenrollamiento.
• Girasas: enzimas que inducen superenrollamiento negativo, con gasto de ATP. (Son un tipo de
topoisomerasas, tipo 2)
Inhibidores de topoisomerasas y girasas se utilizan como antibióticos: novobiocina, ciprofloxacina.

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ORGANIZACIÓN ESTRUCTURAL DEL GENOMA VIRAL

Virus bacteriófagos, animales y vegetales pueden presentar DNA (en cápsides o cabezas)
O RNA como material genético, denominándose DNAvirus o RNAvirus. Pueden estar
formados por una cadena doble (dos hebras) o sencilla (una hebra), y puede ser una
molécula lineal o circular.

Los bacteriófagos presentan una cápsula en la que se encuentra el DNA, que no se asocia
a proteínas. Los retrovirus presentan una enzima, la retrotranscriptasa inversa que
permite la conversión de RNA en DNA para poder integrar así su material genético en la
célula que quieren infectar.

En las bacterias, las moléculas de DNA son plásmidos que contiene unos 1000 pares de
bases.

CROMOSOMAS Y CROMATINA

Los nucleosomas se van a condensar en forma de fibras y van a formar parte de la cromatina.
Un nucleosoma es una cadena de ADN que va a rodear a las histonas (4 histonas) La histona H1 sella los
nucleosomas. El ADN de unión se encuentra entre los nucleosomas permitiendo su unión.

CROMATINA

“Sustancia coloreada”. Es DNA sin condensar (no está compactado) se encuentra en la interfase, unido a
proteínas histonas y no histonas. “Sustancia coloreada”. Su unidad fundamental son los nucleosomas.

Corpúsculo de Barr: en el núcleo femenino de las células femeninas, formado por heterocromatina
facultativa. Adherido a la membrana nuclear. Es una dismorfia que se presenta en el núcleo y se observa
como una mancha. Es un tipo de heterocromatina porque se inactiva.

Tipos de cromatina:
• Heterocromatina: ADN transcripcionalmente inactivo. Representa el 90%. Puede presentarse en
dos formas diferentes:

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 o Constitutiva: siempre condensada, nunca se activa. Está situada en centrómeros y
telómeros o en inactivación cromosómica del X humano salvo en embriogénesis y
habitualmente se encuentra con ADN satélite (secuencias repetitivas).
o Facultativa (es necesaria para poder expresar información): no siempre está
condensada. Está formada por genes inactivos que pueden dejar de estarlo (solo va a
ser activa en un momento dado) y tiene actividad transcripcional en el cromosoma X en
embriogénesis. Esto es lo que pasa en el corpúsculo de Barr (se encuentra en el núcleo
de las células femeninas), que está endosado a la membrana nuclear. Para saber el
número de Barr, se resta 1 al nº total de cromosomas X.
• Eucromatina: es transcripcionalmente activa y representa el 10%. Replicación más temprana que
la heterocromatina y se encuentra en interfase como inactiva.

CROMOSOMAS

“Cuerpo coloreado”. Es ADN condensado en mitosis, unido a proteínas histonas y no histonas. El

cromosoma mitótico tiene 2 cromátidas, y centrómero y telómero definidos.

Niveles de organización en el cromosoma eucariótico: los cromosomas son el grado de

superespiralización que se da únicamente durante la división celular.
Las rosetas son conformaciones que comprenden 6 loops o giros y cada una de ellas se une en lo que es
una cadena de 30 rosetas (un coil) que se van compactando hasta dar lugar a las cromátidas y
posteriormente a los cromosomas metafásicos.

ORGANIZACIÓN ESTRUCTURAL DEL GENOMA EN EUCARIOTAS

En la cromatina, las proteínas de unión al DNA son de dos clases:

• Histonas: son 5 tipos de proteínas, presentes en cantidades equimolares (H2A, H2B, H3, H4 Y
H1). Todas las histonas son proteínas pequeñas, muy básicas, con gran cantidad de lisina y
arginina. Las proteínas histonas se combinan de una forma específica para formar un elemento
de repetición de la estructura de la cromatina, el nucleosoma.
• No histónicas: los nucleoides de las células procariotas contienen también proteínas asociadas
al DNA, pero estas proteínas son muy diferentes.

Los nucleosomas contienen 146 pares de bases de DNA, que envuelven (1,75 vueltas) a un octámero de
histonas, dos de cada tipo (H2A, H2B, H3, H4). Esta composición explica las cantidades equivalentes de
histonas que hay en la cromatina. Los nucleosomas se unen entre sí gracias al ADN linker y la H1 une los
componentes que forman los nucleosomas, se denomina la histona ensambladora. La unión de
nucleosomas forma fibras que son las que componen la cromatina. Cada vuelta de hélice contiene
aproximadamente 6 nucleosomas.

Aunque el nucleosoma es una estructura casi invariable en los eucariotas, la forma en que se espacian los
nucleosomas a lo largo del DNA varía considerablemente entre los organismos y tejidos. La longitud del
DNA entre nucleosomas puede variar. El DNA internucleosómico o ligador, está ocupado por las histonas
de tipo H1 (con abundancia de lisina) y por proteínas no histónicas.

Nucleosoma = octámero de histonas (H2,A, H2B, H3 y H4) + filamentos de ADN,

Cromatosoma = octámero de histonas (H2,A, H2B, H3 y H4) + filamentos de ADN + H1.

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CROMOSOMAS METAFÁSICOS Y CARIOTIPO

El cromosoma metafásico ya es el ADN condensado, está formado por 2 cromátidas (1 molécula de ADN
de doble hebra cada una). El cinetocoro (centrómero + huso acromático) se encuentra en el centrómero,
y de él salen proteínas del huso mitótico. La telomerasa sintetiza y repara telómeros en las zonas finales
(extremas) de los brazos de los cromosomas, en ambos brazos.
Como su propio nombre indica, únicamente es visible en metafase, ya que en la interfase, la cromatina
está difusa y no puede verse consolidada.

En un genoma diploide (célula somática) hay 2 juegos de cromosomas, mientras que en un genoma
haploide (célula germinal) hay 1 juego de cromosomas.

Las bandas determinan las características específicas de cada cromosoma. Los brazos de los cromosomas
pueden tener distinto tamaño e incluso algunos cromosomas no tienen el brazo p (acrocéntricos). Los dos
brazos son:
• Brazo P: largo
• Brazo Q: corto

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CARIOTIPO
Se ven los cromosomas en metafase. 2n=46 (22 autosómicos y 1 par sex)

El centrómero y las bandas en cada brazo son específicos de cada cromosoma. Particularidades de cada
cromosoma:
• Cromosoma 3: es fácil de identificar porque parece que tiene una boina, es decir una banda
teñida en el telómero del brazo p.
• Cromosoma 6: tiene una doble banda negra.
• Cromosoma 11: tiene una banda blanca ancha arriba.

Bandeo cromosómico: tinción con

quinacrina o giemsa típica e identificativa
de cada especie y produce las bandas en
las cromátidas de los cromosomas.
Altamente reproducible es decir, todos los
cariotipos humanos van a presentar este
tipo de bandeo (estudios evolutivos).

ARN

Estructura similar al ADN: una cadena de nucleótidos unidos por enlaces fosfodiéster
• El grupo azúcar en cada molécula de RNA es la ribosa porque presenta un grupo hidroxilo. (DNA-
desoxirribosa)
• La timina (T) se sustituye por uracilo (U).
• Las moléculas de ARN son generalmente monocatenarias. (a veces aparecen como una doble
cadena)
• Crece en dirección 5´→ 3´
• El grupo –OH de la ribosa, confiere dos propiedades fundamentales a la molécula:
o Impide la conformación B
o Promueve la reactividad química (debido a su grupo hidroxilo). Esto le hace ser muy
inestable y por tanto se degrada fácilmente y tiene que mantenerse a muy bajas
temperaturas.

TIPOS DE ARN

- ARN mensajero (mARN): transporta la información genética del DNA a los ribosomas, que se
encargan de la síntesis de proteínas.
- ARN ribosómico (rARN): constituye los ribosomas y representa un 75% del RNA celular total.
o Estructura del ARN ribosomal: tamaño de 16S, ARN ribosomal con zonas de doble
cadena presenta dominios con zonas en las cuales se aparean las 2 cadenas.

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 - ARN de transferencia (tARN): transporta los aminoácidos
activos al ribosomas, que se van adicionando a las cadenas
polipeptídicas durante la síntesis de proteínas
(traducción). Por una parte se une al codón y por la otra al
aminoácido.
o Estructura del tARN: tiene una forma de trébol.
Cuando nos encontramos este ARN tiene una
forma de L en su forma tridimensional. Tiene el
brazo del anticodón, el brazo aceptor (se une a la
zona del aminoácido por el extremo 3’), brazo T y
brazo D. En los brazos, el ARN aparece como una
estructura de doble cadena, particular del ARN
que es característicamente monocatenario.

Estos 3 son los más frecuentes pero también existen otros:

- ARN nuclear pequeño (snARN): son pequeñas moléculas de ARN de localización nuclear que
participan principalmente en la maduración del mARN. Están en los espliceosomas, eliminan
intrones.
- ARN viral: forma parte del genoma del virus (ej: SARS2 → SARS-covid19)
- Micro ARN: son muy pequeños, alrededor de 19-22 nucleótidos. Participan en la regulación de
la expresión
- siARN: interferencia del RNA. Son parecidos a los microARN que van a regular igualmente la
expresión génica pero mediante otros mecanismos.
Estos dos últimos se conocen como ARN basura. Aunque posteriormente se ha dado a conocer
que tienen funciones reguladoras muy importantes. Volveremos con estos ARN pequeños en
maduración.

FLUJO DE LA INFORMACIÓN GENÉTICA

- En la replicación, se duplica la información genética.

- En la transcripción, se pasa la información de ADN a ARN, utilizando la
hebra de ADN como molde.
- En la traducción se utiliza el RNA para sintetizar proteínas.

Todos estos procesos están muy regulados.

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DIFERENCIAS ENTRE EUCARIOTAS Y PROCARIOTAS

En procariotas, los procesos de transcripción y traducción ocurren en el mismo lugar en el citoplasma y

de manera continua (sin parones), mientras que en eucariotas, la replicación y la transcripción ocurre el
interior del núcleo, luego el RNA se modifica para poder salir y a finalmente se traduce a proteínas en el
citoplasma, por lo que además es un proceso discontinuo.

El DNA de eucariotas es monocistrónico, es decir, solo da lugar a un tipo de proteína. Además presenta
fragmentos que no codifican nada (intrones), que se deben eliminar en un proceso de maduración. El DNA
procariota en cambio es policistrónico puesto que codifica para varias proteínas.

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TEMA 1.2: ÁCIDOS NUCLEICOS COMO SOPORTE DEL MENSAJE GENÉTICO

DESCUBRIMIENTO DEL PRINCIPIO TRANSFORMANTE

EXPERIMENTO DE GRIFFIN (1928)

Experimento de Griffith (1928): experimentos realizados para estudiar la neumonía en humanos a partir
del Streptococcus (neumococos), las bacterias causantes de dicha patología.
Cogió una cepa (S), que tenía una envuelta de proteínas , lo que hacía era que lo inyectaba a un ratón.
• La cepa S (smooth) células virulentas, vivas encapsuladas de polisacáridos. → El ratón muere
• La cepa R (rough) células no virulentas, vivas pero no encapsuladas → El ratón vive.

Al someter la cepa R a calor, las células virulentas morían por

calor, y al inyectarlas, los ratones no mueren. Al introducir
ambas cepas a la vez (R vivas y S muertas), el ratón muere.

Lo que pensó es que algo tenía que pasar desde las células
muertas a las celulas vivas para que las células vivas no
virulentas causasen la muerte del ratón. Finalmente se
descubrió que era el ADN aunque él en un principio lo denominó
principio transformante. A partir de esas células no virulentas
vivas, él dedujo que había un principio transformante (pero no
sabía qué era concretamente) que transformaba las no
virulentas en virulentas (y se producía la muerte del ratón).
Extrajo una serie de componentes de las células virulentas
muertas que añadió a las células vivas no virulentas. Griffith no
sabía qué había extraído pero en realidad era ADN.

Este experimento fue mejorado por Avery, McLeod y

McCarthy en 1944 y propusieron cuál era la naturaleza de esa
sustancia transformante.

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ADN COMO PORTADOR DE LA INFORMACIÓN GENÉTICA

EXPERIMENTO DE AVERY, MCLEOD Y MCCARTHY (1944)

El médico microbiólogo Oswald Avery quedó sorprendido por los resultados publicados por Griffith y
aunque al principio no creía mucho en ellos, se propuso descubrir la sustancia responsable del fenómeno
de transformación. Así fue como Avery, junto a MacLeod y McCarty comenzaron a fraccionar el extracto
de bacterias S libre de células donde, según Griffith, estaba el principio transformante.

Encontraron que podían eliminar las proteínas, los lípidos, los polisacáridos y el ARN del extracto sin
disminuir la propiedad del extracto de transformar a los neumococos R en S. Sin embargo, si purificaban
el ADN presente en el extracto y lo incubaban con las bacterias R, éstas se transformaban en S. Era el ADN
el principio transformante que hacía que los neumococos R se transformaran en S, es decir, era el ADN el
que llevaba la información necesaria para que la cepa R fuera capaz de sintetizar una cápsula de
polisacáridos idéntica a la que poseían las bacterias S.

Cuando Avery, MacLeod y McCarty publicaron sus resultados en 1944, fueron muy pocos los que
concluyeron que los genes estaban compuestos de ADN. En esa época era realmente difícil de imaginar
que una molécula “monótona” compuesta sólo de cuatro bases nitrogenadas diferentes pudiera tener la
suficiente variabilidad como para llevar toda la información genética que precisaban los seres vivos. Sin
duda, eran las proteínas las candidatas para tal función, debido a su gran complejidad y múltiples formas.
En este contexto, Avery, MacLeod y McCarty concluyeron, tímidamente, en su artículo:
“Si los resultados del presente estudio se confirman, entonces el ADN debe ser considerado como una
molécula que posee especificidad biológica cuya base química aún no ha sido determinada”.

EXPERIMENTO DE HERSHEY Y CHASE REALIZADO CON EL FAGO T2 (1952)

Aportaron mucha más infromación.

En 1952 Hershey y Chase estudiaron la infección de la bacteria E.Coli por un virus bacteriano, el fago T2.
Aprovechando el hecho de que las proteínas del bacteriófago contienen azufre y poco fósforo y que el
DNA bacteriano contiene poco fósforo pero no azufre, marcaron al bacteriófago T2 (tienen una cubierta
de proteínas en el interior DNA) con los isótopos radiactivos 35 S y 32 p (fósforo) → marcaron el DNA.
Comprobaron que cuando el bacteriófago se unía a E.Coli, era principalmente el 32 p lo que se observaba
y por tanto, el DNA bacteriófago era el que se transfería a la bacteria. El DNA insertado era suficiente para
dirigir la formación de nuevos bacteriófagos.

19
Es decir, p32 marca el DNA, puesto que tiene P, y S35 marca cápside, ya que tiene polisacáridos y
proteínas, estas últimas con aa con grupos fosfato con la cisteína o metionina.
Las proteínas de la cápside son ricas en cisteína y metionina, que son aminoácidos ricos en azufre.

En la primera tanda de experimentos marcaron el DNA con fósforo 32 radiactivo, en el segundo, marcaron
la cubierta. Lo analizaron por libre y se estudiaba como el DNA se introducía en el interior de la bacteria
mientras la cubierta no. Realizaron una centrifugación y observaron como por un lado tenían las bacterias
en la cual una de ellas se encuentra el DNA radiactivo mientras que en el otro cosa, observaron como la
cápsida de los virus se liberaba por otro lado diferente a la bacteria.

CONCLUSIÓN: el material interior de la cápsida del bacteriófago (DNA) sí pasa al interior de la bacteria
pero la cápsida como tal no. Con ello pudieron definir cómo los virus inyectan su ADN a las bacterias que
infectan y la cápside no tienen nada que ver. El DNA es la parte del fago que pasa a la bacteria.

20
TEMA 2: REPLICACIÓN DEL ADN

MODELOS DE REPLICACIÓN. EXPERIMENTO DE MESELSON Y STAH

Anteriormente existían varios modelos de replicación: el conservativo, el semiconservativo y el

dispersivo:
• Modelo conservativo: consiste en que una de las moléculas de ADN hijas estaría formada por
dos cadenas de ADN recién sintetizadas, y la otra por las dos cadenas parentales.
• Modelo semiconservativo: consiste en que cada una de las moléculas de ADN hijas tendría una
hebra antigua y una sintetizada de novo.
• Modelo dispersivo: consiste en que las dos moléculas de ADN hijas están formada por trozos de
las parentales, y trozos sintetizados de nuevo aleatoriamente.

Para saber qué tipo de replicación era la correcta, Meselson y Stah realizaron un experimento en 1958 en
el que descubrieron que la replicación es semiconservativa.

EXPERIMENTO DE MESELSON Y STAH (1958)

Siempre vamos a tener una cadena parental. Extrajeron DNA, lo centrifugaron

y previamente marcando el DNA con nitrógeno 15 que va a hacer que el DNA
sea un DNA pesado (queda abajo en el tubo). Era un DNA extraído directo. del
núcleo. Una vez se dividió el ADN se introdujo N14 (más ligero que el 15) y 15.
El DNA recién extraído quedaba marcado con nitrógeno 14.

En una primera generación se encontraba un híbrido entre 15N/14N y en la

segunda generación se encuentra una parte del Híbrido de 14N/15N y una
parte de 14N puro .Tras las distintas divisiones una de las cadenas parentales
iba a aparecer en la generación, aparece el DNA unido a otra cadena recién
sintetizada. La banda que permanece en el medio está formada por una hebra
de N14 y otra de N15. Al centrifugarla se sitúa en valores intermedios.

CONCLUSIÓN
Siempre va a haber dos hebras parentales y el resto de nueva síntesis, y en el experimento final la banda
de sólo N14 representa aquellas dobles hélices con dos hebras de nueva síntesis, sin ninguna hebra
parental, las dos en el medio en el dibujo c). Se averiguó que nunca íbamos a tener una hebra
completamente azul puesto que siempre se necesitan de la hebra roja (14N), es decir las parentales no se
sintetizan.

PROPIEDADES DE LA REPLICACIÓN

- Semiconservativa. Produce dos moléculas de DNA bicatenario “hijas”

formadas por una cadena parental y una cadena de nueva síntesis.
- Bidireccional: la replicación del cromosoma bacteriano empieza en un único
sitio (siempre el mismo) y continúa su replicación bidireccionalmente hasta
que el cromosoma entero es copiado. Hay dos horquillas de replicación (zona
de intersección de las regiones no replicadas y recién replicadas) que se
mueven en direcciones opuestas.

21
 - Semidiscontinua: la cadena conductora es sintetizada de manera continua en el sentido 5’ à 3’,
sin parones (se utiliza como molde la cadena 3’ → 5’ que es la complementaria), mientras que la
cadena retardada lo hace en segmentos (fragmentos de Okazaki), que también se sintetizan en
dirección 5’ → 3’ (utilizando como molde la cadena 5’ à 3’) aunque luego se tienen que unir
para poder formar una cadena continua.

SÍNTESIS DE ADN

La síntesis de DNA progresa en dirección 5’ → 3’, siendo el 3’ OH libre el punto de elongación del DNA, y
es semidiscontinua. Debido a que las 2 cadenas de DNA son antiparalelas, la cadena que actúa de molde
se lee del extremo 3’ al 5’. Es decir, la lectura se hace en sentido 3’ à 5’, pero la síntesis es siempre 5’ →
3’ (ya que la DNA polimerasa I sólo sintetiza en esa dirección).
Si la síntesis transcurre siempre en dirección 5’ à 3’ porque la DNA polimerasa I no puede sintetizar en
otra dirección que no sea esa.

¿Cómo pueden sintetizarse las 2 cadenas simultáneamente? Si las dos fuesen sintetizadas continuamente
a medida que se desplaza la horquilla de replicación, una tendría que ser sintetizada en dirección 3 → 5’
y eso no es posible.
Ese problema fue resuelto por Okazaki, que descubrió que una de las cadenas nuevas de DNA se
sintetizaba en forma de trozos cortos (pocos centenares o miles de nucleótidos) a los cuales denominó
fragmentos de Okazaki (que luego se unen). Esto condujo a pensar que había una hebra conductora cuya
síntesis era en dirección 5’ → 3’ y una hebra retardada cuya síntesis era también en dirección 5’ → 3’, la
cual es opuesta a la dirección del movimiento de la horquilla.
Las ADN polimerasas requieren de la presencia de un primer o ARN cebador que es una pequeña molécula
de ARN que ayuda a la ADN polimerasa a comenzar la síntesis. En la polimerización de la hebra retardada
se requiere un primer por cada fragmento de Okazaki.

ENZIMAS IMPLICADAS EN LA REPLICACIÓN

ADN POLIMERASAS

ADN polimerasas: van sintetizando el ADN mediante la adición de al extremo 3’ terminal de la cadena
creciente (5’ en la nueva cadena complementaria).
*La ADN polimerasa III es la encargada de la elongación (síntesis) y la ADN polimerasa I es la encargada
de eliminar y reemplazar los cebadores.

La DNA polimerasa III sintetiza DNA mediante la adición de nucleótidos al extremo 3’ - terminal de la
cadena creciente. El sustrato que entra es un desoxinucleósido 5’- triofosfato (dNTP), cuya identidad está

22
determinada por el apareamiento de bases (lo añade en un -OH en posición 3’). La DNA polimerasa
cataliza la formación de un enlace fosfodiéster 5’-3’ entre el dNTP entrante y la cadena creciente.

Las enzimas que realizan la síntesis de DNA son las polimerasas. La polimerasa I es la que inicia la síntesis
de DNA, (está formada por 2 subunidades, la grande es la catalítica; por en medio de ambas subunidades
pasa el DNA a replicar), para ello necesita de un molde, es decir, una secuencia de nucleótidos específica
con un 3’ OH libre y un cebador (que será el principio de la nueva hebra de DNA).

Después de añadir un nucleótido a la cadena de DNA (primer), la DNA polimerasa I se disocia. La

procesividad es el número de nucleótidos que añade una polimerasa antes de disociarse, cuantos más
nucleótidos añada sin disociarse, más rápida será la replicación. La DNA polimerasa I tiene un índice de
procesividad bajo, por lo que se llegó a la conclusión de que debía de haber más polimerasas implicadas
en el proceso.

TIPOS DE ADN POLIMERASAS Y SU FUNCIÓN

23
ACTIVIDAD 3’-5’ EXONUCLEASA

Esta actividad de la ADN polimerasa I permite a la enzima corregir el ADN recién sintetizado,
reconociendo la distorsión producida por un apareamiento de bases incorrecto, y retirando el nucleótido
incorporado erróneamente antes de que la cadena se extienda (corrige el error, proofreading con su
actividad 3´→ 5´). Va justo en dirección contraria porque vuelve a corregir el error creado.

Dado que la DNA polimerasa requiere un grupo 3’ -OH libre para extender una cadena de ADN, se necesita
un cebador (primer), que es un fragmento corto de ARN que actúa como cebador para la síntesis de ADN
(le proporciona el grupo OH ya que no podría sintetizar la cadena de nuevo).

En E. Coli, este ARN cebador es sintetizado, tanto en la cadena libre

como en la retardada, por la enzima primasa (una ARN polimerasa).
Posteriormente el ARN es eliminado y reemplazado por ADN.
En la cadena retardada se van a necesitar más cebadores que en la
hebra líder (solo 1), porque por cada fragmento de Okazaki se va a
requerir un primer.

La función principal de la ADN polimerasa I (con su actividad 5´→ 3´) es

eliminar el ARN cebador y reemplazarlo con ADN. En este proceso
actúan de forma concertada las actividades 5’ - 3’ exonucleasa y
polimerasa de la DNA Pol I. Recibe el nombre de ‘desplazamiento de
mella (nick-translation)’ porqué la mella (nick) se desplaza hacia el
extremo 3’. La mella se sella por acción de la DNA ligasa, uniéndose así
los fragmentos de Okazaki para que pueda ser una cadena continua.

La ADN polimerasa I también funciona en la reparación del DNA

dañado. Por tanto, la polimerasa I tiene funciones indispensables en la
replicación y la reparación del DNA de E. Coli, aunque no es responsable
de la mayoría de la síntesis de DNA.

24
TRASLADO DE UNA MELLA EN EL ADN POR LA ADN POLIMERASA

Cuando en 1969 Cairns y DeLucia descubrieron que una cepa mutante de E.

Coli con menos del 1% de actividad Polimerasa I replicaba normalmente su
ADN, surgió la idea de que quizás la ADN polimerasa I no fuera la
responsable de la replicación. Descubrieron la ADN polimerasas II y III.
• La ADN Pol I: funciona para escindir los fragmentos de
RNA. Elimina y reemplaza a los cebadores.

Así, se buscan y se descubren otras DNA polimerasas:

• ADN Pol II: implicada en la reparación del DNA. Reinicia la
replicación después de que el ADN dañado detiene la síntesis.
• ADN Pol III: relacionada con la replicación (replicasa). Implicada
especialmente en la síntesis de ADN. Responsable de la
elongación (verdadera síntesis) del ADN.
• ADN Pol IV y V: (descubiertas más tarde) implicadas en la
reparación. La V realiza la síntesis translesional de DNA.

ADN POLIMERASA III

La ADN polimerasa III es la verdadera responsable de la elongación de la cadena durante la replicación en

E. Coli. Es la más compleja. Su centro catalítico está formado por 3 subunidades DHyT pero al menos otras
7 subunidades se combinan con ella para formar la holoenzima polimerasa III y así aumentar la velocidad
de reacción y la procesividad.

Procesividad: nº de nucleótidos incorporados antes de separarse del molde.

Elongación: nº de nucleótidos sintetizados por segundo
Proofreading: eliminación de los errores de copia

ESTRUCTURA DE LA ADN POLIMERASA III

Procariotas: formada por dos subunidades, forman una abrazadera. También tienen un “Core” o cuerpo
de la DNA polimerasa y quedan unido por la abrazadera y el Clamp loader (“cargador” o “ensamblador”).

Eucariotas: el ensamblador es el factor de procesividad (RFC), la abrazadera se le denomina antígeno

nuclear de proliferación nuclear (PCNA).
El Clamp (las subunidades alfa y gamma, delta) permiten que las subunidades beta se unan al complejo.
El cuerpo de la polimerasa, con actividad de polimerización y proliferación (dos subunidades alfa y épsilon:
con actividad de proliferación y proofreading).

25
Todas las subunidades
son necesarias para
que se pueda producir
la función de la
DNA polimerasa
(Síntesis de DNA).

ENZIMAS DEL REPLIOSOMA

El DNA necesita más enzimas que las polimerasas para replicarse. Al conjunto de estas proteínas se le
denomina replisoma. Estas proteínas son las siguientes:
• Proteínas accesorias de la polimerasa: potencian la procesividad de la polimerasa. La subunidad
B (abrazadera para permitir que el dna se sitúe en su interior) forma un anillo alrededor del DNA
que actúa como abrazadera deslizante.
• Helicasas: abren (desenrrollan) la doble hélice y son las responsables del desarrollo progresivo
del dsADN (de la doble cadena superenrrollada del ADN), es decir desenrollan el dsADN
rompiendo los puentes de hidrógeno que mantienen unidas las bases nitrogenadas de ambas
cadenas de ADN. Requiere gasto de ATP, utilizan la energía desprendida de la hidrólisis de ATP.
Para que puedan entrar es necesario que se produzca la apertura en el Ori C. Avanzan por cada
horquilla de replicación (hay dos por cada burbuja de replicación, formada a partir de cada origen
de replicación), y avanzan en sentidos opuestos desnaturalizando el DNA. La DNA B + DNA C =
helicasa. La ADN C activa la B y la ADN B y C juntas es lo mismo que helicasa
• Topoisomerasas II (o ADN girasa): liberan la tensión topológica generada por el
desenrollamiento de la doble hélice de ADN, inducida por las helicasas. Inician la síntesis de
cebadores (oligos) de ARN.
• DNA primasa: inician la síntesis de cebadores de ARN (sintetiza el primer).
• Proteínas SSB: (de unión a ssDNA) una vez han entrado las helicasas entran estas. Impiden la
renaturalización prematura del ADN. Estabilizan el ADN en la conformación de una sola hebra
para que actúe como molde (etabilizan la apertura de la doble hélice) y evitan que el ADN se
vuelva a enrollar, uniéndose a ambos lafos de la cadena sencilla.
• ADN ligasa: une los huecos (mellas) en hebra sencilla entre la cadena naciente y los fragmentos
de Okazaki en la hebra retardada.

El acceso a las cadenas de DNA que tienen que actuar de molde requiere la separación de las dos cadenas
parentales. Esta tarea corre a cargo generalmente de enzimas denominadas helicasas, que se mueven a
lo largo del DNA separándolo con gasto de ATP.
La separación de las cadenas crea una tensión topológica en la estructura helicoidal del DNA, que es
relajada por las topoisomerasas.
Las cadenas separadas son estabilizadas por las proteínas de unión a DNA (proteínas SSB).
Por otro lado tenemos las primasas que sintetizan los cebadores necesarios para iniciar la síntesis de DNA.
Posteriormente estos cebadores son reemplazados por DNA gracias a la acción de la DNA polimerasa I.
Después de rellenarse el hueco, queda una mella en forma de enlace fosfodiéster roto que es reparado
por las DNA ligasas.

26
Los nucleótidos se aparean según la complementariedad de bases (A-T y G-C) y su geometría. Si no
cumplen ambas características, las bases no se aparearán, y se producirá un error que puede
desencadenar una mutación.

INHIBIDORES DE LAS ENZIMAS QUE FORMAN EL REPLIOSOMA

• Antibióticos:
o novobiocina: bloquea la unión del ATP a la girasa (ya que esta topoisomerasa libera la
tensión y requiere el ATP, este fármaco bloquea esa unión y no se puede tener la enzima
con una actividad normal).
o Ácido nalidíxico y la ciprofloxacina bloquean la ruptura y posterior unión de las cadenas
de DNA.
• Antitumorales: camptotecina: inhibe a la topoisomerasa I humana.

RESUMEN DE TODO HASTA AQUÍ

- La replicación es bidireccional.
- La doble hélice se tiene que desenrollar (por las helicasas→ rompen ptes de H para desenrollar
la doble hélice).
- El superenrollamiento tiene que ser compensado (por la DNA girasa = topoisomerasa II →
compensan el superenrollamiento).
- La replicación es semidiscontinua: la cadena conductora se sintetiza de manera continua y la
cadena retardada se sintetiza de manera discontinua (fragmentos de Okazaki).
- La DNA Pol III se encarga de la elongación y utiliza RNA como cebador ya que requiere de un
grupo OH.
- Se necesita una primasa para sintetizar el cebador (oligos de RNA)
- La DNA Pol I reemplaza/elimina el RNA cebador y lo sustituye por DNA. Actividad exonucleasa
en sentido 3’-5’
- La ADN polimerasas no puede sintetizar en sentido 3’→ 5’ porque necesita extremo 3’ con un OH
libre.
- La DNA ligasa sella las “mellas” entre los fragmentos de Okazaki y el inicio de la cadena líder.

HORQUILLA DE REPLICACIÓN

Okazaki plantea la síntesis discontinua de la hebra retardada y la necesidad de cebadores para ello. El
hecho de que cuando se sintetiza DNA in vitro en presencia de rifampicina (que inhibe la ARN polimerasa
pero no a la primasa) se inhiba la síntesis de la hebra adelantada pero no la de la retrasada, sugiere la
posibilidad de que ambas participen al menos en la síntesis. La primasa sería imprescindible para la
retrasada (para la síntesis de los cebadores) y en la adelantada participarán ambas ARN polimerasas y
primasas.
La primasa (DNAG protein) sintetiza segmentos cortos de nucleótidos de RNA y proporciona un grupo 3’-
OH al que la DNA polimerasa puede añadir nucleótidos de DNA.

27
En un modelo de replicación de DNA en E. coli, las dos unidades de DNA polimerasa III están conectadas.
El molde de la cadena retrasada forma un bucle, de manera que permite la replicación de las dos cadenas
antiparalelas de DNA. En la foto inferior, se muestran los componentes de la maquinaria de replicación
en la horquilla de replicación.

28
REPLICACIÓN DEL ADN EN PROCARIOTAS (E.COLI)

1. INICIACIÓN

En el cromosoma bacteriano la replicación comienza en un lugar

denominado “origen de replicación”, que en E. Coli se denomina OriC.
Es una región que consta de 245 pares de bases que contienen
secuencias de DNA muy conservadas entre los orígenes de replicación
bacterianos. Estas secuencias son reconocidas por las enzimas que
participan en el inicio de la replicación:
• La DNA-A: se une al OriC, iniciando la separación de hebras
(apertura), que requiere ATP para favorecer la entrada de las
siguientes proteínas.
• La DNA-B: es una helicasa que desenrolla el ADN en la zona de
3 repeticiones. Se unen a las proteínas C con gasto de ATP para
formar estos complejos y así la helicasa está activa y rompe los
puentes de hidrógenos y en ambas direcciones se puede
realizar la apertura, se une a las hebras de ADN. Ya está
formada la burbuja de replicación, con una horquilla a cada
lado. Posteriormente se libera el ATP.
• Después se une una primasa que comienza a sintetizar el RNA
cebador.

Secuencias en torno al origen de replicación del E. coli (oriC):

Zona roja: 3 repeticiones de 13 pares de bases
Zona azul 4 repeticiones de 9 pares de bases

Numerosas copias de una proteína de 52 kDa, conocida como DnaA, se unen al OriC iniciando así la
separación de hebras (lo que requiere ATP) HU = proteínas de unión al dsDNA que facilitan que se doble
(histone like protein). IHF: integration host factor. La DnaB es una helicasa que desenrolla el DNA Luego
se une la primasa que comienza a sintetizar el RNA cebador. IHF y HU son factores necesarios, que
permiten la apertura del ADN en la zona roja, si no están no se produce apertura, no se rompen puentes
de hidrógeno, y no pueden pasar helicasas y comenzar replicación.

E Coli: para que pueda comenzar la replicación, ambas cadenas deben estar metiladas
(si no está metilado, está inactivo el ADN). El ADN nuevo (secuencias de inicio) se
encuentra hemimetilado, (sólo una cadena) y está unido a la membrana de la
bacteria. Sólo tras un tiempo se desprende y entonces es accesible a las metilasas
(dam metilasas = deoxyadenosin metilasa, adicionan el grupo metilo en la cadena
recién sintetizada par que se pueda iniciar otro ciclo. ADN activo=ADN metilado.

La regulación del proceso de replicación en E. Coli se lleva a cabo por metilación. El DNA nuevo (secuencias
de inicio - OriC) se encuentra metilado. Inmediatamente después de que se haya producido la replicación,
el DNA es semimetilado: las hebras parentales tienen las secuencias OriC metiladas, mientras que las
hebras de nueva síntesis no lo están (es decir, solo una cadena).
Una vez se ha replicado, las secuencias hemimetiladas se unen a la membrana plasmática, y después de
un tiempo, OriC se desprende de la membrana y entonces es accesible a las metilasas para que completen
la metilación y se pueda iniciar otro ciclo.

29
RESUMEN: el mecanismo de replicación viene dado por la metilación en el extremo 5’, que es el
responsable de regular el proceso. Cuando se encuentra metilado en la adenina, estará preparado para la
replicación. Posteriormente se encontrará la hemimetilación, ya que se ha producido la replicación de la
cadena pero no la metilación. Para que se vuelva a replicar, se necesita la metilación de las otras cadenas,
mediante las Dam metilasas.

2. ELONGACIÓN

Consiste en la síntesis de la cadena conductora y la retardada. La síntesis de la cadena conductora, la

más sencilla de las dos, empieza con la síntesis de un corto cebador de ARN (por la primasa), en el origen
de replicación. Los desoxirribunucleótidos son añadidos a este cebador por un complejo de DNA
polimerasa III unida a la helicasa anclada en la hebra de DNA opuesta. Seguidamente, la síntesis de la
hebra conductora transcurre de manera continua, al mismo ritmo de desenrollamiento del DNA en la
horquilla de replicación.

La síntesis de la hebra rezagada se realiza a trozos de corta longitud, los fragmentos de Okazaki. Primero,
la primasa sintetiza un cebador de RNA y, como en la síntesis de la hebra conductora, la DNA polimerasa
III se une al cebador de RNA y añade desoxirribonucleótidos. Cuando se ha completado la síntesis de un
fragmento de Okazaki, la replicación se detiene y las subunidades núcleo de la DNA polimerasa III se
disocian de su abrazadera deslizante E (y del fragmento de Okazaki completado) y se asocian con la
siguiente abrazadera. Esto inicia la síntesis de un nuevo fragmento de Okazaki.

En la síntesis de los fragmentos de Okazaki participan diversos complejos enzimáticos. Uno de ellos está
compuesto por la helicasa y la primasa y se denomina primosoma (necesario para iniciar cada fragmento
de Okazaki). Otro, es la DNA polimerasa III (dos holoenzimas) que usa uno de sus juegos para la síntesis
continua de la hebra conductora, mientras que el otro juego de subunidades núcleo circula entre un
fragmento de Okazaki y el siguiente sobre el bucle formado por la hebra retardada.

El replisoma (conjunto de enzimas) efectúa una rápida síntesis de DNA a un ritmo de unos 1.000
nucleótidos por segundo en cada hebra (conductora y rezagada). Una vez ha finalizado la síntesis de un
fragmento de Okazaki, su cebador de RNA es eliminado y reemplazado con DNA por la DNA polimerasa
I, y la mella restante es sellada por la DNA ligasa.

La DNA ligasa cataliza la formación de un enlace fosfodiéster entre un 3’ hidroxilo, al final de una hebra
de DNA y un 5’ fosfato al final de otra cadena. El fosfato debe ser activado por adenilación. 3.

30
3. TERMINACIÓN

La replicación procede hasta que las dos horquillas de replicación se encuentran

entre las secuencias Ter (secuencias de 20 pb) enfrentadas. Estas secuencias están
dispuestas en el cromosoma para crear una especie de trampa donde una horquilla
de replicación puede entrar pero no salir.

Los sitios Ter C, B, F y G permiten que pase un replisoma que se mueve en sentido
antihorario pero no uno que se mueve en sentido horario. En los Ter A, D y E ocurre
lo contrario. Así se asegura que las dos horquillas de replicación se encuentren en la
región de terminación aun cuando una de ellas llegue más rápido. Tenemos
secuencias específicas para cada cadena de la horquilla de replicación en cada
dirección.

Aclaración: Las horas en el reloj van desde las 12 a 1 a 2 y etc desde el medio por la derecha hasta llegar
de nuevo a las 12 por la izquierda, en este dibujo las horas del reloj son las de la derecha que son A D E y
las que sintetizamos en orden de 12 11 10 9 8 son las C, B, F, G, las antihorario.

REPLICACIÓN VÍRICA

Su material genético es el RNA que está en una cápside de proteínas

(spike). Este ARN viral es el que se va a transcribir (gracias a la
transcripción inversa y a la actuación de ARN transcriptasa inversa con el
que se obtendrá el cDNA capaz ya de replicarse para tener una cadena
doble de DNA. Entonces ya puede insertarse en las células e inducir la
infección viral).

No cumplen el dogma, es el RNA el que va a replicarse (por sí solo no

puede, se replica gracias a la acción de la transcriptasa inversa que lo
transforma en DNA y ya es capaz de replicarse), en vez del ADN que es lo
normal y lo que dice el dogma. Los virus se replican utilizando las enzimas
de las células a las que invaden (células huésped) pero mediante otros
mecanismos distintos al procariota o eucariota.
Aclaración: a partir de ADN se transcribe ARN al revés de lo normal y
luego la replicación se hace sobre el ARN, que es lo que luego usan los
virus para inyectar en la célula que van a infectar.

31
En la imagen vemos como un retrovirus (por ejemplo: VIH, coronavirus) se replica, es decir, pasa de forma
monocatenaria RNA a forma bicatenaria DNA. En la replicación de los virus no hay patrones, sino
modelos, ya que no se conoce exactamente la replicación de los mismos, además de que suelen mutar
con bastante frecuencia, por lo que una misma “especie” de virus puede tener diversas formas de
replicación.

REPLICACIÓN EN EUCARIOTAS

En eucariotas el ADN no solo está superenrrollado, sino que se organiza en cromatina y después en
cromosomas.
Pasos para la replicación en eucariotas:
1. Identificación de los orígenes de replicación
2. Desenrollado (desnaturalización) del dsADN para proporcionar
un molde ssADN.
3. Formación de la horquilla de replicación
4. Iniciación de la síntesis de ADN y elongación
5. Formación de las burbujas de replicación y ligación
6. Reconstitución de la estructura cromatinica.

El mecanismo es más o menos el mismo que en eucariotas (como vemos arriba) pero hay algunas
diferencias:
• No es DNA circular sino lineal.
• Hay varios orígenes de replicación en cada cromosoma.
• La replicación está coordinada y es simultánea en todos los cromosomas y, a su vez, en todos los
orígenes de replicación en los cromosomas.
• Está regulada por ciclinas.
• Varían las proteínas que actúan. Por ejemplo: hay cinco polimerasas.

32
POLIMERASAS

• Polimerasa I: en procariotas se encargaba de la eliminación de los cebadores, rellenaba los gaps

de los cebadores en la cadena retardada. En eucariotas la polimerasa que corresponde a esta es
la alfa.
• Polimerasa II: era la encargada de la reparación. En eucariotas se corresponde con las epsilon
(proofreading, corrección de la síntesis de DNA), beta (reparación) y gamma (síntesis y
reparación de DNA mitocondrial).
• Polimerasa III: se encarga de la síntesis de DNA. En eucariotas corresponde a delta (procesividad
de la cadena líder ).

REPLICACIÓN DE LOS TELÓMEROS

En los telómeros (extremos de los cromosomas) hay repeticiones en tándem de

secuencias de 6 nucleótidos. Una de las hebras está enriquecida en G (guanina) en el
extremo 3’. Las repeticiones se generan por la telomerasa que es un enzima que contiene
una molécula de RNA.
Debido a la eliminación de los cebadores vamos a tener una parte a modo de cadena
sencilla, el DNA se iría acortando con cada replicación, pero la telomerasa RNA hace una
elongación, es decir, permite la síntesis a partir de ese fragmento de DNA y lo alarga. De
este modo está permitiendo que tras la división a pesar de que tengamos acortamiento,
con la acción de la telomerasa se mantenga su longitud y no se produzca el
acortamiento.

Las telomerasas tienen más actividad en células germinales, primeras células

embrionarias, células somáticas proliferadas y células tumorales. Es una enzima que
presenta cierta homología con las transcriptasas en reverso (porque se va a sintetizar
DNA a partir de RNA).

En el extremo parece que los telómeros forman bucles

terminales. El acortamiento de los telómeros podría
contribuir al envejecimiento, se ve que la telomerasa
no funciona bien y se produce el acortamiento de los
telómeros.

33
34
TEMA 3: REPARACIÓN DEL ADN

MUTACIONES DEL ADN

MUTACIONES ESPONTÁNEAS E INDUCIDAS

Las mutaciones espontáneas son aquellas que ocurren como consecuencia de la actividad natural de la
célula; ésta lleva acabo procesos bastante complejos, como por ejemplo la replicación, en la que puede
haber algún error que origine una mutación.

Una mutación inducida es, en cambio, aquella provocada por un agente externo (agente mutágeno),
como ciertas radiaciones y sustancias químicas.

MUTACIONES SOMÁTICAS Y GERMINALES

Una mutación somática es aquella que se produce en células

somáticas; a no ser que provoquen cáncer no suelen ser
peligrosas, puesto que si la célula no es viable podrá ser
sustituida por otra.

Una mutación germinal es aquella que se produce en células

germinales; estas sí que son trascendentales, ya que si
originan un nuevo organismo éste tendrá todas las células
mutadas.

FRECUENCIA Y TASA DE MUTACIÓN

- La frecuencia de mutación es el número de células mutadas que hay al final de la replicación

(por gen, por gameto...).
- La tasa de mutación es el número de mutaciones en el número de divisiones celulares (cuántas
divisiones ha tenido la célula).
En la frecuencia se tiene en cuenta el número de células mutadas al final y en la tasa se tienen en cuenta
las mutaciones producidas en las divisiones celulares.

En este ejemplo, la frecuencia de mutación (2/8) hace referencia a cuántos individuos de los que se me
han generado presentan mutación. En cambio, la tasa de mutación (1/7) hace referencia al número de
divisiones que han originado mutación.

35
TIPOS DE CAMBIOS EN EL ADN

Si la mutación afecta a ADN no esencial (hay

que recordar que más del 98 % del ADN no
se transcribe), su efecto será inapreciable y
se hablará de mutación silenciosa.
Hay una gran relación entre mutaciones y
cáncer, se ha comprobado en un estudio
que más del 90 % de factores
carcinogénicos son también mutagénicos.

Una célula sufre miles de lesiones a lo largo

de un día, pero de éstas, menos de una de
cada mil acaba en mutación; esto es así por
los sistemas de reparación del ADN de que
dispone la célula.

LECTURA DE LA FOTO

La primera secuencia es lo normal, con su secuencia de nucleótidos normal y su proteína.

• Ejemplo 1: deleción puntual (se modifica un nucleótido, se elimina) → si eliminamos un uracilo

se continua leyendo desde ahí, la lectura (el marco de lectura), cambia completamente, hay un
cambio en el marco de lectura. Cambia la proteína completamente

• Ejemplo 2: delección de un triplete. El inicio sería lo mismo. El marco de lectura no se modifica,

hay un triplete que se ha modificado pero el marco no, con el ejemplo de arriba el marco va a
ser igual. Estas deleciones de tripletes pueden o no llegar a mutaciones, si esa parte de la
proteína no es esencial para su funcionalidad entonces no va a llevar a lo que es una mutación
en sí.

• Ejemplo 3: inserción puntual. Vamos a añadir un nucleótido, en este caso se añade la citosina.
Se cambia el marco de lectura. Esta proteína va a ser completamente distinta a la proteína
normal, la wildtype (la del principio).

• Ejemplo 4: mutaciones supresoras. Se denominan así porque se producen inserciones y

deleciones a la misma vez. En este caso tenemos la inserción de uracilo, en esa parte cambia el
marco de lectura y ene se momento se produce una deleción entonces esa parte de la proteína
va a ser igual que la que teníamos al principio pero solo tenemos ese cambio de lectura (es como
si eliminamos esa mutación con otra mutación por eso se denomina mutación supresora).

Si esta parte es fundamental para la proteína si se producirá una alteración pero si no es esencial esa
mutación se suprimirá. Cuando verdaderamente hay una mutación es cuando se produce una alteración
en el marco de lectura.

36
MUTACIONES ESPONTÁNEAS (CAUSAS)

ERRORES ESPONTÁNEOS EN LA REPLICACIÓN

Durante la replicación la ADN polimerasa va añadiendo nucleótidos y puede haber errores. Es posible que
el proofreading (repara errores) falle y se arrastren mutaciones. Estos errores pueden ser causadas por:

TAUTOMERÍA

Consiste en una mutación causada porque una “base rara” (tautómero), se sitúa en lugar de la “normal”,
pudiendo originar un apareamiento incorrecto. Se produce la mutación en la cadena con la base
cambiada.
El emparejamiento normal de las formas de bases sería la forma ceto. Si las bases nitrogenadas se
encuentran en forma tautomérica (otra forma en la que el doble enlace se halla en equilibrio con la ceto)
las bases se alinearán de forma incorrecta.

La forma imino de la citosina permite que la citosina se una a la adenina y del mismo modo la forma enol
de la timina (grupo OH en vez de solo oxígeno) se puede unir a guanina mediante 3 puentes de hidrógeno.
Del mismo modo la adenina en forma imino también podrá unirse erróneamente a la citosina con 3
puentes de hidrógeno. La guanina tautomérica en forma enol también puede unirse a la timina con 3
puentes de hidrógeno. Estas formas tautoméricas son estadísticamente poco probables.

IMAGEN ABAJO à La cadena de arriba va a dar lugar a un ADN silvestre y otro mutante ya que una de las
hebras contiene una timina que no debería y al sintetizarse la complementaria se añade una adenina que
en la hebra original no estaba así. La guanina tautomérica se observa unida a la timina. Cuando vuelva a
replicarse en la segunda generación observamos en la de arriba a la derecha que no hay cambios con
respecto a la parenteral pero en la de abajo la timina se aparea con adenina (esta copia de ADN estará
mutada).
En la cadena de abajo (c) no va a pasar nada porque no ha habido cambios.

37
ALINEAMIENTO INCORRECTO

Una mutación de inserción o de deleción genera un mutante con una base más o con una menos; esto
origina un desplazamiento del marco de lectura. Los alineamientos incorrectos se van a producir en zonas
con muchas repeticiones, que son zonas donde la DNA polimerasa puede cometer más errores. Hay dos
tipos, inserciones (adición) o delecciones:
• Adición extra (inserción): durante la síntesis de DNA, en
zonas con muchas repeticiones de nucleótidos, se va a
producir tantos nucleótidos que sin querer se puede añadir
uno extra.
Se forma un bucle que luego al separarse las hebras hará que
se sintetice un nucleótido más.

• Delección: se observan muchas CT en la cadena molde; se

produce un lazo, al producirse la deleción, no se tiene en
cuenta la CT y se pasa a la siguiente CT.
En la replicación de la cadena va a ir añadiendo CACACA, pero
el lazo no lo tiene en cuenta y por tanto no se tiene en cuenta
esa CT, que conlleva que en la siguiente replicación se carezca
de esa CT en la que se ha producido la deleción. Por ello se
produce un alineamiento incorrecto.
Si se produce una deleción de tripletes, no hay cambio de
lecturas, si va a existir una mutación pero no se cambia el
marco de lectura y si esta parte no es esencial en la función
de la proteína, no va a pasar nada.

LESIONES ESPONTÁNEAS EN EL ADN

DESPURINIZACIÓN

Pérdida de la base púrica del nucleótido por hidrólisis del enlace beta N-
glucosídico, creándose un sitio apurínico. La DNA Pol añade Adenina
(normalmente, no siempre).

38
DESAMINACIÓN

Pérdida del grupo amino (eliminación grupo amino) en las bases nitrogenadas que provocan
emparejamiento distinto al normal. Por ejemplo, al desaminar la citosina, se obtiene uracilo. Esto ocurre
de manera espontánea y da origen a mutación.

Generalmente está producido por radiaciones o energía calorífica y para reparar esto (un uracilo
incorrecto) participan enzimas del tipo uracilo DNA glicosilasas.
A partir de este supuesto se explica que el ADN no tenga uracilo sino timina. Si tuviese uracilo no sería
capaz de distinguir los uracilos naturales de los originados por mutación, y no habría sistema efectivo de
reparación. Teniendo timina en vez de uracilo soluciona este problema, ya que todos los uracilos serán
mutantes y habrán de ser eliminados.
La uracil ADN glicosilasa quita el uracilo y deja un sitio libre; las nucleasas cortan la cadena de DNA
alrededor del sitio donde ha quedado el hueco; después actúan la DNA Polimerasa (tipo 2 en procariotas)
y DNA Ligasa. Sintetizan de nuevo este fragmento colocando la base nitrogenada correcta y las ligasas
eliminan esos gaps que han quedado y vuelven a hacer continua la hebra.

DAÑOS POR OXIDACIÓN

Acción de radicales libres sobre el ADN. Se producen oxidaciones por radicales oxidantes (radicales
hidroxilos, superóxido, peróxido de hidrógeno). Alteran las bases provocando apareamientos incorrectos.

Estas bases se pueden emparejar de forma errónea unas con otras, ejemplo que se unan guanina se
convierta por una mutación en algo raro y se empareje con adenina. Se puede comparar con los
tautómeros aunque estos están en equilibrio mientras que los radicales libres no lo están y simplemente
convierten la guanina en una base rara pero no en equilibrio.

39
MUTACIONES INDUCIDAS

ANÁLOGOS DE BASES NITROGENADAS

Hay análogos de bases, que son capaces de aparearse con más de una además de las correctas se pueden
aparear a lo que no deberían. Por ejemplo:
• 5-Bromouracilo: es análogo a la timina y se
aparea de forma normal con Guanina (G) y
Adenina (A). De normal solo con la A pero se
permite el apareamiento “raro” con la G.
• 2-Aminopurina: análogo a la adenina y se aparea
de forma normal con Timina (T) pero este
análogo lo hace también con la Citosina (C).

MUTACIONES INDUCIDAS POR AGENTES QUÍMICOS

Provocan error del apareamiento al generar modificaciones covalentes estables, van a producir
emparejamientos incorrectos. Por ejemplo:
• Desaminación: óxido nitroso (NO).
• Agente alquilante: EMS (etilmetilmetano
sulfonato) produce una alteración en la guanina y
hace que se una de forma incorrecta a la timina.
Pasamos de tener un emparejamiento de guanina-
citosina a una adenina-timina.

• Agentes intercalantes: (proflavina, bromuro de etidio, dioxina…) moléculas planas que se

intercalan entres las bases del ADN (interrumpen la doble cadena). Provocan la interrupción de
la cadena de DNA, por lo que ocurre una distorsión de la estructura tridimensional de la hélice,
provocando inserciones, deleciones, etc.
o Dioxinas procedentes de la combustión de plásticos
o Proflavina
o Bromuro de etidio: sustancia empleada entre otras cosas para
la tinción de ácidos nucleicos ya que se ve por rayos UV. El
bromuro de etidio puede causar una mutación (es un agente
cancerígeno como la dioxina, por que se intercala en el DNA).

Cuando estamos trabajando en el laboratorio con el gel de agarosa, se usa bromuro de etidio al
intercalarse en el DNA, el gel, se puede observar a luz ultravioleta el DNA que aparece marcado. Además,
se puede intercalar el gel en el DNA de nuestras manos si no utilizamos guantes.
Si nos cae una gota del bromuro, ahí también va a producir una lesión en el DNA en nuestro cuerpo y
puede existir mutaciones, esa es la razón por la que el uso de guantes es necesario en el laboratorio.

40
AGENTES FÍSICOS

Pueden ser de dos tipos: radiaciones no ionizantes o radiaciones ionizantes.

RADIACIONES NO IONIZANTES

Son los rayos UV, radiaciones electromagnéticas de menor longitud de onda que la luz visible y muy
absorbidas por el ADN.
El efecto de la luz UV genera dímeros de timina (fotodímero) mediante enlace covalente (fuerte) entre
dos timinas contiguas, que provocan que replicación y transcripción se detengan. Necesitamos enzimas
que rompan estas uniones covalentes.

RADIACIONES IONIZANTES

Son de menor longitud de onda que las UV y mucho más energéticas; son los rayos X, los rayos Y, etc.
Pueden provocar:
• Ruptura cromosómica: rotura de la doble cadena (efectos letales y directos).
• Apareamiento incorrecto: roturas del enlace N-glucosídico, enlace que une las bases
nitrogenadas a la desoxirribosa.

Dos efectos:
- Efecto directo: se observa el efecto directo de la rotura de la cadena de DNA directamente.
- Efecto indirecto: las radiaciones ionizantes van a tener un efecto sobre las moléculas de agua
citosólica que van a producir un efecto radiactivo sobre ciertos iones reactivos y son estos los
que van a tener un efecto directo con el ADN citoplasmático y mitocondrial, es decir en total es
un efecto indirecto a través de iones radiactivos.

MECANISMOS DE REPARACIÓN DEL ADN

Los daños causados en el ADN tienen graves consecuencias, entre las que destacan la apoptosis (muerte
de la célula), y el cáncer, en el que se produce una división incontrolada de las células enfermas. Otras
consecuencias no tan exageradas pero aun así muy importantes son los fallos en funciones celulares como
consecuencia de la mala expresión de un gen.

Además hay que tener en cuenta que aquí nos estamos refiriendo a mutaciones génicas (alteración de la
secuencia de nucleótidos de un gen), pero existen también mutaciones cromosómicas (alteración de la
secuencia de genes de un cromosoma) y mutaciones genómicas (alteración del número de cromosomas),
que provocan graves síndromes o incluso que el individuo no sea viable.

41
La reparación del ADN es de vital importancia para la supervivencia de la célula y del individuo. Los
sistemas de reparación consumen mucha energía en forma de ATP y muchas veces son redundantes, pero
la célula no puede arriesgarse a que uno falle. Generalmente cuando algo es importante en la célula hay
varios mecanismos redundantes que llevan a cabo distintos procesos con el mismo fin.

ESQUEMA MECANISMOS DE REPARACIÓN

REPARACIÓN DIRECTA

Debido al efecto de la luz ultravioleta se producen alteraciones en los dímeros de timina (alteración en el
DNA que lleva a mutaciones al estar mucho tiempo al sol). El cáncer de piel se debe a mutaciones
(fotorreactivación) en los dímeros de timina.

Son procesos que cambian directamente las bases dañadas en vez de eliminarlas. Es decir, se reparan
las lesiones sin eliminar la base o el nucleótido, algunos mecanismo de reparación que tiene nuestro
organismo son:
• DNA fotoliasa: (es activada por la luz blanca) revierte los dímeros de timina mediante la
fotorreactivación, es decir, rompe los enlaces covalentes que se habían formado entre las dos
timinas. La misma luz del sol es capaz de producir una reparación gracias a la activación de estas
enzimas. Es capaz de absorber la energía de la luz UVA, adquiriendo así un estado excitado que
facilita la transferencia de un electrón al dímero y, en consecuencia, su escisión.
• Transferasas de grupos alquilo: reparación directa. Eliminan los grupos alquilo generados por
mutágenos (metanosulfonato de etilo, nitrosoguanidina). Van a introducir grupos alquilo en el
DNA.

42
REPARACIÓN POR ESCISIÓN

REPARACIÓN POR ESCISIÓN DE BASES (BER)

Es el más sencillo de los dos.

Son sistemas de reparación dependientes de homología, utilizan la cadena homóloga para sintetizar DNA.
Reparan daños causados por metilación, desaminación, oxidación o pérdida espontánea de bases. Se
rompen las despurinizaciones y tendremos distintas enzimas implicadas. Se usa para mutaciones
pequeñas (a nivel de bases). El propio proceso de reparación acaba afectando varios pares de bases.

Proceso de actuación:
1. Mediante la acción de las ADN glicosilasas elimina la base afectada/dañada rompiendo el enlace
N-glucosídico.
2. Se origina un sitio AP (apurínico o apirimidínico). Se ha eliminado una base púrica o una
pirimidínica. En este momento la endonucleasa rompe la cadena de DNA (en el interior) por ese
sitio y rompe también (actuando como una exonucleasa) un tramo alrededor de la zona AP para
poder asegurarse que la polimerasa 2 (reparación) pueda sintetizar de nuevo la nueva cadena de
DNA usando la otra cadena sin mutación como molde. Por ello se considera que es dependiente
de homología.
Endonucleasa: rompe el enlace en el interior de la cadena
Exonucleasas: Ya existe esa rotura y va a eliminar todo el fragmento, eliminando todos los
enlaces fosfodiéster.

CONCLUSIÓN
La reparación no se realizará simplemente insertando una nueva base. La desoxirribosa 5-fosfato que me
ha quedado se elimina y junto a ella varios nucleótidos de alrededor mediante AP endonucleasas (rompe
en el interior de la cadena, el enlace fosfodiéster) y exonucleasa (ya tenemos la rotura y la exonucleasa
elimina un fragmento de DNA) de escisión. A continuación ese segmento de ADN es reemplazado
mediante la ADN polimerasa, se forman los puentes de hidrógeno intercatenarios y posteriormente
quedan sellados mediante la ADN ligasa.
“En vez de un remiendo pongo un parche”.

43
REPARACIÓN POR ESCISIÓN DE NUCLEÓTIDOS

Para realizar esta reparación se produce un bloqueo en la replicación.

Corrige los errores voluminosos (no es solo una base, es en varios
nucleótidos el daño) que la escisión de base no reconoce (bloqueo de la
horquilla de replicación o del complejo transcripcional). Si este error no se
repara vamos a provocar un daño en la horquilla de replicación por lo que
la actuación de este mecanismo es imprescindible para evitar daños
anteriores.

Repara lesiones que causan grandes distorsiones en la lectura helicoidal

del ADN. Se libera un segmento de nucleótidos que contiene el dañado
mediante una escinucleasa, que hidroliza ambos enlaces fosfodiéster. Se
crea un hueco que será rellenado de ADN por la polimerasa y la ligasa.
Endonucleasa que cortan y que luego van a eliminar ese fragmento mal
sintetizado, luego ADN polimerasa sintetiza ADN correcto de ese hueco y
las ligasas unen la mella que se ha producido.

Vamos a tener factores como el TF2H y TFIH que identifican el daño y permiten que las proteínas Xp,
Xpd… se adhieran a la zona donde se ha producido el daño entre nucleótidos. Se produce entonces una
incisión en el lugar donde se ha producido el daño. Son proteínas que forman un complejo multiproteico,
la unión de todos estos factores y enzimas hacen que la doble cadena se desenrolle y se pueda producir
ruptura de doble enlaces para la separación de las dos hebras.

REPARACIÓN POST-REPLICATIVA: MISMATCH REPAIR, MMR

Detiene fallos en la nueva cadena y corrige emparejamientos o alineamientos erróneos (causados por
ejemplo por tautómeros). Participan una serie de enzimas que eliminan el fragmento donde hay daño y
las ADN polimerasas y ligasas la reparan.

Hay que identificar que hay alineamientos incorrectos, para ello, se produce una metilación en la
secuencia GATC en la cadena molde.
El grupo metilo nos indica que es un sitio donde se van a unir las proteínas reparadoras del alineamiento
incorrecto (las atrae), las siguientes proteínas:
• MutH: se une a la zona donde se ha producido la metilación
• MutS: se une donde se encuentra el alineamiento incorrecto
• MutL: permite el plegamiento porque une MutS y MutH.

44
Metilación avisa a proteínas mut para que se unan a la zona del ADN donde tienen que realizar la
reparación. Identifica también cuál es la cadena vieja y cuál la nueva.

Una vez plegadas las cadenas pasan a funcionar las exonucleasas: rompen desde la cadena de la secuencia
GATC hasta unos nucleótidos posteriores al alineamiento incorrecto.
Con la unión de estas proteínas se forma un codo que favorece el reconocimiento del apareamiento
erróneo. Se retira el codo y la DNA Polimerasa genera nuevos nucleótidos, solucionando el error, y las
ligasas unen el nuevo fragmento sintetizado con el resto de la cadena y forman una cadena continua.

REPARACIÓN PROPENSA A ERROR

SISTEMA SOS
Es un mecanismo Post-replicación porque la DNA polimerasa III no ha conseguido realizar el proofreading
(se acude a él como “auxilio”)
La DNA polimerasa no identifica el daño (no se realiza proofreading), por eso se indica como un
mecanismo de postreplicación aunque se produzca en la replicación como tal.

Se puede identificar durante la replicación o después. Evita el bloqueo en la replicación (se utiliza mucho
en E.coli) mediante bases no específicas; se acumulan mutaciones mediante este sistema, pero es la única
alternativa a la muerte de la célula. Queremos que la replicación no pare, da igual lo que añada, lo
importante es seguir la replicación.

La proteína RecA se une a la cadena dañada y sirve como señal de que ahí hay un daño. Es esencial para
que se una la Pol V (bypass). El proceso comienza cuando las proteínas que reconocen el daño (RecA),
una vez es identificado el daño las ADN polimerasa de tipo III es sustituida por una de tipo V en E Coli
(bypass), y esta continúa con la síntesis, ya que esta no tiene capacidad de exonucleasa 3’ → 5’.
Conseguimos que no se pare la replicación una vez pasado el daño cuando se vuelve a cambiar por la III y
sigue con la síntesis de forma normal. La V en verdad solo nos sirve para evitar que se pare por completo
pero el error no se va a corregir.
Es por ello que se denomina reparación propensa a error, porque no se repara; solo evita un daño mayor
que sería el bloqueo total de la replicación.

45
Polimerasa N es igual que la V pero en este caso en eucariotas.

Resumen: La polimerasa de bypass es la que actúa en este mecanismo, no tiene función exonucleasa
3’→5’ (no corrige) y es la más propensa a cometer errores.
En E. Coli el daño del ADN por diversos agentes desencadena la respuesta SOS, mediante la cual se detiene
la replicación y se potencian diversos mecanismos de reparación mediante la expresión de una serie de
genes implicados en ella.
La polimerasa III es reemplazada por la polimerasa 5 (se para temporalmente al unirse y empieza a
funcionar: bypass) esta continua la síntesis de ADN sin tener en cuenta el daño.
En eucariotas la polimerasa N saltea los diremos de pirimidina e introduce AA transversos

REPARACIÓN POR RECOMBINACIÓN. ROTURAS DE DOBLE CADENA

XLas roturas bicatenarias afectan a ambas hebras de ADN, por lo que no son susceptibles de reparación
mediante mecanismos basados en la síntesis de ADN en el fragmento dañado como veíamos
anteriormente. Tiene lugar a través de la reparación recombinativa, gracias a la cual se unen de nuevo
las hebras rotas.

La recombinación, que es explicada por el modelo de Holliday, sirve como mecanismo de reparación,
aunque su función principal es la redistribución del contenido de un genoma entre varios individuos
durante la reproducción para asegurar la diversidad. La otra forma de asegurar la diversidad es la
mutación.
Este mecanismo implica la dependencia de la proteína Rec A, igual que el mecanismo SOS propenso a
errores. Ante un error, mediado por Rec A, la hebra no dañada se traslada al hueco. Rec A es una proteína
procariota pero en eucariotas hay un mecanismo similar.

La reparación por recombinación puede ser homóloga, DSBS (doublé strand break repair) y SDSA (síntesis
dependent strand annealing) o no homóloga, NHEJ (non homologous extrem junctions, propenso a error).

REPARACIÓN POR RECOMBINACIÓN NO HOMÓLOGA: NHEJ

Reparación de ADN por NHEJ. Se usa cuando hay unión de extremos no homólogos y es propenso a error
En este mecanismo se repara por la introducción de una delección .Se unen los dos puntos terminales de
la ruptura sin utilizar una secuencia molde. A menudo se pierden secuencias de ADN y puede ser
mutagénico. En células de mamíferos es el principal mecanismo hasta que la replicación del ADN permite
la reparación recombinacional utilizando la cromátida homóloga como molde.

46
 • DNA-PK: proteína quinasa dependiente de DNA.
Identifica dónde está el daño y a su vez tiene
actividad exonucleasa.
• KU80/KU70: heterodímeros que son ATPasa
dependiente de DNA con activación helicasa.
• La unión DNA-PK, KU80 Y 70: identifican dónde
está el daño uniéndose a los extremos no
homólogos e identificando nuevos lugares
posibles homólogos aunque no estén justo en el
extremo.
• Posteriormente intervienen otras enzimas y por
último una ligasa que une los extremos, la ligasa
de tipo IV junto a su cofactor XRCC4.

Mecanismo característico por rotura de las 2 cadenas. Esta rotura produce terminaciones sin homología,
con cortes diferentes en cada extremo. Tras la escisión de extremos llegará la familia X de las ADN
polimerasa de tipo lambda y mu.

Se unen los dos puntos terminales de la ruptura sin utilizar

una secuencia molde. A menudo se pierden secuencias de
ADN y puede ser mutagénico. En células de mamíferos es
el principal mecanismo hasta que la replicación del ADN
permite la reparación recombinacional utilizando la
cromátida homóloga como molde.

Nosotros tenemos extremos no homólogos por lo tanto no

podemos unir las cadenas. Por tanto tenemos que
identificar una zona que si sea homóloga en ambas
cadenas para hacer la escisión y así poder ligar las bases y
que la doble cadena quede unida. Por ejemplo, CGT/ GCA:
zonas de apareamiento homólogo. Las exonucleasas
quitan el sobrante de los extremos no homólogos.

Lo que se introduce es una delección, se ha recortado por lo que la secuencia no es la misma, es como
crear una mutación. Al crearse una deleción de 9 pares de bases se le reconoce como un mecanismo
propenso a errores, pero se corrige el daño.
Es un tipo de recombinación molecular debido a que tenemos mecanismos en los cuales se produce doble
rotura en las dos cadenas, no tenemos una sin error que nos sirva como molde, no pueden participar las
DNA polimerasas.
Objetivo: evitar que la cadena rota detenga la replicación.

REPARACIÓN POR RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA: DSBR Y SDSA

Reparación de DNA por DSBR y SDSA. Se usa cuando hay recombinación homóloga (Modelo de
Holliday) y cuando se produce un corte en la cadena. Es otro sistema de reparación de rotura de doble
cadena, mejor que el anterior, pues permite copiar la secuencia que nos faltaba, en vez de eliminarla. El
problema es que requiere que haya dos ADN de secuencias homólogas.

47
MODELO DE HOLLIDAY ESQUEMA VISUAL

Tenemos un corte en ambas

cadenas que se tiene que reparar
mediante la recomb. homóloga

à Cadena roja usa como molde la

cadena azul, cadenas negras son
síntesis a partir de cadena azul.

- DSBR: se producen deleciones en el extremo 5’ para que la 3’ invada la cadena inferior entonces
este mecanismo lo arregla (reparación de la cadena de doble cadena). Se producen los dos
modelos Holliday, la resolución (en plano horizontal, vertical, o una mezcla de ambos). Se
forman heteroduplex recombinantes, con entrecruzamiento. Mecanismo fiel a lo que ocurre en
la recombinación homóloga porque se producen los 2 sistemas holidays y también la resolución.
Aparecen heteroduplex recombinantes; recombinación homóloga tal cual. Las ADN polimerasas
de la cadena roja usan como molde la cadena azul.

- SDSA: síntesis dependiente del anillamiento de la cadena, no reproduce de manera fidedigna el

mecanismo anterior, se produce la invasión, pero luego se va a renaturalizar la hélice en base a
la cadena (lo negro en la foto de abajo, es síntesis de nueva cadena) ya existente. No hay
entrecruzamiento pero sí cruce para reparar ambas cadenas. De esta forma se repara la doble
cadena que se ha roto en la que sí que ha habido un cruce para poder sintetizar la cadena rota.
No hay formación de sistema holiday, solo es dependiente del anillamiento de la cadena pero
no hay resolución ni nada de eso. Sólo síntesis de ADN en base a las cadenas ya existentes.

DIFERENCIA ENTRE AMBOS PROCESOS

Ambos se basan en reparan las roturas de doble cadena, primeros pasos son iguales, el DSBR es más fiel
a la recombinación homóloga, se produce tanto el sistema Holliday como la resolución y al final se
produce una recombinación, el DSBR utiliza el mecanismo de recombinación homóloga tal cual. SDSA
también se utiliza cuando se produce rotura de cadenas, pero no llega a completarse los dos sistemas
holliday, la recombinación, etc. SDSA es un sistema más sencillo, solo hay síntesis de DNA de las cadenas
tal cual se encuentran, no hay entrecruzamiento pero está incluida en este tipo porque los primeros pasos
son iguales al DSBR, es decir, la reparación solo se basa en una síntesis de la cadena rota (azul). SDSA
síntesis de ADN basado en la cadena azul, más sencilla sin entrecruzamiento. El SDSA es como un DSBR
incompleto.

48
ESTA MAL EL DIBUJO DEL RESULTADO DEL DSBR, realmente sería igual que la resolución de los dos
sistemas holliday. La imagen de la derecha sí que está bien.

PROTEÍNA SPO II.

Tiene un papel fundamental en la recombinación meiótica en las levaduras.

En las levaduras, SPO II (que es una topoisomerasa de tipo II específica de levaduras), que identifica el
daño (donde se ha producido el corte). Se produce entonces un recorte en el extremo 3’ para que los
extremos 5’ puedan invadir.
Rad51 (en levaduras) y Dmc1 (además en organismos superiores) se unen a los extremos de estas cadenas
para facilitar la invasión (actúan parecido a RecA, son homólogas).

Organismos superiores: órganos diferenciados y que asimismo contienen tejidos vasculares, la cual les
permite asegurar la supervivencia en el medio terrestre. Las plantas tienen tejidos especializados para
realizar el proceso de fotosíntesis y para la conducción de la savia y del agua.

49
MODELO DE DECISIÓN TEMPRANA

En la rama de la izquierda en el resultado

de abajo, el segundo, en la última
cadena hay rojo junto con un poquito de
azul,( que es el error que había en el
dibujo de arriba, que aparecía todo del
mismo color.)

Lo verde es la síntesis de la nueva

cadena.
En la rama de la derecha hay una mera
síntesis de dna pero no hay resolución.
Se inicia como una posible
recombinación en realidad no lo es.

REPARACIÓN DE ROTURA CON RESTAURACIÓN COMPLETA DE LA SECUENCIA

Como hemos visto, no solo se produce en levaduras sino que también se da en organismos superiores. En
esos casos las proteínas (aparecen varias) son muy importantes para reparar el daño que se ha producido
en la doble cadena, son homólogas a las RecA de las procariotas.

BRCA2 y BRCA1: son marcadores de tumores (muy relacionados especialmente con el cáncer de mama;
angelina jolie tenía muy elevados el BRCA 1 y 2) que van a participar en la primera identificación del daño
uniéndose a los extremos 3’ para que luego se produzca la invasión de la cadena.

BRCA1 es un gen supresor de tumores humano, que regula el ciclo celular y evita la proliferación
incontrolada. La proteína BRCA1, producto de este gen, forma parte del sistema de detección y
reparación de los daños del ADN.

Las restauración es completa.

50
RESUMEN MECANISMOS DE REPARACIÓN

• Sistemas de completa fidelidad, síntesis a partir de una cadena no dañada:

o Eliminación de dímeros de timina: método no propenso a error al sintetizarse ADN en
base a una cadena, se producen uniones entre dos timinas. Se ha identificado factores
(XPC y 23B) que van a hacer una primera identificación del daño, la participación de
todos estos lo que va todos estos factores (TF2H y RPA) van a participar en esa apertura
y desenrollamiento de la doble cadena de ADN y las enzimas XPF y XPG van a actuar
como endonucleasas, cortando el ADN a nivel de los enlaces fosfodiéster unos cuantos
nucleótidos por delante y por detrás para permitir que se sinteticen (…) reparadoras
que van a sintetizar el ADN de nuevo y luego las ADN ligasas lo unirán.
o El sistema NER y BER (reparación por excisión de bases y nucleótidos) también son
ejemplos de sistemas no propensos a error
• Sistemas que provocan errores: como consecuencia de la deleción, en realidad son mutaciones
pequeñas:
o NHEJ: los errores se producen por la rotura de las dos cadenas pero no hay homología,
este mecanismo va a intentar crear homología en base a realizar una serie de
deleciones (son deleciones muy pequeñas pero siguen siendo una mutación que resulta
aun asi mejor que el hecho de tener la doble cadena rota). Reparación con introducción
de deleciones.

TRASTORNOS ASOCIADOS A DÉFICIT EN LOS SISTEMAS DE REPARACIÓN DEL ADN

- Xeroderma pigmentosum (XP): fotosensibilidad en la piel, cáncer de piel. Mutaciones en todos

factores XP del sistema NER.
- Síndrome de Cockayne (CS): enanismo senilidad precoz, sordera, hipersensibilidad a la luz
ultravioleta. Mutaciones en CSA y CSB y XPG del sistema NER.
- Tricotiodistrofia (TTD): retraso físico y mental, deficiencia de azufre, produce pelo y uñas
quebradizas, mutaciones en XPD del sistema NER.

Todos los anteriores trastornos se asocian a tumores de piel. Aunque también se pueden producir
carcinomas, leucemia y otros tipos de cáncer.

51
52
TEMA 4: RECOMBINACIÓN DEL ADN

La recombinación consiste en el intercambio de fragmentos entre dos moléculas de ADN. Es un proceso

importante en algunos tipos de reparación ADN y en otros procesos como la meiosis, la generación de
diversidad de anticuerpos y el ciclo vital de algunos virus.

En la recombinación genética, se forman dos moléculas hijas a partir del intercambio genético entre dos
moléculas parentales. Para que se produzca la recombinación, tiene que haber ruptura y unión de las dos
hebras de moléculas recombinantes. Las enzimas que catalizan el intercambio del material genético en la
recombinación se llaman recombinasas.
Para que haya recombinación, tiene que haber secuencias homólogas. Los dúplex de ADN paternos se
alinean en regiones con similitud en la secuencia y mediante la ruptura y empalme de segmentos
homólogos, se forman nuevas moléculas de ADN.

Los dúplex de DNA paternos se alinean en regiones con similitud en la secuencia y mediante la ruptura y
empalme de segmentos homólogos, se forman nuevas moléculas de DNA completamente distintas a los
DNA paternos. Cuando las dos hebras de un dúplex están dañadas, la información para la reparación debe
provenir de otra molécula de ADN.

La recombinación es el proceso por el que la información genética se redistribuye. Permite “barajar”

grandes conjuntos de genes, siendo así una fuente de variación y selección para la evolución, más rápida
que la mutación.

53
TIPOS DE RECOMBINACIÓN

1. Recombinación homóloga (RecA dependiente en bacterias): identifica donde se va a producir la

reparación, en este caso la recombinación. Existe homología en las dos cadenas. Se produce en la
meiosis. Tiene que haber homología de secuencias. La interacción ADN-ADN es lo que inicia el
proceso. Forman nuevas moléculas, hay un intercambio de información genética.
2. Recombinación específica (no homóloga, RecA independiente en bacterias): no se requiere
homología de secuencias. La proteína inicia la recombinación.
2.1. Específica de sitio, legítima o conservativa: inserción de virus bacteriófagos que insertan su
material genético.
2.2. Específica ilegítima: elementos genéticos transponibles, transposones

La proteína dependiente de ATP, RecA participa en la recombinación

homóloga. Permite que el DNA de hebra sencilla explore rápidamente
un dúplex de DNA en busca de una secuencia idéntica o parecida. A
continuación, RecA cataliza el intercambio de hebras en el lugar
homólogo. RecA involucra rotura y recombinación de dos cadenas. Si
no participa RecA no se puede producir la recombinación.

RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA EN EUCARIOTAS

Involucra la rotura y vuelta a unirse las dos cadenas. Heteroduplex recombinantes (ambas cadenas se
cortan y vuelven a unirse, de forma que intercambian material genético). IMP: para que haya
recombinación debe existir corte en las dos cadenas. Características:
• Ocurre durante la meiosis (sobrecruzamiento de cromátidas) en la profase I: paquiteno.
• Los cromosomas intercambian segmentos de ADN entre sí
• Supone la rotura de las cadenas de ADN en ambos cromosomas
• Es un proceso que ocurre al azar en cualquier punto de los cromosomas.

54
Este tipo de recombinación se produce después de la replicación del DNA, tras la profase I. En esta fase,
cada conjunto de cromosomas se presenta como dos pares de cromátidas. La información genética ahora
se intercambia entre las cromátidas homólogas (estrechamente asociadas por recombinación genética
homóloga), proceso que implica el corte y empalme del ADN a nivel de ambos cromosomas. Este
intercambio también se denomina entrecruzamiento y es imprescindible que haya secuencias homólogas.

La recombinación homóloga tiene 3 funciones:

1. Contribuye a la reparación de varios tipos de lesiones de DNA.
2. En células eucariotas, proporciona una unión física transitoria entre las cromátidas que es
necesaria para la segregación ordenada de los cromosomas en la primera división meiótica.
3. Mejora la diversidad genética de una población.

MODELO DE HOLLIDAY

Un modelo propuesto para la

recombinación homóloga es el Modelo de Holliday, propuesto por Holliday en 1964 y reestablecido por
Dressler y Huntington en 1976, quienes demostraron la existencia de intermediarios físicos.
Un intermediario clave en este mecanismo es una estructura con forma de cruz, conocida como unión de
Holliday. Este intermediario solo se forma cuando las secuencias de nucleótidos de las regiones de
recombinación de los dúplex parentales son muy iguales o idénticas, es decir, solo en recombinación
homóloga.

1. Implica: Alienamiento de cadenas homólogas (dúplex homólogos).

55
2. Se tiene que producir un corte/mella en ambas cadenas gracias a enzimas (recombinasas) en el
mismo lugar de ambas cadenas homólogas.

3. Este corte provoca un desplazamiento de ambas cadenas hacia la cadena contraria (la verde a
la azul y viceversa). Se produce un cruce/ intercambio. Esta estructura se conoce como
intermediario/ estructura de holliday (se ligan), forman una cruz.

4. Desplazamiento del intermediario holliday, se desplaza/ migra el punto de unión e intercambio

entre cadenas hacia la misma dirección (ya se considera heteroduplex).

5. Se produce una rotación de 180º de una de las cadenas, es como si abriesemos la parte de abajo
y la abrieramos y solo por esta zona la girasemos 180º. De esta apertura sale que el cruce entre
cadenas desaparece.

56
 6. Finalmente, se resuelve la estructura, mediante el corte por nucleasas especializadas. Según
cómo sea el corte (en vertical o en horizontal) podemos obtener cromosomas no recombinantes,
o cromosomas recombinantes.
- El plano horizontal: se produce un corte (por donde
están los puntos) y la unión de la zona azul con la gris.
Esta resolución nos da heteroduplex no
recombinantes, ya que no está todo intercambiado.
obtenemos una cadena gris intacta y una cadena
mixta, una cadena mixta y otra azul entera pura (nos
da heteroduplex pero no son heteroduplex
recombinantes: no está todo intercambiado, hay
cadenas enteras de un solo color, se les denomina
recombinantes sin entrecruzamiento).

- En el plano vertical se produce un corte y ambas

cadenas se van a ligar (B-c y C-b). Se producen
heteroduplex recombinantes, porque en las 4 cadenas
se ha producido recombinación (recombinantes con
entrecruzamiento).

MODELO ACTUALIZADO

La recombinación se inicia por una rotura de doble cadena en una de las hélices
(cromátida del cromosoma A). La otra hélice (cromátida del cromosoma B) se utiliza
como molde para reparar la rotura.
1. Rotura de la doble hélice
2. Para que se produzca la migración tiene que existir una digestión parcial
de los extremos 5’ generados. Actividad 5’-3’ exonucleasa: los extremos
3’ quedan en forma de cadena sencilla.
3. Apareamiento de hebras. Invasión de una hebra en la otra. Reparación por
elongación de los extremos 3’ usando como molde el otro cromosoma.
4. Formación de una estructura intermedia con dos regiones heteroduplexas
y dos estructuras de Holliday.
5. Rotación de las estructuras de Holliday, resolución por corte. Formación
de regiones heteroduplexas con o sin recombinación y posterior ligación
de dos cadenas.

Lo naranja en la foto lo sintetizan las DNA polimerasas de reparación, lo hacen tras

el corte, es decir, reparan el corte que se ha producido en un primer momento.

Las bacterias pueden conjugar su ADN mediante plásmidos que se transfieren de

unas bacterias a otras. También un fago (virus que infecta a bacterias) puede
extraer un alelo de ADN de una célula y llevárselo a otra bacteria.

57
RECOMBINACIÓN ESPECÍFICA DE SITIO O LEGÍTIMA

Inserción de bacteriófagos. (no homóloga, RecA independiente en bacterias), no se requiere homología

de secuencias. La proteína inicia la recombinación. Dirigida por la interacción ADN con proteína.

La recombinación específica de sitio es un proceso muy diferente a la recombinación homóloga. Tiene dos
funciones:
• Regulación de la expresión de ciertos genes
• Promoción de reordenamientos programados de ADN durante el desarrollo de muchos
organismos o los ciclos de replicación de algunos ADN de virus y plásmidos.

RECOMBINACIÓN ESPECÍFICA ILEGÍTIMA. TRANSPOSICIÓN

Lo descubrió Bárbara McClintock en los años 50, a través de observaciones en granos de maíz, recibiendo
el premio Nobel de Medicina y Fisiología en 1983. Observó que algunos granos se presentaban incoloros
O amarillos, otros tenían puntos muy pequeños, otros los tenían grandes y algunos eran completamente
negros.
Dedujo que cuando un elemento transponible estaba en el genoma, el gen no se expresaba (no había
color en los granos). Pero si estos transposones se eliminaban (saltaban), el gen se transcribía y producía
esa pigmentación en los granos.
También pudo observar que cuando el salto se producía en una etapa de desarrollo del grano más tardía,
tenía poco tiempo para expresarse, y las manchas eran pequeñas; en cambio, si el cambio se producía al
principio, las manchas resultaban muy grandes.
Los transposones o elementos génicos transponibles son genes saltarines, que pasan de unas secuencias
de DNA a otras. Están en casi todas las células y se mueven o “saltan” de un lugar del cromosoma a otro
del mismo o de otro cromosoma. El proceso se llama transposición y es poco frecuente; la nueva
localización ocurre más o menos al azar.

El gen que determina que los genes sean movibles es la transposasa, la cual permite al transposón
moverse de un lado al otro. También hay dos secuencias de DNA invertidas.

El experimento de Barbara McClintock:

Se observan en las mazorcas de maíz granos con diferentes colores debido a que Barbara observó que en
la secuencia de DNA de los granos existían ciertas zonas que impedían la expresión de los genes, estos
elementos (transposones) eran capaces de saltar, por lo que esas zonas de DNA son capaces de
desplazarse y esto a su vez producía que actuase como activador de un gen pigmentador, cambio de
colores.
En los granos blancos, este salto no se había producido, en cambio en los granos totalmente marrones, el
DNA del elemento transponible era escindida para que el gen de pigmentación se pudiese transposar. En
otro aparecen grandes manchas porque las escisión se produce en etapas muy tempranas de desarrollo y
por tanto estas pigmentaciones vienen desarrolladas desde hace tiempo. Los que presentan pequeñas
puntos es por escisiones en etapas muy tardías del desarrollo, todavía no había crecido el grano. Ella
puedo predecir que en los diferentes granos actuaban una serie de elementos que son capaces de saltar
de una zona del genoma a otro (transposones).

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TIPOS DE TRANSPOSONES

Hay transposones sencillos y complejos, dependiendo de la cantidad de genes que se localicen entre
medias.

Tipos de transposones en base de su complejidad:

• Clase 1 (transposones sencillos): cuando solo presenta una IS y también compuestos cuando
presentan distintas secuencias de inserción: Van a determinar que pertenezca a esta clase su
secuencia de inserción, una secuencia que consiste en 2 secuencias invertidas y que limitan al
gen de la transposasa que permite al transposón sencillo moverse de un sitio a otro. Hay 2 tipos
de elementos de clase 1:
o Secuencia de inserción o elementos IS: dos secuencias invertidas que limitan al gen de
la transposasas. También va a estar en los compuestos. E. Coli contiene 8 copias de IS1
y 5 copias de IS2.
o Transposón compuesto: van a tener dos secuencias de inserción rodeando al elemento
de resistencia.
• Clase 2 (transposones compuestos): ya no presentan secuencia de inserción como tal, lo que los
hace más complejos. Si presentan secuencias inversas y entre ellas encontramos distintos genes
como el gen de la transposasa (si no lo tuviera no sería un transposón) o el de la resolvasa.
• Clase 3: no hay secuencia de inserción (no hay IS) si no que van a tener genes dentro de la zona.
Si que vamos a tener el gen de transposasa además de genes que favorecen la transposición,
bacteriofagos (favorecen la inclusión en bacteriófagos). Son de una longitud mucho mayor que
los anteriores.

59
TRANSPOSONES SENCILLOS (CLASE 1)

Presentan elementos de inserción/elementos IS que son zonas invertidas. Tamaño < 2000 pb. E. Coli
contiene 8 copias de IS1 y 5 copias de IS2.
Los transposones sencillos están formados por:
• Repeticiones directas flanqueantes en el DNA
huésped (secuencias diana): debido a cómo se van a
insertarse los transposones y como van a saltar de
una zona a la zona diana.
• Repeticiones terminales cortas e invertidas (IS) (lo
azul en la imagen)
• Gen de la transposasa que corta el ADN en ambas
cadenas y realiza la apertura para poder insertarse.
como quedan zonas sin rellenar, se tendrá que
producir una síntesis de ADN, genes reguladores (lo amarillo).

Hay una región dentro del DNA huésped, necesario para que el transposón se
coloque.
El gen de la transposasa realiza cortes cohesivos (para permitir la entrada del
transposón), es decir, hace que quede una parte arriba y otra abajo, y en medio
de ambos es donde se va a localizar el transposón.

Tras la replicación se produce una duplicación de las secuencias flanqueantes

(rojas en el dibujo) del transposón (secuencias diana), se rellenan los huecos.

En el proceso de inserción de un transposón se genera duplicación de la

secuencia diana (de inserción).

TRANSPOSONES COMPUESTOS (CLASE 1)

También contienen elementos IS por eso se les considera de clase I.

- Contienen genes en la región central (proporciona resistencia a drogas), más dos módulos del
tipo IS (tanto en la misma orientación como en dirección contraria). En la región central, aparecen
al menos dos estructuras que rodean los elementos de resistencia a drogas, normalmente a
antibióticos.
- Los transposones compuestos pueden transportar todo tipo de secuencias de ADN en su región
central.
- Estos transposones pueden trasladarse de una zona a otra de forma análoga a los de tipo I
sencillos.

60
TRANSPOSONES MÁS COMPLEJOS (TN) (CLASE 2)

Tamaño > 2000 pb (mayor que los de clase I). No presentan secuencia de inserción como tal (no tienen
elemento IS), sino unas secuencias invertidas que van a rodear a otros genes:
• tnpA, es el gen de la transposa así como
• Genes a resistencia a antibióticos como el amp (ampicilina). Transportan genes que no solo están
implicados en la transposición, por ejemplo genes de resistencia a antibióticos.
• Genes represores o de la resolvasas.

TRANSPOSONES MUCHO MÁS COMPLEJOS (TN) (CLASE 3)

Pueden participar en la transposición replicativa. Las dos rayas del dibujo indica que es mucho más
grande pero no estudiaremos estos en tanto detalle dada su complejidad. Hay otra serie de genes en la
zona interna.

MECANISMOS DE TRANSPOSICIÓN

Tanto los transposones de clase 1 como los de clase 2 se van a transportar de una forma muy similar:
El propio gen de la transposasa (enzima) es el que hace que esa estructura salte de una zona a otra. Estos
genes permiten que actúen como endonucleasas para que rompan el gen en esa zona y también el gen
diana (acción exonucleasa).

TRANSPOSICIÓN CONSERVATIVA/DIRECTA/SIMPLE (CORTA Y PEGA)

Es una transposición directa (simple): el elemento se desplaza de un sitio a otro, es decir, el ADN huésped
recibe el transposón, y la región donante se queda sin él (el transposón salta de un sitio a otro).

61
Salta desde un sitio en el ADN a otro sitio distinto. Es un
mecanismo de cortar y pegar, requiere de una serie de cortes en
la zona dónde están las zonas invertidas del transposón, en esos
extremos de ambas cadenas en la zona verde. En la
transposición directa o simple el transposón es escindido por
cortes en ambos extremos para permitir el movimiento hasta
una nueva localización. Es el gen de la transposasa el que le
permite saltar de un sitio a otro y se une mediante un enlace
fosfodiéster.

Este proceso deja una rotura de cadena doble en el ADN dador,

que debe ser reparada. En el sitio diana se produce un corte, el
transposón es insertado en la rotura y la replicación del ADN
llena el hueco para duplicar la secuencia del sitio diana.
Para que el transposón entre o salga debe reconocer un blanco,
las zonas son cercanas pero no existe una determinada zona.

TRANSPOSICIÓN REPLICATIVA (COPIA Y PEGA + RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA)

El transposón es copiado, se duplica mediante la replicación del mismo (uno se queda en el ADN donante
y otro se va al diana).
El ADN huésped recibe el transposón, pero la región donante lo tiene también. Es decir, una copia se
queda en el lugar de origen y la otra es desplazada.

COMPARACIÓN DE AMBOS TIPOS

La transposición replicativa, requiere la actividad resolvasa, que cataliza una recombinación entre dos
elementos, por lo que solo se da en los transposones de la clase II y III. En la transposición simple se
producen unos cortes y copia de bandas, y en la transposición replicativa, la resolvasa promueve la
recombinación homóloga.
La diferencia entre una y otra es que en la simple se localiza una secuencia diana y el transposón se inserta
directamente, mientras que en la replicativa el transposón se replica para después insertarse.

62
La zona morada sería el transposón y la parte amarilla la secuencia diana.
Gracias a la transposasa se permite el corte que facilita que el ADN quede
unido de una zona del ADN donante al ADN huésped o periférico. En la parte
izquierda, la transposición sencilla, se realizan una serie de cortes y la zona
amarilla queda a ambos extremos. Lo que se realiza es que gracias a una
ADN polimerasa y a una ligasa se produce una copia de la zona diana. La
zona donante queda sin ADN y sería letal ya que se ha quedado sin una parte
del gen. La zona roja representa lo que se ha sintetizado de novo.

En la transposición replicativa (derecha) se va a producir una inserción de

forma similar a la transposición directa pero se va a producir una síntesis
previa de ADN que permite que la resolvasa cree una recombinación
homóloga entre ambas zonas. Ese gen va a permitir la realización de una
recombinación homóloga. La zona morada es la zona del transposon, la
blanca es la zona de novo y roja es la zona que se ha creado de novo a partir
de la amarilla en el ADN diana debido a la inserción que se produce (zona de
síntesis de novo de duplicación del DNA donante ya que son zonas de la
doble cadena que han quedado incompletas en una hebra), la blanca es la
zona que se ha sintetizado de novo y observamos que se ha producido una
recombinación homóloga tanto en la zona huésped como en la zona
donante. Al producirse la replicación homóloga se produce un heteroduplex
recombinante.
En la simple desaparece el transposón del donante y va todo al huésped
mientras que en la replicativa primero se realiza una síntesis de DNA que
queda copiada para luego saltar.

Genes resolvasa: “resolver/resolución en la recombinación homóloga” (en clase II y III) Se va a producir

una resolución y una síntesis de DNA.

EFECTOS DE LOS TRANSPOSONES DEPENDIENDO DE SU LOCALIZACIÓN FINAL

Que efectos va a producir el transposón (recombinación que va a producir variación)

Las diferentes situaciones son las siguientes:
1. Cuando el transposón se integra en una región del gen x (y se mete dentro de un exón): puede
provocar que una proteína no sea funcional debido a que el exón es totalmente diferente con el
transposón. El transposón hace que no se pueda expresar el gen x con normalidad.
2. Cuando se inserta al principio (en el promotor, zona dónde inicia transcripción, permite la
expresión del gen): hace que la transcripción se produzca en más células de las que se producía
al principio (sin él) porque no afecta la estructura del gen por tanto de la proteína pero sí en la
secuencia promotora. De esta forma los exones no se ven alterados, solo se ve modificada la
zona inicial y repercute en que se pueda iniciar la transcripción en otras células. Si por ejemplo
se expresa en tejido adiposo, lo que puede permitir este elemento transponible es que este gen
además de expresarse en este tejido puede expresarse también en el hígado.
3. Cuando se inserta alejado completamente de la zona del gen x, no tiene ningún efecto sobre la
expresión de ese gen y posterior proteina. El gen se expresará normal.
El hecho de que el elemento transponible salte a una u otra zona se va a producir de forma independiente,
simplemente de que salte a una u otra zona pero no está regulado por nada.

63
IMAGEN: zona inicial del gen es la promotora (5´); una zona de intrones (rayas negras) y exones
(rectángulos verdes) y luego una zona final del gen (3’). La flechita indica el inicio de la transcripción.

Un transposón puede pasar de un sitio a otro del genoma produciendo dos secuencias homólogas.
Se producen sitios de recombinación y dependiendo de la orientación, la recombinación homóloga entre
ellas puede tener efecto diferente, puede dar lugar a inversión o delección (se añade complejidad).

Dentro de los transposones hay genes que pueden encontrarse en direcciones distintas por lo que para
que haya recombinación se deberán alinear las secuencias. Cuando los elementos de recombinación
están en direcciones opuestas necesitamos que se forme un lazo.
En la cara del transposón se produce un lazo para que se apareen las zonas homólogas y se recombinen.
Esto produce una inversión. Para alinearse, además del lazo del transposón, se produce otro lazo en uno
de los lados y esto provoca que se apareen los homólogos. Si los homólogos están en direcciones opuestas
se produce un loop, (imagen de la izq). Como consecuencia de la resolución de este tipo de
recombinación, en el interior de esa zona se va a producir una inversión.
En el caso de la derecha, los segmentos abc (las secuencias homólogas: tienen que alinearse, estar en
forma paralela para que se pueda producir la recombinación) se encuentran en la misma dirección y para
que se pueda producir una recombinación necesitamos loop + giro; así conseguimos que las 2 secuencias
estén alineadas y en la misma dirección. La resolución de este caso tiene como consecuencia un corte que
producirá la deleción de toda la parte interna entre las 2 secuencias homólogas.

64
RESUMEN
La transposición implica el intercambio de DNA y su recombinación, se produce reordenamientos en el
DNA:
• Inversión: apareamiento por curvatura y entrecruzamiento entre tos transponibles en
direcciones opuestas.
• Delección: apareamiento por formación de bucles y entrecruzamiento entre los dos elementos
transponibles en la misma dirección. Nos conseguimos deshacer de una parte de ADN, es la
finalidad de la transposición.
Finalidad: con ambas conseguimos introducir variación en el ADN.

TRANSPOSICIÓN EN EUCARIOTAS

Aunque hay semejanzas entre los mecanismos de transposición de eucariotas y procariotas, también hay
diferencias notables:
• La integración y la escisión son procesos diferenciados en eucariotas y se pueden aislar
transposones de forma libre.
• Frecuentemente, la replicación del ADN se da con la síntesis de un ARN intermediario
(retrotransposones)

Los transposones de eucariotas presentan semejanzas con los retrovirus (secuencias muy similares a los
del retrovirus) → retrotransposon.

RETROTRANSPOSONES

Hay que recordar que con los retrovirus se obtenía una copia del ADN del virus.
Extremos con zonas invertidas que se denominan LTR-R (repetición terminal larga derecha) y LTR-L
izquierda, entre estas dos zonas hay una secuencia central. Son transposones muy complejos de hasta
miles de pares de bases. IR son
las siglas de repeticiones
inversas.

RSV es el retrovirus del

sarcoma de rous y el MoMLV el
de la leucemia. Es una
comparación de secuencias del
retrovirus con los elementos
transponibles en eucariotas.

65
El ADN del elemento móvil (transposón) se transcribe para dar ARN. A partir de él por la retrotranscripción
inversa vamos a obtener el cADN (ADN complementario) complementario, que es el que se integra en el
genoma (muy similar a lo que ocurre en los retrovirus). Mantenemos el ADN en el donante mantiene el
lo tenemos también en el receptor.

Hay retrotransposones que carecen de las repeticiones terminales largas (LTR), así que no se pueden
retrotranscribir como los retrovirus. Estos son los LINE que tienen truncado el extremo 5’, que suelen
tener un tamaño (1-7 Kb).

Importancia de los retrotransposones: es una forma de en los organismos eucariotas. Son zonas muy
grandes entonces pueden saltar (estamos hablando de zonas con miles de pares de bases en las regiones
de repetición terminal larga añadido a las zonas centrales) de una región muy grande de ADN a otra. Va a
introducir una variabilidad muy grande (desplaza una gran cantidad de genes de la región central).

66
TEMA 5: TRANSCRIPCIÓN

La transcripción es el proceso por el cual se sintetiza ARN a partir de ADN como molde. Así la información
genética almacenada en el DNA se transfiere al RNA y se hace disponible para la síntesis de proteínas. La
síntesis de RNA se realiza en sentido 5’ à 3’. En el dibujo la bolita naranja es la RNA polimerasa que va
añadiendo nucleótidos de forma paralela a la cadena template/molde. Con el tránscrito de ARN se
realizará la síntesis de proteinas.

El ADN tiene dos cadenas, pero solo una es la que el ARN utiliza. La hebra de ADN que sirve como molde
durante la transcripción es la hebra no codificante o hebra antisentido, ya que su secuencia es
complementaria a la del ARN. La otra hebra de ADN tiene la misma secuencia que la del ARN transcrito
(excepto el cambio de U por T) y es la hebra codificante o cadena sentido.
IMP: saber cuál sería un ARN a partir de la cadena codificante de ADN.

Denominamos posición +1 al inicio de la transcripción (el primer nucleótido que va a codificar para la
proteína y por ello se le denomina el inicio de la transcripción), y a partir de ahí avanzaremos a +2,+3... Es
lo que se denomina downstream (va en dirección 3’). Si hablamos de posiciones -1, -2… nos estaremos
refiriendo a upstream (va en dirección 5’).
Todo lo que hay a la derecha de la posición +1 se denomina downstream o corriente abajo y lo que queda
a la izquierda se denomina upstream o corriente arriba. Todo es una unidad transcripcional, formado por:
• Zona inicial promotora: se le une la ARN polimerasa para poder sintetizar el ARN.
• Zona codificante: empieza en la zona +1, se usa como molde para la síntesis del ARN.
• Zona terminadora es la zona transcripcional e indica que tiene que terminar el transcrito de ARN.
A lo largo de toda la secuencias tenemos varias zonas transcripcionales e incluso pueden estar en
dirección contraria.

67
Unidad transcripcional (gen): zona promotora + zona codificante + zona terminadora. A lo largo de una
secuencia puede haber distintas unidades transcripcionales que pueden estar en distintas direcciones.

DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR

Cada gen codifica para una proteína. El ADN porta los genes (la
información genética), están colocados espaciadamente, y
cuando la célula indique, ADN se abrirá y el gen será transcrito
a un ARNm (copia de RNA de un gen), el cual saldrá del núcleo
al citoplasma para ser traducido a proteína por un ribosoma.
Un gen codifica para una proteína (cada triplete → 1 codón).
Cada triplete, codón, codifica para un aminoácido à Los genes
codifican para proteínas.

En el caso de los retrovirus y retrotransposones se observa la

transcripción en reverso.

SÍNTESIS DE ARN

La síntesis de ARN tiene tres etapas: iniciación, elongación y terminación.

La bioquímica del proceso de síntesis es muy similar entre eucariotas y procariotas. Siempre sintetizan en
dirección 5’ → 3’ utilizando ADN como molde (la cadena no codificante), aunque la regulación del proceso
es más compleja, o por lo menos distinta en procariotas que en eucariotas.

La síntesis del ARN está catalizada por las ARN polimerasas. Hay varias, tanto en eucariotas como en
procariotas y son diferentes en procariotas que en eucariotas. Las ARN polimerasas de eucariotas y
procariotas guardan similitud estructural, pese a las diferencias de tamaño y de número de subunidades.

68
ARN POLIMERASAS (ENZIMAS IMPLICADAS)

Se unen a lugares concretos de iniciación, no se unen a cualquier sitio del ADN y estos sitios vienen
determinados por las secuencias promotoras.

Desenrollan un tramo de DNA, rompiendo los enlaces de hidrógeno, dejando un espacio entre las dos
cadenas y polimerizan el RNA en dirección 5’ à 3’ utilizando una hebra de ADN (leen en dirección 3’ →
5’). Además detectan señales de terminación para poder terminar la transcripción.
Sobre todo en eucariotas, las ARN polimerasas interaccionan con proteínas que regulan el proceso de
transcripción (factores de transcripción o elementos en trans).

La RNA polimerasa, a diferencia de la ADN polimerasa, no

tiene actividad exonucleasa, no tiene capacidad para
corregir errores por lo que va a cometer 10 veces más errores
La RNA polimerasa cataliza la formación de un enlace
fosfodiéster. La reacción está impulsada por liberación y
posterior hidrólisis del pirofosfato y la base añadida siempre
va a ser complementaria a la base leída en la cadena molde
de ADN.

SUBUNIDADES EN E.COLI

• α (alfa): formada por 2 unidades. Es esencial para el ensamblaje y la activación de la enzima por
distintas proteínas reguladoras.
• β (beta): contiene parte del centro activo de la ARN polimerasa se encarga de unir NTPs e
interacciona con sigma.
• β’: participa en la unión del DNA. Tiene que identificar una zona de iniciación y unirse, por lo que
participa en la unión directa
• σ (sigma): está implicada en el inicio de la transcripción, es la que reconoce las secuencias
promotoras de DNA. Hace función de radar. Lee la cadena del DNA para determinar donde va a
iniciar la transcripción determinada enzima. Sin el factor sigma la transcripción no puede
empezar porque es el que detecta la región de ADN a la que tiene que unirse y a partir de la cual
va a comenzar la transcripción.
• ω (omega): tiene función de estabilización de todo el complejo de la holoenzima. Fue descubierta
más recientemente.

SECUENCIAS PROMOTORAS

Las secuencias promotoras son secuencias de ADN a las que se une la ARN polimerasa para iniciar la
transcripción. La ARN polimerasa va recorriendo la cadena de ADN hasta encontrar la zona promotora.
Son secuencias localizadas upstream.

Las regiones upstream suelen tener secuencias consenso que son comunes y se mantienen igual en las
diferentes zonas promotoras en las diferentes unidades transcripcionales. Estas secuencias consenso
tienen nombres específicos. Son secuencias de unos 40 pb que se localizan en los extremos 5’ de los
genes:

69
 • El primer elemento que se transcribe (designado por +1) suele ser una purina (P).
• En la región consenso -10/ Caja Pribnow: respecto al origen, la mayoría de los genes contienen
una secuencia consenso de TATAAT, que se denomina TATA Box/caja TATA.
• En la región consenso -35: la mayoría de los genes tienen una secuencia consenso muy parecida
a “TTGACA” (puede estar partida la secuencia) .
Las regiones -10 y -35: están separadas por 17±1 pb. Ambas forman las secuencias promotoras de los
genes en organismos procariotas.

La transcripción se inicia en las secuencias promotoras que es la zona donde se une la ARN polimerasa y
escanea e identifica las regiones -35 y -10. A partir de ese momento comienza la síntesis.

COMPARACIÓN DE PROMOTORES PROCARIOTAS Y EUCARIOTAS

En el caso de eucariotas es similar pero la secuencia TATA no se localiza en una sección -10 sino en una
región -25 y se denomina Hogness. La región -35 no existe en eucariotas y en su lugar encontramos la
secuencia CAAT en posición -75.

En la foto se aprecia una ARN polimerasa, en cuyo centro

activo se unen los nucleótidos. La ARN polimerasa se va a unir
a la zona promotora que se encuentra superenrrollada. Para
que se pueda internalizar la ARN polimerasa es necesario la
rotura de los puentes de hidrógeno entre bases

70
PROCESO DE TRANSCRIPCIÓN EN PROCARIOTAS

1 Y 2. UNIÓN, INICIACIÓN Y ELONGACIÓN

La transcripción se inicia en las secuencias promotoras atendiendo a ciertas señales. En la región 5’ hay
secuencias que indican dónde se inicia la transcripción. Hay secuencias que son reconocidas por proteínas
que forman el complejo de transcripción.
Primero hay que liberar las tensiones, porque el DNA se encuentra superenrollado. Al desenrollarlo, la
RNA polimerasa se introduce y a medida que va pasando, el DNA se vuelve a enrollar.

Proceso:
1. Unión inespecífica: la ARN polimerasa encuentra a los promotores mediante un proceso de
búsqueda en el que la holoenzima se une de manera inespecífica al ADN, con una baja afinidad
y luego se desplaza al o largo del ADN hasta llegar a una secuencia promotora, donde se une con
una afinidad mucho mayor.
2. Formación del complejo promotor cerrado: Las secuencias promotoras son reconocidas por la
subunidad sigma. El encuentro inicial entre la ARN polimerasa y un promotor genera un complejo
promotor cerrado (ADN no desenrollado).
3. Formación del complejo promotor abierto: A continuación, la ARN polimerasa desenrolla unas
12 pb del DNA (burbuja de transcripción) y forma el complejo promotor abierto (cuando ya se
han roto los puentes de hidrógeno).
La RNA polimerasa es capaz de iniciar la síntesis de novo (sin cebador como lo requería la DNA
polimerasa. La DNA pol necesitaba un extremo OH libre en el extremo 3’.
4. Iniciación de la síntesis de mRNA: igual que la de DNA, se desarrolla en la dirección 5’→3’, por
eso en el extremo 5’ de la cadena de ARN hay un grupo trifosfato. El primer nucleótido suele ser
A o G (purina).
5. Elongación de RNAm: se sintetizan 10 nucleótidos hasta que se disocia (libera) la subunidad
sigma.
6. Liberación de sigma y la cadena recién sintetizada: el complejo de transcripción se aleja del
promotor desplazándose a lo largo del ADN molde.

71
SUPERENRROLLAMIENTO DEL ADN DURANTE LA TRANSCRIPCIÓN

Los giros helicoidales del DNA son empujados hacia delante de la

burbuja de transcripción que va avanzando, por lo que se enrollan
más apretados (superenrollamiento positivo). Mientras que el DNA
que está detrás de la burbuja, se desenrolla de forma equivalente
(superenrollamiento negativo).

Para poder llevar a cabo la elongación y síntesis de ARN, las enzimas topoisomerasas nos desenrollan la
hebra de ADN. En eucariotas, el ADN está asociado a histonas y ha de ser desempaquetado para poder
ser transcrito. Las topoisomerasas van por delante y por detrás de la ARN polimerasa y, son necesarias
para eliminar los superenrollamientos positivos y negativos.

3. TERMINACIÓN

La ARN polimerasa no necesita cebador, es capaz de iniciar la síntesis de novo (la ADN polimerasa no).
La síntesis de ARN se produce en dirección 5’ à 3’, al igual que la de ADN. Por eso en el extremo 5’ de la
cadena de ARN hay un grupo trifosfato. El primer nucleótido suele ser A o G.
Tras alcanzar una longitud de unos 10 nucleótidos, la subunidad sigma se disocia (se libera) y el complejo
de transcripción se aleja del promotor, desplazándose a lo largo del ADN molde.

Hay dos maneras de terminar el proceso:

• Terminación dependiente de Rho (proteína que actúa como factor de terminación), un
hexámero de subunidades idénticas. Es una helicasa dependiente de ATP que se mueve a lo
largo del transcrito de ARN, hasta que encuentra la burbuja de transcripción y cataliza el
desenrollamiento de la doble hélice ADN-ARN, liberando así la cadena de ARN.

72
 • Terminación independiente de Rho (señales de terminación de la transcripción): la ARN
polimerasa avanza hasta que aparezca rho o hasta que encuentre una serie de secuencias. Son
secuencias repetidas e invertidas, lo que va a determinar la terminación de la transcripción. Son
ricas en C, G, A y T (estas dos últimas en la última zona). Lo que van a permitir es que durante la
transcripción, el ARN produzca una especie de bucle porque al ser zonas con repeticiones
invertidas serán complementarias y se van a producir uniones que darán lugar a ese
bucle/terminación. Es decir, se aparean por similitud (complementariedad), formando bucles, y
esto indica el final de la transcripción. Esto propicia que el ARN se separe del ADN y se termine
la transcripción.

En algunos genes bacterianos, la terminación de la transcripción requiere la presencia de rho. En las

bacterias la terminación es independiente de rho y es un proceso de múltiples pasos.

ANTIBIÓTICOS QUE INTERFIEREN EN EL PROCESO DE TRANSCRIPCIÓN

Hay antibióticos que inhiben el proceso de transcripción; algunos lo hacen con los procesos (transcripción)
en procariotas de forma selectiva, lo que puede aprovecharse para tratar infecciones bacterianas como:
• Rifampicina: inhibe la etapa de iniciación, al inhibir la formación de los enlaces fosfodiéster en
procariotas (inhibe la ARN Polimerasa). Este se podría utilizar como antibiótico para infecciones
bacterianas ya que solo afecta a la formación de dicho enlace en procariotas.
• Actinomicina D: se une al ADN de doble hélice e impide que sea molde para la síntesis de ARN.
Es específico de la unión con ADN por lo que si este no puede servir como molde pues no va a
haber síntesis. A bajas concentraciones es capaz de inhibir sólo la transcripción, sin afectar a la
replicación, y actúa tanto en eucariotas como en procariotas.
Sin embargo hay otras sustancias que no se usan como antibióticos en sí pero que también van a inhibir
el proceso de transcripción, es el caso de la amanita phalloides (oronja mortal).

En procariotas, los precursores del tARN y

rARN experimentan fragmentación y
modificaciones químicas. El transcrito primario
contiene la secuencia de más de un tARN y
rARN. En E. Coli se obtienen 3 rARN y un tARN
de un mismo transcrito.

Otro tipo de modificación consiste en la

adición de nucleótidos en los extremos de los
ARN, como es el caso de los tARN a los que se
añade CCA en los extremos 3’: unión del
aminoácido al tARN.

73
En procariotas, el transcrito primario sirve de mARN y es utilizado inmediatamente como molde para la
síntesis de proteínas. No hay proceso de maduración del ARN en procariotas.
En eucariotas, los precursores de mARN maduran en el núcleo, donde experimentan diversos cortes y
empalmes (splicing) antes de ser transportados al citoplasma para que se traduzcan en proteínas. Se
realiza la síntesis de un transcrito primario de RNA ya que luego va a madurar para poder salir hacia el
citoplasma.

REGULACIÓN DE LA TRANSCRIPCIÓN EN PROCARIOTAS. OPERONES

Esto no ocurre en eucariotas porque nosotros tenemos una unidad genética para ese gen en concreto
pero los procariotas tienen todos los genes metidos en el mismo sitio por lo que los activan y desactivan
según las conveniencias del organismo.

La mayoría de los genes que codifican proteínas (genes estructurales) en eucariotas se transcriben de
forma individual, en los organismos procariotas aparecen varios genes. Sin embargo, en procariotas, los
genes están con frecuencia en tándem a lo largo de una hebra simple, por lo que pueden transcribirse
juntos. Estas unidades genéticas se llaman operones y contienen genes con funciones relacionadas.

Un operón se transcribe como una unidad única, que da lugar a un mARN policistrónico (el cistrón es el
sinónimo antiguo de gen; por tanto es muchos genes). Por el contrario, los genes estructurales eucariotas,
que no son parte de operones, dan lugar a los mARN monocistrónicos (hay solo un ARN mensajero que
se corresponde con un gen).

OPERÓN LACTOSA

Este es el ejemplo más sencillo que existe para explicar cómo se controlan los procesos de transcripción.
El operón lactosa se encuentra en bacterias, y es el encargado de regular la supervivencia del organismo
gracias a la metabolización de la lactosa.

Vamos a estudiar el comportamiento del operón en las dos situaciones posibles:

74
 • Si hay lactosa (inductor): se activa el gen correspondiente que comienza a sintetizar toda la
maquinaria necesaria para procesar la lactosa. Entre otras moléculas, sintetiza E Galactosidasa,
enzima encargada de romper la lactosa.
• Si no hay lactosa: actúan los represores, que son proteínas que se activan cuando no hay
inductor.

CON INDUCTOR (LACTOSA)

Si hay inductor (lactosa presente), éste se encarga de

separar a la proteína represora de la región de DNA
donde se encuentra el gen encargado de sintetizar la
maquinaria necesaria para el metabolismo de
lactosa. La lactosa se une a la zona de control y la
libera permitiendo que puedan transmitirse los
siguientes genes y a las enzimas correspondientes
para el metabolismo de la lactosa. De esta forma, la
polimerasa puede unirse a este gen y comenzar la
transcripción del mARN que se encargará de
codificar las proteínas correspondientes
(galactosidasa, permeasa y transacetilasa) para que
se sintetice la maquinaria correspondiente y se
degrade la lactosa.

SIN INDUCTOR

Por el contrario, si el organismo carece de inductor,

se va a activar la proteína represora
correspondiente, que se va a unir a la región de DNA
encargada de la síntesis de los metabolitos de la
lactosa (al promotor). De esta forma, la polimerasa
no se puede unir a este gen y no puede sintetizar
toda la maquinaria. Es lógico, ya que para qué va a
desperdiciar energía sintetizando aquello que no va
a utilizar, al no tener sustrato al que degradar.

75
TRANSCRIPCIÓN EN EUCARIOTAS

La bioquímica de la transcripción en eucariotas es similar a la que ocurre en procariotas: la síntesis ocurre

en dirección 5’ à 3’, se puede sintetizar de novo pero utilizando DNA como molde y sin requerimiento
de cebador. Sin embargo, existen tres tipos de ARN polimerasas (no como en procariotas que solo hay
una).

El proceso está regulado de forma distinta (elementos de respuesta, enhancers o potenciadores y

silencers o silenciadores modulan la transcripción). Los productos de transcripción de las polimerasas en
eucariotas sufren procesos de maduración o procesamiento en el ARNm, además, en ocasiones existe un
proceso de edición del ARN.

ARNS Y ARN POLIMERASAS EN EUCARIOTAS

Hay varios tipos de ARN en eucariotas:

• Ribosomal (r): 80% del total. Tipos: 28S, 18S, 5´8S y 5S
• Mensajero (m): 5% del total.
• Transferente (t): 15% del total.
• Pequeño nucleolar (snRNA): se encuentran en los spliceosomas, que son los complejos que
eliminan intrones y regulan la expresión génica.

También hay varios tipos de ARN polimerasas en eucariotas, y cada una tiene un promotor distinto. Se
clasifican en función de la sensibilidad a la amantina (toxina que inhibe la acción de las polimerasas) y por
el tipo de ARN que sintetizan. Las ARN polimerasas son las siguientes:
• ARN polimerasa I: es insensible a la alfa-amantina (que se encarga de la inhibición de la
transcripción) por ello, la ARN polimerasa se encarga por lo tanto de la transcripción de los rARN
(28S, 18S y 5’8S) y se localiza en el nucleolo. Tenemos elementos promotores upstream y
elementos downstream. La secuencia tipo TATA es el elemento iniciador ribosómico.

76
 • ARN polimerasa II: es sensible a la alfa-Amanitina a bajas concentraciones, se encarga de los
mARN y se localiza en el nucleoplasma. Tenemos a una distancia lejana al inicio de la
transcripción unos elementos enhancer o intensificadores, que son secuencias que participan en
la regulación de la transcripción, son elementos reguladores de la unión de la ARN polimerasa a
la zona promotora = promotores reguladores (enhancers). Separado por muchas pares de bases
tenemos el promotor. Puede existir la TATA Box y otros elementos downstream en el promotor
(DPE).
La tata box en eucariotas está en posición -25, en procariotas está en -10. A cierta distancia del
inicio vamos a encontrar enhancer (intensificadores) su función es regular la unión de la ARN
polimerasa a la zona promotora, van a favorecer la unión. También hay elementos posteriores al
inicio son los DPE.

• ARN polimerasa III: es sensible a la alfa-Amanitina a altas concentraciones, se encuentra en el

nucleoplasma y hay dos tipos diferenciados. La tipo I se encarga del rARN (5s). Tenemos
elementos promotores downstream, el bloque A y el bloque C. La tipo II se encarga del tARN.
Tenemos elementos promotores downstream, el bloque A y el bloque B.
La flecha indica la posición +1, el lugar donde se inicia la transcripción. La secuencia promotora
está dentro de la secuencia codificante (transcrita).

• ARN tipo IV: los productos van a ser algunos siRNA (pequeños RNAs de interferencia) de
vegetales

Existen diferencias entre un promotor y un enhancer. Los promotores son aquellos segmentos de ADN
que son transcripcionalmente activos y que inician el proceso por lo tanto se encuentran en el lugar de
retranscripcion. Por el contrario, los enhancers se encuentran alejados del lugar de replicación y su
función es acelerar el proceso cuando reaccionan con un factor de transcripción.

77
PROCESO DE TRANSCRIPCIÓN EN EUCARIOTAS

Para que la ARN polimerasa pueda entrar el ADN en esas zonas promotora tiene que abrirse la cromatina
para liberar el ADN y luego abrirse por la zona que hay histonas. Se requieren por tanto una serie de
factores de transcripción que pertenecen a la maquinaria basal.

Abrir la cromatina donde van a actuar diferentes factores como SWI/SNF que son remodeladores de la
cromatina dependientes de ATP en levaduras o HAT (acetiltransferasas de Histonas) y que van a unirse a
la zona promotora y harán que la cromatina se abra.

COMPLEJO DE TRANSCRIPCIÓN EN EUCARIOTAS

Para que empiece la transcripción, para que la ARN polimerasa empiece va a haber factores de
transcripción que van a hacer que la ARN polimerasa se una a zona promotora. Los factores pueden ser:
• Componentes basales: pertenecen a la maquinaria basal, unen la polimerasa, como el TBP
(TFIID): proteína de unión a caja TATA; TF2A, B, E, G, F, H.
El TBP es muy importante. Es una proteína perteneciente al TFIID de unión a caja TATA (secuencia
en el ADN que va a pertenecer a la zona promotora de los genes en todos los organismos) En
procariotas se la caja TATA se encontraba en -10 y en eucariotas en -25, el resto de la cadena
contigua es la zona -75 y se encuentra la secuencia CAAT.
• Coactivadores: favorecen que se produzca el inicio de la transcripción y son los TAFs. Regulan la
acción de la ARN polimerasa.
• Activadores: son factores de transcripción que favorecen que esta ARN polimerasa pueda
transcribir al unirse a toda la maquinaria y son el SP1, ATF, CTF, AP1.

Resumen: en esta primera etapa vamos a tener una serie de factores que van a permitir que la ADN se
abra y producir una serie de factores que van a permitir la unión de la ARN polimerasa a esa zona y
posteriormente a otra serie de factores que van a participar transcripcionalmente.

DESPLAZAMIENTO DE NUCLEOSOMAS

El ADN se encuentra enrollado en las histonas formando los

nucleosomas. En el momento en el que la ARN polimerasa se une,
esas estructuras se tienen que deshacer. A medida que la ARN
polimerasa va a avanzando, el nucleosoma se va desenrollando, y
una vez pasa la ARN polimerasa, el ADN se vuelve a enrollar en los
nucleosomas; pero por impedimento, este nuevo nucleosoma no se
forma en el mismo sitio, sino un poco más atrasado. Es lo que se llama
desplazamiento de los nucleosomas.

78
INCIACIÓN DE LA TRANSCRIPCIÓN DE ARNM

La ARN polimerasa II reconoce una secuencia promotora (en eucariotas, la TATA box). Para que la
encuentre, se tiene que producir la unión de unas proteínas o cofactores:
1. Lo primero que se va a unir es la TBP, (proteína que
forma parte del factor de transcripción 2D) para que
luego la ARN polimeasa se una a la TATA.
2. Cuando ya tenemos el TFIID (proteína TBP) unido a la
TATA box, se van a unir el factor A y B, necesarios para
que la polimerasa se pueda unir.
3. Se unen los factores F, E y H y una vez unidos la ARN
polimerasa II ya puede unirse, si faltase alguno de
ellos no se podría unir y no se podría producir la
transcripción.
Este último, el H, el que va a producir la apertura de
la hélice, ya que tiene actividad helicasa. Cuando
tenemos todos estos factores, la ARN polimerasa II se
puede unir a la cadena.

Una vez abiertas las dos cadenas, el factor H (abre la doble hélice) y produce una fosforilación del carboxilo
terminal de la ARN polimerasa II, se liberan el factor TF2B, TF2E y TF2H, y la ARN polimerasa II ya puede
avanzar a lo largo de la cadena de ADN y comenzar la transcripción.

Hay elementos en cis y elementos en trans:

• Los elementos en cis de respuesta: son secuencias de la propia cadena de ADN (TATA, CAAT y
GC box) a los cuales se van a unir los factores de transcripción (proteínas).
• Los elementos en trans: son las proteínas o factores de transcripción que se unen a
estas secuencias del ADN (octámero IG, AP1...), regulando el proceso. En unos casos tendremos
la activación de la transcripción y en otros se produce la inhibición. Por ejemplo: el gen de la
metalotioneina, contiene la caja TATA, tenemos los distintos elementos respuesta a los cuales se
van a unir las respectivas proteínas.

79
Los arriba mencionados son los factores basales, y todos tienen que participar; si no,
no se produce la transcripción:
• TFIID: 2 subunidades que se unen a la TATA Box.
• TFIIB: 1 proteína que media interacción entre TFIID y ARN polimerasa.
• TFIIF: 4 proteínas que estabilizan el complejo ADN-TBP-B.
• TFIIE: 4 proteínas que regulan a TFIIH y en conjunto promueven la adición
del primer nucleótido del ARN.
• TFIIH: 9 subunidades y tiene actividad helicasa (abrir la cadena ADN) y
reparación del ADN.

La ARN polimerasa (12 subunidades) requiere estos factores para posicionar

correctamente la enzima y para regular su actividad.

Una vez acoplados todos los factores y la polimerasa en presencia de ATP, la enzima
se fosforila en el dominio CDT y empieza la transcripción. Los enhacer van a regular
la transcripción, y los correpresores provocan que no se produzca la misma. Todos
estos elementos son upstream, junto con los factores de transcripción.

Aquí podemos ver que se va a iniciar el proceso de transcripción, ya que la secuencia TATA está activa y
el enhancer también. El enhancer ha recibido el factor de transcripción correspondiente en este proceso
y la ARN polimerasa realiza la síntesis (no todos los genes tienen estos activadores).

Aquí vemos cómo actúan varios elementos de regulación (secuencias, proteínas...), que pueden acelerar
(enhancers) o ralentizar el proceso de transcripción (inhiben). Pueden ser represores inhibiendo la
transcripción. Dependiendo de que existan unos u otros vamos a encontrar una clase de regulación
dependiendo de lo que se requiera en ese momento (si necesitamos glucosa- enhancers, pero si estamos
en un estado de diabetes y no queremos más glucosa actuarán los represores para que se inhiba la
transcripción de la glucosa).

80
TERMINACIÓN DE LA TRANSCRIPCIÓN DEL ARNM EN EUCARIOTAS

La terminación de la transcripción por la RNA polimerasa II requiere la exonucleasa Rat1. La escisión del
pre-mRNA (inmaduro) produce un extremo 5’ al que se une Rat1. Rat1 degrada la molécula de RNA en
dirección 5’→3’. Cuando Rat1 alcanza a la doble hélice de RNA y DNA en la burbuja de replicación acaba
con la degradación, se libera Rat1 y también el mRNA. (termina la transcripción en eucariotas)

TRANSCRITOS EN PROCARIOTAS Y EUCARIOTAS

Procariotas: tienen zona promotora, codificante y terminadora. En procariotas el mARN resultante de la

transcripción, ya está listo para ser traducido (aquí no hay maduración).

Eucariotas: en eucariotas, tenemos una zona promotora igual que en procariotas pero el mARN no está
listo para la traducción (pre-mARN, inmaduro), tiene que sufrir un procesamiento, una serie de
modificaciones. Entre éstas, están el capping (adición de la caperuza en el extremo 5’ y metilación), la
poliadenilación (adición de la cola poli A en el 3’) y la eliminación de los intrones (splicing) en la región
codificante. Con esto ya tendríamos el mARN maduro, que será el que se use en la traducción.

81
MODIFICACIONES POSTRANSCRIPCIONALES (MADURACIÓN DEL ARN) EUCARIOTAS

Hay modificaciones post-transcripcionales en cualquiera de los productos de las 3 polimerasas

eucarióticas, aunque se suele ver más el del mARN.
A partir del ADN de iniciación se observan exones e intrones. Hay una sección que no es codificante pero
que es necesaria para que se produzca el procesamiento.

La secuencia consenso es una zona que va a ser identificada por enzimas que van a realizar un corte en el
extremo 3’. En el extremo 5’ la modificación que tenemos es el capping (adición del cap o casquete) y en
el extremo 3’ se eliminará una zona para luego añadir al sitio de escisión la cola de poliA.
Luego se produce el splicing (corte y empalme) que elimina los intrones (que son secuencias no
codificantes). Ya maduro sería con la caperuza, la cola poli A y los exones quedando ya solo la región
codificante de la proteína.

82
1. CAPPING: ADICIÓN DEL CAP

El extremo 5’ sufre una hidrólisis de un grupo fosfato (de los 3 que tenía
el 1er nucleótido), y el grupo difosfato que queda, ataca al fósforo alfa
del GTP, formando un enlace 5’ - 5’ fosfodiéster. Esto ocurre mediante
la guaninil transferasa. Así queda unido un nucleótido de guanidina.

Queda unida una guanina en el extremo 5’ del transcrito, a la cual se

añade un grupo metilo en posición del átomo N7 (en la posición 7 de
esa guanina). Es decir, el átomo de N-7 de la guanina terminal es
metilado, utilizando S-adenosil metionina (produce la primera
metilación de la guanosina del nucleótido adicionado gracias a la
guanosil transferasa). Luego se producirán metilaciones en el 2º y el
resto de los nucleótidos (tanto en las ribosas como en las bases
nitrogenadas).

2. POLIADENILACIÓN

Se añade una cola de poli A en el extremo 3’ que confiere estabilidad y facilita la unión al ribosoma. Va a
ser cuando termine la transcripción.
Tenemos una secuencia consenso (AAUAAA) que permite un corte en el extremo 3´ downstream (por
detrás de la secuencia consenso, unos 10-30 nucleótidos por detrás) y permite la adición de la cola poli A
(200) por la poliA polimerasa. Se produce en presencia de ATP. En el pre-RNA está poliadenilado.

En la foto, en la primera línea

verde en el extremo 5’ ya no hay
cap, y en la tercer fila se observa
cómo se añade la cola poli A en
el extremo 3’ que permitirá la
unión al ribosoma.

83
3. SPLICING

Eliminación de los intrones.

Se hace una síntesis y procesado del hnARN (heterogeneous nuclear RNA). En este proceso son muy
importantes las secuencias de consenso, identifican las zonas donde se van a llevar a cabo los cortes, que
se van a localizar en los exones. Sitio de la ramificación en la zona central del intrón.

1. Viene definido por secuencias consenso que delimitan donde se van a producir esos cortes para
que puedan ser eliminados los intrones. Las secuencias consenso son AGGU y CAGG. El corte se
produce entre las guaninas.
2. Se produce un ataque nucleofílico al extremo 5’ del intrón (que es el 3’ del exón 1). De esta
forma queda libre un grupo -OH en posición 3’ del exón 1. Después, se produce un corte en el
extremo 3’ del intrón, que se une con el extremo 5’ del exón siguiente (2). El extremo 3’ del
intrón es el extremo 5’ del exón.
3. El proceso comienza con la ruptura del enlace fosfodiéster que conecta el exón 1 con el extremo
5’ del intrón(a). En esta reacción el grupo atacante es el OH en posición 2’ del centro de
ramificación. Es una reacción de transesterificación. Esto genera un intermedio en forma de lazo
“lariat” que es el intrón en sí. (que queda unido al exón 2)

El intrón sería los amarillo junto a lo rosa. Grupo

atacante en el dibujo es un grupo OH en la posición
2’, que ataca al extremo 5’ del exón, como
consecuencia se forma el lazo intermedio. El exón 1
queda libre y su grupo OH ataca al enlace
fosfodiéster que une el intrón con exón (segundo en
la foto).

4. Luego, el OH del extremo 3’ del exón 1 ataca el enlace fosfodiéster que une el exón 2 con el
intrón (b) y se libera el lazo. Es decir quedan unidos los exones 1 y 2 siendo digerido el intrón
(desaparece).

84
Todo este proceso está catalizado por los espliceosomas (contienen ribonucleoproteínas). Los centros
catalíticos de los spliceosomas (snurps= U (U1, U2, U4…)) son ribonucleoproteínas. Contienen snRNP
(small nuclear RNP que tienen menos de 300 nucleótidos) que presentan complementariedad de bases
en algunas regiones, y se aparean. También lo hacen con el mARN.

El U1 y U2 participan primero, el U1 se une al 5’ del intrón en la zona de la guanina y el U2 se une a la

adenina en la parte del branch (sitio de ramificación). Posteriormente, van a actuar U4, U5 y U6 que se
unen a todo el complejo y se forma el espliceosoma o empalmosoma que van a permitir que se produzcan
las transesterificaciones (los ataques nucleofílicos) y la formación del lazo (el lazo en realidad es el intrón
en sí).

Después, se separan U1 y U4 (1ª transesterificación gracias al ataque nucleofílico que se produce entre el
OH del sitio de ramificación que es la adenina en una posición intermedia). Una vez que se han producido
la primera y segunda transesterificación (conlleva la unión de los dos exones tras liberar al intrón que
estaba contenido en el lazo) tenemos los intrones eliminados del transcrito y los exones unidos.

Habrá tantos procesos de splicing como intrones haya.

85
ALTERACIONES EN EL PROCESO DE SPLICING

Las alteraciones en el procesamiento del mARN (mensajero ya maduro) de la cadena beta la hemoglobina,
producen talasemia que es una especie de anemia debido a que no se puede sintetizar bien la cadena
beta de hemoglobina y no se puede en consecuencia transportar el oxígeno.

Una mutación cambia una A por una G en el primer intrón del gen que codifica para la cadena beta de la
hemoglobina, y genera un centro de corte y empalme. Es decir, se convierte la secuencia en un nuevo
sitio de corte en la posición 5’ del intrón, por lo que se produce una proteína alterada, que debe
degradarse.
El STOP codon se encuentra en un intrón que es zona no codificante. En algunos casos se produce en ese
sitio una mutación entonces en ese caso la mutación lleva a un nuevo sitio 5´de corte, entonces el
mecanismo del splicing lo identifica como si dentro de un intrón hubiese dos intrones y da lugar a un
mRNA maduro anormal y se produce la talasemia y el ARN mal sintetizado no será funcional y será
degradado.

86
AUTOMADURACIÓN O AUTO-SPLICING

Además del splicing, hay algunos eucariotas que tienen otros procesos la auto maduración o auto splicing
es el autoprocesamiento de ARN como en el caso de la Tetrahymena. El ARN se corta y empalma por sí
mismo en presencia de un factor de guanosina. No hay spliceosomas, pero se necesita la presencia ese
cofactor de guanosina con grupo -OH para producir el primer ataque nucleofílico y luego el grupo -OH del
exón produce el 2º ataque.

En 1989 T. Cech fue galardonado, junto con Sidney Altman, con el Premio Nobel de Química por los
descubrimientos de los procesos químicos de propiedades catalizadoras del ácido ribonucleico.

En la foto se produce la liberación

del factor de guanina. El
autoprocesamiento también se ha
descrito en precursores del ARN
mensajero de las mitocondrias de
levaduras y en algunos
cloroplastos de organismos
unicelulares.

Existen varios tipos de autoprocesamientos, se dividen en:

• Intrones de tipo I: que requieren el cofactor de Guanosina para producir la eliminación del
intrón. Se da en genes nucleares, mitocondriales y cloroplásticos que codifican para ARNr, ARNt
y ARNm en hongos.
• Intrones de tipo II: en los que hay un -OH en posición 2’ de un adenilato específico del intrón. Se
da en transcritos primarios de ARNm mitocondrial o cloroplástico, en hongos, algas y plantas. En
vez de guanosina tenemos grupos OH del mismo intrón, adenina que va a producir el primer
ataque para luego formarse el lazo.
Los intrones del grupo I y II se pliegan en estructuras secundarias características.
• Hay un 4º grupo de intrones, que es del ARNt de las levaduras.
• Grupo III serían los intrones derivados del espliceosoma.

87
PROCESAMIENTO ALTERNATIVO (SPLICING ALTERNATIVO)

Posibilidad de no solo escindir los intrones si no también los exones, considerar un exón como si fuera un
intrón. Las células eucariontes tienen vías alternativas para el procesamiento del mARN:
1. Con corte y empalme alternativo, el pre-mARN puede ser cortado y empalmado de manera
diferente para producir distintos mARN.
2. Con múltiples sitios de escisión 3’ (del exón), hay dos o más sitios potenciales para la escisión y
la poliadenilación; la utilización de los diferentes sitios produce mARN de distintas longitudes.

Se puede dar un procesamiento alternativo de pre-RNA en eucariotas. Podemos tener un splicing selectivo
o alternativo, por ejemplo, si se une el exón 1 con el 3, o el 2 y 3 sin tener en consideración el 1. Es decir,
según los exones que se unan, se pueden producir genes diferentes, y por tanto, distintas proteínas.
En el caso de abajo se elimina el exón 2 que está entre medias del intrón 1 y 3.

Procesadores alternativos mecanismos: son cortes que se producen dentro de un mismo exón, al
producirse ese corte se obtiene un RNA más corto.

La técnica de splicing alternativo puede dar lugar a promotores alternativos (GK) dependiendo del tejido
en el que nos encontremos. Esto aumenta todavía más la versatilidad a la hora de obtener proteínas. Con
esto se puede explicar cómo nuestro organismo produce tanta cantidad de proteínas a partir de un
número limitado de genes.

La glucokinasa (proteína) en el hígado no contiene el exón 1B ni el 2A y se parte del 1L. Por otro lado, en
la célula pituitaria y en las células B se inicia la transcripción en el 1B pero no se tiene en cuenta el 1L ni el
2A.
Promotores/inicio de la transcripción: 1L células del hígado, 1B células de la pituitaria

Aquí abajo vemos otro ejemplo de procesamiento alternativo, lo que se denomina múltiples sitios de
corte en 3’. Dependiendo del tejido, el producto del mismo gen es la proteína relacionada con el gen de
la calcitonina (CGRP) o la calcitonina.

88
 En las células tiroides el sitio de corte sería el sitio
A rosa, ahí se añadiría la cola poliA. Mientras que
en el caso de las células neuronales el exón rosa
desaparecería y el sitio de corte sería el sitio A
azul.

CONCLUSIÓN: a partir de un mismo ARN se sintetizan proteínas distintas en función de los exones que se
eliminan, en función de cómo madure el ARN. De tal forma que obtenemos diferentes ARNm a partir de
un mismo Pre-ARN.

PROCESAMIENTO (MADURACIÓN) DEL ARNR EN EUCARIOTAS

ADNr: secuencias repetidas de ADN que contienen

el ADN que codifica para ARNr. Se encuentran en los
NOR (Regiones Organizadoras Nucleolares),
regiones que al desempaquetarse el cromosoma
después de la mitosis se encuentran asociadas a
nucleolos en formación.

Modificación de ARNr: primero se producen modificaciones químicas en el ARNr precursor (metilaciones,

puntos rojos) que van a ser puntos de información para que se produzcan los diferentes cortes, después
se produce el corte de los ARNr (cleavage). Todas las regiones que no codifican o que no son parte de los
ribosómicos son degradados.

Las regiones organizadoras nucleolares (NOR) se encuentran en los satélites de los pares de cromosomas
13, 14, 15, 21 y 22 que son acrocéntricos, aquí se va a sintetizar los ARNr de 18S, 28S y 5,8 S. Cada uno
de los genes para ARNr está repetido en racimos (clusters) distales, colocados en serie (tándem) en estos
cinco cromosomas.
Sin embargo, el ARNr de 5S se sintetiza a partir del NOR del cromosoma 1. El DNA que codifica el ARNr
5S se encuentra en una secuencia repetida de dicho cromosoma y se transcribe por separado.
A partir de ARN de 45 S se obtienen tanto el del 28, como el de 18 y 5.8.

IMAGEN: Observamos un ribosoma eucariota con las 2

subunidades que se unirán para formar el ribosoma cuando
entre un mRNA.
Cada una de las subunidades están formadas por proteínas
y rRNA que se origina en los satélites dentro del núcleo. El
preRNA sale del núcleo mediante la pre40S y pre 60S donde
forman una serie de complejos con proteínas del orden de
Ran, exportina, Nmd3 que lo exportarán fuera del núcleo.
Una vez el complejo pasa al citoplasma se liberan las
proteínas y ya podrían unirse las subunidades.

89
El transporte de ARNr del núcleo al citoplasma es dependiente de la hidrólisis de GTP (RanGTP) y de
exportinas
Para la subunidad pre-60S es necesaria la proteína Nmd3 porque es muy grande. Proteína identificativa
de la subunidad mayor. En la subunidad pequeña no existe.

Ensamblaje y exportación de unidades ribosomales: el nucleolo refleja la actividad transcripcional y

traduccional. Todas las proteínas ribosomales tienen que entrar en el nucleolo desde el citoplasma para
ensamblarse y dar lugar a los ribosomas.

MDAURACIÓN DE LOS ARNR EN EUCARIOTAS

Observamos las presubunidades 45S, 32S, 20S sintetizadas en el nucleolo en los satélites de los
cromosomas acrocéntricos. El ARNr de 5s no se va a sintetizar donde el resto (se sintetizaba en el
cromosoma 1), este se incorporará para formar parte de la subunidad correspondiente y posteriormente
se producirá el transporte al citoplasma mediante los poros. Finalmente se unirán el resto de proteínas
formando las subunidades grandes. Proteínas nucleosómicas son las que se sintetizan en el citoplasma y
entran en el núcleo para unirse a las presubunidades para formar subunidades.

PROCESAMIENTO (MADURACIÓN) DEL ARNT Y ARNR 5S EN EUCARIOTAS

La ARN polimerasa III produce el ARNt y el ARN 5S.

Aunque no haya maduración en el mRNA procariotas sí que existe maduración de los rARN en procariotas.

90
Se parte de un transcrito precursor de 30S al que se le añade grupos metilo para dar lugar a
intermediarios.

Estos intermediarios son rARN 16S, un intermediario de transferencia, un 23S y el 5S a diferencia de los
eucariotas que venían de un sitio distinto. Estos intermediarios sufren una serie de cortes para dar lugar
a los rARN maduros 16S, 23S y 5S quedando incluido también el tARN (en eucariotas tampoco pasa esto)

En procariotas los precursores de tARN y rARN

experimentan fragmentación y modificaciones
químicas de nucleótidos. El transcrito primario
contiene la secuencia de más de un tARN y rARN.
En E.coli se obtienen 3 rARN y un tARN de un
mismo transcrito.

En este momento es cuando se introducen las ‘bases raras’ que aparecen en el tARN procariota como el
6-dimetiladenina, así como la adición de grupos metilo. En otros nucleótidos (uridilato) añado grupo
metilo y da ribotimidilato, y si añado oxígeno, da un doble enlace para dar pseudouridilato.

El tARN tiene un extremo 3’, uno 5’ y una zona de unión al codón (anticodón). Ese tARN precursor sufre
metilaciones y cortes (en extremo 3’, 5’ y en zona donde está el anticodón). Todo eso será un intrón que
se va a eliminar (asi solo dejamos la zona del anticodón). Por acción de la ARN polimerasa II se elimina la
secuencia líder de la tARN, el extremo 3’ se elimina. Esto dará lugar al pre-tARN y finalmente añadiremos
las bases ACC en extremo 3’ para que ese extremo se pueda unir al ribosoma y luego se una el aminoácido
correspondiente.
Estos nucleótidos “raros” son los que estarán formando la estructura del tARN (en los brazos…).

91
ESQUEMA RESUMEN
Partimos de lo de la izquierda, sería el transcrito primario y se
obtiene finalmente el ARNt maduro se ha eliminado lo que
había en la cola 5’ (líder), se ha eliminado intrón (lo que era
marillo) y se produce un cambio en el extremo 3’.

También se ha añadido la secuencia ACC, se ha dejado sola la

zona del anticodón, y se observan la pseudouridina, las bases
con metilaciones... Es decir, estamos ya ante un tRNA maduro
IMP: se da tanto en eucariotas como en procariotas.

EDICIÓN, CORRECCIÓN O EDITING DEL ARNM

Partimos de un mARN maduro con su cap, cola de poliA y solo presentes los exones necesarios.
Además de los mecanismos de maduración, el RNAm puede sufrir procesos de edición o editing post
transcripcionales. Se produce una corrección, normalmente por desaminaciones.

Tenemos dos caminos en la corrección:

• Partimos de la secuencia CAA y se produce una desaminación (de citosina a uracilo) de forma
espontánea. El triplete UAA, cuando el RNA se traduzca vamos a tener un STOP codon y cuando
se traduzca en ese codón se para y la proteína correspondiente que se obtiene es la Apo B-48 (se
denomina forma truncada) que aparece en células intestinales. En esta forma truncada no tiene
receptor del LDL
• Si no hay desaminación (tendremos la proteína entera) tenemos la secuencia CAA, lo que se
traduce en la proteína ApoB (100), que se expresa en hepatocitos.

92
ARN INHIBIDORES

miARN

Los micro ARN son ARN monocatenarios (entre 21 y 25

nucleótidos) y muy pequeños que en un principio se pensaba que
no tenían utilidad pero que en realidad tienen la capacidad de
regular la expresión de otros genes mediante diversos procesos
(gracias a que pueden unirse a distintos ARNm), utilizando para
ello la ruta de ribointerferencia. Se unen directamente al ARNm e
impiden su traducción, la bloquean siendo ese su método de
regulación.

Los miARN son moléculas de ARN transcritas a partir de genes específicos de ADN para microARN, pero
no son traducidas a proteínas, no son codificantes para proteínas, simplemente regulan la expresión de
otros genes.

Vamos a obtener pri-miRNA (forma de horquilla, bucle), producido por

ARN polimerasa II. A estos pri-miRNA les llega una endonucleasa
denominada Drosha y recorta dejando estos pre-microRNA dejando estas
unidades de forma individualizada y gracias a la microexportina 5 salen
hacia el citoplasma.
DICER, proteína que recorta y deja solo estas moléculas de RNA que ya son
dobles pero que no tienen uniones (sin bucle). Estos miRNA dúplex se unen
a DICER permiten que se separen y es entonces cuando el micro ARN
queda libre y se une a unas proteínas llamadas RISC (RNA- induced
silencing complex).

A partir de aquí pueden inhibir la traducción cumpliendo su función, se

unen directamente al ARN mensajero y en ese momento es cuando inhiben
la traducción del ARNm.

Regulan la expresión génica de 4 formas diferentes:

• Degradación de la proteína durante la traducción
• Inhibición de la elongación de la traducción
• Terminación prematura de la traducción (disgregación de los ribosomas)
• Inhibición de la iniciación de la traducción

siARN

Otro tipo de RNA pequeños, que en algún momento comparten su acción, son los siRNA. Son moléculas
sencillas provenientes de una molécula doble de ARN que provienen de replicaciones virales o de
horquillas largas. No están transcritos a partir de un gen, sino que provienen de moléculas de doble
cadena de ARN. También se unen a los RISC pero la principal diferencia es que se aparean por completo,
la secuencia de los siRNA es igual que los RNA mensajeros a los que van a producir un corte.
Esto que realizan los siRNA también pueden realizarlo algunos miRNA (por tanto estos últimos tienen dos
mecanismos de actuación).

93
DIFERENCIAS ENTRE miRNA y siRNA

1. siARN no vienen de genes específicos que codifican para ellos, sino de moléculas dobles de ARN
que a su vez provienen de horquillas largas o de replicación viral. Una vez se tiene la molécula
doble de ARN, se corta y se obtienen varios siARN.
2. siARN se aparean por completo, cosa que no ocurre con miARN (en realidad en algunos también)

3. RITS (silenciador transcripcional inducido) y RISC (complejo silenciador inducido): diferencia en

su forma de silenciar, pero RITS son capaces de unirse directamente al ADN y alteran estructuras
de la cromatina (se unen en la zona untranslated regions 3’UTR).

La vía de la derecha son los miRNA que pueden

degradar el RNA mensajero cuando hay una unión
perfecta o inhibir la traducción al unirse de forma
imperfecta.
Los siRNA provienen de dobles cadenas de RNA, su
origen es completamente distinto al de los miRNA. Lo
que sí comparten es la capacidad de unión a los DICER
y a los complejos RISC quedando ya listo para unirse a
los mRNA, produciendo un corte y degradación de
forma que en ningún momento se alcanzará la
traducción.

94
lncARN

Los lncRNA (Long Non Coding ARN) son transcripciones de más de 200 ribonucleótidos que no codifican
para proteínas. Este límite distingue los lncRNAs de pequeños ARNs de reglamentación, como microRNAs
(miRNAs), ARNs cortos de interferencia (siRNAs), RNAs pequeños nucleolares (snoRNAs), y otros ARN
cortos. Tiene también un papel muy importante en lo que es la regulación de la expresión génica.

Funciones:
• Participan en enfermedades neurodegenerativas, desarrollo de las actividades cerebrales,
funcionamiento neuronal...
• Se unen específicamente a un factor de transcripción (REST), implicado en el desarrollo del
cerebro y provoca distintas patologías neurológicas.
• Inhibe el reclutamiento de la ARN polimerasa II.
• Induce cambios epigenéticos, al producir metilaciones en histonas, sobre todo metilación. Es
decir, alteraciones en la compactación de la cromatina. Produce su remodelamiento.
• Se une específicamente a genes con los que tiene complementariedad
• A partir de él se producen otro tipo de ARNs como los endo-siRNAs. La enzima DICER produce
el corte del complejo formado por la unión de lncRNA y miRNA, y dan lugar a estos endo-siRNAs.
• Se une específicamente a proteínas modificándolas
• También da lugar a los piRNAs (piwi-RNAs)
• Se une específicamente a exones e intrones produciendo proteínas distintas a las que se
tendrían que formar. Los lncRNA se unen a los exones impidiendo que se forme el espliceosoma
y por lo tanto que se produzca el splicing, como consecuencia esto da lugar a un mRNA en el que
no hay un exón que tendrían que estar.

95
96
TEMA 6: TRADUCCIÓN

CÓDIGO GENÉTICO

El código genético es la correspondencia entre la

secuencia de nucleótidos (lo que viene escrito en el
mARN) en un ácido nucleico y la secuencia de
aminoácidos en una proteína. Responde a la siguiente
pregunta:
¿Cómo traducir el código de 4 letras del ARNm en el
código de 20 letras de las proteínas?
Se requiere un código de tripletes (4^3 = 64
combinaciones), ya que un código de dobletes con dos
bases por codón no sería suficiente (4^2 = 16). Una serie
de tres nucleótidos (codón) especifica un aminoácido.

CIENTÍFICOS IMPORTANTES

• Severo Ochoa y Kornberg: descubrieron la polinucleótido fosforilasa, que permitió la

producción de ARNm sintéticos en presencia de Mg2+. Estos luego se traducían para ver qué
proteínas resultaban, lo que fue fundamental para descifrar el código genético. Ambos,
obtuvieron el premio Nobel de fisiología en 1959. Kornberg por su parte obtuvo también en 2006
el premio Nobel de química por cristalizar la ARN polimerasa II de levaduras y resolver la
estructura.
• Niremberg y Matthai: sintetizaron un ARN artificial de uracilos (UUUUUUUUU) y lo tradujeron
a un polipéptido de “Phes” (Phe Phe Phe), fue el primer codón descifrado (UUU codifica para
Phe)
• Holley: trabajó en el ARNt, molécula que por un lado se une al ARNm reconociendo el triplete,
y por otro lleva el aminoácido correspondiente.
• Khorana: continuó sintetizando moléculas artificiales de ARN y terminó por descifrar el código
genético.
• Brenner y Crick: llevaron a cabo el primer trabajo que apuntaba al triplete como elemento
codificante de un aminoácido.

97
 Comprobaron que cuando introducían mutaciones en el gen rIIB del fago T4 utilizando
proflavina, que al intercalarse entre dos bases provoca inserción o deleción de una sola base,
obtenían proteínas mutadas por alteración de la secuencia. Esto mismo ocurría cuando
insertaban o delecionaban otra base pero se recuperaba la cepa salvaje cuando se introducía una
tercera inserción o deleción (se recuperaba la pauta de lectura).
• Khorana, Niremberg y Holley: recibieron el premio Nobel en 1968

CARACTERÍSTICAS DEL CÓDIGO GENÉTICO

• No tiene solapamientos: se leen de tres en tres, si leemos AUA es distinto de si leemos UAC.

• No tiene puntuación interna: la secuencia de nucleótidos se lee de modo secuencial, triplete por
triplete.

En un código de tres letras sin solapamientos, el mensaje

traducido a partir de una determinada secuencia de letras
depende del punto en el cual se comience la traducción.
El desplazamiento del punto de partida para la lectura del
código, una letra a la izquierda o a derecha, cambia
totalmente el mensaje. Es decir si nuestra pauta de lectura
empieza en UAC tendremos tirosina, si tenemos UAC
tendremos treonina, y así; es totalmente diferente según
dónde comience la traducción.

Otras características:
• No es ambiguo: cada codón corresponde sólo a un aa.
• Es degenerado: excepto para Trp y Met, cada aminoácido está codificado por 2 o más codones
(sinónimos). Por ejemplo: 6 codones para la arginina.

• Es universal: aunque hay algunas excepciones.

• Todos los codones tienen un significado: recordamos que tenemos 4 al cubo = 64; de estos, 61
codifican para aminoácidos y los otros 3 son codones de terminación (UAA, UGA Y UAG).
• El codón AUG se utiliza para especificar el sitio de iniciación para la síntesis de proteínas
• En los codones sinónimos los dos primeros nucleótidos suelen ser suficientes para especificar un
determinado aminoácido, mientras que el tercero normalmente varía.

98
ARN TRANSFERENTE (ARNT)

CARACTERÍSTICAS

• Están formados por una cadena única que contiene entre 73 y 93 ribonucleótidos.
• Contienen muchas bases nada corrientes (e incluso metilaciones).
• Aproximadamente la mitad de los nucleótidos están apareados para formar dobles hélices.
• La estructura terciaria del tRNA tiene forma de L.

El brazo formado por bases emparejadas que incluye los extremos 5’ y 3’ se

denomina brazo aceptor o brazo del aminoácido, debido a que es donde se une
covalentemente el aminoácido.

La secuencia del trinucleótido del extremo 3’ de una molécula de ARNt madura

es siempre CCA (el aminoácido se une a la adenosina). El extremo 5’ está siempre
fosforilado. El brazo opuesto al aceptor es el brazo anticodón, es la región que
interacciona directamente con el ARNm.
Los otros dos brazos toman sus nombres de los nucleótidos poco
usuales que se encuentran en ellos (D –Dihidrouridina,
Seudouridina).

ARNT EN SU FORMA DE HOJA DE TRÉBOL

En la parte superior, su residuo de aminoácido unido covalentemente, y en la parte inferior su anticodón

que es el segmento trinucleótido que aparea las bases con el codón del mARN complementario durante
la traducción.
Es decir, la parte del extremo 3’ se une al aminoácido y el anticodon se une al triplete del ARNm, con el
que es complementario.

99
HIPÓTESIS DEL BALANCEO

Algunas moléculas de ARNt reconocen más de un codón a causa del balanceo en el apareamiento de
bases, no ocurre con todos los ARNt, solo con los sinónimos.

En el codón, las dos primeras bases determinan la unión al aminoácido (se aparean en la forma estándar),
la tercera es la posición de balanceo, que permite cierta libertad estérica.
Esto tiene una ventaja principal, y es que la disociación entre ARNt y ARNm es más rápida y por tanto, la
síntesis de proteína también. La traducción se va a producir de forma mas rápida.

Esta hipótesis, que afirmaba que el apareamiento de la 3ª base del codón no es rígido, fue propuesta por
Crick para explicar cómo un ARNt puede reconocer varios codones degenerados.
La posición 3: posición wobble

APAREAMIENTOS PERMITIDOS EN LA 3ª BASE DEL CODON SEGÚN LA HIPÓTESIS

La inosina eleva al máximo el nº de codones que pueden ser leídos por una molécula de ANRt
determinada, lo que explica la frecuente aparición de esta base (inosina) en los anticodones. En el ARNt
la inosina se forma por la desaminación de la adenosina tras la transcripción.

Las dos primeras bases del codón se aparean de forma estándar, pero la tercera no (laxa por la presencia
de la inosina). Los codones que difieren en alguna de sus dos primeras bases deben ser reconocidos por
distintos tARNs. Por ejemplo: UUA y CUA codifican para leucina, pero por distintos tARNs.

En procariotas, el ARNr 16S de la subunidad pequeña del ribosoma, interacciona con el dúplex codón-
anticodón de las dos primeras bases del codón, pero no con la tercera, por lo que el reconocimiento de
ésta no es estricto. Esta zona es más flexible, más laxa y permite establecer puentes de hidrógeno entre
bases.
La presencia de inosina, frecuente en el tARN, favorece el establecimiento de este tipo de uniones.
Recordamos también que el balanceo permite una mayor rapidez en el proceso de síntesis de proteínas
(más velocidad en la traducción).

100
AMINOACIL - ARNT SINTETASAS

Son enzimas que catalizan la adición de los aminoácidos a sus correspondientes moléculas de ARNt.
La aminoacilación (formación de aminoacil-RNAt) se produce en dos reacciones secuenciales que se
catalizan por esta enzima única:
1. Activación de los aminoácidos por adenilación: para que los aminoácidos se puedan unir deben
activarse, requiriendo energía en forma de ATP. Tras la reacción de adenilación, pasa a ser
aminoacil adenilato y se libera un pirofosfato. Este aminoácido ya se encuentra activado y se
puede unir al ARNt.

2. Aminoacil-AMP (adenilado) + ARNt → Aminoacil-ARNt + AMP: una vez que

tenemos el aminoácido activo, ya se puede unir a su ARNt, formando el aminoacil-
ARNt y liberándose el AMP. El grupo carboxilo del aminoácido se une al grupo 2’
o 3’ - hidroxilo de la ribosa del adenilato que está en posición 3’ del ARNt (los
aminoácidos se unen por el extremo 3’ en el ARNt). El producto aminoácido-ARNt
es un compuesto de alta energía. De esta forma el aminoácido queda activado para
transferirse posteriormente a la cadena polipeptídica en formación.

RESUMEN DE LA REACCIÓN CONJUNTA

Observamos la adenilación en presencia de ATP liberando pirofosfato y conseguimos el aminoácido

activado al haber añadido el grupo AMP (adenilación). Es entonces cuando llega el ARNt y se une,
quedando un aminoacil-tRNA.
Esos aminoacil-tRNAs son específicos y para cada uno de ellos existe una aminoacil-ARNt sintetasa. (1
para la serina, otro distinto para la metionina, etc)

¿Cómo reconocen las sintetasas sus ARNt correspondientes?

Su conocimiento preciso de los tARNs es tan importante para una alta fidelidad en la síntesis de proteínas
como lo es la exacta selección de los aminoácidos. Las sintetasas reconocen su ARNt correspondiente
principalmente por las bases de su anticodón, pero también pueden reconocer otras características
estructurales alternativas del ARNt (por ejemplo: base en posición 20, bases en posición 11/24...).

101
 IMAGEN: muestra los distintos sitios de unión a la
sintetasa en función de lo común que sea encontrar que
la unión se realiza en esos puntos.

Las posiciones en rojo son importantes para el

reconocimiento por una sintetasa, en amarillo por más
de una (más generalizado) y en azul pueden o no ser
utilizados.

Las aminoacil-ARNt sintetasas son las que verdaderamente

interpretan el código, ya que sintetizan el aminoacil ARNt,
son las que inician todo el proceso. El grupo aminoacilo
puede estar unido en el hidroxilo 3´pero también puede
unirse en el 2´ (como la imagen).

CARGA DEL ARNT

La síntesis supone un gasto equivalente a 2 ATPs, por

la hidrólisis del PP (pirofosfato), lo que favorece
térmicamente la reacción. Los lugares de activación
son selectivos para los aminoácidos, es decir cada
aminoácido se activará en una zona determinada
que será la que interacciones con la enzima.

Por todo, las aminoacil-ARNt sintetasas son las

verdaderas intérpretes del código genético, ya que
son las que sintetizan el aminoacil ARNt.

La imagen muestra una aminoacil tARN sintetasa

específica para el triptófano y por ejemplo la serina
no sería capaz de unirse a esta sintetasa.

La síntesis de proteínas tiene una gran fidelidad y precisión gracias a que las aminoacil-tARNs sintetasas
tienen un mecanismo de revisión completa para producir la activación solo en los casos que sea
verdaderamente adecuado el aminoácido que ha llegado. El brazo del extremo CCA es flexible y presenta
el aminoácido en dos lugares del enzima, el de activación y el de revisión (edición o editing), para
comprobar que es el correcto. El lugar hidrolítico rompe los aminoácidos más pequeños mientras que uno
mayor es rechazado por el lugar de acilación.

102
COMPLEJO TREONIL – ARNT SINTETASA

Reconocen a la treonina. Si no lo reconoce, no se une.

Las sintetasas reconocen el tARN por el anticodón o por otras regiones. Solo se unen cuando reconocen
el aminoácido, tanto anticodón como otros aspectos alternativos que hemos dicho antes.

Hay dos clases de aminoacil-tARN sintetasas (I y II), que reconocen caras distintas del tARN, aunque ambos
tipos se unen a todo tipo de aminoácidos. Según donde se produzca la adenilación del aminoácido:
• Las de tipo I: suelen ser monoméricas y acilan el -OH 2’ de la adenosina terminal. El aminoácido
quedaría adenilado por el 2´.
• Las de tipo II: son multiméricas (más complejas formadas por más monómeros) y, acilan el -OH
3’ de la adenosina terminal (excepto en el caso de la phe tARN).

Las interacciones codón-anticodón son determinantes en el aminoácido a incorporar en la cadena

polipeptídica. Así, si se modifica un aminoácido-tARN, siguiendo el código determinado por el codón, se
incorpora alanina en vez de cisteína.

El níquel raney (tóxico) quita el grupo sulfhidrilo de la cisteína por una reacción específica, en el tARN que
llevaba la cisteína metía una alanina. Reconocía el codón de la cisteína pero aportaba una alanina por lo
que se producía una mutación. Siempre vamos a tener tARN específicos para cada aminoácido.

RIBOSOMAS

Es el lugar donde se produce la interacción entre el mARN y

el tARN, son otro elemento importante para la traducción.
Son partículas ribonucleoproteicas, porque están formados
tanto por ARN como por proteínas. Tienen varias moléculas
de ARN grande y docenas de proteínas diferentes.

Tamaños :
• Procariotas: subunidad grande, 50S (5S, 23S + 34
proteínas) y subunidad pequeña, 30S (16S +21
proteínas).
• Eucariotas: subunidad grande, 60S (5S, 28S y 5,8S +
49 proteínas) y subunidad pequeña, 40S (18S + 33
proteínas).
Funciones:
• ⅔ de su masa son RNA
• Se unen al mARN para que sus codones puedan leerse con alta fidelidad
• Presenta sitios de unión específicos para el tARN.
• Interviene en las interacciones de los factores proteicos no ribosómicos, que promueven la
iniciación, elongación y terminación de la cadena (fases de la traducción).
• Cataliza la formación del enlace peptídico, que une a los aminoácidos para formar la proteína.
• Experimenta un movimiento que le permite traducir codones de modo secuencial.
Lugares de unión:
El mARN se une a la subunidad pequeña, mientras que el ARNt contacta primero con la subunidad
pequeña (30S)mediante tres sitios de unión: sitio A (aminoacilo), sitio P (peptidilo) y sitio E (salida = exit)
y después con la subunidad grande (50S). La unión es secuencial porque los tARN van a ir llegando a estos
tres sitios específicos del ribosoma.

103
PROCESO DE SÍNTESIS DE PROTEÍNAS. TRADUCCIÓN

1. Iniciación: se produce el ensamblaje de un tARN iniciador (en procariotas es el específico de la

formil-metionina, que es diferente de la mertionina normal, esta formilada), un mARN con un
codón de iniciación (AUG), y las dos subunidades ribosómicas ensambladas. Para que se
ensamblen requieren de factores de iniciación que hidrolicen ATP.
2. Elongación: una vez que ya se ha ensamblado. Consiste en la adición de aminoácidos, síntesis de
enlaces peptídicos. Requiere de factores de elongación capaces de unir el aminoácido-tARN
apropiado al sitio A (aminoacilo) y translocar el peptidil-tARN al sitio P (peptidilo).
3. Terminación: la síntesis de proteínas acaba por medio de factores de liberación que reconocen
los codones de terminación UAA, UGA y UAG, y producen la hidrólisis del enlace éster entre el

1. INICIACIÓN

Lo primero que ocurre es la formación del complejo de iniciación, lo cual requiere el gasto de una molécula
de GTP, formado por la unión de los siguientes elementos.

Subunidad pequeña (30S) + mARN + ARNtmet-formilada + 3 factores de iniciación

Los tres factores de iniciación necesarios (en procariotas, en eucariotas

son muchos más) son:
• IF1: bloquea el sitio A.
• IF2: se asocia con la formil-metionina (fMet) y la ayuda a unirse a
la subunidad pequeña.
• IF3: bloquea el sitio E y evita que ambas subunidades se junten
todavía. Ayuda a posicionar fMet-tRNA en el sitio P, que actúa
por complementariedad con el codón iniciador del mARN (AUG).

IF 1 y 3 son importantes para el reconocimiento de la secuencia Shine-

Dalgarno. El 2 lleva asociado un GTP y produce la unión entre el tRNA y el
primer codón.

104
La secuencia Shine-Dalgarno es una secuencia de nucleótidos que se encuentra en el 5’ del codón
iniciador (del ARNm) y es complementario a las secuencias cerca del extremo 3’ del ARN ribosomal 16S.
Lo primero que se produce es el reconocimiento de la secuencia por el 16S ARNr. Es una secuencia
consenso (AGGAGGU), es decir, se va a encontrar en todos los sitios de iniciación de la traducción (puede
haber pequeñas variaciones pero siempre está próxima al codón de inicio). Está en una posición -10.

Después la subunidad grande (50S) se une al complejo, con gasto de GTP, y provoca la liberación de los
factores de iniciación:
1. Sitio A (aminoacil): entra nuevo ARNt excepto el primero que va directamente al sitio P
2. Sitio P (peptidil): crecimiento cadena peptídica
3. Sitio E (salida): salida tARN desacilado

Señales de inicio de la traducción:

• En procariotas: la secuencia consenso está en posición -10, y es rica en purinas es el elemento
de shine dalgarno en el que se produce el emparejamiento de bases con el ARN ribosómico en la
subunidad 16S.
• En eucariotas: está el casquete (CAP), que es quien indica el principio de la traducción, es muy
importante porque favorece el inicio de la traducción.

RESUMEN:
• Procariotas: dos subunidades (la pequeña se une por la secuencia gracias a IF3) cuando es
reconocido y unido entran el ARNt específico para la metionina y en presencia de energía el
factor II y I se une el primer ARNt (portando ya metf) se unen directamente al sitio P (ya que
tanto el A como el P están libres al ser el primero). Una vez esto se liberan los factores (GDP y el
fosfato orgánico) cuando entra en juego la subunidad grande formando el complejo 70S aquí es
cuando decimos que comienza la traducción.

• Eucariotas: tenemos el codón de iniciación. La zona del casquete se une al ribosoma. Además de
esta unión hay una serie de proteínas que favorecen la interacción con la cola poli A, gracias a
esta interacción entre proteínas, casquete y la cola poli A que produce una estabilidad, es
entonces cuando se produce la traducción. El mecanismo es igual pero intervienen componentes
diferentes.

105
2. ELONGACIÓN

Ya tenemos el primer ARNt en la posición P por lo que la A está libre. Llega el segundo ARNt unido a su
aminoácido correspondiente y cuyo anticodón es complementario al siguiente codón del ARNm
El reconocimiento se produce por puentes de hidrógeno entre el codón y el anticodón. Este proceso
requiere de GTP y 2 factores de elongación: EF-Ts y EF-Tu.

Factores de elongación importantes:

• EF-Tu: actividad GTPasa, favorece la interacción en la zona A con el tARN. Permite que quede
unido el segundo tARN.
• EF-Ts: favorece la formación del enlace peptídico por la peptidasa. Es el único sin actividad
GTPasa.
Estos dos primeros actúan en interacción del segundo tARN cuando se une al sitio A mediante el
anticodon. Ambos forman un complejo que es el que capta el GTP, se libera el factor Ts y ya
tiene esa actividad GTPasa necesaria.
• EF-G (lo mismo que la translocasa): con actividad GTP y permite la translocación, el paso del
tARN del sitio P al E, en sitio P quedaría ocupado con ARN unido a la cadena peptídica y el sitio A
libre para la entrada del siguiente tARN.

Gracias a un factor de elongación, se abre el sitio A para que el nuevo aminoacil-tRNA se acople. Ahora,
el sitio P tiene el principio de la cadena peptídica, y el sitio A tiene el siguiente aminoácido que va a
añadirse a la cadena.

Tras la unión del segundo tARN se forma un enlace

peptídico entre el extremo carboxilo del último
aminoácido del polipéptido y el extremo amino del
aminoácido que está acoplado al ARNt en el sitio A. Esto
está catalizado por la peptidil- transferasa (cuyo centro
activo está en la subunidad 50S), con gasto de GTP. La
formación del enlace peptídico permite que la cadena
polipeptídica pase al sitio A.
En este punto, en el sitio A se ha formado un nuevo
péptido, mientras que en el sitio P hay un ARNt sin
aminoácido, que se elimina gracias a la translocasa.

Se produce después la translocación, que es un

movimiento del ribosoma sobre el mARN, de forma que el
tARN con la cadena polipeptídica pasa al sitio P, y el sitio
A queda vacío. En el sitio E se encuentra el tARN vacío a
punto de salir. Requiere GTP, y factor EF-G (Translocasa).

El ribosoma continúa trasladando los codones del ARNm mientras siguen acoplándose más aminoacil-
RNAt al sitio A; hasta que el ribosoma alcanza un codón de parada en el ARNm (UAA, UGA o UAG).

La elongación consiste en la adición de todos los aminoácidos. El proceso se repite tantas veces como
aminoácido posea el polipéptido sintetizado menos uno (excepto el primero, metionina).

106
3. TERMINACIÓN

Ocurre cuando uno de los tres codones de terminación (UAA, UAG o UGA) entra en el sitio A, ya que estos
codones No son reconocidos por ningún ARNt (no codifican para ningún aminoácido) y el último codón se
une al factor de liberación o terminación (RF) y una molécula de GTP, lo que permite la liberación de la
proteína del ribosoma y la disociación del ribosoma.

Terminación se produce gracias a los codones de

terminación que son reconocidos por factores de
liberación (RF) se requiere además GTP:
• RF1 reconoce UAA y UAG.
• RF2 reconoce UAA y UGA.
• RF3 cataliza la liberación al final del proceso de
terminación. Lleva a cabo las interacciones con
GTP (lleva asociada actividad GTPasa.)

En el sitio P tenemos todo el polipéptido, en el E se está

liberando el último tARN y tenemos la llegada de una
serie de factores que se van a unir a los codones de
terminación (RF1 y RF2).

RESUMEN

La síntesis de proteínas es un proceso que requiere mucha energía. Un enlace peptídico requiere:
• 2 moléculas de ATP para formar 2 moléculas de aminoacil-tARN (carga de los tRNA).
• 1 molécula de GTP para que el tARN entre en el sitio A.
• 1 molécula de GTP para producir la translocación.
Total de energía requerida: 2ATP y 2GTP.

En procariotas está acoplado a la traducción, a medida que va pasando por la transcripción se va

añadiendo a la traducción (son simultáneos); existe un acoplamiento transcripción-traducción. Además
en los procariotas los mARN son policistrónicos, ya que contienen información que codifica para más de
una proteína (un gen codifica para mas de una proteína) y la velocidad de síntesis de proteínas en
procariotas es de unos 300 aminoácidos por cada 20 segundos, esto se debe al elevado número de genes
transcritos al mismo tiempo.

El ARNm se traduce en dirección 5’ → 3’ y las proteínas se sintetizan desde el extremo N-Terminal al C-

Terminal. En procariotas, la traducción del mARN puede iniciarse antes de que se haya completado la
transcripción, ya que la dirección de síntesis de mARN es también 5’ à 3’.

En el citosol, las proteínas se sintetizan mediante polirribosomas/polisomas, que son varios ribosomas
que traducen simultáneamente un mARN eucariótico. De esta forma se incrementa la eficiencia de
utilización del mARN.

107
DIFERENCIAS EN LA TRADUCCIÓN ENTRE PROCARIOTAS Y EUCARIOTAS

Aclaración sobre el complejo de iniciación: en procariotas primero hay una interacción gracias al
elemento Shine Dalgarno. Se une el 16S rARN y tras la interacción llega el tARN. En cambio, en eucariotas
existe primero una interacción entre el tARN y la subunidad pequeña sin participar el mRNA. Una vez se
ha producido la interacción es cuando el mARN se empieza a implicar. Recordar la importancia del
casquete porque una vez se ha reconocido el tARN por la subunidad pequeña, llega el mARN, la subunidad
grande, se unen proteínas al casquete e interacciona con la cola de poliA.

PROCESADO POST-TRADUCCIONAL DE LAS PROTEÍNAS

Las proteínas nacientes necesitan un procesado postraduccional, que puede ser:

1. Proteolítico: adición de péptidos señal, maduración estructural.
2. Modificaciones químicas:
2.1. Unión de carbohidratos (citoesqueleto, matriz extracelular...)
2.1.1. N-acetilglucosamina en serina y treonina para citoplasma. Maduración en Golgi.
2.1.2. Glicosilación compleja para secreción o exportación a membrana plasmática, Golgi o a
lisosomas.
2.1.2.1. N-glicosilación: unión a aspargina dentro del retículo endoplasmático, es la más
frecuente.
2.1.2.2. O-glicosilación: unión a serina y treonina en Golgi, es menos frecuente.
2.2. Unión de lípidos: miristoilación (C14) en N-terminal de glicina, palmitoilación (C16) y prenilación
(C15-C20) en tiol (SH) del cisteína. Sirve para la interacción con membrana plasmática, la
señalización, la transducción de señales...
2.3. Sencillas: fosforilación, hidroxilación, acetilación... (activación/desactivación).

Estos procesos se llevan a cabo principalmente en eucariotas, este es el principal problema de la expresión
de proteínas de eucariotas en procariotas.

PROCESAMIENTO PROTEOLÍTICO DE LA PREPROINSULINA

La preproinsulina tiene una secuencia “pre” de 23 restos que marca el almacenaje en gránulos de las
propias células beta de los islotes de Langerhans del páncreas. Es la secuencia señalizadora (sirve para la
localización) y es eliminado por la peptidasa en los gránulos, quedando proinsulina inactiva almacenada.

108
La secuencia “pro” es una forma inactiva y pasa a su forma activa mediante las carboxipeptidasas que
retiran el denominado péptido C, se activa cuando es necesaria la secreción de insulina (sirve para la
activación).

PROCESAMIENTO DE PROTEÍNAS EN EL CITOSOL

Las chaperonas se encargan del plegamiento de proteínas en el citosol aunque tengan modificaciones
químicas.
Tras terminar la traducción el polipéptido sale del ribosoma. El plegamiento se produce gracias a
proteínas chaperonas del tipo ADNj y ADNk que producen un primer plegamiento en presencia de ATP
en el que se va a liberar el fosfato quedando ADP. Luego se plegará más la proteína, y con GroES y GroEL
se produce el plegamiento definitivo.

Todas las proteínas requieren un plegamiento postraduccional. Al final lo que tenemos es la proteína
nativa que ni siquiera está en su localización y no es activa. Tiene que pasar a la localización final (núcleo,
mitocondria, citosol) sufriendo una serie de plegamientos en su paso para que pueda ejercer su función,
sino la proteína se degradará.

ANTIBIÓTICOS INHIBIDORES DE LA SÍNTESIS DE PROTEÍNAS

• Estreptomicina y otros aminoglicósidos (sólo actúan en procariotas, específico para las

infecciones bacterianas): nhibe la iniciación y origina una lectura errónea (altera la lectura del
código genético bacteriano) del mARN en procariotas.
• Tetraciclina: se une a la subunidad 30S e inhibe la unión de los aminoacil-tARNs en procariotas
(bloquea el sitio A del ribosoma).

109
 • Cloranfenicol: inhibe la actividad peptidiltransferasa de la subunidad ribosómica 50S en
procariotas. Bloquea la peptidiltransferasa bacteriana, de mitocondrias y cloroplastos, sin afectar
a los ribosomas de eucariotas
• Cicloheximida: inhibe actividad peptidiltransferasa de la subunidad ribosómica 60S en
eucariotas.
• Eritromicina: se une a la subunidad 50S e inhibe la translocación en procariotas.
• Puromicina: provoca la terminación prematura de la cadena por actuar como un análogo del
aminoacil-tRNA en procariotas y eucariotas. La puromicina es un análogo estructural del extremo
aminocilado de un ARNt cargado. Causa una terminación de la traducción anticipada, ya que se
une al sitio A y no se va a producir la translocación y se libera el péptido.

Otros potentes inhibidores tóxicos son: la toxina diftérica ADP-ribosila entre otros al factor EF2,
bloqueando su función. Y la ricina (proteína tóxica en la semilla de ricino) mediante una actividad
glicosilasa elimina las adeninas del rARN y desestructura los ribosomas.

COMPARACIÓN ENTRE BACTERIAS Y EUCARIOTAS

110
TEMA 7: MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES DE LAS PROTEÍNAS

Las proteínas se sintetizan en el RER y se transportan al AG (llegan a través de vesículas) tras haber
pasado por el REL (donde van a adquirir ya una serie de modificaciones). Así van adquiriendo
modificaciones químicas (en AG) -más específicas de AG que en REL (como la formación de glicoproteínas
y glicolípidos) y adquiriendo señales péptidos para ser dirigidas al lugar donde su funcionalidad es máxima.
En el AG también se produce el plegamiento o empaquetamiento.

Las proteínas para los lisosomas se produce una evaginacion de la membrana de golgi y se forma el
lisosoma.
Las proteínas destinadas a la secreción, la integración en la
membrana plasmática o la integración en los lisosomas comparten,
generalmente, los primeros pasos de una ruta que comienza en el
RE. Las proteínas sintetizadas en el citosol pueden quedarse ahí
como proteínas citosólicas o bien migrar al núcleo, a las
mitocondrias o a los cloroplastos.
La mayoría de las proteínas de membrana, lisosómicas o secretadas
tienen una secuencia amino-terminal que las marca para su
translocación a la luz del RE. El extremo carboxilo de la secuencia
está bien definido por un sitio de corte de una proteasa, que elimina
la secuencia señal una vez la proteína ha sido importada por el RE.

El elemento más importante en estas rutas es una secuencia corta de aminoácidos, denominada
secuencia señal, cuya función es dirigir la proteína hacia su localización apropiada en la célula. A menudo
es eliminada durante el transporte o después de que la proteína haya alcanzado su destino final.

¿Qué va a determinar el destino de las proteínas que salen de Golgi?

Las secuencias señal de proteínas (o de secreción o de membrana) tienen longitudes variables (13 - 36
aas), de los cuales entre 9 y 12 son hidrofóbicos. Uno o más son positivos y suelen estar cerca del extremo
N-terminal y delante de la secuencia hidrofóbica. Tienen una corta secuencia en el extremo C-terminal
que es relativamente polar, con aminoácido de cadena corta (especialmente alanina) en las posiciones
más cercanas al sitio de corte. La secuencia señal aparece muy pronto, ya que se encuentra en el extremo
N-terminal, que es sintetizado primero. Lo más normal es que una vez la proteína ha llegado a su destino
el péptido señal se corte.

¿Cómo las dirige hacia una localización?

El ribosoma la vas sintetizando a partir del péptido señal
(grupo amino terminal) y es reconocido por las SRP.
Interaccionará con el péptido señal.
Las SRP (partícula de reconocimiento de señal), que
reconocen la secuencia; constan de 6 dominios
específicos y de RNA de 300 nucleótidos. Una vez que las
SRP reconocen y se unen al péptido señal, redirigen el
ribosoma a la membrana externa del RER, y ahí se une a
los receptores de membrana. Dentro del lumen se van a
sintetizar las proteínas de membrana o proteínas de
secreción.

111
SÍNTESIS DE PROTEÍNAS EN EL RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO RUGOSO (RER)

En el ribosoma se van sintetizando las proteínas a partir del péptido señal que es detectado por SRP que
interacciona con el péptido produciéndose el transporte del complejo hacia la parte de la membrana del
RER donde hay una proteína receptora y un receptor que va a tener una proteína translocadora o poro.
Este complejo gracias al SRP se desplaza hacia la membrana se produce una interacción y el ribosoma se
coloca en el mismo, cuando se produce la translocación y la proteína se introduce en el lumen del RE.

PROTEÍNAS DE SECRECIÓN

El poro (traslocón) que se encuentra cerrado va a interaccionar directamente con el ribosoma. La

subunidad alfa lleva a cabo su actividad GTPasa y con ello se produce la apertura del traslocón (al
interaccionar directamente con el ribosoma).
Se libera el SRP junto a GDP que puede reciclarse y unirse al siguiente ribosoma. Mientras tanto el
ribosoma, una vez que está en unión con el traslocón, continúa con la síntesis de proteína. Se introduce
el péptido señal y el resto de proteína al lumen. Hay una peptidasa señal que produce el corte del péptido
señal puesto que ya no lo necesita más.

Esa proteína en el interior del lumen del RE se plegará (pero no completamente ya que es solo la cadena
polipeptídica que sufrirá las modificaciones y plegamientos postraduccionales). Una vez se ha sintetizado
todo, se cierra el translocón y se disocia.
Importante: la proteína aún no está plegada, debe seguir un proceso de modificaciones y plegamientos.

PROTEÍNAS DE MEMBRANA

(a partir del paso 5 de la foto anterior). Lo mismo, el péptido señal llega, la SPR lo reconoce, la peptidasa
rompe la secuencia señal, y la proteína se va introduciendo hacia el lumen. Tenemos que tener secuencia
que indique que es proteína de membrana (secuencia en rojo en la foto) que indica que parte de esta
proteína tiene que quedar en la membrana, va a haber una translocación, el poro se cierra y hay parte
que es transferido al interior de la membrana y a partir de ahí el resto de la proteína lo sintetiza fuera de
la membrana.

Va a quedar en la membrana del RE que se transporta en vesícula para que después se fusione con golgi
y se transporta entre los dictiosomas pero permaneciendo en la membrana.

Resumen: la proteína comienza a ser sintetizada hacia el interior hasta que llega el péptido señal que hace
que continúe hacia el citosol el resto de la síntesis.

112
Una vez sintetizadas las proteínas, se lleva a cabo sobre ellas una serie de procesos:
• Maduración y procesamiento del polipéptido: modificaciones químicas de los residuos de
aminoácidos y eliminación de fragmentos del polipéptido.
• Plegamiento correcto de las proteínas hasta alcanzar la configuración de proteína nativa (para
que sean activas). En algunos casos requiere de maduración previa (fosforilaciones,
metilaciones...).
• Distribución de proteínas hacia diferentes localizaciones (para poder ejercer su función),
determinada por las modificaciones postraduccionales.
• Degradación de proteínas tras su destino y cumplida su función. Las proteínas que ya han
ejercido su función.

MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES

Es el conjunto de procesos que modifican las proteínas una vez terminada su síntesis. Contribuyen al
correcto plegamiento, regulan la expresión de la proteína, o la actividad y localización en la célula. Se han
descrito más de 100 modificaciones postraduccionales:
• Glicosilación: permite que a la vez que se añaden azúcares se lleve a cabo el plegamiento (facilita
la interacción con otras moléculas y facilita también el plegamiento adecuado).
• Acetilación, fosforilación y metilación (reversible).
• Eliminación de aminoácidos o péptidos (procesamiento): pre y pro insulina
• Autoprocesamiento: eliminación de secuencias internas, es un proceso autocatalítico.
• Adición de ácidos grasos (lípidos): por ejemplo la palmitoilación. Determinan su posicionamiento
en la membrana plasmática.
• Incorporación covalente de enzimas (biotina, ácido lipoico, fosfato de piridoxal…)

MADURACIÓN DE LAS PROTEÍNAS

• Maduración por modificación de aminoácidos:

o Unión de sustituyentes a los aminoácidos
§ Acetilación
§ Carboxilación: adición del grupo carboxilo
§ Fosforilación: adición grupo fosfato (es reversible).
§ Hidroxilación
§ Metilación: adición grupos metilo.
o Modificación con lípidos
§ Acilación (ácidos grasos)
§ Prenilación (terpenos)
o Incorporación de glúcidos: glicosilación

113
 • Maduración por escisión proteolítica:
o Activación proteolítica de enzimas
o Activación proteolítica de hormonas

• Ayuste de proteínas: (corte y empalme) la parte interna se elimina y las dos partes externas se
unen para formar la proteína funciona (como lo que hemos visto en la insulina, donde hay que
cortar una parte interna, otra externa… etc de forma que el péptido C quede unido por
determinadas zonas para hacerla funcional) en verdad es una activación proteolítica pero se
denomina así porque además del corte se produce una unión. No hay solo una escisión.

GLISOSILACIONES

N-GLICOSILACIÓN

Ocurre en la membrana del RE. Se sintetizan oligosacáridos como precursores unidos a lípidos entre los
que destaca el dolicol (poliisoprenol de 14-24 carbonos) que se encuentra anclada en la membrana del
RE, que es el más frecuente.
Proceso:
1. Tenemos una partícula de dolicol que se encuentra fosforilado y anclado a la membrana del RE,
la 1º reacción es la adición de 2 unidades de N-acetilglucosamina en forma de 2 UDP-GlcNac.
2. Se adicionan 5 manosas en forma de 5GDPManosa. Se liberan los 5 GDP y quedan las manosas
unidas al Nacetil-Glc.
3. Una vez tenemos esqueleto se produce una translocación, paso de este esqueleto de
oligosacáridos hacia el interior de la membrana con el dolicol hacia fuera.
4. Se añade 3 moléculas de glucosa y 4 manosas más quedando unido todo al dolicol en la cara
interna.
5. Llegan los ribosomas con el ARN mensajero y el péptido se va introduciendo.
6. En ese momento se produce la transferencia de todo el esqueleto de azúcares hacia la proteína
quedando el dolicol como difosfato en la membrana.
7. La proteína sigue sintetizando y se libera.
8. Ya tenemos la glicoproteína sintetizada en el interior del RE.
9. Se produce una translocación del dolicol difosfato con hidrólisis de uno de los fosfatos (liberado
al citosol en forma de fosfato inorgánico) quedando el dolicol reciclado y preparado para recibir
las 2 unidades de N-AcetilGlucosamina.
10. El dolicol se recicla para volver a ser usado.

114
O-GLICOSILACIÓN

Se realizan en el Golgi por adición serial de unidades de monosacáridos y no necesita dolicol.

INHIBICIÓN DE LAS GLICOSILACIONES

La formación de las glicosilaciones se puede inhibir mediante la tunicamicina (tiene una cadena de ácidos
grasos) en el punto de adición de la N-acetilGlucosamina (en el primer paso). Esto lo hace porque es un
análogo estructural de la UDP N-Acetilglucosamina y puede interaccionar de forma que ya no tendríamos
el dolicol unido a la NAG sino que quedaría unido a la tunicamicina y no puede continuar el proceso de
adición del resto de moléculas.

PLEGAMIENTO DE LAS PROTEÍNAS

PLEGAMIENTO DE PROTEÍNAS DE MEMBRANA POR CHAPERONAS

Primero es necesario que se produzcan adiciones de oligosacáridos (O-glicosilaciones).En este caso

participan las chaperonas con ayuda de la calnexina (en la membrana) y calreticulina (en el lumen)
producen plegamiento, pero también tienen que reconocer primero O-glicosilaciones.

Además pueden producirse puentes disulfuro entre los distintos residuos, lo que también contribuye al
plegamiento de la proteína. Estos puentes disulfuro son catalizados por la disulfuro isomerasa (PDI) y
pueden ser reversibles o irreversibles. La PDI proporciona los grupos sulhidrilo necesarios para la
formación de puentes de disulfuros.

115
PLEGAMIENTO DE PROTEÍNAS SE SECRECIÓN: CICLO CALNEXINA/CALRETICULINA

Membrana: calnexina
Lumen del RE: calreticulina

Partimos de una molécula no plegada con esqueleto de 3

glucosa y el ciclo se repite tantas veces como plegamientos
requiera la proteína.

El procesamiento del núcleo del oligosacárido comienza por el

recorte (trimming) de sus 3 residuos de glucosa, llevado a
cabo por la glucosidasa lo que permite que la proteína se
pliega parcialmente. La GT (glucosiltransferasa) vuelve a
glicosilar la proteína parcialmente plegada.

La calnexina o la calreticulina (homólogas) son lectinas que reconocen glucoproteínas parcialmente

plegadas, que contienen un oligosacárido monoglucosado, protegiéndolo de la degradación.
Si la proteína se libera y se desglucosila antes de su plegamiento completo, la glucosiltransferasa, que
reconoce proteínas nativas la vuelve a glucosilar para repetir el ciclo y volver a poder plegarse por
completo, con el fin de conseguir que la proteína sea reconocida por la calnexina. En el proceso participa
también la ERp57, similar a la PDI para la correcta formación de posibles puentes disulfuro, para favorecer
el plegamiento.
Hay proteínas que requieren para su plegamiento:
• Solo calnexina
• Solo ERp57 (similar a la PDI)
• O ambos mecanismos

PLEGAMIENTO DE PROTEÍNAS EN EL CITOSOL: CHAPERONAS CITOSÓLICAS

Las proteínas se pliegan primeramente por chaperonas citosólicas a medida que van saliendo del
ribosoma. En un primer plegamiento tenemos Hsp70 que tienen actividad ATPasa, luego con ATP
producen plegamientos parciales de forma que las proteínas citosólicas se pliegan más hasta que se
alcance el máximo nivel de plegamiento requerido. Los plegamientos más complejos (si no es suficiente
con un plegamiento) son los realizados por las GroES (Hsp10) y la GroEL (Hsp60), formada por varias
subunidades y es como si fuera un barril, que dejan la proteína totalmente plegada cuando esta se
introduce dentro de sus estructuras.
Requiere como ya hemos dicho de ATP y de GroES y
GroEL. En este momento se libera ADP, a GroES y la
proteína queda completamente plegada.

Hsp60 tiene 2 tipos de conformaciones:

• Cerrada (tight): la chaperona realiza el
plegamiento
• Abierta (relaxed): no tenemos la
chaperona realizando el plegamiento que es
cuando libera la proteína plegada).

116
VÍAS DE DISTRIBUCIÓN DE LAS PROTEÍNAS

SINTETIZADAS EN EL RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO RUGOSO

Se distribuyen acorde a su función desde el retículo endoplasmático, pasando primero por el aparato de
Golgi. El transporte se realiza principalmente en vesículas y entre los sacos de Golgi también se mueven
vía vesículas hasta que llegan a la cara trans.
Una vez aquí, se produce una invaginación del aparto de Golgi, lo que forma una nueva vesícula que
transportará las proteínas a lisosomas, al exterior para participar como proteínas secretoras o se funden
con la membrana ya que son proteínas de membrana.

SÍNTETIZADAS POR POLIRRIBOSOMAS LIBRES

Las proteínas destinadas al citoplasma, mitocondrias, cloroplastos y núcleo se sintetizan en

polirribosomas libres.
• Proteínas mitocondriales: el péptido señal identifica a la proteína como proteína de la
mitocondria y favorece la unión al factor estimulador de la importación mitocondrial (MSF o
Hsp70) y este factor es el que lleva a la membrana de la mitocondria la proteína.
El receptor que se encuentra en las mitocondrias es el complejo Tom y Tim que permite que una
vez activado se abra como si fuese un poro y facilitando que entre la proteína. La apertura del
complejo (realizada por mHsp70) permite la entrada y en el interior de la matriz se produce el
corte del péptido señal. En el interior de la matriz sufrirán diversos plegamientos para llegar a la
proteína mitocondrial madura.

• Proteínas tilacoidales (en los tilacoides de los cloroplastos): la secuencia señal permite que la
proteína sea dirigida hacia el interior de los cloroplastos (estroma) y una vez ha entrado, se
elimina esta señal. Sin embargo, tenemos otra señal que permite que el precursor de la proteína
pase al interior del tilacoide. Una vez ahí, se elimina la señal y sufre el plegamiento, pasando a
ser proteínas específicas de tilacoides (proteínas maduras). Es decir, requieren 2 señalizaciones
distintas.

117
 • Proteínas nucleares: tenemos las importinas, dos subunidades que reconocen las secuencias de
reconocimiento nuclear (del péptido señal que es NLS). Transportan las proteínas a través de la
membrana nuclear (a través de los poros) mediante Ran unidas a GTP, luego la proteína se libera
y las dos subunidades libres (alfa y beta) vuelven al citosol para seguir importando nuevas
proteínas (las subunidades se reciclan). No se elimina la secuencia señal.

DEGRADACIÓN DE PROTEÍNAS EN EL CITOSOL

Las proteínas para degradar son poliubicuitinizadas para poder ser reconocidas por el proteasoma. La
ubiquitina/ubicuitina es una proteína de 76 aminoácidos, ubicua, termoestable, presente en todas las
células (en algunos casos histonas) y muy abundante. En algunos casos, histonas, se encuentra unida a
proteínas en número de uno o de pocas unidades.

PROCESO DE POLIUBIQUITINACIÓN

Lo que hace la ubiquitina es que a la proteína que reconocen y quieren eliminar, le añaden una
ramificación de ubiquitinas (poliubicuitinización) que serán reconocidas por el proteosoma que será lo
que produzca la degradación final.
• Enzima 1: activadora, forma enlace tioéster entre el grupo carboxilo de la ubicuitina y el azufre
de la enzima activadora
• Enzima 2: transportadora con grupo sulfhidrilo, se produce una transtioesterificación al pasar de
E1 hacia E2 liberándose E1.
• Enzima 3: reconocimiento de sustrato y pasa la ubicuitina a la proteína diana gracias al grupo
amino de la proteína.

118
PROCESO:
La ubiquitina es transferida al centro activo del enzima activador E1, gastando
ATP. Esa ubicuitina se transfiere al centro activo del enzima transportador (E2)
mediante una transtioesterificación y queda libre E1. Se recicla E1 y E2 transporta
la ubiquitina hacia formar el complejo con la proteína (unión mediante un enlace
isopeptídico entre una lisina del extremo amino de la proteína diana y el carbono
terminal de la ubiquitina) gracias a E3 y (enzima de reconocimiento de sustrato)
queda libre la E2. La E3 es la enzima que ha reconocido a la proteína. Este ciclo se
repite n veces.

RECONOCIMIENTO POR EL PROTEASOMA

Además de estar ubiquitinada (señal para que la proteína sea degradada) la proteína va a tener una serie
de señales que van a indicar que se tienen que degradar y que serán reconocidas por el proteasoma:
• Señales de aminoácido desestabilizante
• Señales PEST (ricas en Prolina, Ácido glutámico, Serina y Treonina)

El proteasoma es un conjunto de proteínas de 600 Kda formado por dos tipos de subunidades: 1 de 20S
y otras dos 19S (caps/lids→ hacen que sea funcional el proteasoma). La parte central está estructurada
en 4 anillos con 6 subunidades cada uno. Es muy abundante.

Se conocen inhibidores del proteasoma para que no se degraden las proteínas: se utiliza mucho en el
laboratorio el acetyl-leu-leu-norleucina (ALLN). Si se encuentra inhibido se fomenta la acumulación de
proteínas.

ENFERMEDADES

El que el proteosoma se encuentre inhibido va a favorecer la acumulación de proteínas, provocando

enfermedades graves por la acumulación de productos de degradación de proteínas mal plegadas, como
por ejemplo la enfermedad de Alzheimer por acumulación de beta amiloide mal plegada.

En esta enfermedad lo que ocurre es que en vez de formar una alfa hélice (forma habitual) se obtiene una
forma de beta plegada. Si se acumula sería patológico y se formarían agregados amiloides que son placas
de beta amiloide en el cerebro (deberían degradarse). A microscopio se observan como agujeros.

119
TEMA 8: INGENIERÍA GENÉTICA I. TÉCNICAS DE ANÁLISIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Con el nacimiento de la biología molecular surge la tecnología del DNA, la ingeniería genética (síntesis de
nuevas proteínas, transgénicos, clonaje…) y la localización de las alteraciones genéticas.

ENZIMAS MÁS UTILIZADAS EN BIOTECNOLOGÍA

Enzimas que vamos a utilizar en el clonaje:

• Nucleasas: mellan, cortan o degradan DNA. Son enzimas que van a degradar el DNA
• Ligasas: unen moléculas de ADN. Por ejemplo: ligasas de la replicación, reparación del DNA...
• Enzimas modificadoras: modifican añadiendo o eliminando grupos dentro del ADN. Por ejemplo:
T4PNK, T4 polynucleotide kinase CIAP, calf alkaline phosphatase, transferasas…
• Polimerasas: sintetizan ADN o ARN, o bien completan la síntesis de moléculas previas. Las vamos
a poder extraer de bacterias u otros organismos y así utilizarlas en el laboratorio para poder
modificar el DNA e introducirlo en un organismo y poder obtener genes distintos.

NUCLEASAS

Las nucleasas son enzimas que degradan el ácido nucleico hidrolizando el enlace fosfodiéster que une un
nucleótido al siguiente. Pueden actuar sobre dobles hélices o sobre hebras sencillas (ARN, ADN de cadena
sencilla como el cADN…). Hay dos tipos de nucleasas:
• Exonucleasas: actúan sobre los extremos del ADN, habitualmente de forma inespecífica.
• Endonucleasas: actúan rompiendo enlaces internos de la molécula de ADN. Son muy específicas
ya que pueden reconocer secuencias específicas, en cuyo caso se denominan
endonucleasas/enzimas de restricción.

Las endonucleasas de restricción pueden ser de tres tipos:

1. Tipo I: requieren ATP y realizan cortes en lugares inespecíficos. Pueden modificar el ADN, por
ejemplo: metilación.
2. Tipo II: no requieren ATP, no modifican el ADN y reconocen secuencias específicas.
3. Tipo III: requieren ATP, cortes en lugares específicos (reconocen secuencias) y pueden modificar
el ADN, por ejemplo: metilación.

120
ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN TIPO II
• Reconocen una secuencia concreta de nucleótidos: la secuencia frecuentemente es
palindrómica (podemos leer en la secuencia de arriba y la de abajo la misma secuencia) y de una
longitud típica de 6 nucleótidos (variando desde 4 a 20 nucleótidos).
• Un mismo enzima puede cortar más de una secuencia específica: por ejemplo la enzima Hinf1
corta en la secuencia GANTC siendo N cualquier nucleótido por lo que sirve para varias
secuencias.
• Se han caracterizado centenares de endonucleasas de restricción: hay disponible software
específico online que permite determinar las endonucleasas que cortan una molécula concreta
de ADN (mapa de restricción).
• Frecuencia de los cortes: depende del número de bases que contiene la secuencia de
reconocimiento. Estadísticamente, la frecuencia de corte sería uno cada 4^n nucleótidos (n=
número de nucleótidos en la secuencia reconocida). Cuántas veces va a cortar una enzima.De
acuerdo con esto, habría 1/256, 1/1024 y 1/4096 para n= 4, 5 y 6.

Corte romo no hay protuberancia es el caso del último,

corte simétrico de ambos extremos. Protuberancia es
como un saliente y en función de en qué cadena se
produce esa prolongación será 3’ o 5’.

Protuberante = cohesivo. En el extremo 5’ cohesivo, la

enzima identifica la secuencia y su complementario en
su otra cadena (la secuencia palindrómica) entonces se
dice que el corte se va a producir en GG. Entonces se
produce una protuberancia.

El nombre de las enzimas: como se extraen

de bacterias tenemos el nombre del género
(1ª letra), de la especie, de la cepa y el orden
(con números romanos) se suele utilizar la
primera y segunda letra del género.

121
MAPAS DE RESTRINCCIÓN

Tendremos un DNA generalmente circular (plásmido) porque trabajamos con bacterias. Este DNA tiene
una secuencia específica y podemos ver donde cada enzima realizará el corte. Esto nos servirá para:
• La identificación de DNA de diferentes bacterias.
• El diagnóstico: específicamente podemos diagnosticar mutaciones
ya que conoceremos la secuencia de DNA.
• Clonaje: tenemos un plásmido (DNA circular) que podremos cortar
para introducir un trozo de DNA externo.

IMAGEN: p viene de plásmido, tet significa resistente a tetraciclina y amp:

son genes (recombinación) que van a dar la característica de resistencia a
antibióticos. resistente a ampicilina.

ADN LIGASAS

Este tipo de enzimas en las células eucariotas y procariotas, tienen como función corregir las
discontinuidades en la hebra de ADN causadas en el mecanismo de replicación de la hebra retardada del
ADN por la reparación de errores en la replicación o por agresiones externas al ADN: químicas, físicas…

Su papel en la biotecnología es el de catalizar la unión de fragmentos distintos de ADN, tanto si son

romos, como si son cohesivos (protuberantes). Unimos fragmentos rotos. Favorecen la formación del
enlace covalente fosfodiéster entre 3’-OH y 5’-fosfato.

ACCIÓN DE LAS DNA LIGASAS:

IMAGEN: en el carril ‘none’ no hay ligasas y observamos distintas

franjas del DNA que representan los diferentes fragmentos de ADN
y su tamaño. 2º carril: la ligasa se define en unidades internacionales.

Con 2 unidades de ligasa, la mantenemos 5 minutos en el tubo; con

otras 2 unidades la mantenemos 45 mins, con una concentración de
0,2 (menor) 45 min también, e igual otros 45 min con concentración
de 0,02...

¿Cuál utilizaríamos a raíz de esta electroforesis?

• Usaremos la de 2 unidades 5 minutos. Apreciamos todo el DNA unido mientras que en el 4º carril
y el último los fragmentos siguen separados aunque estemos mucho tiempo.
• Las bandas superiores que no vemos nos indica que la mayor parte del DNA está unidos.

122
PROCESO:
Tenemos el plásmido al que queremos introducir un fragmento de ADN, y el ADN circular con todas las
enzimas y su mapa de restricción así como su resistencia a antibióticos.

Yo busco cortar el plásmido (usando enzimas de restrincción) para insertar un fragmento de ADN y así
introducir un gen que no contenga la bacteria por sí sola.
Para ello debemos cortar las 2 partes con la misma enzima, tanto en el plásmido como en el fragmento
de ADN que busco introducir. Así la ligasa puede realizar la unión en las dos partes, mediante la formación
de enlaces fosfodiéster entre el plásmido y el fragmento quedando este incluido. Para que la ligasa los
pueda unir, tienen que coincidir los extremos del ADN y del plásmido y por complementariedad las ligasas
serán capaces de unirlos.

FOSFATASA ALCALINA

Hay enzimas denominadas modificadoras ya que modifican el ADN como la fosfatasa alcalina. En función
de la secuencia que tengamos en nuestro fragmento escogeremos una u otra enzima que modifique pero
esa misma enzima tendrá que cortar tanto el plásmido como el fragmento para que encajen.

Lo que intentamos realizar es que el fragmento rosa (foto arriba)se introduzca pero
a veces el fragmento no queda unido, bien porque la secuencia es complicada o
porque las enzimas no cortan muy bien. Esto lo evitamos utilizando la fosfatasa
alcalina que desfosforilará (eliminar grupos fosfatos que quedan expuestos por la
enzima de restricción) el vector en el que quedan expuestos los grupos fosfatos de
forma que solo queden libres los OH de los extremos.

Luego añadimos la ligasa junto con el vector. Al tener los grupos fosfatos ya si que
puede introducirse y nos aseguramos de que el fragmento pequeño/inserto quede
introducido en el plásmido. Esto normalmente no se hace ya que lo normal es que
se una bien. Solo lo hacemos en casos en los que la enzima no corte bien, las
secuencias son difícilmente reconocibles… Para evitar la recircularización que es
muy fácil añadimos la fosfatasa alcalina (CIAP) como paso previo. Después
debemos inhibirla usando 75º durante 10 minutos con 5mM de EDTA.

123
TRANSFERSAS TERMINAL

Es un tipo de ADN polimerasa que cataliza la adición (transfieren) de nucleótidos al extremo 3’ de un ADN
(extremos 3’ colgante, romo, en DNA lineal o doble).

Tenemos un ADN romo y un cADN que no son compatibles. Para eso las enzimas transferasas terminales
añaden G en el plásmido y C en el cADN y así producen que sean complementarios. Creamos extremos
cohesivos/compatibles y así favorecemos que el inserto pueda introducirse mas fácilmente en el
plásmido que antes no podíamos introducir dada la complementariedad de bases.

Propósito: facilitar los ensayos de clonación cuando no hay extremos compatibles.

RETROTRANSCRIPTASAS

Las retrotranscriptasas son ADN polimerasas ARN

dependientes.
Tenemos una secuencia de ARN mensajero y a partir de ese
ARNm usaremos una retrotranscriptasa inversa para obtener el
cADN. Este suele ser a partir de un primer de ADN denominado
oligo dT en los que hay muchas timinas complementarias a las
colas de poli-A (en todos los ARN, eucariotas). Va a facilitar a la
transcriptasa reversa sintetizar el DNA complementario a partir
de ese RNA. Una vez tenemos el cADN ya se puede replicar de
forma normal y conseguir así una doble hélice.

Utilizamos estas enzimas para:

• Generación de cDNAs de doble hebra para construir genotecas de expresión
• Generación de cDNAs de cadenas sencillas con los que realizar RT-PCR (retrotranscripción)

CONFERENCIA DE ASILOMAR (1975)

Un grupo de investigadores en este campo e inquietos con las consecuencias de su investigación, se

reunieron para proponer una moratoria en los trabajos del ADN recombinante en relación con:
1. La replicación autónoma de plásmidos bacterianos que puedan introducir determinantes
genéticos para resistencia a antibióticos o la producción de toxinas.
2. Unir ADN de virus animales, oncogénicos o no, a elementos de ADN capaces de replicar
autónomamente, tales como los plásmidos bacterianos u otros virus.

124
 3. Para evitar riesgos de diseminación de las nuevas moléculas de ADN recombinante deberían
establecerse barreras biológicas y barreras físicas de seguridad. Está muy legislado y controlado.
Se trabaja en centros con mucha supervisión en los que incluso hay campanas de seguridad y
otro tipo de barreras físicas.

Podemos modificar ADN de animales introduciéndoles ADN que no son suyos usando ADN recombinante:
animales transgénicos, o les falta un gen o tienen genes humanos…
• Knock out: falta un gen
• Knock in: tiene un de más

TÉCNICAS DE ANÁLISIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS

DESANATURALIZACIÓN DEL ADN Y EFECTO DE HIPERCROMICIDAD

El ADN en una disolución está en una doble hélice superenrollado por lo que la solución es viscosa (soga
rígida). Esto si se le aplica temperatura, agentes desnaturalizantes, se desnaturaliza, rompiéndose los
puentes de hidrógeno que unían ambas cadenas. Esto va poco a poco hasta que se produce la disociación
completa cuando ya podremos decir que está totalmente desnaturalizado. Absorbe más radiación a
260nm que cuando está hibridado.

Hipercromicidad: el ADN de forma sencilla absorbe

más radiación que una cadena de doble hélice unida,
porque los nucleótidos libres absorben más luz UV
que cuando están apareados.

Temperatura de fusión (tm, melting temperatura): es

la temperatura a la cual la cadena de ADN está
semidesnaturalizada (50%, la mitad del ADN está
desnaturalizado). La temperatura de fusión va a ser
mayor cuando mayor sea la cantidad de guaninas y
citosinas, debido a los 3 puentes de hidrógeno que
hay entre ambas (frente a 2 puentes de hidrógeno
entre adenina y timina).

TRADUCCIÓN NICK

Marcaje radiactivo de sondas de DNA (la sonda marcada emite radiación)

Aprovecharemos las características de la ADN polimerasa I con su actividad de nick translation que
eliminaba cebadores.

En primer lugar añadimos DNAasa que produce un corte (nick o

mella) en el ADN (lo daña) dejando un grupo -OH libre en el
extremo 3’ y grupo fosfato libre en el extremo 5’. Posteriormente
añadimos la ADN polimerasa y se añaden también dNTP
marcados con P32 y los dNTP fríos (no marcados). La polimerasa
sintetizará en base a la cadena complementaria pero con el
marcaje radioactivo.

125
TRANSCRIPCIÓN IN VITRO: ARN POLIMERASAS DE BACTERIÓFAGOS

Otra forma de marcaje de sondas cuando tenemos ARN.

1. Generación de ribosondas marcadas radiactivamente pero
utilizando una transcripción in vitro. Usaremos plásmidos de
origen viral, bacteriófagos que nos ayuden a sintetizar estas
ribosondas.
En el plásmido (que son de origen viral) aparece un promotor
de la ARN polimerasa que sintetizará el ARN. El BamHI es una
enzima de restricción que nos va a permitir linealizar ese
vector. Se añaden ya los ribonucleótidos que, aprovechando
el promotor, serán añadidos utilizando la ARN polimerasa. Lo
que hacemos es realizarlo en el laboratorio por lo que solo es
necesario añadir la ARN polimerasa y los ribonucleótidos que
pueden o no estar marcados radiactivamente. Conclusión: es
igual que la sonda de DNA pero utilizando RNA para obtener
las ribosondas.
2. Se utilizará en la expresión dirigida de proteínas (transcripción-traducción acopladas in vivo/in
vitro).

Las RNA polimerasas más usadas son la Sp6, T7 y T3 ARN que sólo reconocen sus promotores de origen
viral. ARN Polimerasa de E.coli no reconoce esos promotores.

CONCEPTO HIBRIDACIÓN Y SUS TIPOS

Consiste en producir la desnaturalización del ADN para que se separen las dos cadenas, añadir un ADN
catenario complementario y que esté marcada (para poder detectar ese ADN) y conseguir que se unan
por complementariedad de bases.

126
 Podemos hacer que nuestra molécula de ADN se desnaturalice
haciendo que se vuelva a naturalizar uniéndose a una cadena
complementaria que tiene señalización (sonda marcada). Partimos de
una molécula de ADN doble y añadimos una sonda marcada
complementaria a una zona de la secuencia. Es necesario conocer esa
zona para utilizar la sonda en el sitio exacto. Se puede hibridar el ácido
nucleico con la sonda marcada y con ello, ese ADN va a ser
inmovilizado, pasándolo a un soporte sólido.

La propiedad anterior la vamos a utilizar en el concepto de hibridación. Para poder localizar el ADN
necesitamos que se una a algo que nos permita localizarlo, nos lo haga visible, utilizando una cadena
complementaria que lleve una señalización (luz, color...)

Desnaturalizo el ADN, introduzco una sonda marcada (para poder

identificar el ADN que puede ser luz, radiactividad...) que se une a él por
complementariedad de bases y después vuelvo a renaturalizar el ADN
con una molécula externa que tiene una secuencia complementaria (se
tienen que poder volver a formar los puentes de hidrógeno).

La hibridación en condiciones experimentales de alta selectividad

garantiza la especificidad en la interacción. Se van a añadir las sondas y
vamos a tener una mezcla de ADN y queremos visualizar solo el gen A
entonces queremos que solo se unan al A. En unas condiciones de
hibridación astringentes, muy selectivas y específicas para que la sonda
se una al gen que nos interese.
Ahora mi propósito es localizar moléculas de ADN con secuencia
parecida a A, en este caso la hibridación también es al 50% pero
bajamos la temperatura, lo que hacemos es que además de formarse
complementariedad con A, la sonda, aunque no de forma completa
también se une a las parecidas (c, e) y damos más amplitud.

RESUMEN:
• Si necesito especificidad: mayor temperatura y por tanto más difícil que se forme la doble
cadena. Solo en las que sean completamente complementarias, idénticas
• Si busco permisividad, obtener más moléculas, es decir, mayor cantidad de moléculas similares
no iguales: bajo la temperatura, astringencia reducida.

Respuesta ante el estrés del retículo endoplasmático, cuando

no se produce un plegamiento correcto de proteínas: UPR,
respuesta a proteínas sin plegar, hay 3 mecanismos:
• ATF6 (factor de transcripción activador 6): son
factores de transcripción, producirán más
chaperonas que van a producir el plegamiento de
proteínas, ya que el RE no puede por el estrés.
• Enzima que requiere inositol, IRE1: facilita que se
produzcan una serie de fosforilaciones
• Quinasa de estrés de retículo, PERK: van a fosforilar
ese factor específico de iniciación y se va a producir
una reducción del mismo.

127
TIPOS DE HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS:
Tipo de interacción entre: ADN (fragmento pequeño)-ADN (molécula) / ADN-ARN / ARN-ARN.
Principalmente vamos a ver sondas de ADN, pero también existen de ARN.
• Hibridación en filtro: normalmente de nitrocelulosa o celulosa, donde tenemos inmovilizado el
ADN o el ARN (la sonda no va a estar inmovilizada).
o Southern (ADN-ADN): hay uno inmovilizado y usaremos sondas
o Northern (interacción ADN-ARN): el ARN es el inmovilizado, es un poco más antigua y
está siendo reemplazada por la RT-PCR.
o Colony Hybridization: colonias bacterianas sobre un soporte.
o Dot-blot: se inmovilizan bacterias en el filtro.
• Hibridación en solución: más complicada, se usa menos.
• Hibridación in situ: vamos a utilizar en vez de la molécula como tal, se emplean tejidos y se o
cromosomas, pero no tenemos completamente inmovilizado el ácido nucleico. Se ve como se
hibrida de forma directa.

HIBRIDACIÓN IN SITU

En vez de la molécula como tal, se emplean tejidos o cromosomas, pero no tenemos completamente
inmovilizado el ácido nucleico. Vamos a utilizar la sonda que se va a unir al órgano directo. Donde se ven
las zonas más oscuras es donde hay expresión del gen. No estamos extrayendo nada, ni ARN, ni ADN,
estamos marcando directamente un tejido. Se utiliza mucho con embriones porque se ve donde se
expresa ese gen específicamente.

IMAGEN: en la imagen del embrión las manchas oscuras como x la columna es por
donde se expresa.
Hemos usado una hibridación in situ con sondas específicas de RNA para ese gen.

TÉCNICA DE FISH (fluorescent in situ hybridization)

Hibridación in situ que se realiza en cromosomas: cariotipo. Añadimos una sonda que me va
a marcar las bandas en los cromosomas. En el cromosoma homólogo tenemos la banda verde
pero no la roja, esto nos indica que ha habido una delección en uno de los brazos que dará
lugar a una enfermedad. La técnica la podemos emplear no solo con color sino también con
luz. Esta técnica se utiliza para ver si hay deleciones, translocaciones…

SOUTHERN

Transferencia e hibridación. Interacción ADN-ADN, tenemos una sonda de ADN y ADN inmovilizado en un
filtro. Proceso:
1. Se corta el ADN (fragmentarlo) con enzimas de restricción, utilizando ADNsas

2. Se somete el ADN fragmentado a una electroforesis en el gel de agarosa: tenemos ADN fragmentado,
tenemos en cada tubo muestras de ADN y se ha añadido a cada tubo el buffer de carga (proporciona las
condiciones óptimas para el proceso) porque el ADN es transparente. En cada pocillo con las diferentes
muestras estas se irán hacia el fondo. Con tris-EDTA hacemos una solución líquida y cuando solidifica,
usaremos unos pocillos como en forma de peine. Ese gel con los pocillos lo dejaremos en una cubeta de
electroforesis.

128
Lo vamos a someter a cargas eléctricas que van del polo positivo al negativo y que hace que arrastre las
moléculas de DNA que se encuentran en los pocillos. Gracias al EDTA evitamos que sea degradado por las
enzimas.
Para interpretar los resultados, en el primer pocillo se va a cargar un marcador ya que nosotros sólo
tenemos fragmentos de ADN por las enzimas de restricción. Los fragmentos, que por el peso del buffer se
encuentran en el fondo, recorrerán el gel por la corriente eléctrica de forma que se detienen en distintos
puntos según sus tamaños.
Correrán antes los fragmentos más pequeños porque el agar es un entramado, pasarán más fácilmente
las más pequeñas. Los fragmentos de ADN de tamaños conocidos los ponemos en el primer pocillo para
poder comparar nuestra muestra con los tamaños de las muestras del ADN conocido en el primer pocillo.
El glicerol aporta la densidad para que no floten y vayan al fondo de los pocillos. Encima, es azul para
poder verlo.
Conectamos la corriente y comienza la electroforesis. El ADN es negativo por lo que migrará del polo
negativo al positivo. En cuanto vaya avanzando, detendremos la corriente justo antes de llegar al otro
frente.
El bromuro de etidio es un agente quelante (mutante) que se usa en muchas técnicas de biología
molecular y se intercala entre las moléculas de ADN para visualizarlo ya que en presencia de UV emite
fluorescencia.
Al incidir luz UV en el gel observamos hasta donde ha corrido. La distancia que han avanzado es
inversamente proporcional a su tamaño. Para estimar el tamaño lo comparamos con la realizada de
tamaño conocido. Para documentar el resultado se hace una foto del gel.

3. Transferimos el DNA a una membrana de transferencia por capilarización. Normalmente a un filtro de

nitrocelulosa.
Ponemos un cristal y encima nuestro gel, pero antes del gel ponemos papeles de filtro cuyos bordes van
a estar en contacto con el líquido, sobre él se coloca el gel y encima el filtro de nitrocelulosa y luego
sobre este vamos a poner una serie de papeles (más papeles encima del de nitrocelulosa) y luego un libro
gordo y se deja durante toda la noche. El peso va a hacer que el líquido sea absorbido por el papel y
arrastre el ADN desde el gel hasta el filtro de nitrocelulosa. De esta forma, todo lo que estaba en el gel
van a pasar a este filtro.

4. Añadimos fragmentos marcados de ADN a la membrana esa para hibridar, y la sonda radiactiva por
complementariedad se unirá al ADN, dependiendo del grado de especificidad que quiera, lo realizaré a
una determinada temperatura u otra (si quiero que se una a ambas moléculas utilizaré una temperatura
más baja.

129
INTERPRETACIÓN DE UN SOUTHERN:
Partimos de que vamos a utilizar un ADN de secuencia conocida en el que hemos usado enzimas de
restricción (HindIII) y nos quedan un fragmento de 4 kilobases, uno de 2 y otro fragmento que no sabemos
(del resto del plásmido). Se han usado dos sondas, la A complementaria a la primera zona y la B
complementaria a la segunda zona.
¿A qué fragmento se asociará la sonda A (sonda radiactiva)? al de 4 kilobases. ¿A qué se une la sonda
B? a ambos fragmentos, al de 4 y al de 2. Esto nos demuestra que la enzima HINDIII funciona porque ha
cortado. Si por ejemplo hubiera una mutación no cortaría, por lo tanto el tamaño sería de 6kB porque al
haber mutación en el sitio de corte no se separa en los fragmentos de 2 y 4.

Resumen: la sonda B se unirá a un trocito de DNA de 4Kb y a otro trocito de KB (suficiente para ser
observable) y la sonda A, se unirá solo al de 4kB. Si las enzimas de restricción están mutadas, no cortarán
el DNA y ambas sondas se unirán al de 6KB.

Sabemos que tenemos en 3 sitios a HINDIII. Lo que hacemos

es que este plásmido lo añadimos a un tubo con una enzima
y se producirá corte en esos sitios.
Los tamaños de cada fragmento son de 4, 2 y 10 (kilo bases)
ya que está linearizado, no es circular.
Una sonda (A) se unirá al fragmento de 4 (la sonda a) de forma
que en el southern encontraremos solo la banda de 4.
La sonda B se puede unir a los fragmentos de 4 y de 2 por lo
que visualizaremos ambos fragmentos. No quiere decir que
estén los 2 unidos pero como por complementariedad,
aunque no completa, se unen pues los visualizaremos en las
bandas.

Entonces con la sonda B podremos ver ambos fragmentos a distintas alturas en el southern. Se podría
dar el caso de que la enzima no corte bien, por lo que podríamos tener una banda de 6 y observaremos
tanto a A como a B. Si existe mutación ese corte entre 4 y 2 no se produce *no se puede unir la sonda.

NORTHERN

Se trata de ARNm inmovilizados que se hibridan con sondas moleculares de ADN (son más comunes las
sondas radiactivas).Es ARN-ADN y vamos a ver la expresión.

Los house keeping o genes controles, son genes que se expresan prácticamente en todos los tejidos. Estos
genes sirven para ver la cantidad de ARN añadido en cada uno de los pocillos, y sirve también de control
si, por ejemplo, en una de las bandas no hemos detectado el gen, de manera que se pueda comprobar si

130
es que realmente no hay del gen que buscamos o es que no hay ARN bien porque se ha degradado o por
cualquier otra cosa.

Se extrae el ARNm de distintos tejidos de humanos (corazón, pulmón, hígado…). Se somete a una
electroforesis (tenemos un gel, lo pasamos al filtro…) y le añadimos la sonda marcada del gen que
queremos ver. Buscamos ver cómo ese fragmento se une específicamente (a ese ARNm específico).
Queremos ver si tenemos expresión: si se une la sonda es que ese ARNm se expresa en la muestra que
estamos mirando.
Llevamos a cabo el mismo proceso: poner las muestras, se corre en un gel, tenemos el filtro de
nitrocelulosa y se hace hibridar con la sonda de lectina, obteniendo unión en los diferentes tejidos.

IMAGEN: no hay expresión de lectina en el

corazón, muy poquito en pulmón, en hígado
hay mucha (donde mayormente se expresa) y
en riñón un poquito, depende del marcaje. En
la imagen de la derecha hay mucho en hígado
y un poco en riñón y bazo.

¿Por qué tenemos dos bandas?

Porque hay dos isoformas de la misma proteína (debido al splicing alternativo), se produce splicing
alternativo, en él en el ARNm tenemos el exón 1 que se une al exón 3 mientras que los intrones 1 y 2 se
eliminan junto con el exón 2. Si yo tengo una sonda que se une al exón 5, detectare a la isoforma del
hígado? si y la de la célula beta pituitaria? también. Mientras que una te quitas 30 kb en otra no, ambas
isoformas tienen distinto peso porque depende del número de bases, exones una tiene más y otra menos.
Tenemos 2 isoformas porque la sonda se une a ambas.
Normalmente las isoformas se expresan en tejidos diferentes pero puede, como en este caso, expresarse
ambas en el mismo tejido.

¿Qué es lo de beta-actina?
Es una proteina de control que aparece en cada uno de los órganos. Pongo un control de B-actina (o
también ciclofilina o gel GDPH) y me dice que en el corazón, pulmón, hígado y riñón he puesto más o
menos la misma cantidad de ARN, así me aseguro de verdad de que por ejemplo en el corazón no se
expresa el gen que estoy estudiando (lectina), y esto no se debe a que no haya puesto el ARN que codifica
para lectina.
En un northern siempre vamos a tener lo que denominamos control de carga para poder comprobar que
hay las mismas cantidades/concentraciones de ARN y que verdaderamente he cargado ARN en el pocillo.
En la beta actina de adultos: también se ven dos bandas como si fuesen dos isoformas, vemos en la
proteína de control que he puesto más cantidad de RNA en corazón y en músculo esquelético

131
WESTERN (PROTEÍNAS)

Detección de proteínas mediante anticuerpos, transferencia a nivel de proteína. Lo que tendremos en

ese gel de poliacrilamida son proteínas.
1. Introducimos en los pocillos las proteínas (no aann) de las
distintas muestras y lo transferimos a una membrana
porosa.
2. Para hacer la detección de las proteínas que me interesan,
incubo con anticuerpos. Uso un anticuerpo primario, que
se unirá a la proteína de interés (por ejemplo: quiero
identificar la proteína lectina, uso un anticuerpo primario
que se una a la muestra que exprese lectina).
3. Luego se lava para que no quede manchado de otra
reacción y se quita el exceso de anticuerpo primario.
4. Ahora lo incubamos con el anticuerpo secundario (que me
permitirá visualizar el primario) y lo marco con color,
radiactividad, luminiscencia… Este anticuerpo secundario
se une al anticuerpo primario entonces quedarán ambos
unidos a la muestra que expresa lectina.
Para visualizar, añadimos un sustrato que reacciona con la enzima y me produce color, entonces se
produce una banda (por ejemplo con color, o fluorescencia). En el caso de radioactivo no añado nada (ya
emite por si solo radiación). La sonda se une cuando se une el anticuerpo primario y emite radiación.

IMAGEN: lo rojo es el anticuerpo secundario y el verde

es el anticuerpo primario

El anticuerpo primario se une al anticuerpo

secundario, el cual actúa como una enzima que
reacciona con un sustrato generando producto
coloreado. En la imagen vemos un ejemplo de
quimioluminiscencia (emite luz) si hay una expresión
de lectina.

El marcador también se usa con las proteínas, vemos que hay diferentes tamaños. Las proteínas están
en el gel y las pasamos al filtro de nitrocelulosa y vemos que se ha producido color (diferentes por los
distintos tamaños).

Bandas inespecíficas: el anticuerpo se une no porque se haya

expresado la proteína.
Por ejemplo, en la imagen las bandas específicas son la 4 y la 5,
pero en la 1 hay algunas inespecíficas porque el anticuerpo no
se une sólo a la proteína que buscamos.

Para saber si es específico o inespecífico: cuando te lo venden

te dicen a que se tiene que unir y qué tamaño tiene, entonces si
se tiene que unir a lectina que pesa 30 kd, pues la que tengo 30
kd será esa, y las de otro tamaño será inespecífica.

132
HIBRIDACIÓN EN DOT-BLOT

Casi no se utiliza. Vamos a poner directamente la cantidad de ADN

en ese equipo donde se pone el filtro donde tenemos el ADN de
cada una de las muestras (se hace todo el uno: se pasaba
directamente al filtro). Lo marcamos directamente en el filtro y
vemos si tenemos mayor o menor cantidad de ADN. También
observamos controles positivos y negativos.

SECUENCIACIÓN

SECUENCIACIÓN DEL ADN

Frederick Sanger and ADN Model. British biochemist Professor Frederick Sanger recibió su segundo
Premio Nobel en química en el año 1980. El primero lo recibió en 1958 por sus estudios sobre la estructura
de proteínas y en especial sobre la insulina.

EXPERIMENTO:
Decía que se podía leer la secuencia de la dsDNA.
Partimos de una secuencia de ADN (secuencia modelo o template, en azul), y vamos añadiendo en cada
tubo 2,3 didesoxinucleótidos trifosfato de cada tipo (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTPT). Para que la ADN
polimerasa pueda sintetizar ADN debe haber un grupo OH en posición 3’ (necesitamos un primer).
Esto sirve para sintetizar DNA hasta donde queramos ya que no continúa la polimerización, sino que la
detiene. Sirve para saber que nuclótidos constituyen la secuencia diana (template).

133
A cada tubo añadió un primer, una ADN polimerasa y dNTP (diferente en
cada uno):
• Primer tubo : dideoxiadenosíntrifosfato.
• Sgundo tubo: dideoxicitidíntrifosfato.
• Tercer tubo: dideoxiguanosíntrifosfato.
• Cuarto tubo: dideoxitiminatrifosfato.

Tubo 1: 2 fragmentos
• Primero añade la A (ddATP) (la dideoxi no tiene grupo OH en posición 3’ y se para).
• Aquí añade la dATP y posteriormente la ddATP , justo se acaba la secuencia y no se sintetiza más
porque no hay grupo OH libre en el 3’

Tubo 2: 3 fragmentos
• Añade la citosina dideoxi y se para
• Añade la citosina deoxi, la ADN polimerasa sigue sintetizando, añade la dideoxi (ddCTP) y se para
• Añade las dos deoxi y finalmente la dideoxicitosina

Tubo 3: 2 fragmentos
• Añado la ddGTP y se para
• Añado la dGTP y la ADN polimerasa sigue sintetizando hasta que añado la ddGTP y se para.

Tubo 4: 3 fragmentos
• Añado la ddTTP y la ADN polimerasa se para
• Añado la dTTP y la ADN polimerasa sigue hasta que añado la ddTTP

Conclusión: si añades base normal deoxi, tiene grupo OH para continuar sintetizando, si se añade dideoxi,
al no tener grupo OH en la posición 3’ se para.

Los fragmentos obtenidos en los tubos los metemos en un gel de agarosa, metemos cada tubo en un
pocillo distinto y corremos el gel. En la cuadrícula, cuanto más abajo esté menor tamaño tendrá y las
líneas equivalen a los diferentes fragmentos, y las de una misma columna son los fragmentos resultado
de cada tubo.

El primer fragmento grande es una A, el tercero G el cuarto T, quinto G y así sigo leyendo hasta que llego
a la citosina. Si tengo una secuencia que no conozco, puedo hacer este experimento y con la solución que
me de, puedo sacar la secuencia del template por complementariedad ya que la solución es justo la
secuencia complementaria del template (el template no lo conocemos). Interpretamos gel leyendo desde
el fragmento más grande.

RESUMEN:
Quiero saber la secuencia problema o template (que no conocemos) y para ello separo el DNA en
fragmentos en el orden en el que se añaden los desoxinucleótidos, los corremos en el gel y obtenemos la
secuencia complementaria al template. Leemos desde el fragmento más grande (el primero que sale en
la parte superior) al más pequeño.

134
SECUENCIACIÓN ENZIMÁTICA

Actualmente hay equipos que la realizan de forma rápida. Usamos el experimento previo, pero de forma
enzimática.
• Tenemos la secuencia template (no la conocemos)
• El primer: debo saber alguna parte de la secuencia template para incluir este primer de un
plásmido.
• dNTP’s (se marcan radiactivamente), añado el ddNTP (dideoxido).

En cada tubo tengo los segmentos marcados radiactivamente y con color. Es una reacción enzimática que
produce color. En el gel tendré los distintos fragmentos de color.

Esto es lo que ocurre en la actualidad; no hay radiactividad y con lo que se continua es con los colores
añadiendo cebadores marcados con fluorocromo tetrametilrodamina (color según el del dNTP). Las C
naranjas, las G verdes, las A rosas y las T azules.
Si hacemos incidir un láser sobre esas moléculas podremos tener impreso en un ordenador y conocer si
se trata de una base o de otra y además con distinta intensidad. En los nucleótidos que no se observan
picos es porque no son esos. El pico indica de qué molécula se trata al estar bien definidos.

135
Ya tenemos geles de acrilamida en un tubo vertical. Sale un patrón de secuenciación gracias al láser. Los
picos mejoran con el tiempo.

Es un cromatograma, empezamos en el 1. Tenemos todas las

secuencias.
En el principio aparecen unas N que representan que el cebador
no se ha enganchado bien y que la ADN polimerasa no ha
podido comenzar bien su reacción, por eso no vemos picos tan
definidos.

A partir del 80 ya vemos que la ADN polimerasa se ha unido del

todo y se sintetiza la cadena bien. (se suele descartar por tanto
la primera parte). A veces aparecen 2 picos o 4 picos y no se
reconoce bien.
Por ejemplo: tengo un inserto que hemos añadido al plásmido con las enzimas de restricción y quiero
saber la secuencia. Lo que hago es usar un primer que está en el plásmido (plásmido: ADN que conozco)
y secuencio todo el plásmido y así conozco la secuencia desconocida que le he introducido. Esta técnica
es de lo último, es cara, nos permite conocer secuencias y ver en los cromatogramas si hay alguna
mutación comparando dos cromatogramas de dos pacientes.

Muchas veces las máquinas dan errores y es necesario hacer varias secuenciaciones partir de distintos
sentidos y ver que están bien, para ello usamos 2 o más primers, según el nº de secuenciaciones que
vayamos a hacer.

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

Se trata de una serie de ciclos en los que se llevan a cabo procesos de

desnaturalización, renaturalización y síntesis de ADN en cadena.
Hay un ADN que se utiliza como molde. Se añaden los primers, la polimerasa que
es termoestable, generalmente se usa la ADN polimerasa Taq, y por último los
nucleótidos.

Lo primero que ocurre es la desnaturalización de ADN de modo que se abren las

hebras, posteriormente se produce el anillamiento de los primers por
complementariedad en las dos direcciones y la síntesis de la cadena
complementaria de cada hebra, de manera que se obtienen dos dúplex. Tras este
primer ciclo, se puede llevar a cabo otro en el que a partir de dos hebras se
obtengan cuatro, tras esto otro, en el que a partir de cuatro hebras se sinteticen
ocho y así sucesivamente.

136
Elementos: secuencia diana, cadena molde que sirve como molde para que a partir de las dos primeras
que anillan con cada una de las cadenas, la taq y los dntp se pueda amplificar el ADN.

Condiciones en cada ciclo:

• Separar la doble cadena para que el primer se pueda anillar. Para eso se calienta la muestra a 95
grados para desnaturalizarse. Es vital esta primera desnaturalización.
• Luego enfriarlo a 70ºC para que anille el primer. Esto ocurrirá en el paso inicial de cada ciclo.

IMAGEN: ADN está superenrollado y se separa, luego los

primers se unen y la ADN polimerasa sintetiza una copia
de DNA. (2^n)

POLIMERASAS IMPLICADAS EN LA PCR

La ADN polimerasa termoestable (enzima), incluso en el primer paso hay que calentar la muestra, necesita
un aumento de temperatura.

Hay distintos tipos dependiendo de si tienen actividad 3´→ 5´ exonucleasa (proofreading:

• Taq polimerasa: no tiene actividad 3’ à 5’ exonucleasa o de proofreading, por lo que tiene una
mayor probabilidad de error. Va a polimerizar sin ningún parón, ya que no puede corregir
mientras va sintetizando.
• Pfu y Vent: sí que tienen actividad exonucleasa por lo que la tasa de error es menor. Ambas son
termoestables y su vida media es de 7 horas.
En algunos momentos requerimos Taq cuando no nos influya tanto cometer errores pero si buscamos una
completa fidelidad usaremos las otras 2.

La reacción se inicia gracias a los primers, cebadores u oligos. Hay que diseñarlos y para ello necesitamos
unas condiciones esenciales que usamos en la PCR, las cuales son:
• Tamaño entre 15 y 25 nucleótidos: para que tengan buena capacidad de anillamiento.
• Temperatura de fusión entre 50 y 65 ºC: depende mucho del contenido de G+C
• Contenido en G+C entre un 40% y un 60%.
• Sin apareamientos internos por autocomplementariedad. Si se complementan, se unirían entre
sí y no se unirían a la cadena, que es lo que realmente queremos.

137
 • Sin apareamientos 5’-3’ entre los oligos de la misma pareja por complementariedad de
secuencia en los extremos.
• Cálculo de Tm (temperatura de fusión, melting temperature): 2x(A+T)+4x(G+C) en grados
centígrados. A = contenido de adenina...
A día de hoy esto está automatizado y al introducirlo en el ordenador no tendremos que calcularlo sino
que el programa nos lo dará y trata de que siga todas estas características.

CICLOS DE LA PCR

Lo que vamos a ver es la cantidad de ADN (bandas) y en los termobloques ponemos el tubo con todos los
componentes. Sufren una serie de ciclos (en el primero subimos hasta los 95º para que se produzca la
desnaturalización). En este momento se separa la doble cadena y cuando termina se baja la temperatura
normalmente hasta los 55º para que se produzca el anillamiento de los primers (primero baja a 70ºC y
luego a 55ºC)
Una vez ya hay anillamiento, en el 3º ciclo, se aumenta la temperatura a los 72ºC y ya comienza la síntesis
de la cadena complementaria. En este momento ya se ha sintetizado la cadena de ADN en ese ciclo y
rápidamente sube la temperatura para comenzar el nuevo ciclo (todo se repite entre 25 o 30 ciclos).
En el ciclo 30 (el último) el termobloque pone la temperatura de los tubos a 4ºC y se mantiene hasta que
la persona que hace la PCR recoge la muestra.

Esto es síntesis de ADN, las PCR de ahora con el covid no solo es esto,
porque los virus suelen ser de ARN y aquí no podemos meter ARN.
¿Que deberíamos hacer previamente a la PCR? pues pasar con la
retrotranscriptasa inversa el ARN a ADN. ARN → cADN → dsADN → PCR.
La retrotranscriptasa se usa para:
• Generación de cDNAs de doble hebra para construir genotecas
de expresión
• Generación de cDNAs de cadenas sencillas con los que realizar
RT-PCR

138
PCR STANDARD VS PCR TIEMPO REAL

PCR estándar: vemos o hacemos el análisis en el punto final, corremos la muestra en un gel de
electroforesis y vemos la cantidad de ADN que hay al final de los 30 ciclos.

PCR a tiempo real (RT-PCR): vamos a tener un análisis de la cinética de la reacción, vamos a detectar el
producto en cada ciclo de la reacción. Existen equipos que proporcionan la cantidad exacta en cada ciclo
de la reacción. Básicamente puedo ver como aumenta la concentración de mi producto en cada ciclo de
la reacción. Si pongo RT al final significa que es una retrotranscripción PCR.

DETECCIÓN DEL PRODUCTO EN CADA CICLO DE REACCIÓN (RT-PCR)

Como hemos dicho en la PCR a tiempo real podemos saber la cantidad de producto que tenemos en cada
ciclo de reacción, esto se puede hacer de varias maneras: gracias a compuestos o reporteros
fluorescentes.

COMPUESTOS FLUORESCENTES:
Son compuestos que emiten fluorescencia cuando se unen a un dsADN, mediante una interacción
inespecífica. Algunos de estos son: Sybr green (el más usado), EtBr, YOYO-1, entre otros...
Pueden unirse a dímeros, dos primers se unen formando un dímero y emiten fluorescencia.

REPORTEROS FLUORESCENTES: son más específicos.

• Beacons moleculares: fluoróforo que emite señal cuando el agente bloqueador
(Quencher) se encuentra alejado por efecto de la hibridación a la secuencia target.
El fluoroforo se encuentra en un extremo, después de la parte que presenta
complementariedad y se haya bloqueado por el quencher. La molécula beacon en
esa situación al no unirse a la diana no emite fluorescencia porque el agente
bloqueador se lo impide.
Si se hibrida, el beacon (que es parecido a la sonda) se une por complementariedad
y lo que ocurre es que el fluoróforo se separa del quencher y emite fluorescencia
(cuando se une a la cadena). El beacon se une al ADN y es en ese momento cuando
podremos visualizarla (por la hibridación producida).

• Sondas Taqman: los que más se utilizan. Es una sonda que va

a hibridar, tenemos una hibridación (muy característica) con
una zona de ADN en el cual presentan complementariedad.
La sonda va a tener también el fluoróforo y el quencher y
todavía no hay fluorescencia, en este momento empieza la
síntesis del ADN (hay una desnaturalización y la cadena es ya
sencilla y tenemos un primer y la ADN polimerasa).

139
 Ahora se produce el anillamiento del primer y la taq polimerasa empieza a sintetizar ADN
(añadiendo todos los componentes) y añadimos una sonda que tiene una cadena
complementaria a parte de la cadena molde y la sonda hibrida. La fluoresceína emite
fluorescencia cuando llegue la ADN polimerasa y ocurre una eliminación
(degradación) de la sonda y la ADN polimerasa va a sintetizar el ADN. La fluoresceína (ya
individualizada) empieza a emitir una vez se ha degradado la sonda y la fluoresceína está aislada.

Lo contrario a los beacons: solo emite cuando se degrada mientra que los beacons emiten
cuando se une. en este tipo de síntesis de ADN es como si fuera un primer ciclo y esta
fluorescencia se va a emitir en cada ciclo pudiendo ver la cantidad de ADN sintetizado cuando
estemos realizando las RT-PCR ya que la cantidad de fluorescencia va a ser proporcional.

2 fluorescencias (a modo de control). Tipos de fluoroforos según la longitud de onda:

o FAM: con el que marco el gen que verdaderamente quiero ver (lectina). Máxima emisión
a 535 nm.
o TAMRA: (ciclofilina, beta actina). Con lo que marco el resto de muestras. Expresión en
todas las muestras, que no va a cambiar y va a ser en todas las muestras muy igual por
lo que solo me tendría que dar una curva (ya que todas las muestras deberían expresar
la misma cantidad). Si tuviese varias curvas, me indicaría que estoy poniendo
concentraciones diferentes del ARN, y por ello las CT son distintas. Habría que
normalizar. absorbe a 560 nm (igual que con el control en el northern).
Siempre se pone una sonda TAMRA para normalizar por si hubiésemos puesto
diferentes concentraciones. Si se ha medido perfectamente el ARN en las muestras con
TAMRA voy a tener todas las líneas juntas y todas las muestras tienen más o menos
todas, la misma cantidad. Sabemos que aquí la expresión es igual, solo varia la cantidad
de ARN.

• FRET

CANTIDAD DE ADN

Los productos de amplificación no se detectan en los primeros ciclos porque están por debajo de la escala
utilizada. Recién se observa la curva en los últimos ciclos hasta llegar a la fase de plateau. Básicamente
que al principio no se ve casi nada de DNA

140
En verdad no se observa como antes, sino así: el software determina en qué punto la cantidad de ADN
cruza una línea arbitraria. Vemos como va subiendo y en el ciclo 20 ya va llegando al plateau. Tenemos
una representación en base a la cantidad de ADN que se obtiene en un punto determinado. Tenemos
distintas muestras y distintas concentraciones de ADN que se van alcanzando en los distintos puntos
(ejemplo en la foto: la muestra azul alcanza antes la concentración de 700 y la morada más tarde). Esos
puntos se denominan Ct = ciclo crítico: es el valor inversamente proporcional a la cantidad inicial de
moléculas específicas en la muestra original. Es decir, tengo distintas muestras y llego en cada ciclo a una
concentración. Para cada muestra la Ct es diferente.
Para la última muestra, para conseguir la misma cantidad de ADN he necesitado 34 ciclos. Como la Ct es
inversamente proporcional a la cantidad inicial de moléculas específicas en la muestra original, a mayor
Ct menos moléculas de ADN.

Debo poner una sonda TAMRA para normalizar. Ya que si he puesto distinta cantidad de ARN en cada
muestra me va a hacer tener líneas distintas y no es el objetivo. Debo hacer una división ratio (dividir la
intensidad de una entre la de otra) así tenemos las distintas Ct para la sonda problema de lectina y otra
de B actina.

CUANTIFICACIÓN DE ADN O CADN

Tendríamos el tresoldi y en las curvas daríamos el Ct o ciclo crítico (inversamente proporcional a la

cantidad de DNA que he puesto), por lo que sobre la cantidad de ADN de la que parto pero yo parto de
ARN puesto que en verdad estoy midiendo la expresión del ARNm. Depende de la sonda que esté usando
puedo hablar de la muestra de x tejido que expresa por ejemplo lectina. Vemos que en las distintas
muestras se expresa en distintos grados (ya que uso una sonda taqman para la lectina).
Cantidad de ADN inversamente proporciona a los ciclos críticos (ciclo en el que he alcanzado la
concentración que yo defino). Fluorescencia sí es proporcional a la cantidad de ADN.

La gráfica nos muestra, con un threshold, la cantidad de

emisión de fluorescencia proporcional a la cantidad de ADN
que es inversamente proporcional a los ciclos críticos Ct. Existe
un ciclo a partir del cual la síntesis se produce de forma
continua y va aumentando la concentración hasta que llega a
ese plato. En este caso he requerido 14 ciclos para que se
pudiese emitir esa fluorescencia y la cantidad de ADN era
perceptible por el sistema. Cantidad de ADN suficiente para
que pueda emitir la sonda/ fluorescencnia. Es decir, lo que
nos va a decir la gráfica es, en qué ciclo tengo cantidad de ADN
suficiente para que se emita fluorescencia.

A menor concentración de la secuencia target en la muestra inicial, se necesitará más ciclos para ser
detectada, por lo tanto se obtienen valores de CT mayores para muestras más diluidas.
En la parte de abajo es el ciclo en el que vemos la fluorescencia de la sonda (debido a que ya tengo la
suficiente cantidad de DNA para que se emita).

Ct : ciclo crítico, el que es inversamente proporcional a la cantidad inicial de moléculas. El ciclo en el cual
he alcanzado una concentración que yo defino con el threshold.
Línea arbitraria: cantidad de ADN, aunque realmente es de fluorescencia.

141
RT-PCR (A TIEMPO REAL)

Vamos a tener un análisis de la cinética de la reacción, vamos a detectar el producto en cada ciclo de la
reacción. Existen equipos que proporcionan la cantidad exacta en cada ciclo de la reacción. Básicamente
puedo ver como aumenta la concentración de mi producto en cada ciclo de la reacción.

En un northern podíamos ver las variantes splicing, pero aquí es un

poco más complicado, mido ADN, lo corro en un gel (las muestras) y
veo dos bandas, la síntesis de cada una de las isoformas (ARNm y la
variante).
De acuerdo a esas 2 variantes puedo decir que por ejemplo en el tejido
tres la variante 2 se expresa muy poco y la variante 1 mucho (más
incluso que el mARN completo). Por lo que aquí también podemos ver
las distintas variantes del splicing (las isoformas).

APLICACIONES DE LA RT PCR Y HUELLAS DACTILARES DEL DNA

Son pruebas paternas para detectar el ADN en las que se miden secuencias
repetitivas entre 2 sitios de restricción. Observamos el ADN que proviene del
cromosomas de cada parental y vemos el número de VNTR (repeticiones en
tándem de número variable de los cromosomas, se ve ven de color azul oscuro en
la imagen). Con enzimas de restricción cortamos el ADN y obtenemos esos tandem.
Posteriormente hacemos una RT-PCR de los fragmentos y se corren en un gel de
electroforesis con los 2 alelos (madre: 6vntr y padre: 2vntr) obteniendo los tandem
repetidos en el ADN materno y paterno.

El desplazamiento del ADN va a ser más rápido en el paterno, ya que tiene menos
repeticiones, menos cantidad (2 rep vs 6 rep maternas) por el número de
repeticiones.

En estas pruebas de paternidad/pruebas parenterales se extrae el ADN de la descendencia y se ve si

aparecen los 2 alelos parentales en el gel, si no aparece uno de ellos… mala cosa.
Esta técnica se usa en lo que es el diagnóstico policial o en pruebas de paternidad. En el ámbito policial
científico a esto lo llaman “huellas dactilares”: cada uno tenemos una huella propia, característica
(heredadas de nuestros padres).
Por tanto, se cortan los VNTR de los alelos con
enzimas de restricción de forma que queden ambos
alelos (las repeticiones). En uno hay un mayor número
de repeticiones y se digiere (“E” en la imagen). Luego
lo corremos en el gel y lo transferimos e hibridamos
con la sonda de forma parecida a un southern.

Actualmente, lo más rápido es realizar una PCR,

utilizamos primers para tener la longitud del
fragmento del alelo 1 y del alelo 2. Cada persona tiene
un conjunto de bases únicas por lo que para comparar
uno con otro se emplean las repeticiones en tándem.

142
Mellizos diferentes, en el caso de los gemelos si es cierto que además del DNA intervienen los ambientes
externos. Es decir, se ven afectados por la epigenética en el que las metilaciones o acetilaciones de
histonas permiten diferenciar entre gemelos. ¡NO TODO ESTÁ EN DEL DNA! y es precisamente la
epigenética lo que nos permite diferenciar entre gemelos. En esta técnica podemos usar cualquier
cromosoma materno o paterno.

143
TEMA 9: INGENIERÍA GENÉTICA II. VECTORES DE CLONACIÓN Y CONSTRUCCIÓN
DE GENOTECAS

Vamos a ver las aplicaciones de todo lo que hemos visto en el tema anterior. Tenemos 2 tipos de
genotecas (genómicas y de cADN’s). También las diferencias entre los vectores de expresión y los
vectores de clonación.

El ADN recombinante consiste en que tenemos un fragmento de ADN y lo introducimos en un plásmido

o un vector de clonación. En este proceso se siguen las siguientes fases:
1. Partimos del ADN de un organismo donador que se extrae, se corta con endonucleasas de
restricción y se liga a otro ADN (vector de clonación: suelen ser plásmidos de bacterias) para
formar una nueva molécula de ADN recombinado (nueva construcción de ADN es otra molécula
nueva).
2. Esta construcción vector de clonación-DNA insertado (ya en el interior del vector de clonación)
se transfiere y mantiene dentro de una célula hospedadora. La introducción del ADN en la célula
hospedadora por lo general suelen ser bacterias (E.cose), aunque también pueden ser virus. La
introducción del ADN en la célula hospedadora se denomina transformación.
La transformación se puede hacer por choque térmico o por choque eléctrico (electroporación).
3. Aquellas células que han tomado la construcción del ADN (células transformadas) se identifican
y seleccionan, separándolas de aquellas que no contienen la construcción (a nosotros nos
interesan las transformadas). No todas van a captar ese ADN, ese plásmido con el inserto, y por
ello debemos identificar, selecccionar y separar de aquellas que no lo han incluido (las que no
poseen ADN externo se retiran).
4. Si es necesario, la construcción de ADN puede manipularse para asegurarnos de que la proteína
que es codificada por la secuencia del ADN clonado va a ser producida por la célula hospedadora.
En muchos casos nuestro objetivo es que esa célula hospedadora pueda producir esa proteína.

Es una herramienta muy útil para hacer genotecas, para secuenciar el genoma humano, hacer animales
transgénicos, etc.

RESUMEN:
Siempre se va a necesitar un plásmido bacteriano o vector de clonación, en el que se va a introducir, por
lo general, ADN eucariótico, de manera que tendremos la posibilidad de que un organismo procariota
exprese proteínas eucariotas. El gen promotor del plásmido, permite la expresión del ADN insertado.

Por lo tanto se extrae el ADN que puede ser de un cultivo de células o de tejido (aunque en realidad, las
extracciones de ADN ya no se hacen, ahora hay kits de ADN que se comercializan). Este ADN se corta con
la enzima de restricción, así como el vector para que puedan unirse y se meten en la bacteria. Por último
se seleccionan las bacterias con el plásmido como veremos a continuación.

IMAGEN: esquema de un vector de clonación (es

decir, de la clonación de un vector). Vemos el
plásmido con distintos elementos en su interior
(resistencia a antibióticos, etc…). Nuestra
intención es introducirle un fragmento de ADN.
Esto se llevaría a las bacterias y las bacterias que
lo tengan las multiplicaremos, guardaremos…

144
También podemos tener vectores de expresión: plásmidos específicos que tienen promotores
bacterianos y sitios de unión al ribosoma. Al meter un ADN externo (eucariota) en un plásmido
(procariota), gracias a esos promotores bacterianos de los plásmidos procariotas y sitios de unión al
ribosoma podremos obtener el ARN. Esas bacterias podrían traducirlo a proteína.
Por ejemplo: insulina sintética, la fabrico en bacterias con este esquema (meto el gen de la insulina
humana en el plásmido bacteriano, se sintetiza el ARNm y las bacterias serían capaces de producir esa
proteína). Recupero el producto de una proteína eucariota. Fin: sintetizar la proteína eucariota a partir de
bacterias.

Quimera: lo que obtenemos al añadir el inserto a la bacteria. Es el propio ADN

recombinante en sí.

IMAGEN: tenemos los plásmidos y el fragmento que queramos insertar, que

cortaremos los dos fragmentos con las mismas enzimas para crear extremos
cohesivos y que al unirse encajen (que se apareen, que sean homólogos) y que
la ligasa posteriormente una (se forman los enlaces fosfodiéster entre los
extremos, de este modo tendremos ya el inserto dentro del plásmido (el ADN
recombinante). Una vez tenemos vector de clonación lo introduciremos en
las bacterias.

Existen varias moléculas susceptibles de ser vectores de clonación, y utilizaremos unos u otros
dependiendo del tamaño de nuestro inserto. Estos vectores son:
• Plásmidos (10 kb): segmentos pequeños por lo que será difícil introducir fragmentos eucariotas
de gran tamaño
• Bacteriófagos (20 kb): para introducir fragmentos mayores a 10 kb
• Cósmidos (50 kb): para introducir fragmentos aún mayores (>20 kb)
• YAC (Yeast Artificial Chromosome) (200-800 kb): cromosoma artificial de levaduras: son muy
específicos.

145
PLÁSMIDOS

MAPA DE RESTRINCCIÓN DEL PLÁSMIDO PBR322

En los mapas de restricción de plásmidos, se incluye la siguiente información, el siguiente mapa de

restricción es el del plásmido pBR322:
Nombre. p: viene de plásmido, BR: iniciales de los investigadores que lo
crearon (F. Bolivar y R. Rodríguez). 322 distingue este plásmido de otros
desarrollados en el mismo laboratorio (pBR325, 327, 328, etc).

Pares de bases: 4363 pares de bases y genes de resistencia a ampicilina

(Ampr) y a tetraciclina (Tetr ). Cuando una bacteria incorpore estos
genes va a tener resistencia a estos antibióticos, de manera que si se
añaden estos antibióticos en su medio, solo sobrevivirán las que
expresen estos genes, es una forma de seleccionarlas.

Sitio de corte: suelen tener varios, pero nos interesa tener solo 1,
porque linealizará el vector (conseguiremos pasarlo de circular a lineal),
si tenemos varios sitios mal porque nos lo fragmentará mucho. Conviene
tener sitios de corte únicos en distintos sitios. Ej: EcoRI, HindIII, que
hacen cortes únicos y muy específicos. Se suelen hacer en regiones que
no tienen ADN codificante, ahí se mete el inserto

Origen de la replicación: pMB1 (similar al ColE1) que solo funciona en Escherichia coli.

Otra característica de estos plásmidos es su alto número de copias. Normalmente no puede ser
transferido a otra bacteria (no conjugable ni movilizable) y solo funciona en un tipo de bacterias (en este
caso E.coli).

Los plásmidos que producidos de manera sintética, se han hecho a partir de ADN que se va juntando de
manera que el plásmido se desarrolla acorde a las necesidades. En la zona de ADN no codificante tiene
una zona con muchas enzimas de restricción para poder tener la opción de meter todo tipo de inserto,
ya que si solo hay una enzima solo podrá introducir un inserto. Este sitio se denomina polylinker (zonas
donde podemos introducir nuestros insertos y tenemos muchas posibilidades).

TRANSFORMACIÓN DE BACTERIAS

Tenemos el plásmido con el inserto ya metido, lo llevamos en un tubo eppendorf a bacterias para
transformarlas. Normalmente tenemos soluciones de bacterias compradas previamente (están
congeladas en tubos, las descongelamos a 37ºC ) y añadimos ese tubo a los tubos de bacterias.
Esto se hace en una situación de choque térmico a 42ºC, porque nuestra intención es que los plásmidos
se metan en las bacterias, cuya temperatura es de 37ºC, lo que conseguimos al subir la temperatura es
que las bacterias se abran y adquieran el plásmido (se meten por los poros de las bacterias), de tal forma
que cada bacteria incluya dentro de su genoma el plásmido (no todas lo conseguirán), la temperatura se
pasa de nuevo a 37ºC y pasan otra vez a su estado normal.

146
Ahora elegimos, para cual, pasamos las bacterias a un medio sólido (utilizando placas de agar, que son
unas placas de plástico en las que se mete agar que es un gel sólido donde pueden crecer las bacterias)
este paso se realiza distribuyendo las bacterias con un asa de siembra (sembramos las bacterias), se añade
el líquido en la placa y se esparcen las bacterias por la placa (gracias al asa). Luego lo pasamos a una
estufa a 37 grados para que crezcan y podemos observar las bacterias muy bien separadas y con un
punzón podré cogerlas para volverlas a llevar a un medio líquido para que se reproduzcan. Ya no veo toda
la muestra sino que vemos colonias.

FORMAS DE SELECCIONAR LAS BACTERIAS QUE SE INCLUYEN EN EL PLÁSMIDO

Ahora que ya tenemos separadas las bacterias tenemos que seleccionar cuales han introducido el
plásmido con el inserto. Para ello vamos a utilizar los genes específicos de selección como el gen Lacz.
El gen lacZ es utilizado, entonces, al igual que los genes de resistencia a antibióticos, en la selección.

Polylinker: tenemos muchos sitios de corte únicos (pat1, sph…) y tenemos la posibilidad de encontrar dos
sitios para la enzima de restricción, son zonas donde se va a introducir el fragmento (tenemos muchas
posibilidades). Son sitios súper específicos y pequeños en los que hay una gran variedad de enzimas de
restricción, algunas incluso con un único sitio de corte que se encuentran dentro del gen lacZ.

Vector de clonación → transformación de las bacterias → obtengo bacterias con o sin plásmido →
selección con genes específicos de selección o genes resistentes a ampicilina.

En este plásmido encontramos el gen de resistencia a la ampicilina (verde), luego tenemos el polilinker,
el Ori y el gen LacZ que codifica para la beta galactosidasa. Cuando hay LacZ, se activa, si no hay LacZ
permanece inactivo.
Vamos a añadir el inserto, y aquí tenemos varias posibilidades:
• Si todas han introducido el plásmido con el inserto, tendrán el gen de la E galactosidasa inactivo,
por lo que las bacterias serán blancas.
• Si no hemos conseguido introducir el inserto, pero el plásmido contiene el gen de la E
galactosidasa activo y de la resistencia a ampicilina, vamos a tener colonias azules
• Si no hay ni inserto ni bacteria no crece nada.

147
RESUMEN:
En presencia del sustrato ese gen producirá una enzima que sintetizará un producto de color azul. Para
ello es necesario que las bacterias del medio que tienen el gen tengan el sustrato. Si el gen no está
activado, no se producirá la reacción, el IPTG se une con el LacZ y lo inhibe.

Si el lacZ se expresa, en presencia del sustrato saldrá de color azul, el IPTG dejara de ser actio para dejar
de reprimir a lacZ, de tal forma q si añado la enizma (b galactosidasa), lacZ la activara y el sustrato q hemos
añadido será usado x la enzima y pasara a ser de color azul. Con lacZ activo se genera el gen lacZ, que
activa una enzima que estaba inactiva x el represor IPTG, la enzima actúa sobre el sustrato q he añadido
y cambia a color azul. Solo se produce color azul si el gen está activado. El IPTG hace que se mantenga
inactiva la bgalactosidada permitiendo que se una al gen LacZ.

NUEVA EXPLICACIÓN DEL IPTG: esto se añade y se une al represor del gen represor de Lac Z. Cuando se
añade el X-gal y se está expresando LacZ. IPTG hace que el represor de LacZ se inactive y se sintetice de
nuevo la B-galactosidasa. Esta última se une al fragmento que sintetiza LacZ al expresarse y actúa sobre
el Xgal para que de producto azul.

Esta técnica nos permite saber qué colonias tienen un inserto y cuáles no. Pero ¿Cuáles de las colonias
que tienen el inserto, tienen el inserto de interés?:

Tenemos el gen para la ampicilina y el gen para la B-galactosidasa, nosotros con las enzimas de restricción
introduciremos el injerto en el interior del gen lacZ TRAS cortar y ligar con las enzimas. (cortamos con las
mismas enzimas de restricción y pegamos), dentro de las placas en las que cultivo las bacterias tendre 3
posibilidades:
1. El inserto queda incorporado en el plásmido y se incorpora a la bacteria. Las bacterias han
incorporado el plásmido.
2. El inserto no ha quedado insertado en el plásmido (con la ligasa se recircularizará y vuelve a ser
igual, sin inserto). Fallan las enzimas de restricción. Pero el plásmido si se incorpora a la bacteria.
3. La transformación no se ha producido y no se ha incluido el plásmido dentro del genoma.

¿Cómo identificamos estas bacterias?

En nuestra placa tenemos ampicilina (azul)...
1. Las bacterias que sí han incorporado el injerto a través del
plásmido serán de color blanco ya que el gen del LacZ esta
interrumpido x el inserto IGTP (no se expresa), todas ellas
tienen el gen de resistencia a ampicilina por lo que aunque
añada a ampicilina van a crecer pero no de color azul.
2. En el segundo caso van a crecer también las bacterias ya
que tienen el plásmido con el gen resistente a ampicilina
pero no han incorporado el injerto (rosa) y el gen de LacZ
no se ve interrumpido. Por tanto desarrollarán el color azul
porque no está interrumpido. En este caso son bacterias
con el plásmido pero SIN el inserto.
3. Las bacterias que no han incluido plásmido no van a crecer,
van a morir por la acción de la ampicilina que he añadido a
la placa al no tener el gen de resistencia.

148
SELECCIÓN POR HIBRIDACIÓN (ADN)

Mediante el empleo de sondas. Vamos a hacer réplicas en el filtro de nitrocelulosa, el cual se trata con
sosa para matar las bacterias y que quede solo el ADN.
Luego desnaturalizamos el ADN para permitir que la sonda marcada se una por complementariedad
(estará diseñada con primers que se encuentren en el inserto, no en el plásmido). De esa forma la sonda
sólo se unirá al ADN presente en el filtro y que contenga el inserto.

La cosa es que seleccionamos la parte que me interesa del ADN (la parte que contiene los insertos)
haciendo que hibride con una sonda.

SELECCIÓN POR INMUNODETECCIÓN (PROTEÍNAS)

Observando qué proteínas se expresan. Es otra forma de detectar lo que nos interesa; tenemos colonias
en una placa y las pasamos a un filtro de nitrocelulosa para generar la réplica.
Luego lisamos las células para dejar fijadas esas proteínas en los espacios donde antes estaban las
bacterias. Esto es parecido a un western pero en vez de carriles tenemos el filtro con las proteínas y
utilizamos un anticuerpo primario para fijarse la proteína de interés (las que han incluido el injerto), y
posteriormente añadiré un anticuerpo secundario para dar lugar a una reacción colorimétrica o radiactiva.
No tenemos el ADN, dejamos que las bacterias generen las proteínas (detectamos proteínas).

Mecanismo: para seleccionarlas utilizamos anticuerpos. Un primer anticuerpo

(especifico) que se une a la proteína de interés, y luego se lava, y se añade un
segundo anticuerpo (que es el que lleva el color, radiactividad…) que se une
específicamente al primer anticuerpo, y da lugar a una reacción de color.

Tras detectar en el filtro que bacterias nos interesan (gracias al marcaje proteico),
nos vamos a la placa a cogerlas.

IMAGEN: saco ADN lo corto con enzimas de restricción, y con esas mismas corto
el plásmido. Luego el inserto se introduce en el plásmido, y este en la bacteria.
Estas son las bacterias que a mi me interesan. O bien identifico el plásmido con
antibiótico (por la resistencia a antibióticos), por la acción del gen LacZ, mediante
una sonda o por la identificación de las proteínas con un anticuerpo.

Me interesa seleccionar y separar esas bacterias y clonarlas para guardarlas como reserva

149
SELECCIÓN POR ANTIBIÓTICOS

Tenemos un plásmido con resistencia a la ampicilina y tetraciclina (pRB322). Digerimos los plásmidos,
después lo tratamos con la ligasa y tenemos dos opciones, que se haya insertado o que no.
Hacemos crecer las bacterias en ampicilina, así, todas las que tengan plásmido van a crecer. Hacemos una
réplica, y el filtro lo hacemos crecer en dos placas, una placa solo con ampicilina y otra solo con
tetraciclina. Nos interesan las que no han crecido en tetraciclina. Las bacterias que no han incluido los
plásmidos son necesarias de identificar pero se mueren por el uso de ampicilina y tetraciclina.

Las primeras (abajo izquierda) bacterias al presentar genes de resistencia (a ampicilina y tetraciclina)
crecerán en la placa en presencia de ambas sustancias, pero no tienen el inserto.
Mientras que las segundas bacterias, tenemos el inserto, que interrumpe el gen de la tetraciclina y no le
permite actuar, pero el de la resistencia a ampicilina lo tienen bien. Es por ello, que en presencia de
ampicilina y tetraciclina, estas bacterias mueren.

¿Cómo hacemos para seleccionar la cepa 2 de bacterias que nos interesan?

Creceremos las bacterias en presencia de ampicilina. Pasaré a un filtro de celulosa las bacterias haciendo
una réplica. Ahora lo que hacemos es crecer las réplicas 1 en ampicilina como control y otra entetraciclina.

En ampicilina sobrevivirán todas las que tengan el plásmido pero en la placa con tetraciclina solo
crecerán las que no han incluido el plásmido (en verdad son las que no me interesan). ¿Qué hago ahora?
pues al saber cuales no me interesan (las veo en la placa 2 de tetraciclina) seleccionaré las que no estén
presentes en la placa original.
Por eso es una selección negativa, no cogemos directamente las que han crecido ya que no que nos
interesan porque nos indica que no han incorporado el plásmido. Cogemos las que no están. Es necesario
hacer estos pasos experimentales.

CONCLUSIÓN
Ambas crecen en ampicilina, porque ambas incluyen el plásmido y tienen el gen resistente a ampicilina,
pero solo pueden crecer en tetraciclina las que no tienen interrumpido el plásmido. De tal manera que
haciendo una réplica de ampicilina y tetraciclina, en las de tetraciclina tendremos la del pBR322, y en la
de ampicilina estarán las que verdaderamente me interesan la que tiene su plásmido interrumpido por el
ADN de inserto.

150
SELECCIÓN POR CARACTERÍSTICAS NUTRICIONALES: MARCADORES AUXOTRÓFICOS

Con un bloque de madera cubierto con terciopelo, vamos a pasar (replicar) las bacterias a una placa con
la mitad de medio (crecen solo las que yo he delimitado, pongo en el medio algo relacionado con el inserto
que presenten las bacterias de mi interés) y otras con medio completo (en el que crecen todas las colonias
de bacterias). Por ejemplo tenemos un plásmido que puede crecer en presencia de galactosa.

Vamos a diferenciar las que crecen o las que mueren en el medio completo o incompleto. Es lo mismo
de antes pero en vez de utilizar antibióticos, se usa un nutriente.
Si yo hago un inserto que les permita vivir en galactosa, pongo en mi medio limitado galactosa y no
glucosa de forma que solo podrán estar aquellas que hayan integrado el inserto que les permita sobrevivir
en ese medio.

RESUMEN
Nos interesan las que han introducido el inserto y las seleccionamos a través de medios nutricionales.
Cogemos los medios de selección según nos interese en cada momento y en cada situación ya que hay
veces que no todos los métodos se pueden usar de igual forma.

FAGOS

BACTERIÓFAGOS

Permiten meter insertos más grandes, podemos introducir insertos de hasta 20kb.

Infección viral: podemos utilizar el fago para incorporar el DNA externo al de la bacteria. Tenemos dos
posibilidades:
• Ciclo lítico: la bacteria no incorpora el ADN a
su ADN, y estos fagos se aprovechen del
hospedador de la bacteria y pueda hacer su
ciclo lítico, es decir, una creación de priones
nuevos. Ciclo en el que se infecta.
• Ciclo lisogénico: el ADN del fago sí se incorpora
al ADN de la bacteria; en este caso sí hay
recombinación. El ADN del fago (lambda) está
integrado en el genoma de la bacteria (E. Coli),
tenemos provirus. Se introduce el ADN del
virus dentro del ADN de la bacteria que
infecta.

151
Amplificación del clon vía ciclo lítico: tenemos fagos con un material genético específico que van a
cometer una infección. Vamos a tener clones de virus.

FAGO LAMBA

Tiene un genoma de unas 45.000 pb por lo que si tengo un inserto de 15 lo puedo usar. Tienen un
fragmento central de 15kb que no es esencial para la replicación y puede ser eliminado; ahí es donde
vamos a introducir nuestro inserto.

Es la que voy a utilizar para introducir el inserto. Cortaré el material con

las enzimas de restricción, lo ligaré y ya tendré el inserto en el ADN del
fago.
Se produce el empaquetamiento del ADN in vitro para permitir la
formación de las partículas del fago. Son cápsides proteicas que llevan el
ADN en su interior. Se realiza in vitro porque debo tener unas
condiciones de cultivo específicas.
Una vez tengo los fagos con los insertos se produce la transfección. Se
infectan las células y se produce la propagación (cuando ya han crecido
los fagos, se han convertido en viriones).

IMAGEN: ejemplo 1. Tengo el ADN de un fago que son en realidad los

vectores. Tenemos ADN humano que incluiremos en distintos fagos.
Tenemos 2 insertos (círculo rosa y triángulo verde). Las enzimas de
restricción cortan tanto el ADN humano como el ADN del fago. Unos
incluirán un inserto y otros el otro. De momento están todos en la misma
placa por lo que debo seleccionarlos para tenerlos en placas distintas en
función del inserto que hayan incorporado.
Las calvas se ven ya que los fagos rompen las bacterias y lo que se observa
es que en esas calvas es donde están los virus.

Ejemplo 2: las colonias hacen réplicas, luego pongo la sosa que destruye virus y solo deja el ADN en la
réplica. Finalmente añado la sonda específica que se va a unir a los virus que tienen el inserto que a mi
me interesa; los demás no se van a unir (luego hago una autorradiografía y veré los clones hibridados con
la sonda). Me iré a la placa original del crecimiento bacteriano con virus para seleccionar. Se hace igual
que con ADN y con proteínas.

152
TRANSFORMACIÓN CON VECTORES DE EXPRESIÓN

Para obtener el ARNm y luego la proteína.

Igual con el DNA del fago. En el fago tendríamos que tener
un promotor para que puedan expresar la proteína y que
los fagos puedan producir esa proteína.

Vectores de expresión: T7 en DNA procariota y CMV en

DNA eucarionte
Nuestro fin es, no solo tener un ADN recombinante sino
también obtener la proteína mediante la bacteria.

PRODUCCIÓN Y PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

Este mecanismo se asocia a que yo puedo hacer la purificación a partir de proteínas recombinantes (se
puede recuperar la proteína).
Proteínas recombinantes: introducimos ese gen en el
plásmido, transformamos bacterias y al final obtenemos
esa proteína. Pueden ser una proteína eucariota o
procariota que se obtiene desde bacterias.

Purificación de proteínas: podemos obtener esa

purificación a través de bacterias, las cuales hemos
introducido un plásmido con un inserto (DNA
recombinante), las transformamos para que sinteticen
el ARNM y luego la proteína, la cual la secretaran, pues
esa proteína la vamos a purificar.
Tendré un medio con bacterias en las que he metido
esos plásmidos para tener las proteínas recombinantes. Entonces: plásmido-promotor activado con IPTG
que permite a la ARN polimerasa sintetizar el ARNm y después la síntesis proteica.

Así obtengo anticuerpos policlonales y otros productos pero todo aplicado a la obtención de las proteínas
recombinantes que vienen de un ARNm recombinante.

RESUMEN
Las bacterias introducen plásmido con gen que codifica para la proteína de interés, para que las bacterias
lo traduzcan, y secreten dichas proteínas.
Este plásmido es diferente porque tiene promotor para la ARN polimerasa que cambiara ese fragmento
externo de ADN en ARN y luego se traducirá la proteína recombinante, a diferencia de los plásmidos
normales que no tienen el promotor ni el sitio de unión a los ribosomas.

153
PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS POLICLONALES

Inyectamos la proteína recombinante que actuaría con un antígeno en conejos. 6 semanas después el
antígeno producirá reacción en los conejos y se pueden purificar como por ejemplo con la calreticulina y
podemos recuperar esos anticuerpos policlonales).
Cuando no podamos usar la transformación de bacterias para que nos sintetice proteína porque la
proteína que sintetiza sería tóxica para la bacteria usaremos el método que se describe abajo:
transcripción-traduducción acopladas in vitro.

TRANSCRIPCIÓN-TRADUCCIÓN ACOPLADAS IN VITRO

Cuando no podamos obtener proteínas porque sean tóxicas

para las bacterias usaremos este método. Se utiliza para la
producción de proteínas tóxicas para E. coli.
Tenemos un ADN molde circular o lineal, y una transcripción
traducción acoplada. Añadimos ARN polimerasa, que crea
ARNm, y vamos a tener la creación de las proteínas.

Básicamente, hacemos una transcripción-traducción

directamente en el tubo, sin necesitar bacterias. Se hace
cuando la proteína de interés sea tóxica para mis bacterias.

Lo que obtenemos con los vectores de clonación es obtener clones que podemos guardar; lo mismo con
los fagos. Es decir, al final almacenaré diferentes plásmidos y bacterias que puedo catalogar y de los que
puedo hacer genotecas (puedo hacer bacterias con el mismo plásmido y guardarlos, lo mismo con
fagos…).

ESTRATEGIAS DE CLONACIÓN Y CONSTRUCCIÓN DE GENOTECAS

Genoteca: sitio donde tienes todo el DNA disponible y tu escoges el que te interesa.

Existen dos tipos de genotecas:

- Genotecas de ARN (de expresión de ADNc). Lo que haré será sintetizar mediante una
retrotranscripción un ADN complementario al ARN mensajero que se ha expresado. En el ADNc
hemos quitado secuencias promotoras, intrones, etc. Lo que tenemos es el ARNm maduro,
tenemos la secuencia codificante del gen. Podemos utilizar los plásmidos.

- Genotecas de ADN genómico que puedo purificar posteriormente. puedo tener diferentes fagos
con distintos insertos. En una genoteca de ADN genómico tenemos las secuencias promotoras,
exones, intrones, etc. Lo que principalmente vamos a utilizar es recombinar el ADN en un vector
de un fago lambda. Se siguen una serie de pasos:
1. Construir una genoteca representativa de bacterias o de fagos.
2. Aislar los clones de nuestro interés (screening).
3. Subclonar fragmentos seleccionados. A partir de esas bacterias podemos obtener ese
plásmido, construir otro fragmento… Es decir, puedo trabajar tanto con genotecas de
ADN genómico como con genotecas de ADNc. Queremos este gen, pues vamos a pasar
el plásmido o el fago a bacterias para tener más cantidad.

154
GENOTECAS DE ADN GENÓMICO

Las genotecas de ADN genómico son representativas cuando poseen un número de clones entre 3 y 10
veces superior al mínimo (tamaño del genoma / capacidad del vector). Formado por plásmidos
modificados hasta genoma recombinantes de ADN.

Hemos hecho una digestión para introducirlo en un plásmido, que

en este caso son fagos, realizamos el empaquetamiento in vitro y
luego obtenemos toda la mezcla de los genes. Tras hacer crecer todo
en una placa con bacterias, haremos una selección. Hacemos una
infección en E. coli mediante los virus bacteriófagos y a partir de las
placas, seleccionamos los que nos interesen (por ejemplo los que
tengan el gen A)

Puedo hacerlo por sondas, diseñándola anteriormente y luego

haciéndola hibridar. Después haré crecer los fagos. Esta selección se
llama titulación de la genoteca porque lo que hago es una selección
de cada fago con los distintos genes y a partir de esos podré trabajar.
El tamaño del inserto es muy grande (superior a 10kb) por lo que
utilizamos los fagos para obtener esta genoteca representativa,
cuando poseen un número de clones entre 3 y 10 veces superior al
tamaño mínimo.

155
CÓSMIDOS

Cuando el tamaño es aún mayor, los fagos se me quedan cortos, y actúan como vector los cósmidos.
Los cósmidos son vectores de clonación ampliamente usados en la elaboración de genotecas de ADN
genómicos de gran tamaño, ya que permiten la introducción del inserto de ADN de hasta 45 kb; el doble
que los vectores derivados de la eliminación de parte del genoma del fago lambda (los fagémidos).

Muy usados en genotecas y gracias a ellos podemos trabajar con ellas ya que tienen características
comunes con plásmidos y con fagos, es la suma de las características de ambos elementos. Un cósmido
es un plásmido al cual se le han adicionado segmentos del cromosoma de un fago filamentoso, como el
fago lambda.

Los cósmidos contienen:

• Todo lo que tiene el plásmido: el OriC, y un gen
de resistencia a un antibiótico, el gen LacZ.
• Las características que comparte con el fago
son los extremos COS (extremos
complementarios del genoma del fago que
permiten la recircularización).

Estos vectores facilitan el trabajo, porque permiten el

empaquetamiento in vitro de las secuencias entre dos
extremos COS, y usar los fagos empaquetados para
transfectar cepas de E. Coli, consiguiendo un plásmido
grande dentro de la bacteria, ya que el cósmido se
recirculariza al entrar gracias a los extremos COS.

Tenemos nuestro ADN genómico con intrones, exones, zonas promotoras... Introducimos los distintos
insertos en nuestro vector, que permiten la recircularización de ese cósmido. Con esto vamos a conseguir
el empaquetamiento del fago lambda que se convertiría en una molécula madura para infectar.

RASTERO DE SECUENCIAS EN GENOTECAS

Es lo mismo, voy a tener partículas víricas que llevo a crecer en un césped de bacterias o placa petri. Las
hemos obtenido a partir del cósmido.
Para la selección lo denominamos rastreo de secuencias de genotecas. Lo llevo a un filtro de nitrocelulosa,
hibrido con sondas específicas para cada uno de los insertos, obtengo la colonia que desee y me iré a
picar a la placa. Cuando hago la autorradiografía con radiactividad es para después irme a la placa y picar
los virus que me interesen y crecernos en medios específicos.

Importante: esta genoteca es de ADN genómico. También se

puede hacer con proteínas mediante el empleo de
anticuerpos.
Lo que pasa es que tenemos ADN con muchos insertos. Lo
que puedo hacer para diferenciar cada uno de los insertos y
comprobar que estén situados correctamente (porque no se
si están de forma correcta) es ir probando. ¿Cómo compruebo
que el cósmido esté ok? Mediante el paseo cromosómico de
genotecas de ADN genómico.

156
PASEO CROMOSÓMICO

Partimos de todo el ADN genómico con los insertos. Iremos seleccionando gracias a que iremos
hibridando con sondas específicas (sonda A foto) de cada uno de los insertos para comprobar que están
todos y bien colocados.
Después, lo hibridamos con una sonda complementaria a una zona de A, obteniendo un segundo clon.
Hibridamos con otra sonda que sea complementario a ese clon y a otro tercer clon. Vamos haciendo como
un mapeo de todos esos clones, (representación de donde se van a colocar) esos genes, que tenemos en
nuestra genoteca.
El objetivo es tratar de descubrir por fragmentos la secuencia al completo. También se puede hacer con
proteínas.

Las sondas que describiremos ahora deberán hibridar siempre en

los extremos:
1. Primero usaré una sonda que incluya la parte del primer
inserto. La hibridación hará que por complementariedad
coja toda esa parte (clon 1).
2. En el segundo clon (clon 2) usaré una sonda que hibride
en los extremos (por ejemplo en el 5’). A partir de ahí
obtendré otro fragmento y así puedo ir obteniendo la
secuencia entera gracias a que secuenciaré cada uno de
los clones e iré superponiendo las secuencias de cada
uno de los clones para obtener la secuencia final.

CLONACIÓN EN SILICO

Las secuencias se pueden meter en el ordenador. Se produce un paseo cromosómico por todo el DNA
genómico. Las secuencias se comparan unas con otras y se creó la secuencia del genoma humano. Toda
la secuencia me permite analizarla y obtener una serie de aplicaciones.

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GENOTECAS DE EXPRESIÓN DE ADNC

¿Cómo podemos insertar DNAs sin intrones a las bacterias? Aislando ADNc.

Las genotecas de ADNc son representativas cuando respetan el porcentaje de representación original de
cada ARNm en la célula: ni se pierden los bajamente expresados, ni se sobrerepresentan los muy
expresados. Tenemos un plásmido recombinante capaz de producir el ARNm y la proteína.

Obtención de cDNAs: o bien utilizar los oligo dt (cebadores) por el que obtengo el ADNc o bien utilizamos
cebadores Random (al azar) y de esta forma sintetizo el ADNc. O un cebador específico de la zona dentro
de lo que es el gen (de los exones, no de la zona de poliA) que sintetiza el ADNc a partir de una zona
codificante.

Por ejemplo: si queremos producir insulina podemos obtener el ARNm de la proinsulina y a partir de este
podemos producir el ADNc de la proinsulina lo metemos en los plásmidos recombinantes y los
introducimos en las bacterias que producirán proinsulina y posteriormente se llevarán a cabo las
modificaciones postraduccionales para generar la insulina definitiva.

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