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Los ácidos nucleicos y las proteínas son macromoléculas, polímeros lineales compuestos de subunidades.
Junto con los lípidos y el estroma extracelular, crean la actividad celular y la función fisiológica.
El ácido desoxiribonucleico (ADN), fue descubierto por Friedrich Miescher en 1869. El ADN es el componente
mayoritario de los cromosomas y contiene las instrucciones codificadas para la síntesis de cada una de las proteínas de nuestro
cuerpo. Toda la información sobre cada ser vivo está contenida en él, tanto la información relativa a los aspectos externos
como a aquellos aspectos que no se ven. Su estudio permite diagnosticar y tratar enfermedades.
Los ácido nucleicos.
Los ácidos nucleicos (ADN y ARN) son las moléculas encargadas de almacenar, transmitir y expresar la
información genética de los seres vivos.
Se parecen en que son polímeros lineales compuestos de monómeros llamados nucleótidos, unidos entre sí por
enlaces covalentes. Los nucleótidos son las unidades estructurales de los ácidos nucleicos.
Los ARN celulares se localizan en el citoplasma y varían en longitud Las moléculas de ADN celular, situadas en el
núcleo y algún pueden tener hasta varios cientos de millones de nucleótidos. Estas grandes unidades de ADN en
asociación con proteínas pueden teñirse con colorantes y visualizarse en el microscopio
óptico como cromosomas.
Nucleótidos y nucleósidos.
Todos los nucleótidos tienen una estructura de grupo fosfato unido por un enlace
fosfoéster una pentosaque a su vez está unida a una base nitrogenada. Tanto el grupo
fosfato como la base nitrogenada están unidas a la pentosa.
 Las bases nitrogenadas.
Son compuestos heterocíclicos con anillos que contienen nitrógeno y carbono,
numerado para facilitar referirse a ellos. Como los compuestos heterocíclicos contienen grupos amino y, en
general, las aminas actúan como bases, estos compuestos heterocíclicos se denominaron arbitrariamente bases.
Dado que el heteroátomo en el anillo es nitrógeno, estos compuestos fueron nombrados bases de nitrógeno.
Las bases nitrogenadas de los ácidos nucleicos son moléculas heterocíclicas derivadas de purina (bases púricas) o
pirimidina (bases pirimidínicas):

Bases púricas: Derivan de la purina. Bases pirimidínicas: Derivan de la

Adenina y guanina que contienen un par de pirimidina. Citosina, timina y uracilo que
anillos fusionados. contienen un solo anillo.

I. Adenina, guanina y citosina se encuentran tanto en el ADN como en el ARN.

II. La timina se encuentra solo en el ADN y el uracilo se encuentra solo en el ARN. La timina y el uracilo
difieren solo por un grupo metilo: la timina es 5-metiluracilo.
III.Las bases se abrevian como A, G, C, T y U, respectivamente. Por conveniencia, las letras simples también se
usan cuando se escriben secuencias largas de nucleótidos.
 La pentosa.
La pentosa, es un glúcido que contiene cinco átomos de carbono en su estructura. Los carbonos de los azúcares
también están numerados, pero a cada número le sigue un símbolo primo (similar a un apóstrofe) para distinguir los
carbonos de los azúcares de los carbonos de las bases nitrogenadas.
Los ácidos nucleicos pueden tener dos tipos diferentes de pentosas; D-ribosa. Pentosa que compone el ARN y 2'-
desoxi-D-ribosa. Pentosa que compone el ADN
La 2'-desoxi-D-ribosa es igual a la D-ribosa, pero con un -H en vez de un -OH en la posición 2' (C2). La ausencia
del grupo hidroxilo en C2 determina que la 2'-desoxi-D-ribosa tenga una reactividad química menor que la D-
ribosa. Este hecho explica algunas de las características diferenciales entre el ADN y el ARN.
  El ácido fosfórico.
El carácter ácido de los nucleótidos se debe a la presencia de ácido fosfórico en forma de ion
fosfato (de fórmula PO 3-) que se encuentra disociado al pH del interior de las células, liberando
iones de hidrógeno 4y dejando el fosfato cargado negativamente. Debido a que estas cargas
atraen proteínas, la mayoría de los ácidos nucleicos están asociados con proteínas.
Las células y los fluidos extracelulares en los organismos contienen pequeñas concentraciones
de nucleósidos. Los nucleósidos son combinaciones de una base nitrogenada y un azúcar sin el
grupo fosfato.
La unión de la base nitrogenada con la pentosa se realiza mediante un enlace N- glucosídico entre el
átomo del carbono 1' del azúcar (ribosa o desoxirribosa) y el nitrógeno de la posición 9 de una purina (N9) o de la
posición 1 de una pirimidina (N1), con pérdida deuna molécula de agua.

Los nucleótidos son nucleósidos que tienen uno, dos o tres grupos fosfato esterificados en el grupo hidroxilo 5' de
la ribosa. La unión de un nucleósido con el grupo fosfato para dar lugar a un nucleótido, se produce mediante un
enlace éster entre el carbono 5' de la pentosa y el grupo fosfato con pérdida de una molécula de agua.
Nomenclatura de los componentes químicos de los ácidos nucleicos.
Los nucleósidos se nombran:
- Añadiendo a la base nitrogenada la terminación -osina en el caso de las bases púricas o la terminación -idina en
el caso de las bases pirimidínicas.
- Si la pentosa es la 2-desoxi-D-ribosa, se añade el prefijo desoxi- al nombre.
Los nucleótidos se nombran:
- Eliminando la -a- final del nombre del nucleósido y añadiendo la terminación 5' fosfato.

Cuando los nucleótidos se polimerizan para formar ácidos nucleicos, el grupo hidroxilo unido al carbono 3' de la
pentosa de un nucleótido forma un enlace éster con el fosfato unido a la posición 5' de la pentosa de otro
nucleótido. De manera que los nucleótidos se unirán entre sí a través de grupos fosfato mediante enlaces fosfodiéster
entre el carbono 5' de un nucleótido y el carbono 3' del siguiente nucleótido. Cada cadena completa, tendrá todas
sus subunidades alineadas en la misma orientación. Además, los dos extremos de la cadena serán fácilmente
distinguibles, ya que uno tendrá un grupo hidroxilo 3' y el otro un grupo fosfato 5' en su posición terminal. Esta
polaridad en una cadena de ácido nucleico se indica al referirse a un extremo como el extremo 3' y al otro como el
extremo 5'. La estructura primaria de los ácidos nucleicos viene dada por la secuencia lineal de los nucleótidos
unidos covalentemente por medio de enlaces fosfodiéster y escrita en dirección de 5' a -3'.

Los ácidos nucleicos son moléculas especiales. Sus propiedades físico-químicas determinan las técnicas que van
a ser empleadas en su análisis:
 Son moléculas hidrófilas: Los grupos fosfato y -OH que contienen pueden formar puentes de hidrógeno con las
moléculas de agua, presentes en una disolución.
 A pH fisiológico, los ácidos nucleicos tienen una carga negativa y se comportan como
ácidos: El ácido fosfórico, tiene tres grupos -OH disociables con valores de pKa de 1.9, 6.7 y
12.4. Cada uno de los grupos –OH es igualmente capaz de reaccionar para producir un enlace éster. En los ácidos
nucleicos, el grupo fosfato forma solo un enlace fosfodiéster. Aunque el ácido fosfórico es capaz de formar tres
enlaces éster, en los ácidos nucleicos, está formando solo dos enlaces, dejando libre el tercer grupo -OH, que tras la
disociación imparte carga negativa. Por lo que los polinucleótidos son de naturaleza ácida. En el caso del ARN, el
grupo adicional 2'-OH también se suma a la carga negativa haciéndolo menos estable y por tanto más reactivo y
presente mayores problemas de degradación frente a la molécula de ADN. De hecho, el ADN es el más estable de los
polímeros biológicos, lo que le permite mantener la integridad de la información genética, un requisito previo para
actuar como material genético.
 Las soluciones de ácidos nucléicos son altamente viscosas. Su alta viscosidad se debe a la gran longitud y
rigidez de las moléculas. En el caso del ADN, la viscosidad disminuye con la desnaturalización en la medida que el
ADN bicatenario es más rígido y, por lo tanto, más viscoso en comparación con el ADN monocatenario.
 Presentan un pico de absorción característico de luz ultravioleta a una longitud de onda de 260nm, lo que
resulta especialmente útil para la determinación de la concentración del ácido nucleico. La absorción que presentan los
nucleótidos libres es mayor que la de sus formas poliméricas y las moléculas monocatenarias absorben más que las
formas bicatenarias. Del mismo modo, la absorción en el ARN es mayor que en el ADN debido a la presencia del grupo
2'-OH. Además, las bases púricas absorben más que las pirimidínicas debido a la presencia de la estructura de
doble anillo.
 Cumplen el principio de complementariedad de bases: Dos secuencias de ácidos nucleicos con secuencia de
bases complementaria, se unirán mediante enlaces de puente de hidrógeno en condiciones adecuadas de pH,
temperatura y fuerza iónica. Ese proceso se conoce con el nombre de hibridación. Las bases púricas y
pirimidínicas forman parejas de igual manera que lo harían una llave y su cerradura; son los denominados
apareamientos de Watson y Crick. La adenina y la timina son complementarias (A=T), unidas mediante dos
puentes de hidrógeno, mientras que la guanina y la citosina (G≡C) se unen mediante tres puentes de hidrógeno.
Dado que el ARN no contiene timina, la complementariedad se establece entre adenina y uracilo (A=U) mediante
dos puentes de hidrógeno.
La complementariedad de las bases es la clave de la estructura del ADN y tiene importantes implicaciones, pues
permite procesos como la replicación del ADN, la transcripción (generación de ARN a partir de ADN) y la
traducción del ARN en proteínas. La fuerza del enlace de puente de hidrógeno es por lo general entre diez y veinte
veces menor que la de un enlace covalente promedio.
 Los ácidos nucleicos son moléculas densas. Existe una relación lineal entre la densidad y el contenido en G≡C.
Cuanto mayor sea la proporción de guanina y citosina mayor será la densidad del ADN.
 La doble hebra del ADN puede separarse elevando la temperatura. El proceso por el cual la doble cadena
pasa a ser cadena sencilla se conoce como desnaturalización: se produce la ruptura de los enlaces de puente de
hidrógeno entre bases nitrogenadas complementarias que unen ambas cadenas. La temperatura que es necesario
aplicar para separar las cadenas de ADN depende entre otros factores de la proporción de sus bases. Al ir
aumentando la temperatura se empieza a producir la ruptura de los puentes de hidrógeno establecidos entre sus bases.
Los que primero se romperán serán aquellos en los que la unión es más débil, los enlaces A=T (solo dos puentes de
hidrógeno unen estas dos bases entre sí), las uniones C≡G necesitarán temperaturas más altas para separarse. Las
cadenas separadas formarán puentes de hidrógeno ahora con el agua de la solución.
Este es un proceso reversible, de manera que, al disminuir gradualmente la temperatura, se vuelve a formar la
doble hebra reconstituyendo los puentes de hidrógeno entre las bases complementarias. Fenómeno que se conoce
como renaturalización.
A alta temperatura las hebras sueltas del ADN son más estables que la doble cadena. Existe un valor de
referencia, la temperatura de fusión o Tm, a la que el 50% de las cadenas de ADN de la muestra están abiertas.
Uno de los factores que más influencia tiene en el valor de la temperatura de fusión es la composición de bases de
la secuencia, por lo que este valor proporciona una idea acerca del contenido de guanina y citosina de la misma. Si
la Tm de la secuencia de estudio es alta, quiere decir que tiene una gran proporción de C y G formando parte de su
composición. Muchas de las temperaturas utilizadas en las técnicas de biología molecular están calculadas en
relación a este valor.
 Hibridar. Una vez que las cadenas han sido desnaturalizadas son capaces de volver a unirse, cuando baja la
temperatura, emparejándose con secuencias de bases que sean complementarias. A las moléculas formadas como
consecuencia de este proceso se les denomina híbridos y sólo serán estables cuando tengan secuencias similares.
El proceso de hibridación puede producirse entre dos cadenas de ADN distintas o entre una cadena de ADN y una
de ARN siempre que la mayor parte de sus bases sean complementarias.
El hidróxido sódico (NaOH) es utilizado en algunas técnicas (Southern blot) para separar las cadenas de ADN. Otras
utilizan agentes como la urea o la formamida. Estos compuestos actúan disminuyendo la Tm ya que debilitan las
Es fácil seguir el proceso de desnaturalización o renaturalización del ADN porque esta molécula tienelaacultad de
absorber luz en la región del espectro electromagnético correspondiente a la radiación ultravioleta
 Observando la gráfica:
Los valores más altos de absorbancia se producen a las temperaturas más altas. A estas temperaturas el ADN se
habrá desnaturalizado y las cadenas estarán separadas. Las cadenas simples de ADN absorben gran cantidad de luz
ultravioleta, más que la doble cadena. A esta propiedad se le denomina efecto hipercrómico.
En el laboratorio se utiliza esta propiedad de absorción en el ultravioleta para determinar la cantidad de ADN
extraído. Cuanto mayor sea la absorbancia a esta longitud de onda (260 nm) mayor será la cantidad de ADN que
hay en la solución.

RESUELTO

La estructura del ADN.

ADN, o ácido desoxirribonucleico, es el nombre químico de la molécula que contiene la información genética en
todos los seres vivos. En células eucariotas, el ADN se encuentra en el núcleo, formando parte de los cromosomas,
y también en mitocondrias (células animales) y cloroplastos (células vegetales). En las células procariotas, la mayor
parte del ADN se encuentra formando un solo cromosoma y en menor proporción en pequeños fragmentos que
constituyen los plásmidos; no se encuentra dentro del núcleo sino libre en el citoplasma de la célula. Los virus
presentan una mayor variabilidad, pudiendo contener como material genético tanto ADN como
ARN, circular o lineal, de doble cadena o de cadena sencilla.
Caracterización de la molécula de ADN.
La molécula de ADN es un polímero, consistente en dos cadenas polinucleotídicas que se unen y
se enrollan entre sí para formar una estructura de doble hélice. El orden de estos nucleótidos en
la cadena determina la información genética. Cada cadena está formada por azúcares
(desoxirribosa) y grupos fosfato. Y enganchada a cada azúcar hay una de las 4 bases: Adenina
(A); Ctirosina (C); Guanina (G); Timina (T)
La secuencia lineal de nucleótidos, escrita en dirección 5'-3', se corresponde con la estructura
primaria de la molécula de ADN. Cuando la molécula presenta mayor grado de empaquetamiento, aparecen
estructuras secundaria, terciaria o cuaternaria de la molécula.
Las dos cadenas se mantienen unidas por enlaces entre las bases; de manera que la
adenina se enlaza con la timina, y la citosina con la guanina. La secuencia de estas
bases a lo largo de la cadena es lo que codifica las instrucciones para formar proteínas y
moléculas de ARN.
El azúcar que forma parte de la molécula de ADN es la desoxirribosa. Al carbono 1
de este azúcar se le une una base nitrogenada que puede ser: púrica (adenina (A) o
guanina (G)) o pirimidínica (citosina(C) o timina (T)).
En el ADN los nucleótidos se unen entre sí mediante enlaces fosfodiéster (enlace
covalente muy estable) formando largas cadenas. Cada grupo fosfato une el grupo
hidroxilo (OH-) del carbono 3’ de la desoxirribosa con el grupo hidroxilo del carbono 5’ del nucleótido siguiente.
La estructura en doble hélice se mantiene unida mediante los puentes de hidrógeno que se establecen entre las
bases nitrogenadas de cada una de las cadenas.

El emparejamiento que se establece entre las bases nitrogenadas es específico. La adenina de una de las cadenas se
une siempre a la timina presente en la otra. Esta unión se mantiene mediante dos puentes de hidrógeno (A=T). De
la misma manera la citosina de una de las cadenas se une a la guanina presente en la otra mediante tres puentes de
hidrógeno (C≡G). Se dice que las cadenas que forman parte del ADN son complementarias. De esta manera
conociendo la secuencia de nucleótidos de una de ellas.
Debido al principio de complementariedad de bases, en el ADN la cantidad de adenina es siempre igual a la
cantidad de timina, y la de guanina a la de citosina. Para que esta unión de bases sea estable, es necesario que los
nucleótidos sitúen los grupos fosfato en posiciones opuestas. De manera que cuando se forma la doble hélice, las
bases nitrogenadas de ambas hebras se situarán en el interior, y los grupos fosfato en el exterior de la doble
cadena junto con las desoxirribosas.
La doble hélice.
La doble hélice es la descripción de la estructura secundaria del ADN. Cada cadena tiene una columna vertebral
compuesta de grupos alternos de azúcar y grupos fosfato. Unido a cada azúcar hay una de las cuatro bases.
- El ADN es una hélice de doble cadena, con las dos cadenas conectadas por enlaces de hidrógeno. Las bases A
siempre están emparejadas con T, y las C siempre están emparejada con G.
- La doble hélice de ADN muestra un enrollamiento dextrógiro; es decir, gira hacia la derecha, y plectonémico
(para poder separarla hay que desenrollarla).
- La doble hélice del ADN es antiparalela, lo que significa que el extremo 5' de una cadena está emparejado con el
extremo 3' de su cadena complementaria (y viceversa).
- Los nucleótidos están unidos entre sí por sus grupos fosfato, que unen el extremo 3' de un azúcar al extremo 5' del
siguiente azúcar. Los pares de bases de ADN no solo están conectados mediante enlaces de hidrógeno, sino que los
bordes exteriores de las bases que contienen nitrógeno están expuestos y también disponibles para un enlace
potencial de hidrógeno. Estos enlaces de hidrógeno proporcionan un fácil acceso al ADN para otras moléculas,
incluidas las proteínas que desempeñan funciones vitales en la replicación y expresión del ADN.
- Las dimensiones de la doble hélice son: un diámetro de 2 nanómetros (o 20 Angstrom), una longitud del paso o
“giro completo” de 3,4 nanómetros (o 34 Angstrom). Cada paso o “giro completo” está constituido por 10 pares de
nucleótidos.
El tamaño de la molécula de ADN de doble hélice se expresa en pares de bases (pb).
Equivalencias
1pb 1 par de bases
1kb 1000 pares de
(Kilobase) bases
1Mb 106 pares de
(Megabase) bases
1Gb 109 pares de
(Gigabase) bases

El ADN humano está en el núcleo de la célula formando parte de cromosomas, conocido por ADN cromosómico
o ADN cromosómico nuclear. Este tipo de ADN está formado por moléculas de gran longitud, lineales y
bicatenarias. También existe ADN en el interior de las mitocondrias, es el ADN mitocondrial.
La información que lleva el ADN se ha codificado utilizando un alfabeto químico compuesto por 4 los caracteres
correspondientes a las bases: A, C, G y T. Las moléculas de ADN están compuestas por una secuencia de millones
de estos caracteres. El orden de las bases en la secuencia es la manera de transportar la información y la unidad de
información en el ADN son los genes.

Gen: Secuencia de ADN que contiene la información necesaria para la producción de una proteína, además de las
instrucciones reguladoras quedeterminan cuándo y en qué cantidad se sintetizará

En el hombre se calcula que hay unos 30.000 genes, con tener tamaños muy diferentes que varían. El genoma
humano haploide contiene aproximadamente 3000 millones de pares de bases de ADN empaquetados en 23
cromosomas. Como la mayoría de las células del cuerpo (excepto óvulos y espermatozoides) son diploides, con
23 pares de cromosomas, hace un total de 6000 millones de pares de bases de ADN por célula. Además, se estima que
el cuerpo humano contiene alrededor de 50 billones de células, lo que equivale a 100 billones de metros de ADN
por humano. Ciertas proteínas compactan el ADN cromosómico en el espacio microscópico del núcleo eucariota.
Este ADN no se encuentra libre, sino asociado a proteínas con carga positiva:
- Histonas: Funcion estructural y reguladora
- No histonas: Heterogeneas en su composición con función estructural, reguladora y enzimática.

La unión de las histonas con el ADN es lo que se conoce como cromatina. El ADN tiene carga negativa, debido
a los grupos fosfato en su estructura principal de fosfato y azúcar, por lo que las histonas, con carga positiva, se
unen muy fuertemente al ADN. Éstas aportan la energía necesaria para empaquetar el ADN. Como resultado, la
cromatina se puede empaquetar en un volumen mucho más pequeño que el ADN solo.
Vista al microscopio electrónico, la cromatina tiene aspecto de collar de cuentas. La unidad estructural (y
funcional) básica repetitiva de la cromatina es el nucleosoma, que contiene ocho proteínas histonas y
aproximadamente 146 pares de bases de ADN. La configuración tridimensional de la fibra de cromatina constituye
la estructura terciaria del ADN. La cromatina existe en dos formas:
Eucromatina, menos condensada y se Heterocromatina, altamente condensada y
puede transcribir. generalmente no se transcribe.

Los nucleosomas se enrollan a su vez en una espiral llamada solenoide. Durante la división celular, la estructura
de la cromatina y los cromosomas son visibles bajo un microscopio óptico y cambian de forma a medida que el
ADN se duplica y se separa en dos células.
En el ADN hay otras secuencias diferentes a las de los genes, de hecho, estos solo representan entre el 3 y el 5 %
de la secuencia del ADN nuclear. El resto del ADN (entre el 95 y 97 %) no tiene función codificante, es un ADN
que no proporciona instrucciones para producir proteínas. Parte de este ADN es importante para la función de las
células, particularmente el control de la actividad génica. Este ADN no codificante también muestra diferencias en
su secuencia. Hay varios tipos:
 ADN de secuencia de copia única representadas una vez en el ADN o un número muy bajo de veces.
Algunas de estas secuencias están incluidas en los genes. Se les llama intrones.
 ADN repetitivo: Formado por unidades que se repiten prácticamente sin cambios a lo largo de todo el genoma.
Se pueden diferenciar varios tipos:
- Elementos LINES (secuencias largas dispersas a lo largo del ADN). El tamaño medio de la unidad repetida es
800 pb. Hay unas 50.000 copias repartidas por todo el genoma.
- Elementos SINES (secuencias cortas dispersas): Un tipo de estas secuencias muy utilizado como herramienta
diagnóstica son las secuencias Alu (repeticiones de 300 pb). También están dentro de este grupo las secuencias
MIR 130 pb (hay unas 400.000 copias en todo el genoma). Algunas alteraciones en estas secuencias han sido
relacionadas con enfermedades. Son al igual que los anteriores elementos móviles y pueden cambiar de lugar en
el genoma.
- ADN satélite: Se llama así por tener una proporción inusual de AT:CG que le confiere una densidad diferente

y hace que se separe en una banda distinta del resto del ADN en una centrifugación en gradiente de densidad. Son
secuencias de pocos nucleótidos que se repiten en tándem una detrás de otra. Forman parte del ADN
satélite los minisatélites (las secuencias que se repiten son de 15 a 65 pb), también llamados VNTR y los
microsatélites (de 1 hasta 6 pb), llamados STR.
 - Es ADN bicatenario y circular.
- Pequeño, de 16.569 pares de bases (pb).
- Se replica de manera independiente del ADN genómico.
- Se transmite solo por vía materna, es decir, todo el ADN mitocondrial se ha heredado de
lamadre. En el momento de la fecundación, sólo el núcleo del espermatozoide penetra en
el óvulo por lo que el ADN presente en el cigoto es únicamente materno.
- Codifica 37 genes, 13 de ellos corresponden a proteínas y el resto a ARNs esenciales
para su funcionamiento.
El ADN mitocondrial se extrae al mismo tiempo que el ADN nuclear y se estudia mediante las mismas técnicas
de análisis.

Cromosoma bacteriano.
Las células de organismos procariotas presentan una única molécula de ADN circular, cuyos extremos están
unidos por enlaces covalentes, y bicatenaria, llamada cromosoma bacteriano. Esta molécula se encuentra libre en
el citoplasma formando un anillo superenrollado para poder empaquetarse en el interior de la célula.
Plásmidos.
Algunas bacterias además de ADN cromosómico también presentan ADN plasmídico en su citoplasma. Los plásmidos
son un tipo de ADN circular más pequeño que el ADN del cromosoma bacteriano, que se replica de manera
independiente a este. Cuando una bacteria se divide, todos los plásmidos contenidos dentro de la célula se copian de
manera que cada célula hija reciba una copia de cada plásmido. Los plásmidos son importantes sobre todo por dos
motivos:
1. Los genes transportados en los plásmidos proporcionan a las bacterias ventajas genéticas, como la resistencia a los
antibióticos. Estos genes de resistencia a antibióticos van a conferir resistencia a la bacteria que los posea.
2. Los científicos han aprovechado los plásmidos para usarlos como herramientas para clonar, transferir y manipular
genes. Los plásmidos que se usan experimentalmente para estos fines se denominan vectores. Los investigadores

ADN copia.
pueden insertar fragmentos de ADN o genes en un vector plasmídico, creando un llamado plásmido recombinante.
Este plásmido se puede introducir en una bacteria mediante el proceso llamado transformación. Luego, debido a que
las bacterias se dividen rápidamente, pueden usarse como fábricas para copiar fragmentos de ADN en grandes
cantidades.
Tipo de ADN generado in vitro a partir de una molécula de ARN mediante una enzima llamada
retrotranscriptasa. Esta enzima es capaz de sintetizar ADN usando ARN como molde. Es una enzima presente en
virus que tienen ARN como material genético, como es el caso del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH).
Este tipo de ADN es muy útil en biología molecular porque ayuda a conocer la expresión génica de una célula. Es
decir, cómo diferentes tipos de genes se expresan en diferentes tipos de células. Se puede usar un perfil de expresión
génica para encontrar y diagnosticar una enfermedad o afección, o para determinar cómo responde el cuerpo a un
tratamiento.
La estructura del ARN.
Se sabe que las células contienen una variedad de formas de ARN, incluyendo ARN mensajero (ARNm), ARN de
transferencia (ARNt) y ARN ribosómico (ARNr), y cada forma está involucrada en diferentes funciones y actividades.
Aunque existen múltiples tipos de moléculas de ARN, la estructura básica de todo ARN es similar.
El ácido ribonucleico se forma por la polimerización de ribonucleótidos, los cuales se unen entre sí mediante enlaces
fosfodiéster en sentido de 5 ́a 3 ́ (igual que ocurría en el ADN).
El ARN tiene una estructura semejante al ADN, con algunas diferencias importantes:
- El azúcar que forma parte de su estructura es la ribosa.
- La base nitrogenada que forma parte de su estructura es el uracilo (U) en lugar de la timina.
- La mayor parte del ARN se encuentra en forma monocatenaria.
Solo un tipo de ARN, el ARN de transferencia presenta estructura secundaria, consecuencia del apareamiento interno
entre sus bases dando lugar a una molécula con una morfología en forma de hoja de trébol, la cual posteriormente se dobla
adquiriendo una forma de letra L. Esta conformación terciaria es extremadamente importante en su función.
Aunque el ARN es una molécula monocatenaria, puede formar estructuras bicatenarias que son importantes para su función.
Las cadenas individuales de ARN pueden "hibridarse" para formar una doble hebra. Tanto con moléculas de ARN como de
ADN por complementariedad de bases. Clave para la transferencia de la información desde el ADN al ARN.
Existen varios tipos de ARN que realizan funciones específicas:
 ARNm (ARN mensajero): realiza una función de intermediario en la transcripción de genes estructurales del
genoma. Se denomina así a aquellos genes que codifican para proteínas.
 ARNt (ARN de transferencia): participa en la traducción. Transfiere intermediarios a una cadena polipeptídica
creciente durante la traducción. Tiene una estructura en forma de hoja de trébol, con varios sitios funcionales.
Se pueden distinguir las siguientes regiones en la molécula de ARNt:
- Extremo 3': lugar de unión al aminoácido (contiene siempre la secuencia ACC).
- Bucle dihidrouracilo (DHU): Lugar de unión a la aminoacil-ARNt-sintetasa o a enzimas encargadas de unir
un aminoácido a su correspondiente ARNt.
- Bucle T ψ C: lugar de enlace al ribosoma.
- Bucle del anticodón: lugar de reconocimiento de los codones del mensajero.
Existen una serie de bases “raras” que forman parte de la molécula de ARN transferente como el dihidrouracilo y
la pseudouridina( ψ).

 ARNr (ARN ribosomal): forma parte de la estructura de los ribosomas. Existen varios tipos que se designan
mediante las unidades de sus coeficientes de sedimentación, unidades S (Svedberg). La subunidad pequeña del
ribosoma contiene ARNr de 18 S y la grande de 28 S, 5 S y 5.8 S.
Hay hasta otros 9 tipos diferentes, incluido el ARN mitocondrial. Hay ARNs con funciones catalíticas (pueden
actuar como ribonucleasas), ARN nuclear, de interferencia (suprimen la función de genes específicos) etc. Algunos
de estos ARNs son:
- ARN heterogéneo nuclear (RNAhn): Son moléculas largas precursoras del ARNm. Se encuentra en el núcleo
de la célula. Tras el proceso de maduración del ARN dará lugar a ARNm que saldrá al citoplasma de la célula.
- ARN pequeño nuclear (RNAsn): De pequeño tamaño situado en el núcleo de las células eucariotas. Es un ARN
monocatenario que se une a ciertas proteínas del núcleo formando las ribonucleoproteínas nucleares, para realizar
el proceso de eliminación de intrones (maduración del ARNm).
- Micro-ARN (miRNA): es un ARN monocatenario, de una longitud de entre 21 y 25 nucleótidos, y que tiene la
capacidad de regular la expresión de otros genes y que pueden formar estructuras en forma de horquilla. Los micro-
ARN son moléculas de ARN transcritas a partir de genes de ADN, pero no son traducidas a proteínas.
- ARN pequeño interferente (siRNA): o ARN de silenciamiento es una clase de ARN bicatenario. Es un tipo
de ARN interferente que es altamente específico para la secuencia de nucleótidos de su ARN mensajero diana,
interfiriendo por ello con la expresión del gen respectivo.
El flujo de la información genética.
Los genes especifican los tipos de proteínas que producen las células, pero el ADN no es la plantilla directa para la
síntesis de proteínas. Por el contrario, las plantillas para la síntesis de proteínas son moléculas de ARN (ácido
ribonucleico). En particular, los ARN mensajeros que son los intermedios que transportan la información en la
síntesis de proteínas. Otras moléculas de ARN, como el ARN de transferencia (ARNt) y el ARN ribosómico
(ARNr), forman parte de la maquinaria de síntesis de proteínas. Todas las formas de ARN celular son sintetizadas
por las ARN polimerasas que toman instrucciones de las plantillas de ADN. Este proceso de
transcripción es seguido por la traducción, y la síntesis de proteínas de acuerdo con las instrucciones dadas por
las plantillas de ARN. Por lo tanto, el flujo de información genética, en las células normal es:

Estos tres procesos se llaman Dogma Central de la Biología y se cumple en todas las células salvo en virus ARN
que a partir de ARN son capaces de sintetizar ADN mediante el proceso conocido como retrotranscripción.
Este flujo de información depende del código genético, que define la relación entre la secuencia de bases en el
ADN y la secuencia de aminoácidos en una proteína. El código es casi el mismo en todos los organismos: una
secuencia de tres bases llamada codón, especifica un aminoácido. Los codones en el ARNm son leídos
secuencialmente por las moléculas de ARNt, que sirven como adaptadores en la síntesis de proteínas. La síntesis de
proteínas tiene lugar en los ribosomas, que son conjuntos complejos de ARNr y más de 50 tipos de proteínas.

El ADN contiene la información hereditaria, y el ARN es una copia temporal de un gen de ADN. Los ribosomas
crean una proteína a partir de aminoácidos basada en la secuencia de nucleótidos dentro del ARN.
Una réplica es una copia exacta, y la replicación del ADN es el proceso de copiar el ADN. Transcribir algo
es reescribirlo, y la transcripción es el proceso de crear una copia temporal de ARN de una secuencia de ADN original.
Traducir algo, por otro lado, es cambiarlo de un idioma a otro. La traducción de proteínas es el proceso de traducir el
lenguaje del ARN, hecho de nucleótidos, al lenguaje de las proteínas, hecho de aminoácidos. El ADN contiene la
información hereditaria, y el ARN es una copia temporal de un gen de ADN. Los ribosomas crean una proteína a
partir de aminoácidos basada en la secuencia de nucleótidos dentro del ARN.
La primera parte del dogma central es la replicación del ADN. Las dos cadenas de ADN son antiparalelas, lo que
significa que son paralelas entre sí, pero van en direcciones opuestas. La direccionalidad de la cadena está
determinada por la posición del azúcar desoxirribosa en el nucleótido. En una cadena creciente de ácido nucleico, el
grupo fosfato de un nucleótido está unido al azúcar por el átomo de carbono 5', y se agrega un nuevo nucleótido al
carbono 3' del azúcar. Esta dirección "hacia adelante" se conoce como 5′ → 3' (cinco prima a tres prima). Toda
replicación del ADN ocurre en esta dirección. Dado que las dos cadenas de una molécula de ADN son antiparalelas,
si una cadena avanza (5' → 3') de izquierda a derecha, la otra cadena avanza (5' → 3') de derecha a izquierda. Como tal,
el extremo 5' de una hebra se corresponde con el extremo 3' de la otra hebra.
La replicación en eucariotas tiene lugar en el núcleo y dura unas 7 horas. Se caracteriza por ser bidireccional y
semiconservativa.
La replicación del ADN ocurre durante la fase S del ciclo celular. Durante el proceso de replicación del ADN, las
enzimas celulares desenrollan la molécula de ADN y separan las dos cadenas de ADN entre sí.
La replicación del ADN en eucariotas es semiconservativa: cada hebra actual de ADN funciona como plantilla
para una nueva hebra, por lo que una pieza de ADN copiada estará compuesta de una hebra antigua y una nueva.
Después de que las dos cadenas del ADN se separen, la ADN polimerasa será la enzima que establezca los
nucleótidos complementarios de la nueva cadena de ADN, siempre en dirección 5' → 3'.
La ADN polimerasa agrega nuevos nucleótidos basándose en las reglas de complementariedad de bases: enlaces de
adenina con timina y enlaces de citosina con guanina. Las ADN polimerasas celulares son ADN polimerasas
dependientes del ADN porque sintetizan el ADN usando una plantilla de ADN. Es
importante recordar que la ADN polimerasa no inicia la síntesis de una cadena
nueva, sino que elonga una cadena ya existente.
La replicación del ADN es bidireccional. La replicación comienza en un punto de
origen, conocido como origen de replicación y se extiende simultáneamente en
ambas direcciones a partir de ese punto. A los lugares en los que se está
produciendo la replicación se les llama horquillas de replicación.
 La replicación comienza en el origen de replicación, con la apertura de las hebras de ADN.
 La ADN polimerasa copia la cadena molde en la dirección 3' a 5' y sintetiza la nueva hebra en dirección 5' a 3'.
Los dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP ) se van incorporando en la nueva hebra recién sintetizada. Se les denomina
en conjunto desoxirribonucleótidos trifosfato.
En este proceso intervienen además de la ADN polimerasa las siguientes enzimas:
- Topoisomerasas. Estas enzimas introducen roturas transitorias en la hebra de ADN. Desenrollan el ADN.
- Helicasas. Abren la doble cadena de ADN. Hay helicasas de ADN y ARN. Las helicasas de ADN separan el
ADN bicatenario en cadenas individuales que permiten copiar cada cadena. Durante la replicación, las helicasas
de ADN desenrollan el ADN en posiciones llamadas orígenes de replicación donde se iniciará la síntesis. La
helicasa de ADN continúa desenrollando el ADN formando una estructura llamada horquilla de replicación, que
lleva el nombre de la apariencia bifurcada de las dos cadenas de ADN a medida que se descomprimen. El proceso de
romper los enlaces de hidrógeno entre los pares de bases de nucleótidos en el ADN bicatenario requiere energía. Para
romper los enlaces, las helicasas usan la energía almacenada en una molécula llamada ATP que sirve como
moneda de energía de las células.
- Primasas. Enzima que sintetiza fragmentos cortos de ARN llamados cebadores. Estos cebadores sirven como
punto de partida para la síntesis de ADN. La enzima actúa sintetizando secuencias cortas de ARN que son
complementarias de un fragmento de ADN monocatenario, que sirve como molde. Es crítico que los cebadores
sean sintetizados por la primasa antes de que pueda ocurrir la replicación del ADN. Esto se debe a que las ADN
polimerasas, no puede unirse a una cadena sencilla de ADN, por lo que la primasa deposita un fragmento corto
de ARN complementario en la cadena de ADN, creando una porción de doble cadena para que la ADN
polimerasa puede unirse.
La replicación es semidiscontinua. Las dos hebras se copian simultáneamente, aunque lo hacen en direcciones
opuestas. Las polimerasas solo pueden copiar ADN en dirección 3' a 5' lo que significa que copiaran una hebra sin
problemas, la hebra que se construirá de forma directa se le llama hebra conductora.
La otra cadena no podrá sintetizarse de manera continua, porque supondría leer la hebra en la dirección incorrecta
5' a 3'. Por ello una de las cadenas se sintetiza de manera discontinua. Esta hebra denominada hebra retardada
se sintetiza en forma de pequeños fragmentos, llamados fragmentos
de Okazaki. Terminada su síntesis son unidos mediante la acción de una enzima llamada ligasa.
Las ADN polimerasas tienen una alta fidelidad, lo que significa que no colocan una base incorrecta en la cadena
creciente de ADN replicante, aunque sucede en un bajo porcentaje (un error por cada millón de nucleótidos). Por
ello, tras la replicación, se reparan los emparejamientos erróneos. La mayor parte
de ellos se corrigen. Algunos factores que predisponen al cáncer derivan de
defectos en diferentes aspectos de la reparación post replicación. Las ADN
polimerasas también tienen la capacidad de corrección: la ADN polimerasa puede
revertir y reemplazar un nucleótido colocado incorrectamente. Esta enzima, junto
con otras enzimas de reparación, también puede cortar una sección alrededor de un
nucleótido incorrecto y reemplazar la sección de ADN con los nucleótidos
correctos.
En procariotas, existen tres tipos de ADN polimerasas que se nombran con
números romanos como I, II y III. En eucariotas existen al menos 15 tipos diferentes de polimerasas entre las que
destacan α, β, γ, δ, ε, y ζ. Además de su función polimerasa, estas enzimas poseen también actividad exonucleasa,
es decir son capaces de eliminar nucleótidos para corregir errores (actividad 3' → 5') o para eliminar cebadores o
1. La replicación del ADN es semiconservativa. Cada cadena en la doble hélice actúa como plantilla para la
síntesis de una nueva cadena complementaria.
2. Las ADN polimerasas requieren una plantilla y un cebador (iniciador) y sintetizan el ADN en la dirección
de 5 'a 3'.
3. Durante la replicación del ADN, una de las cadenas se sintetiza como una pieza continua. La otra está
hecha a partir de piezas pequeñas.
reparar el ADN (actividad 5' → 3').

Las secciones de ADN llamadas genes codifican la información necesaria para crear proteínas. Hay más de 20,000
genes que codifican proteínas dentro de los 46 cromosomas que constituyen el genoma humano. Y son tres los
pasos necesarios en el proceso de generar una proteína a partir de la información almacenada en el ADN:
transcripción, procesamiento de ARN y traducción.
La replicación del ADN ocurre en el núcleo porque el ADN está ubicado en el núcleo, y la transcripción, el
proceso de crear una copia temporal de ARN a partir del ADN, también ocurre en el núcleo por la misma razón.
Se denomina transcripción al paso de la información contenida en el ADN a un transportador, una molécula de
ARN que transporta la información desde el núcleo al citoplasma. Este transportador es el ARN mensajero.
Solo una de las dos cadenas de ADN, la cadena en la dirección de 3' a 5', actúa como plantilla para la
transcripción (conocida como cadena antisentido o molde). A los genes que codifican para proteínas se le llama
también genes estructurales. Estos genes tienen en su extremo 5’, fuera de la secuencia codificante, una región que
se conoce como promotor, que es el lugar de unión de los factores de inicio de la transcripción o factores de
transcripción que van a posibilitar la unión de la ARN polimerasa a la cadena de ADN.
Las ARN polimerasas celulares son enzimas dependientes de ADN porque sintetizan ARN
basado en una plantilla de ADN. De la misma manera que la ADN polimerasa usa una cadena de
ADN para crear la cadena complementaria, la ARN polimerasa usa la plantilla de ADN para
crear una cadena de ARN, agregando nucleótidos en la dirección 5' → 3' usando las mismas
reglas complementarias de pares de bases que la replicación del ADN, excepto que la base
uracilo sustituye a la timina. Debido a que solo una de las dos cadenas de ADN actúa como la
plantilla para la ARN polimerasa, el ARN resultante es de cadena sencilla. Durante la elongación
de la cadena, la ARN polimerasa se desplaza sobre la hebra molde en dirección 3' → 5' leyendo la secuencia de bases
y seleccionando el ribonucleótido que tiene una base complementaria a la base del ADN.
La ARN polimerasa termina la transcripción cuando alcanza una secuencia al final del gen conocida como señal
de terminación. En este punto, el transcrito de ARN se conoce como ARN mensajero precursor, pre-ARNm o
ARNhn. Se denomina "ARN mensajero" porque es el mensaje, codificado a partir del ADN, de cómo crear una
proteína específica.
Las ARN polimerasas no tienen tan alta fidelidad como las ADN polimerasas y colocan una base incorrecta en un
promedio de una vez por 100,000 nucleótidos transcritos, 10 veces más a menudo que la ADN polimerasa.
En organismos procariotas solo existe una ARN polimerasa. En eucariotas existen tres tipos de ARN polimerasa:
 ARN polimerasa I: Responsable de la síntesis de la mayoría de los ARN.
 ARN polimerasa II: Responsable de la síntesis del ARNm.
 ARN polimerasa III: Responsable de la síntesis del ARNt y de la subunidad 5S del ARNr.
Después de la transcripción, el ARNm precursor se somete a un procesamiento, también conocido como modificación
postranscripcional, para convertir el ARNm precursor en ARNm maduro.
La maduración del ADN comprende varios pasos:
 El extremo 5’ es cubierto por una caperuza (Cap): La primera modificación, que ocurre mientras la ARN
polimerasa todavía está realizando la transcripción del ARNm, es la adición de una "tapa" al extremo 5' del
transcrito primario. El 5'-cap consiste en un nucleótido de guanina metilado (conocido como 7-metilguanosina, m7G)
que protege al ARN de la degradación. Los ribosomas también se unirán a este extremo para iniciar la traducción.
 El extremo 3’ es adenilado (se añade a él una cola de poli A): La segunda modificación es la adición al extremo
3’de una cola poli-A. Consiste en 50-250 nucleótidos de adenina añadidos al extremo 3' del ARNm para proteger el
transcrito del ARNm. Permite salir al ADN maduro del núcleo al citoplasma.
 Eliminación de intrones y empalme de exones (splicing): La modificación final es la eliminación de intrones
mediante un proceso de corte y empalme. Dentro de la mayoría de las transcripciones de ARNm eucariotas, hay
secuencias de ARNm que no se traducirán a proteínas. Estas secuencias, conocidas como intrones, se eliminan
durante la modificación postranscripcional, dejando solo los exones que son las secuencias de codificantes. En este
proceso intervienen unas proteínas conocidas como ribonucleoproteínas pequeñas nucleaures (RNPsn) que se
sitúan en los extremos de los intrones formando un complejo llamado espliciosoma, de manera que la secuencia
intrónica formará un bucle que será finalmente cortado dando lugar al ARNm maduro. Se puede crear más de una
proteína a partir de un solo ARNm a través del proceso de empalme del ARN porque se pueden eliminar diferentes
intrones, lo que da como resultado diferentes secuencias de ARN y, posteriormente, diferentes proteínas. Este
proceso se conoce como empalme alternativo. Los ARNm de algunos virus, incluido el VIH, también sufren
procesos de corte y empalme alternativo del ARN.
Una vez procesado, el transcrito de ARNm maduro abandona el núcleo y se une al ribosoma, que se encuentra en el
citosol. El ribosoma actúa como una fábrica de proteínas, y el ARNm maduro funciona como las instrucciones para
la fabricación. Las proteínas están hechas de aminoácidos y, la mayoría de las proteínas humanas tienen un tamaño
de 50 a 1000 aminoácidos. Hay 20 aminoácidos diferentes, y la secuencia de ARNm determina el orden en que el
ribosoma ensamblará los aminoácidos en una proteína.

Los principales componentes son proteínas. Estas se forman a partir de cadenas polipeptídicas, que a su vez están
formadas por una cadena de aminoácidos. El orden de los aminoácidos en estas cadenas polipeptídicas está
determinado por el código genético. Cada grupo de tres bases presentes en el ARNm recibe el nombre de codón y
generalmente determina la unión de un aminoácido específico.
Se denomina traducción al proceso de lectura de los codones del ARNm que da como resultado la formación de
una cadena polipeptídica. Este proceso se realiza en el citoplasma celular, concretamente es llevado a cabo en los
ribosomas que leen las moléculas de ARNm en dirección 5’ a 3’.
El ARN de transferencia actúa de intermediario en este proceso de fabricación, uniendo un aminoácido a la cadena
cada vez. El ARNt se une al ARNm por su región anticodón, una región complementaria a la secuencia de tres
bases (codón) presente en el ARNm. Cada codón especifica un aminoácido.
 Estructura de los ribosomas
El ribosoma, es una gran partícula de ribonucleoproteínas, formada por ARNr y proteínas, que consta de dos
subunidades (grande y pequeña) en todas las especies.

La subunidad grande 60S del ribosoma eucariota (50S en bacterias) consta de tres moléculas de ARNr (25S, 5.8S y 5S) y
46 proteínas, mientras que la subunidad pequeña 40S (30S en bacterias) incluye una cadena de ARNr (18S) y 33 proteínas. Los
ribosomas eucariotas también se conocen como ribosomas 80S, en referencia a sus coeficientes de sedimentación en unidades
Svedberg, porque sedimentan más rápido que los ribosomas procariotas (70S).
La subunidad pequeña controla la complementariedad entre el anticodón de ARNt y el ARNm, mientras que la subunidad
grande cataliza la formación de enlaces peptídicos.

La traducción comprende tres fases:

 Iniciación: El ribosoma se reúne con el ARNm y el primer ARNt para que pueda comenzar la traducción. El
ARNt que porta el aminoácido metionina se une a la subunidad ribosomal pequeña. Juntos, se unen al extremo 5'
del ARNm al reconocer el casquete de posición 5' (que se agregó durante la etapa de maduración del ARNm en el
núcleo). El ribosoma se desplaza en dirección 5’ a 3’, leyendo la secuencia en palabras de tres bases conocidas como
codones. La síntesis de la cadena polipeptídica comienza cuando el ribosoma encuentra el codón de inicio en el
ARNm, que es la secuencia AUG. Esta secuencia codifica el aminoácido metionina, por lo que toda traducción de
proteínas comienza con metionina. Este codón establece también el marco de lectura de la cadena.
 Elongación: El primer ARNt, que lleva metionina, comienza en el sitio P del ribosoma. Junto a él, está expuesto
un nuevo codón, en otro hueco llamado sitio A. El sitio A será el "lugar de aterrizaje" para el siguiente ARNt, cuyo
anticodón sea complementario del codón expuesto. Una vez formado el enlace peptídico, el ribosoma avanza a través
del ARNm exactamente un codón. Este avance permite que el primer ARNt, ahora vacío, salga a través del sitio E
("salida"). Y se expone un nuevo codón en el sitio A, de forma que todo el ciclo se pueda volver a repetir. Los
aminoácidos se unen a la cadena polipetídica creciente de acuerdo a la secuencia en el ARNm. Los aminoacil-
ARNt, factores de iniciación y elongación, y el GTP (guanosina-5’-trifosfato) son necesarios para que se realicen
tanto la iniciación como la elongación de la cadena polipeptídica.
 Terminación: La síntesis de la cadena continúa hasta que el ribosoma se encuentra una señal de stop. Esta señal de
stop son secuencias de bases que no codifican para ningún aminoácido. Son secuencias stop: UGA, UAG o UAA.
Este codón hace que las subunidades del ribosoma se separen y la cadena polipeptídica sea liberada. Proteínas
llamadas factores de liberación reconocen los codones de terminación y caben perfectamente en el sitio P (aunque
no sean ARNt). Los factores de liberación interfieren con la enzima que normalmente forma los enlaces
peptídicos: hacen que agregue una molécula de agua al último aminoácido de la cadena. Esta reacción separa la
cadena del ARNt, y la proteína que se acaba de formar se libera.

EJERCICIO
RESUELTO Relaciona cada una de las descripciones siguientes con el término correctoutilizado para
definirlas.
Las instrucciones para el ensamblaje de los aminoácidos las proporciona el código genético. En él se encuentran
recogidos los 64 codones que especifican los aminoácidos que forman parte de las proteínas.

Características del código genético:

- El código genético es degenerado, es decir hay varios aminoácidos que tienen más de un codón.
- No se solapa. Cada nucleótido se lee solo una vez. La síntesis comienza con el codón de iniciación AUG cerca
del extremo 5’ del ARN y termina con el codón stop.
- No hay paradas ni marcas que distingan un codón del siguiente.
- Es universal. El mismo codón especifica siempre el mismo aminoácido en todas las especies estudiadas.
El flujo de información del ADN al ARN y de éste a proteínas es uno de los principios de la biología molecular, que
no se cumple siempre. El splicing alternativo hace que se puedan formar varias proteínas combinando los
diferentes exones de un mismo gen, dando lugar a tres proteínas diferentes dependiendo de la combinación de
exones que se realice a partir del ARN inmaduro.
Mutaciones y polimorfismos.
La capacidad para variar, para mutar, es la tercera característica del material genético. Las mutaciones
constituyen la base de la evolución. Podría definirse como “un cambio permanente que afecta a la composición
del ADN”. Tipos de mutaciones dependiendo del tipo de célula donde se produzca la mutación:
 Mutaciones somáticas. Cuando afecta a células que forman parte tejidos del organismo.
 Mutación germinal. Cuando se produce en las células germinales o reproductivas. Estas mutaciones son las
que tienen importancia a nivel evolutivo ya que todas las células del nuevo individuo serán portadoras del cambio
y lo transmitirán a su descendencia.
Algunos cambios se traducen en enfermedades, otros pasan desapercibidos porque ocurren en zonas del ADN no
codificantes o que no realizan una función esencial. A estos cambios se les conoce con el nombre de polimorfismos.

A nivel molecular las mutaciones pueden producirse por exposición a determinados agentes mutágenos
(mutaciones inducidas) o por errores producidos durante la replicación, reparación y transcripción del ADN
(mutaciones espontáneas). Tipos de mutaciones:
1. Sustituciones: cambios de una base por otra. Puede sustituirse una base púrica por otra púrica o una pirimidínica
por otra pirimidínica. Si el cambio se produce entre dos bases del mismo tipo a la sustitución se le da el nombre de
transición. Cuando el cambio tiene lugar entre una base púrica y una pirimidínica se le denomina transversión.
Esto puede producir una proteína defectuosa o una proteína neutral que no produce ni ventajas ni inconvenientes
en el individuo. Se distinguen 3 tipos:
- Mutaciones mis-sense (con sentido alterado), se origina un aminoácido diferente.
- Mutaciones non-sense (sin sentido), cuando dan lugar a un codón stop.
- Mutaciones silenciosas (sinónimas o neutrales) cuando el cambio da lugar al mismo aminoácido.
2. Mutaciones por pérdida o inserción de bases: tienen como resultado el cambio del marco de lectura del
ADN. Se producen por adicción o deleción de unas pocas bases. Estas son las mutaciones más frecuentes en el
genoma. Si estas mutaciones caen dentro de la región codificadora provocarán cambios en el marco de lectura y
darán lugar a proteínas diferentes. Muchos de estos cambios darán lugar a un organismo que no es viable. Se les
denomina también mutaciones frame Shift. Un ejemplo de este tipo de mutación es la enfermedad de Tay–Sachs,
una inserción de 4 pb que causa un corrimiento del marco de lectura que origina una enzima no funcional.
3. Mutaciones causadas por elementos transponibles: se producen por desplazamiento de unas secuencias de un
lugar del ADN a otro, lo que provoca cambios en el mensaje genético. Estos elementos móviles son secuencias
de ADN repetitivo de tipo SINE o Alu. Se ha visto este origen en casos aislados de neurofibromatosis,
Duchenne, beta talasemia, cáncer de mama, poliposis adenomatosa familiar y hemofilia.
Otro tipo de mutaciones son debidas a errores que se producen durante el proceso de splicing ya mencionado,
como las que ocurren en la beta talasemia y las mutaciones dinámicas, secuencias de repeticiones de nucleótidos
que se aumentan su longitud al pasar de una generación a otra. Hay cerca de 20 enfermedades diferentes que están
causadas por este tipo de mutación.

Hay regiones del ADN que no tienen la misma secuencia en todas las personas, existen diferentes "versiones" de
esa secuencia entre los individuos de la población. Estos cambios en el ADN se llama polimorfismos genéticos.
Estas regiones polimórficas pueden encontrarse formando parte de la secuencia de los genes y entonces cada una
de las versiones o alelos determinará una variante de ese gen (color de ojos, pelo…) o pueden encontrarse en
regiones del ADN no codificante, sin traducción funcional alguna (al menos conocida).
Son utilizados como herramientas en el diagnóstico molecular y sirven para marcar los cromosomas.
- RFLPs: Los primeros marcadores del ADN desarrollado. Se definen como diferencias en la secuencia del
ADN que pueden ser detectadas por la formación de fragmentos de diferente longitud tras la digestión del ADN
con enzimas de restricción. Estas enzimas cortan la cadena de ADN cuando reconocen secuencias específicas diana.
- VNTRs: también llamados minisatélites. Son secuencias de ADN que contienen un número variable de
repeticiones en tándem de unidades entre 15 y 65 pb. Se localizan en regiones no codificantes el ADN y el número
de repeticiones varía entre los individuos.
- STRs: microsatélites. En este caso las repeticiones son de un número muy pequeño de bases, generalmente Aes
y Ces. Un mismo STR puede tener varias formas alternativas (alelos) de, por
ejemplo, 2,4, 7, 9, 12 y 17 repeticiones de la misma secuencia básica. Se
transmiten tanto por vía materna como paterna, de manera que cada individuo
recibe STRs tanto de su padre como de su madre.
El número de repeticiones de las VNTRs y STRs se puede utilizar en la
identificación de individuos y es el método utilizado en las pruebas de paternidad e
identificación de criminales.

Son polimorfismos formados por variaciones en un solo nucleótido. No cambian

la longitud de la secuencia de ADN de esa región concreta. Están distribuidos a lo
largo de todo el genoma. Son muy frecuentes, se producen cada 1000 pb.
Estos cambios no forman la enfermedad, pero pueden “predisponer” a la misma
cuando se combinan con otros cambios del mismo tipo. Algunos de estos SNPs cuando aparecen juntos en un
cromosoma provocan tendencia a la deleción del cromosoma, provocando enfermedades.
Los SNPs influyen en el “riesgo” de padecer una enfermedad o en la susceptibilidad de un individuo frente a un
determinado fármaco.
Los SNPs tienen una gran importancia biológica, ya que determinan la mayor parte de la variabilidad genética de los
individuos, causando muchas de las diferencias fenotípicas (observables) de los mismos.
Su ventaja es que al ser sencillos suelen ser identificables incluso en situaciones en las que el ADN de la muestra está
muy degradado (por ejemplo, en restos óseos antiguos) y otros marcadores (como los STR) no están conservados.
Enzimas relacionadas con los ácidos nucléicos.
ADN polimerasas.
Son las enzimas que permiten realizar copias del ADN mediante replicación. Catalizan la formación de polímeros
formados por el ensamblaje de múltiples unidades estructurales o desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTP). Se usan
en la técnica base de la biología molecular, la PCR. La mayoría de las polimerasas utilizadas en biología molecular
se originan a partir de bacterias o de sus virus infecciosos (conocidos como bacteriófagos o fagos). Características:
 Solo agregan nucleótidos al extremo 3'-OH de un cebador preexistente. Ninguna de las ADN polimerasas que se
han caracterizado hasta ahora puede dirigir la síntesis de novo de una molécula polinucleotídica a partir de
nucleótidos individuales. Los cebadores son fragmentos cortos de ARN complementarios a secuencias de ADN,
necesarios para su replicación. Los cebadores son sintetizados por una ARN polimerasa llamada primasa.
 En bacterias, existen tres ADN polimerasas que actúan para lograr la replicación del ADN: Pol I, Pol II y Pol
III. Las tres enzimas catalizan la elongación en dirección 5 ' → 3' de hebras de ADN en presencia de un cebador, los
cuatro dNTP, un ADN molde, y Mg2+ necesario como cofactor. También tienen actividad exonucleasa 3 ' → 5',
conocida como actividad de corrección de pruebas, ya que inicia la eliminación de bases agregadas incorrectamente a
medida que avanza la polimerización. La actividad de corrección aumenta la fidelidad, pero ralentiza la progresión
de la polimerasa. Además, la ADN Pol I tiene actividad de exonucleasa 5 ' → 3', que se utiliza para eliminar el
cebador de ARN del extremo 5 'de las cadenas de ADN. La actividad exonucleasa 5 ' → 3' de la ADN Pol I se utiliza
in vitro para marcaje de nucleótidos.
Actualmente existen diferentes tipos de ADN polimerasas con distintas características. Destacan las ADN
polimerasas termoestables, aisladas de organismos termófilos, capaces de realizar la síntesis de ADN a altas
temperaturas necesarias para desnaturalizar la doble hebra de ADN, sin perder su actividad. Una de las más
utilizadas,es la Taq polimerasa.

Transcriptasa inversa
La caracterización de la transcriptasa inversa (RT) del virus del sarcoma de Rous (RSV) puso de manifiesto que el
ADN monocatenario podría sintetizarse a partir de una plantilla de ARN. El ADN monocatenario resultante es una
copia "complementaria" de la plantilla de ARN, o ADNc. Las transcriptasas inversas virales RSV pertenece a la
familia retroviridae (retrovirus). El ciclo de vida de los retrovirus incluye una transcripción dirigida por RT de su
genoma de ARN y la formación de una molécula de ADN de doble cadena viral, que se integra en el genoma del
huésped. La progenie viral infecciosa se produce a partir de la transcripción del ADN viral. La RT más utilizada en
biología molecular es la que permite la replicación del virus de la mielovistosis aviar (AMV).
Ligasas.
Las ligasas de ADN conectan fragmentos de ADN catalizando la formación de un enlace fosfodiéster entre un grupo
3'-OH y un grupo 5'-fosfato. En las células, las ADN ligasas son esenciales para unir los fragmentos de Okazaki
durante la replicación y en el último paso del proceso de reparación del ADN. Se usan en biología molecular para
unir fragmentos de ADN, como los generados por la digestión de enzimas de restricción, agregar adaptadores al
ADN o reparar mellas. La ligasa más frecuencia en biología molecular es la ADN ligasa del bacteriófago T4.
Debido a que la actividad del ADN ligasas depende de varios factores (como la temperatura, la concentración de
fragmentos, la naturaleza de estos, etc, es difícil establecer las condiciones ideales de incubación. Los protocolos de
ligación deben optimizarse empíricamente para cada reacción y de acuerdo con la cantidad de ADN presente.
Nucleasas.
Las nucleasas dividen los enlaces fosfodiéster en el esqueleto de los ácidos nucleicos. Son espadas de doble filo
para los biólogos moleculares: por un lado, son el peor enemigo de la integridad de los ácidos nucleicos y, por otro
lado, son muy útiles para cortar y manipular ácidos nucleicos con fines de clonación.
Según su modo de acción, se han definido dos clases principales:
- Las exonucleasas: actúan en los extremos de las moléculas de ácido nucleico. Eliminando nucleótidos uno a uno
bien dirección 3' → 5' o 5' → 3'.
- Las endonucleasas escinden los ácidos nucleicos en puntos del interior, no en los extremos.
Según la molécula de ácido nucleico sobre la que actúen pueden ser:
- Desoxirribonucleasas (o ADNasas) cortan el ADN y generan mellas (eliminan el enlace fosfodiéster en la doble
cadena de la molécula entre dos nucleótidos adyacentes de una cadena, mediante la acción enzimática). La ADNasa I,
es una endonucleasa que actúa sobre el ADN monocatenario o bicatenario (aislado o incorporado en la cromatina) muy
utilizada en la técnica de marcaje de sondas de desplazamiento en mella (o nick translation)
- Ribonucleasas (o ARNasas) cortan el ARN. La ARNasa A, es una endonucleasa que
escinde ARN monocatenario. Se usa para reducir la contaminación por ARN en
determinadas técnicas de extracción de ADN.
Según el tipo de cadena sobre la que actúen puede ser:
- Nucleasas que atacan doble cadena de ácido nucleico.
- Nucleasas que atacan cadena sencilla.
Según la especificidad del corte que realizan:
- De forma aleatoria.
- En sitios concretos de la molécula. Este es el caso de las endonucleasas de
restricción muy utilizadas en técnicas de clonación de ácidos nucleicos.
 Endonucleasas de restricción.
Actúan a modo de tijeras y permiten cortar el ADN en regiones específicas de longitud corta, entre 4 y 6
nucleótidos, denominadas dianas de restricción. Son enzimas bacterianas que escinden el ADN bicatenario. Hay tres
tipos de enzimas de restricción, pero solo las de tipo II tienen interés a la hora de trabajar con el ADN. Las enzimas
de restricción de tipo I y III reconocen una secuencia específica, pero cortan a una distancia variable del sitio de
reconocimiento. Las de tipo II, cortan en sitios específicos del ADN y, por lo tanto, son herramientas
extremadamente útiles en biología molecular.
Permiten la clonación y purificación de fragmentos de ADN definidos. Los aproximadamente 500 conocidos se
aíslan típicamente de una variedad de cepas bacterianas.
Se nombran utilizando las iniciales del nombre de la bacteria a partir de la cual se han obtenido, en cursiva con la
primera inicial en mayúscula. La primera letra corresponde al género, y las otras dos a la especie.
Estas enzimas cortan con absoluta precisión dentro de la secuencia reconocida, este es el caso de Eco RI y las
enzimas que se utilizan en investigación. Es característico de este tipo de enzimas que las secuencias que reconocen
son palindrómicas, las dos hebras tienen la misma secuencia de bases cuando se leen en dirección 5’ a 3’. Los
fragmentos obtenidos pueden posteriormente volver a unirse o recombinarse con otro ADN que haya sido cortado
por la misma enzima.
Además de la diana de restricción que reconocen, se diferencian en el mecanismo de corte. Los extremos
generados serán muy reactivos y tienden a unirse por complementariedad a otros extremos cohesivos localizados en
moléculas cortadas por la misma enzima. Esta propiedad se utiliza en clonación, para insertar un gen en un plásmido.
Los fragmentos de ADN generados como consecuencia del corte de las enzimas reciben el nombre de fragmentos de
restricción. Cuando un ADN se corta con una enzima en concreto, ese ADN presentará un número determinado de
dianas de restricción originando una serie de fragmentos de diferente tamaño que darán lugar a un patrón
característico llamado patrón de restricción. Estos fragmentos pueden ser separados mediante la técnica de
electroforesis. Esto puede ser útil para estudiar posibles anomalías en el diagnóstico prenatal así como para detectar
mutaciones.

 Fosfatasa alcalina: Se utiliza para la eliminación de grupos 5'-fosfato de los ácidos nucleicos para evitar la
recircularización de los vectores de ADN en experimentos de clonación. La fosfatasa alcalina no hidroliza los
enlaces fosfodiéster.
 T4 Polinucleótido quinasa: Cataliza la transferencia de un grupo fosfato desde una molécula de ATP al extremo
5'-OH de un ácido nucleico (ADN o ARN, sin limitaciones de tamaño). Se usa para realizar marcajes radiactivos
usando ATP marcado como donante de fosfato.
 Topoisomerasas: Son enzimas nucleares muy conservadas en la evolución que emplean un mecanismo de rotura
transitoria y religación para regular la topología de la molécula de ADN, por lo que desempeñan un papel fundamental
en prácticamente todos los procesos del metabolismo cromosómico, desde la transcripción y la replicación a la
condensación y segregación cromosómica. En el laboratorio de biología molecular se usan para relajar la tensión de
estructuras superenrolladas como es el caso del ADN, para la realización posterior de técnicas como la PCR.

RESUELTO

Diana de restricción: Secuencia de ADN:

G‖GATCC ATCGGGCCTAGGATCCAATCGGGCTTACCCATCCTAGGTTAAGCTG
CCTAG‖G TAGCCCGGATCCTAGGTTAGCCCGAATGGGTAGGATCCAATTCGAC

A T C G G G C C T A G G A T C C A A T C G G G C T T A C C C A T C C T A G G T T A A G C TG T A G C C C G G A T C C T A G G T T
A G C C C G A A T G G GT A G G A T C C A A T T C G A C
Fragmento nº 1: Fragmento nº 2: Fragmento nº 3:
ATCGGGCCTAG GATCCAATCGGGCTTACCCATCCTAG GTTAAGCTG3’
TAGCCCGGATCCTAG GTTAGCCCGAATGGGTAG GATCCAATTCGAC5’
 Etapas.
El ADN genómico se encuentra en todas las células nucleadas de nuestro organismo, y en general, es idéntico en
todas ellas. Por eso, el ADN podrá ser purificado de células blancas de sangre periférica para lo que bastará con una
simple extracción de sangre. Por regla general, el ADN genómico, es el material de elección para observar
alteraciones estructurales en los genes. El estudio a nivel del ADN dará información estructural, sobre la
presencia/ausencia del gen, su tamaño, variantes y mutaciones.
Se debe recurrir al análisis del ARN en el caso por ejemplo de virus cuyo material genético sea ARN. También
para realizar estudios de expresión génica. Estos se realizan sobre el ARN mensajero. Para un determinado gen, su
ARNm estará presente sólo en aquellos tipos celulares donde se exprese (encontraremos ARNm del gen de la
insulina únicamente en las células ß del páncreas) y en algunos casos la obtención de la muestra puede ser
problemática, necesitándose una biopsia más o menos complicada. Además, el ARN es menos estable que el
ADN, siendo fácilmente destruido por una enzima, la ribonucleasa (ARNasa), presente en muchos tejidos e
incluso en el material de laboratorio, con lo que su purificación, manipulación y almacenamiento son
problemáticos. La información que proporciona el estudio del ARNm es funcional, y hace referencia a la
expresión del gen, tanto cualitativa como cuantitativa. A partir del ARNm puede construirse en el laboratorio
su correspondiente ADN complementario o ADNc (molécula de ADN que sólo contiene los exones) utilizando la
retrotranscripción. Esta posibilidad es interesante en casos de genes estructuralmente muy complejos o grandes,
donde las mutaciones puntuales causantes de la enfermedad se distribuyen al azar por todo el gen, mientras que la
molécula de ARNm cuenta con muchos menos nucleótidos. Un estudio de ADNc a partir de ARNm es mucho más
sencillo que el análisis de ADN genómico, siempre que el tejido en el que se expresa el gen esté disponible.
El análisis molecular comienza en la mayor parte de los casos con la extracción de los ácidos nucleicos que se
quieren estudiar. Tras la extracción se mide su concentración. En ese momento el ADN o el ARN están listos para
ser analizados mediante diferentes técnicas. Una de las más utilizadas en la actualidad como técnica de diagnóstico
es la PCR o amplificación en cadena de la polimerasa.
Los métodos de rutina incluyen una serie de pasos básicos:
 Disgregación del tejido: en función de la muestra de la que se parta, se deben liberar las células disgregando el
tejido y eliminando la matriz extracelular si la hay.
 Lisis celular: Una vez el tejido es disgregado en células, se hace necesario romper las membranas celulares
para liberar el ácido nucleico. En el caso concreto de células vegetales, bacterias y hongos, además de la envoltura
plásmática y nuclear, también hay que romper la pared celular. Se basa en la utilización de detergentes que
destruyen la membrana celular, liberando el contenido de las células al exterior. Va acompañada algunas veces de
una incubación con enzimas que degradan las proteínas (proteasas).
 Purificación de los ácidos nucleicos: eliminación de proteínas, lípidos y otros componentes disueltos.
 Precipitación del ácido nucleico: Una vez purificado, se realiza la precipitación, que se consigue con un
alcohol (etanol o isopropanol) en presencia de sales. Los ácidos nucleicos son solubles en soluciones concentradas de
sales, pero insolubles en alcoholes (tipo etanol o isopropanol). ADN y ARN, son moléculas con carga neta negativa
por los grupos fosfato que contienen en su estructura. En un medio acuoso, las moléculas se rodean de una capa
hidratante de moléculas de agua que las estabiliza. En presencia de un alcohol, que actúa como agente deshidratante,
los ácidos nucleicos pierden esa capa hidratante. La presencia de cationes de sodio en el medio, neutraliza la carga
negativa de los grupos fosfato de manera que las moléculas no se repelen entre sí, sino que se unen formando
hebras blanquecinas que podemos observar a simple vista según su concentración.
 Lavado: Una vez precipitado el ácido nucleico, el pellet se lava con etanol al 70% para eliminar sales y otros
posibles contaminantes.
 Rehidratación y almacenamiento. El etanol interfiere con todas las técnicas posteriores de
análisis, por eso debe ser eliminado por completo mediante evaporación. Una vez seco, el pellet
se resuspende en agua destilada libre de nucleasas o en un tampón de baja fuerza iónica, como
puede ser el tampón Tris-EDTA (TE). La rehidratación puede requerir una incubación de la
muestra a 55-65ºC con agitación suave hasta la completa disolución del pellet.
Antes de empezar a describir en detalle las principales etapas, es importante recordar que se debe
mantener en todo momento la trazabilidad de las muestras. Para ello se rotula cada tubo con
tinta indeleble.
La extracción y purificación de los ácidos nucleicos constituye la primera etapa de la mayoría de
los estudios de biología molecular y de todas las técnicas de recombinación de ADN. La calidad y la pureza de los
ácidos nucleicos son dos de los elementos más importantes en ese tipo de análisis. Si se desea obtener ácidos
nucleicos muy purificados, que no contengan contaminantes inhibidores, es preciso aplicar métodos de extracción
adecuados. Esta tabla muestra los contaminantes más habituales capaces de inhibir el análisis PCR.
 Tipos de muestras y tratamiento preliminar.
Los ácidos nucleicos se encuentran confinados dentro de la célula. Bien en el núcleo (como es el caso del ADN),
en las mitcondrias (ADNmt) o en el citoplasma (como sucede con el ARNm). Por ello, para la obtención de los
ácidos nucleicos, hay que abrirse paso a través de membranas celulares (membrana plasmática y membrana
nuclear) y pared celular (en el caso de células vegetales, bacterias u hongos). Pero además, hay que tener en cuenta
que durante ese proceso se pueden liberar enzimas que antes estaban aisladas en compartimentos celulares, que al
ponerse en contacto con los ácidos nucleicos podrían destruirlos como las nucleasas.
El procedimiento general de extracción de ácidos nucleicos consiste en tres etapas:
1. Disgregación de los tejidos y lisis celular.
2. Inactivación de las nucleasas intracelulares.
3. Separación de los ácidos nucleicos de los demás componentes celulares.
La lisis celular depende en gran medida del tipo de muestra que se va a procesar. Para la extracción, es mejor
utilizar muestras recién obtenidas. Si no es posible, hay que almacenar las muestras en condiciones que aseguren la
integridad de los ácidos nucleicos que vas a estudiar. Generalmente las muestras se almacenan a 4 ºC si van a ser
utilizadas en un espacio corto de tiempo (48-72h para obtener un ADN de buena calidad no fragmentado). En caso
contrario las muestras se deben guardar congeladas a -80 ºC. En el caso de biopsias o tejidos se pueden guardar
congeladas en nitrógeno líquido y los cultivos celulares, eliminando previamente el medio de cultivo, a -20ºC o -
80ºC.
El procedimiento de extracción de ácidos nucleicos consta de una serie de pasos que son comunes para todo tipo de
muestras biológicas, sin embargo, los pasos preliminares varían dependiendo del tipo de muestra a analizar.

Es conveniente utilizar en su extracción tubos con EDTA como anticoagulante, también la heparina y el citrato
sódico. La sangre está formada por hematíes, leucocitos y plaquetas; y un componente líquido constituido por
plasma. El ADN obtenido a partir de sangre procede de los leucocitos. Además, los hematíes contienen
hemoglobina, que actúa como inhibidor de la PCR (en concreto su grupo hemo). El primer paso de la extracción
consistirá en separar los leucocitos del resto de los componentes sanguíneos para poder realizar la extracción. Hay
unos 5 pg de ADN en las células humanas, por lo que a partir de 20 ml de sangre anticoagulada con EDTA se
pueden obtener 250 - 500 microgramos de ADN.
El pretratamiento más habitual en muestras de sangre consiste en realizar una lisis de los eritrocitos usando una
solución de lisis en proporción 1:3 (1 volumen de sangre por tres volúmenes de solución de lisis). La lisis suele estar
provocada por choque osmótico y la presencia de detergentes suaves. Finalmente se centrifuga la muestra para
descartar los eritrocitos, obteniendo el sedimento y descartando el sobrenadante.
A veces en vez de necesitar todos los leucocitos, solo interesan los linfocitos y monocitos, es decir, las células
mononucleares de sangre periférica o PBMC. En este se hace un gradiente de densidad usando para ello un medio de
separación. El medio de separación más utilizado está compuesto por Ficoll y diatrizoato sódico. Ese medio de
separación posee una densidad de 1,077 g/ml y una osmolaridad adecuada para mantener intactas las células durante
todo el proceso. En el mercado existen marcas comerciales donde se incluyen los dos componentes listos para su uso
El procedimiento consiste en añadir, muy despacio, la sangre diluida sobre el medio de separación (sin que se
mezclen las dos fases). Centrifugar unos 20-30min a 400-800g en una centrífuga de rotor basculante o rotor
horizontal, sin deceleración para no interferir en la formación del gradiente. Los distintos componentes de la sangre
se van a distribuir en el medio de separación según su densidad. La sucrosa causa la agregación de los eritrocitos,
haciendo que sedimenten junto con los granulocitos que son las células con mayor densidad. Como las células
mononucleares tienen menor densidad que el medio de sedimentación, estas permanecerán en la interfase entre este y
el plasma (con menor densidad que el medio de separación).

Para extraer el ADN de tejidos sólidos, hay que romper el tejido antes de comenzar con el proceso de extracción.
Generalmente esto se realiza utilizando fuerzas mecánicas, como un homogeneizador, que permitirá obtener
células individuales. En este paso previo de homogenización hay que tomar las precauciones necesarias para
evitar que el ácido nucleico sea degradado por nucleasas. Para ello, se debe utilizar el nitrógeno líquido, añadiéndolo
sobre la muestra cuyo ácido nucleico se quiere extraer. La muestra se congelará y posteriormente se machacará. Es
posible también que en vez de una homogeneización manual se recurra a la homogeneización automatizada usando
trituradores mecánicos o sonicadores que consigan la homogeneización. Durante este proceso, es posible que se
produzca la liberación de molélulas que puedan degradar diferentes componentes celulares (proteasas, nucleasas,
etc), por ello es conveniente trabajar en frío (4ºC) para ralentizar en lo posible estos procesos enzimáticos.
La homogeneización puede ser tanto mecánica como química o enzimática, que consiste en someter al tejido a la
acción de enzimas (proteasas) y detergentes que degraden los componentes tisulares y liberen las células.
La muestra se coloca en un tubo Eppendorf y comenzaría el proceso de extracción.
 En los casos de diagnóstico prenatal: Si se utilizan vellosidades coriales, se debe realizar una disección previa de
la muestra para separar el ADN materno que invalidaría el análisis. Si la muestra que se utiliza en el análisis es
líquido amniótico, será necesario centrifugarla para concentrar las células antes del análisis.
 Tejidos fijados en formol e incluidos en parafina o FFPE. Este tipo de tratamiento hace que el ADN se
fragmente y el ARN se degrade parcialmente. La alteración de los ácidos nucleicos será mayor cuanto más tiempo
haya transcurrido entre la obtención y la fijación de la muestra. Aunque el ácido nucleico obtenido a partir de estas
muestras no tiene la misma calidad que el obtenido a partir de tejidos frescos, puede utilizarse en las técnicas de
PCR, ya que muchas veces es la única muestra posible. En este caso es necesario desparafinar previamente la muestra
utilizando reactivos como el octano o el xileno.
La desparafinización consiste en eliminar la parafina que recubre la muestra y la rehidratación de ésta. Para ello,
la muestra se incuba primero con xilol u otro agente desparafinante y posteriormente con etanoles en concentración
decreciente y agua destilada. Una vez rehidratado el tejido, se somete a homogeneización química, quedando la
muestra preparada para la extracción.

Los cultivos celulares suponen un conjunto de técnicas que permiten el mantenimiento de células in vitro, preservando
al máximo sus propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas. Esto hace que sean un buen punto de partida para la
extracción de material genético.
Antes de la extracción, se deben recoger las células, eliminar el medio de cultivo y lavarlas usando un tampón
fosfato Si se parte de células en suspensión, se recoge todo el medio junto con las células y se centrifuga,
guardando el pellet. En el caso de tratarse de cultivos en monocapa, hay que realizar un paso previo para recoger
las células mediante tripsinización o raspado y centrifugando como en el caso anterior.

Las células de la mucosa oral se obtendrán por raspado simple de la pared de la mucosa oral con una torunda o cepillo.
Por su parte, el esputo se utiliza a menudo para detectar en él microorganismos patógenos responsables de infecciones
respiratorias. El esputo se tratará con N-acetil-L-cisteína, para su fluidificación. Si se está investigando una posible
infección por Mycobacterium sp, las muestras se tratarán con NAOH para descontaminar la muestra, puesto que la
mayor parte de las muestras clínicas están contaminadas con una flora bacteriana mixta que tiene un poder de
multiplicación más rápido que las micobacterias. Las micobacterias son más resistentes que las demás bacterias de
flora normal o microbiota debido a la alta cantidad de lípidos en su pared celular, en consecuencia, éstas son más
resistentes a las soluciones ácidas y alcalinas que normalmente eliminan a las demás bacterias. La digestión previa
con N-acetil-L-cisteína, permite la homogeneización de la muestra ya que algunas contienen moco que, si no es
licuado, proporciona a las bacterias contaminantes una barrera de protección frente a la acción del agente
descontaminante.

Las bacterias y las levaduras se recogen en tubo estéril y se centrifugan. Una vez obtenido el pellet, se descarta el
sobrenadante y las células se resuspenden en una solución isotónica (tampón GTE: Glucosa 50 mM, Tris-HCl 25
mM pH 8.0, EDTA 10 mM pH 8.0) donde la glucosa mantiene la presión osmótica, el Tris amortigua el pH, y el
EDTA actúa como quelantes de iones divalentes como el magnesio que son cofactores necesarios para la acción de
las nucleasas. Una vez resuspendidas en el tampón se procederá a su lisis.
Extracción de los ácidos nucleicos.
Implica eliminar los diferentes compartimentos de la célula y la consiguiente puesta en contacto de los ácidos
nucleicos con moléculas que podrían degradarlos (nucleasas). En el caso del ARN, esta molécula tiene una vida
media corta, y una vez ejercida su acción es rápidamente degradada por ARNasas para impedir la síntesis continuada de
la proteína correspondiente. En el caso del ADN, esta molécula se aloja en el núcleo de la célula y está aislada de
las ADNasas que se encuentran en el citoplasma. La lisis de la célula pone a todas estas moléculas en contacto.
Por ello, ligado a la lisis de la célula es necesario inactivar las nucleasas para evitar la degradación de los ácidos
nucleicos.
El procedimiento de lisis suele consistir en un equilibrio de técnicas y ha de ser suficientemente fuerte para romper
el material inicial complejo (un tejido, por ejemplo), pero suficientemente suave para preservar el ácido nucleico
diana. Entre los procedimientos usuales de lisis figuran los siguientes:
- Rotura mecánica (trituración, lisis hipotónica, etc.)
- Tratamiento químico (detergentes, agentes caotrópicos, reducción con tioles, etc.)
- Digestión enzimática (Proteinasa K, etc.)
Es posible romper la membrana celular e inactivar las nucleasas intracelulares al mismo tiempo. Por ejemplo, una
misma solución puede contener detergentes que solubilicen las membranas celulares y sales caotrópicas fuertes
que inactiven las enzimas intracelulares. Tras la lisis celular y la inactivación de las nucleasas, los restos de células
se eliminan fácilmente por filtración o centrifugación.
Componentes habituales de las soluciones de lisis:
 Tris: compuesto tris (hidroximetil) aminometano. Su función es mantener el pH de la solución constante (pH
7.0 a pH 8.0). Es uno de los más utilizados en las soluciones de lisis. Además, interactúa con los lipopolisacáridos
de la membrana celular y los hace permeables, lo que contribuye a la lisis de la membrana celular.
 Detergentes: todas las membranas biológicas están integradas por moléculas de lípidos ordenadas en una doble
capa continua y de proteínas, unidas por interacciones no covalentes. Los detergentes, desestructuran las
membranas celulares, desnaturalizando las proteínas y liberando los ácidos nucleicos. El dodecil sulfato sódico
(SDS), un tensoactivo aniónico, es el detergente más utilizado en los tampones de lisis. El SDS es un fuerte
inhibidor de la enzima Taq polimerasa que se utiliza durante la PCR, por lo que será necesario realizar un paso de
purificación para retirarlo.
 EDTA: es el ácido etilen-diamino-tetra-acético. Es un agente quelante de iones metálicos como Ca2+ y Mg2+.
Dado que el Mg2+ es un cofactor requerido por la mayoría de nucleasas, su secuestro por el EDTA evita la
degradación del ADN.
 Proteasas: son enzimas con capacidad proteolítica que utilizamos para degradar las proteínas de la mezcla
incluidas las enzimas capaces de degradar el ácido nucleico que queremos obtener. La enzima que habitualmente se
usa es la proteinasa K, pues se inactiva fácilmente por calor para evitar que interfiera en técnicas posteriores. Se
utiliza bastante con tejidos frescos o muestras FFPE.
 Agentes caotrópicos: desnaturalizan las macromoléculas impidiendo que ejerzan su acción. Uno de los más usados
es el isotiocianato de guanidinio que inactiva RNasas.
 Cloruro sódico (NaCl): el ion Na+ del NaCl crea un enlace iónico con la carga negativa de las moléculas de
ácidos nucleicos. Impedirá que estas se repelan, las mantendrá unidas y evitará su degradación.
 Cloruro de magnesio (MgCl2): bloquea la carga negativa de las lipoproteínas de la membrana celular.
Para aquellas células que posean pared celular, se deben incluir además tratamientos para eliminación por diversos
métodos:
- Mecánicos: Ebullición, ciclos de congelación-descongelación, sonicación.
- Enzimáticos: Liticasa o zimolasa y lisozima
- Químicos: Se puede sustituir el DSD por tampón CTAB detergente aniónico que elimina los polisacáridos
presentes en la pared celular.
Purificación de ácidos nucleicos.
Una vez lisada la célula, se tienen los ácidos nucleicos libres en solución. La purificación de los ácidos nucleicos
es requisito imprescindible para realizar las diversas técnicas de biología molecular. Mientras que el proceso de
extracción implica la lisis celular para liberar los ácidos nucleicos y la inactivación de nucleasas celulares
(ADNasas y ARNasas) para evitar la degradación de los ácidos nucleicos, el proceso de purificación consiste en
separar los ácidos nucleicos de los demás componentes.
Solventes orgánicos.
En este protocolo, el lisado celular se mezcla con fenol, cloroformo y alcohol
isoamílico para la separación de los ácidos nucleicos y las proteínas. Este método
permite obtener un alto rendimiento, pero es frecuente que restos de solventes
orgánicos contaminen la muestra. Además, el uso de estas sustancias tóxicas para la
salud hace necesario que todo el proceso se lleve a cabo en una campana de extracción
de productos químicos.
La purificación de los ácidos nucleicos mediante la adición de fenol, cloroformo y alcohol isoamílico (25: 24: 1), lo
que da lugar a la aparición de 2 fases: una fase acuosa superior que contiene los ácidos nucleicos y una fase
orgánica que contiene las proteínas disueltas en el fenol y los lípidos disueltos en el cloroformo. El propósito del
fenol es separar los ácidos nucleicos de las proteínas en combinación con soluciones salinas.
- Dado que los ácidos nucleicos son hidrófilos (por su esqueleto azúcar –fosfato), se acumula en la fase acuosa
que no es soluble en fenol.
- A la inversa, las proteínas contienen proporciones variadas de dominios cargados y no cargados, produciendo
regiones hidrofóbicas e hidrofílicas. En presencia de fenol, los núcleos hidrofóbicos interactúan con él, causando la
precipitación de las proteínas que son retenidas en la interfase (normalmente de color blanco).
Para la purificación del ADN el fenol debe tener un pH ligeramente alcalino, mientras que para el ARN se debe
usar un fenol con un pH menor. El fenol ácido específicamente deja al ARN en la fase acuosa. Conforme el pH
disminuye, la concentración de protones aumenta, y la carga negativa del ADN se neutraliza en solución ácida por
protonación. En este caso, el ADN se disuelve en la fase orgánica. El ARN, sin embargo, no se neutraliza, porque
aunque tiene carga negativa, al tener estructura de cadena sencilla, deja las bases nitrogenadas expuestas que
forman enlaces hidrógeno con el agua, quedando retenido en la fase acuosa.
Cromatografía de intercambio iónico.
Posteriormente se precipita el ácido nucleico de la fase acuosa con isopropanol o etanol absoluto y se lava con
etanol al 70% para eliminar sales y pequeñas moléculas orgánicas que podrían aún estar presentes en la muestra.
Por último, el ácido nucleico se resuspende bien en agua libre de nucleasas o en tampón TE (Tris HCl 10 mM, pH
8.0, EDTA 1 mM).
Es una cromatografía que utiliza grupos funcionales con carga, unidos de manera covalente a una fase estacionaria
insoluble llamada resina. El mecanismo básico es el intercambio reversible de los iones en solución con los
grupos funcionales unidos covalentemente a la fase estacionaria. Si se pretende retener un ácido nucleico, que tiene
carga negativa a pH 7,0, se utilizará un intercambiador iónico con grupos cargados positivamente, de manera que al
introducir toda la mezcla obtenida en la extracción, los ácidos nucleicos quedarán retenidos en la columna, pero
eluirán de la columna al cambiar el pH del tampón (conocido como tampón de elución) ya que los iones del tampón
de elución interaccionarán con los grupos cargados del ácido nucleico o del intercambiador iónico, respectivamente.
Se eluirán de la columna las moléculas cargadas positivamente que no se unen a la fase estacionaria y al añadir el
tampón de elución, eluirán las moléculas con poca carga negativa neta y luego las de mayor carga negativa neta.
Una modificación de este método es la extracción en fase sólida. En el caso concreto de la purificación de ácidos
nucleicos, se usan intercambiadores aniónicos que se basan en matrices de sílice o celulosa (como fase estacionaria)
empaquetadas en columnas de polipropileno. En un primer momento, la columna se carga con el lisado en un
tampón de baja salinidad y pH neutro. En estas condiciones, los ácidos nucleicos quedarán unidos a la matriz
mientras que las moléculas con carga positiva (proteínas, polisacáridos y otros contaminantes) eluirán de la
columna. Según se va incrementando la salinidad, se irán eliminando las moléculas con débil carga negativa.
Finalmente, eluirá el ácido nucleico con tampones de máxima salinidad y máximo pH. Las impurezas se eliminan
debido a su diferente capacidad de unión y se obtienen una rápida y eficiente purificación de los ácidos nucleicos
(ADN y/o ARN).
Cromatografía de adsorción.
Se basa en la capacidad de adsorción de los ácidos nucleicos a una membrana de sílice o vídrio en presencia de
sales caotrópicas. Bajo condiciones nativas, los ácidos nucleicos están recubiertos de una capa hidratante de
moléculas de agua que mantienen la solubilidad del ADN en soluciones acuosas. Con la adición de iones caotrópicos
a los ácidos nucleicos, se destruye esta estructura ordenada de moléculas de agua de la capa hidratante, por lo que
las sales caotrópicas crean un entorno hidrofóbico alrededor del ADN. Bajo estas condiciones hidrofóbicas, los
ácidos nucleicos se unen perfectamente a la membrana, mientras que las proteínas, los metabolitos y otros
contaminantes no se unen y, por lo tanto, son eliminados de la muestra durante los pasos de lavado. Posteriormente,
los ácidos nucleicos se eluyen de la membrana mediante tampones de elución con baja concentración de sales,
ligeramente alcalinos, o simplemente agua, ya que permiten recuperar la capa hidratante de los ácidos nucleicos,
liberándolos así de la membrana. Con este rápido proceso de purificación mediante la tecnología de la adsorción-
desorción sobre membranas de sílice, se obtiene ácidos nucleicos altamente purificados y listos para usar en
procesos posteriores como PCR, RT-PCR, qPCR, secuenciación, blotting, clonaje, etc.
Precipitación por sales (salting out)
Se basa en la precipitación de las proteínas en presencia de altas concentraciones de sales. Las altas
concentraciones de sales eliminan la capa de agua que recubre las proteínas, provocando un aumento de las
interacciones hidrofóbicas entre proteínas, lo que disminuye su solubilidad.
- En primer lugar, se procede a una lisis celular con un detergente aniónico que solubiliza los componentes celulares
e inhibe la acción de las nucleasas intracelulares.
- Se desnaturalizan y se eliminan las proteínas por precipitación salina. Se añade la solución salina concentrada al
lisado celular, se agita con vórtex unos segundos y se centrifuga. Recogeremos el sobrenadante (que contendrá los
ácidos nucleicos y sales) y desecharemos el pellet (que contendrá las proteínas precipitadas).
- El ácido nucleico en solución se precipita con isopropanol y se lava con etanol al 70% para finalmente ser
resuspendido en un tampón TE o agua destilada libre de nucleasas.
Partículas magnéticas.
Unión de los ácidos nucleicos a partículas magnéticas, encapsuladas en una matriz inerte, que serán separadas del
resto de componentes mediante un imán. La unión ácido nucleico-partícula magnética, puede realizarse mediante
adsorción o por afinidad.
Mediante adsorción, los ácidos nucleicos se unen selectivamente a partículas magnéticas en presencia de sales
caotrópicas, mientras que el resto de los contaminantes serán eliminados de la muestra. Al colocar el imán, los
ácidos nucleicos unidos a las partículas magnéticas quedarán retenidos en la pared del tubo en contacto con el imán.
Tras realizar un lavado, los ácidos nucleicos purificados se separan de las partículas magnéticas por desorción, al
añadir la cantidad adecuada de agua destilada o tampón TE. Una vez separadas se colocará de nuevo el imán en un
lateral del tubo para agrupar las partículas magnéticas y poder recoger la solución que contendrá los ácidos
nucleicos.
Por afinidad, las partículas magnéticas se recubren de polímeros con alta afinidad por un tipo concreto de ácido
nucleico. Este procedimiento se usa a menudo para la purificación de ARNm. En este caso, se recubren las
partículas magnéticas con oligonucleótidos poli-T que se unen específicamente a la cola de poli-A de los ARNm.
Ultrafiltración.
La muestra se carga directamente sobre la membrana de ultrafiltración y mediante vacío o centrifugación, se eliminan
todos los contaminantes, mientras que las muestras con los ácidos nucleicos permanecen retenidos en la superficie de la
membrana. Después del lavado, se recuperan los ácidos nucleicos añadiendo agua o un tampón adecuado.
Extracción de ADN.
Protocolos para extraer ADN:
- Evitar introducir nucleasas en las soluciones de trabajo ya que degradarán el ADN. Utilizar siempre para la
extracción material estéril.
- Evitar someter al ADN a fuerzas mecánicas que lo fragmentarán. Evitar pipetear con frecuencia o agitarlo
en un agitador tipo vórtex.
Reactivos necesarios:
- Un tampón, generalmente Tris HCl pH 7,5.
- EDTA: la función del este reactivo es quelar los iones magnesio que actúan como cofactores de las DNasas,
inhibiendo así su funcionamiento. Si te fijas está incluido en todos los reactivos que se utilizan en la extracción.
- SDS: Detergente aniónico que solubiliza e inestabiliza las membranas plasmáticas de las células

Protocolo de extracción y purificación de 5 pasos básicos:

Quelante: Compuesto químico
- Lisis celular. Ruptura de las membranas celulares y digestión de proteínas llevada a cabo que se une con firmeza a los
por el SDS y la proteinasa K. iones metálicos. En el campo
- Solubilización del ADN: Mezclando por ejemplo la muestra después de la lisis con de la medicina, los quelantes
compuestos orgánicos como el fenol y el cloroformo, que desnaturalizan las proteínas, y el se usan para extraer metales
tóxicos del cuerpo. También
alcohol isoamílico, que facilita la separación de las fases acuosa y orgánica. Después de la están en estudio para el
centrifugación el ADN se localiza en la fase superior, acuosa. tratamiento de cáncer.
- Precipitación del ADN: se utiliza etanol frío que, en presencia de sales como cloruro
de sodio o acetato de sodio, induce un cambio estructural en el ADN que favorece su precipitación.
- Disolución del ADN en el tampón TE: Se obtiene ADN de buena calidad, pero tiene los inconvenientes de que
es largo y que se usan reactivos tóxicos. Existe otro método que no utiliza estos reactivos.

Protocolo de extracción de ADN a partir de leucocitos de sangre periférica. Método manual

 Extracción de ARN.
Es más complicada que la del ADN ya que el ARN es más reactivo y por lo tanto menos estable que el ADN:
 La inestabilidad es por la pentosa que contiene dos grupos hidroxilo unidos al anillo, mientras que el ADN sólo
tiene uno. Este grupo adicional lo hace más propenso al hidrólisis por nucleasas (ribonucleasas), las cuales son
capaces de romper los enlaces fosfodiéster, que vinculan covalentemente las subunidades de nucleótidos del ARN.
Las ribonucleasas no hidrolizan el ADN porque este carece del segundo grupo hidroxilo que es esencial para la
formación de los intermediarios cíclicos requeridos para el proceso de escisión.
 Las ARNasas, son enzimas muy estables que por lo general no requieren de cofactores para funcionar. Por ello,
una pequeña cantidad de ARNasa degradará cualquier muestra. Para evitarlo, cualquier material o solución empleados
en la extracción de ARN deberán ser tratados con DEPC, producto que inhibe la acción de estas enzimas por
modificación covalente. En la actualidad existen materiales comerciales tratados con este producto especial para
trabajar con ARN. Las soluciones que contienen Tris no pueden ser tratadas eficazmente con DEPC porque el Tris
reacciona con el DEPC interfiriendo en la inactivación de las enzimas.
 El isotiocianato de guanidinio es uno de los desnaturalizantes de proteínas más eficaces usado en la extracción de
ARN. Actúa como agente caotrópico alterando directamente las estructuras secundarias de las proteínas.
 Los métodos de extracción de ARN se basan en la capacidad de la molécula de permanecer soluble en agua en
una solución que contiene isotiocianato de guanidinio, en presencia de solventes orgánicos (fenol/cloroformo). El
procedimiento permite la recuperación de ARN total de pequeñas cantidades de tejido o células, por lo que es
adecuado para estudios de expresión génica cada vez que la cantidad de tejido o células disponibles es limitada.
Existen diversos kits comerciales para el aislamiento de ARN total que emplean la guanidina, la mayoría basados
en el método de un paso, entre los cuales hay un grupo que se basa en la combinación de la solución desnaturalizante,
fenol, y el tampón en una única solución monofásica.
Procedimiento de extracción y purificación:
La extracción de ARN sigue pasos similares a los de la extracción del ADN
 Lisis celular: la solución utilizada para lisar las células y liberar el ARN tiene la siguiente composición:
- Un tampón: citrato de sodio a pH 7.
- Isotiocianato de guanidina concentrado (4 M): desnaturaliza y remueve las proteínas de la célula incluidas
las ribonucleasas.
- N-lauril-sarcosil: un detergente que lisa membrana plasmática.
- 2-β-mercaptoetanol: un agente reductor.
 Purificación del ARN: la adición de fenol/cloroformo seguida por centrifugación da lugar a la formación de dos
fases en la solución: Una fase orgánica se quedará abajo y una fase acuosa arriba, el ARN estará en la fase acuosa.
 Precipitación: el ARN se recupera por precipitación con isopropanol.

Métodos automatizados.
Si el volumen de muestras que llegan al laboratorio es muy alto utilizar métodos automatizados. Se pueden extraer
con él ADN y ARN de todo tipo de muestras, tejidos, cultivos celulares, etc, en pocos minutos.
Se emplean aparatos que contiene en su interior unos cartuchos donde se coloca la muestra previamente tratada con
una proteasa.
En la base de los cartuchos hay una membrana porosa ultrafina que es capaz de unir el ADN o ARN de la muestra,
dejando pasar a través de ella a los lípidos, proteínas y restos de componentes celulares, que son comparativamente
más hidrofóbicos que los ácidos nucléicos y continúan su curso a través de la misma. Otros métodos de extracción
utilizan membranas de fibra de vidrio.
Este sistema de extracción utiliza cantidades muy pequeñas de muestra (200 µl) y no realiza ninguna
centrifugación. La muestra se introduce en una cámara presurizada y es empujada a pasar por la membrana. El
siguiente paso que se realiza es un lavado de la membrana y finalmente se añade una solución para eluir (separar)
el ADN de la membrana y recogerlo en un tubo.
Utilizando métodos automáticos de extracción se obtiene aproximadamente 5 µg de ADN de alta pureza por cada
200 µl de sangre.

RESUELTO

Calidad de los ácidos nucleicos.

En las técnicas de biología molecular se debe evaluar:
- Su integridad (tamaño de las moléculas obtenidas)
- Su concentración (de qué cantidad disponemos)
- El grado de pureza obtenido
Hay que tener en cuenta su funcionalidad en las diferentes técnicas de biología molecular. Una de las formas es PCR o
una RT-PCR de control, así como cortarlo con enzimas de restricción, de manera que tanto estas últimas como la
polimerasa de la PCR sean capaces de utilizar el ácido nucleico, lo que es indicativo de una buena funcionalidad del
mismo.
La integridad de los ácidos nucleicos extraídos se valorará realizando una electroforesis en gel de agarosa. Mediante
esta técnica se observa si se ha obtenido un ácido nucleico de buena calidad o por el contrario está parcialmente
fragmentado o degradado. Según el tipo de ácido nucleico extraído, se obtienen distintos resultados:
 ADN genómico: Presenta un elevado peso molecular, se observará como una única banda en la parte superior
del gel. Si el ADN genómico está fragmentado o degradado, se observará un rastro fluorescente de fragmentos de
un rango amplio de tamaños conocido como “smear”.
Este estudio no se realizará con muestras FFPE procedentes de tejidos fijados en formol y embebidos en parafina,
puesto que la parafina provoca la fragmentación de la muestra.
 ARN: Mediante la electroforesis en gel de agarosa se evalúa la integridad del ARN
observando la proporción de las bandas ribosomales 28S y 18S, que son los ARNs más abundantes. El ARN se
puede considerar íntegro si se observan las dos bandas correspondientes a los ARN ribosomales en el gel, y si la
proporción 28:18S es de 2. También se puede observar el ARNr 5S en la parte inferior del gel. La degradación del
ARN se puede observar como un incremento de fragmentos pequeños, así como en una disminución de la
intensidad de señal de los RNA ribosomales. Cuando se analiza el ARN en un gel de agarosa, es habitual la
aparición de una mancha continua o smear. En este caso no se habla de degradación, sino a la presencia de
ARN de diferentes tamaños.
 ADN plasmídico: Es un ADN circular de doble cadena, puede aparecer con diferentes conformaciones
(superenrollada, relajada y lineal). Aunque las tres conformaciones presentan el mismo tamaño, su diferente forma
va a condicionar su avance a través del gel. Las molecular superenrolladas, más compactas, que presentan un
volumen menor, avanzarán con más facilidad a través del gel de manera que se encontrará más alejada del punto de
origen en comparación con las moléculas relajadas circulares y las lineales. El tamaño correcto del plásmido será el
observado en su forma lineal. De esta manera se pueden comparar unos ADN con otros porque en su forma lineal
todos avanzarán en función de su tamaño.
El ADN mitocondrial, tendrá un patrón similar al ADN plasmídico, ya que también es un ADN bicatenario de
doble cadena.

La pureza de un ácido nucleico es el parámetro que valora la ausencia de contaminantes. Se emplea la espectrometría.
 Cociente 260/A280: La relación A260/A280 es muy estable y se considera que un ADN de pureza óptima
tiene un valor entre 1,7 y 2,0.
- Un ADN de pureza aceptable debe tener al menos una relación A260/A280 > 1,7.
- Un valor de A260/A280 < 1,6 indica una posible contaminación por compuestos aromáticos como fenoles o
proteínas.
- Un cociente A260/A280 > 2.0 podría deberse a la presencia de ARN en la muestra.
Si se sospecha de una posible contaminación con fenoles es posible solucionarlo realizando una nueva purificación .
La contaminación por proteínas se puede solucionar tratando la muestra con proteinasa K. Si el cociente no mejora
tras la realización de estos pasos, podría tratarse de una muestra parcialmente degradada. En caso de que se
sospeche de una contaminación con ARN, se realizará un tratamiento con ARNasas para eliminarlo.
Para muestras de ARN, los cocientes son diferentes y se considera que un ARN de pureza adecuada debe tener un
cociente comprendido entre 1.8 - 2,1.
 Cociente 260/A230: A una longitud de onda de 230nm absorben contaminantes como sales caotrópicas o
carbohidratos. En general, se considera que un ácido nucleico es puro cuando el cociente A260/230 se sitúa en
torno a 1,5-2,2. Un cociente menor de 1,5 indicaría la presencia de contaminantes en la muestra. No obstante, esta
relación resulta mucho más variable que la relación A260/280 y puede verse afectada por factores como la
concentración del ácido nucleico o de la composición del tampón de resuspensión de la muestra.
 Absorbancia a 320nm: Da una idea de turbidez de la muestra y otros factores de interferencia. Una muestra
pura tendrá un valor de A320 cercano a 0. Cuando se calcule este dato, deberá restarse de cada una de las
absorbancias anteriores para realizar los cálculos.

Se realiza mediante un espectrofotómetro: La luz pasa por un prisma (monocromador) donde se selecciona una
longitud de onda (en nuestro caso 260 nm) e incide sobre la cubeta, en la que se encuentra la solución que queremos
medir. Al otro lado de la cubeta se sitúa un detector de luz transmitida. A este punto llegará toda la luz que no haya
sido absorbida por la muestra. A la cantidad de luz absorbida por la
muestra se le denomina Absorbancia (A).
 Ley de Lambert-Beer
Permite relacionar la cantidad de luz absorbida por la muestra con su concentración, de tal forma que cuanta mayor
sea la concentración de la muestra, mayor cantidad de luz se absorberá y menor cantidad de luz llegará al detector.
Conocida la absorbancia de la solución de ADN extraído, es posible determinar su concentración utilizando:

𝐂(𝛍𝐠⁄𝐦𝐋) = 𝐀 · 𝟓𝟎 · 𝐅𝐝
A: absorbancia de la muestra. Valor determinado por el aparato.
- El valor 50: corresponde a la cantidad de ADN de doble cadena (ADNds) que
da lugar a una medición de absorbancia de 1,0. Se sabe que una solución de ADN de
doble cadena con una concentración de 50 μg/ml (o 50 ng/ μl) tiene a 260 nm una
absorbancia de 1,0.
- Fd: Factor de dilución de la muestra. La inversa de la dilución realizada.
Cuando lo que se analiza no es ADN de doble cadena sino ARN o ADN de cadena
sencilla (ADNss):
- Una unidad de absorbancia equivale a 40 μg/ml (o 40 ng/ μl) de ARN.
- Una unidad de absorbancia equivale a 33 μg/ml (o 33 ng/ μl) de ADNs.
Para eliminar la absorbancia debida a la turbidez de la muestra, hay que restar al
valor de absorbancia obtenido a 260nm el valor de la absorbancia a 320n.

RESUELTO

Una vez extraídos y purificados, los ácidos nucleicos deben ser almacenados correctamente para evitar su
degradación.
- Deberán emplearse tubos estériles tipo Eppendorf o criotubos con cierre hermético.
- El ADN se almacenar en nevera a 4ºC si van a ser usadas en un periodo corto de tiempo (3-4 días). Para más
prolongados es conveniente la congelación a -20ºC o a -80ºC.
- Debido a su inestabilidad, las muestras de ARN deberían ser almacenadas a -80ºC para intentar mantener un
ARN intacto en la medida de lo posible.
- Los congeladores tienen un sistema de monitorización de la Tª, un sistema de alarma que avise en caso de mal
funcionamiento, así como de un sistema de seguridad de CO 2 que permita conservar la Tª en caso de avería por
un margen de tiempo.
- Asegurar la trazabilidad de las muestras. Se debe rotular los tubos con tintas indelebles que resistan las bajas
temperaturas o usar etiquetas de codificación que resistan igualmente las bajas temperaturas de almacenamiento.