TEMA 4: MEDIOS DE CULTIVO DE BACTERIAS Y HONGOS: TÉCNICAS DE

PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN

1. INTRODUCCIÓN: DEFINICIONES PREVIAS

Para poder estudiar los mo en laboratorio, es necesario poder cultivarlos y aislarlos en un

medio. Algunas definiciones de interés son:

o Crecimiento bacteriano: aumento del nº de individuos (y no del tamaño de cada

individuo).

o Medio de cultivo: mezcla de sustancias que proporcionan las condiciones de

humedad, pH, presión osmótica, y nutrientes -> todos ellos los más adecuados para
el crecimiento de los mo. Pueden ser sólidos o líquidos. Se definen también como los
preparados articiales usados en los laboratorios de mb para hacer crecer mo en ellos.

o Aislamiento: separación de un conjunto de individuos de la misma especie

microbiana. Se realiza en medios de cultivo siguiendo una serie de procedimientos.

o Cultivo mixto: aquel en el que hay varias especies distintas de mo.

o Cultivo puro: aquel en el que hay una sola especie de mo.

Necesidad de aislamiento de las bacterias: Para identificar una bacteria, debemos

realizarles pruebas bioquímicas, de forma que para la correcta interpretación del cultivo,
éste debe ser puro.

Necesidad de medios de cultivo de bacterias:

a) Para aislar bacterias y poder identificarlas –> Análisis cualitativo.

b) Para obtener la cantidad de células bacterianas suficiente para realizar pruebas de

identificación.

c) Para el recuento del nº de células bacterianas en una muestra –> Análisis

cuantitativo.

Necesidad de medios de cultivo de hongos: se hace por motivos similares, pero hay que
matizar:

a) Las pruebas bioquímicas se emplean de modo limitado (normalmente sólo para

identificar ciertas levaduras).

b) La identificación de mohos se realiza mediante cultivo, de modo que se desarrollen

las estructuras reproductoras que caracterizan a cada género o especie.

c) Los cultivos cuantitativos permiten contar el nº total de esporas o de células de

levaduras.
 2. ASPECTOS GENERALES DEL CRECIMIENTO BACTERIANO

Condiciones generales para el crecimiento de las bacterias -> para que éstas se
multipliquen, el medio de cultivo debe contener:

 Los nutrientes que necesitan.

 Suficiente humedad en el medio y en la atmósfera.

 Una adecuada composición de la atmósfera.

 Una tº que permita el crecimiento.

 Un pH adecuado.

 Una concentración salina adecuada.

 No debe haber factores inhibidores: otras bacterias y hongos o sustancias que

impidan el crecimiento (antibióticos, desinfectantes, metales pesados, etc.).

Necesidades nutricionales de las bacterias: Nutrición: proceso por el cual las bacterias
toman del medio ambiente todos los nutrientes que requieren para la síntesis de sus
materiales celulares y para la generación de energía. Los nutrientes pueden dividirse:

Según - Indispensables: sin ellos, la célula no puede vivir.

necesidad
de la célula: - No indispensables: son usados si están presentes, pero no son esenciales.

- Macronutrientes: se requieren en gran cantidad.

Según
cantidad en - Micronutrientes: se requieren en pequeñas cantidades. A menudo, son
que son requeridos a tan baja concentración que es difícil determinar la cantidad exacta
requeridos: requerida, y otras veces su requerimiento pasa desapercibido por no ser
detectable.

Según uso - Nutrientes con fines energéticos.

de los - Nutrientes con fines estructurales, con los que la célula sintetiza
nutrientes: macromoléculas y otras estructuras.

A veces, un determinado nutriente puede realizar ambas funciones, y además,

bajo ciertas condiciones, pueden servir para sinterizar material celular de
reserva para poder usarlo posteriormente con fines energéticos.

Las necesidades nutricionales de los mo son variables de unos a otros. De cualquier forma,
todos los mo necesitan estos elementos: C (para crecer, ya que es la base estructural de los
compuestos bq), O (constituyente de todas las células, y usado por muchas bacterias como
oxidante de sustancias orgánicas), N (para formar aa, purinas, pirimidinas…), P, S (usado para
sintetizar aa azufrados como Cis o Met), y elementos traza.
Atmósfera necesaria para el crecimiento bacteriano (crecimiento en medios líquidos):

a) Aerobias estrictas: crecen exclusivamente en atmósferas ricas en O2. Obtienen

energía de la respiración aerobia, la cual requiere O2. Son incapaces de llevar a cabo la
fermentación (r. anaerobia), por lo que no crecen en atmósferas con poco o nada de
O2.

b) Anaerobis estrictas: crecen exclusivamente en atmósferas con ausencia de O2, ya que

obtienen energía mediante la respiración anaerobia (fermentación: sin O2), y porque
para ellas el O2 es una sustancia tóxica que las mata o que detiene su crecimiento.

c) Anaerobias facultativas (o aerobias facultativas):

crecen tanto en presencia como en ausencia de O2, pero
si éste está en el medio, lo usan para la respiración
aerobia (si hay O2, lo usan, pero si no hay o escasea,
recurren a la respiración anaerobia).

d) Microaerófila: crecen sólo en atmósferas con O2, pero a

concentraciones menores que las que hay en la
atmósfera libre. Se debe a que llevan a cabo la
respiración aerobia, pero a diferencia de las aerobias
estrictas, concentraciones muy elevadas de O2 las
perjudican.

e) Anaerobias aerotolerantes: llevan a cabo respiración anaerobia pero toleran que

haya O2 (no les perjudica).

Efecto de la tº sobre el crecimiento bacterias:

 Tº mínima: hay una para cada especie,

por debajo de la cual el crecimiento se
detiene (en la mayoría de casos, es muy
superior a los 0ºC).

 Tº óptima: por encima de la mímina,

aquella que permite la máxima
velocidad de crecimiento de una
determinada bacteria; a esta tº, las
reacciones químicas (las catalizadas por
enzimas principalmente) se dan más
rápidamente.

 Tº máxima (la tº más alta): superior a la óptima, aquella hasta la que una
determinada especie puede crecer y que suele ser unos pocos grados ºC mayor que
la óptima. El crecimiento disminuye porque algunos componentes, como las enzimas,
se inactivan.
Los valores de estas tº varían entre bacterias. Según el margen de tº, las bacterias se
clasifican:

o Termófilas: crecen a tº superiores a 50 ºC.

o Mesófilas: crecen a tº intermedias (margen de 20 a 45 ºC). Crecen mejor sobre los 37

ºC.

o Psicrófilas: crecen a bajas tº (5 ºC o debajo). Éstas se subdividen en estrictas y

facultativas para indicar que toleran temperaturas mayores de 20 ºC.

Efecto del pH sobre el crecimiento bacterias:

 pH óptimo (en la mayoría de bacterias): entre 6.5 y 7.5.

 pH mínimo y máximo está entre 4 y 9 (algunas se desarrollan a valores extremos).
 Bacterias crecen mejor en un pH ligeramente básico, hongos a un pH ligeramente
ácido, y algas y protozoos a un pH neutro. Excepciones (sobre todo en bacterias):
- Acidófilos: viven en ambientes con un pH extremadamente bajo.
- Alcalófilos: viven en ambientes con pH extremadamnte alto (de hasta 12).
- Neutrófilos: los que viven en ambientes con pH neutro.

Efecto del pH sobre el crecimiento bacterias:

Tolerancia osmótica: capacidad de un organismo de crecer en medios con osmolaridades

diferentes. Varía entre unas especies bacterianas y otras.

Cuando la presión osmótica del medio es superior o inferior a la tolerancia osmótica de una
bacteria, ésta deja de crecer.

Los medios de cultivo deben tener una osmolaridad que permita el crecimiento de las
bacterias para las que se ha diseñado.

Bacterias osmófilas: pueden crecer en ambientes de osmolaridad elevada. Cuando la

osmolaridad elevada se debe a una elevada concentración de NaCl, se denomina bacteria
halófila.

Curva de crecimiento bacteriano:

1) Fase de latencia: los mo se adaptan al medio. Se da al transferir células microbianas a

un cultivo fresco, y en ella, las bacterias se preparan metabólicamente (sintetizan
enzimas y moléculas importantes para reanimar el crecimiento). No hay crecimiento.
2) Fase exponencial: los mo aumentan su nº exponencialmente  es la más adecuada
para tomar una muestra de bacterias y estudiarlas, pues son células jóvenes en
plena actividad (es la fase de mayor crecimiento celular y de mayor actividad
metabólica).
 Las células se pueden mantener en esta fase transfiriéndolas repetidamente a un
medio fresco de composición idéntica. Este mantenimiento depende,
fundamentalmente, de que se suministren todos los requerimientos nutricionales.
3) Fase estacionaria: el nº de mo se mantiene, pues unos mueren y otros nacen  tomar
muestras sería aceptable.
4) Muerte  muchas células están alteradas y no muestran sus características típicas.
Se da la muerte de la población, sobre todo por un descenso de reservas de energía.
3. MEDIOS DE CULTIVO: ASPECTOS GENERALES

Características generales: son preparados artificiales usados en los laboratorios de mb

para hacer crecer los mo sembrados en ellos. Están formados por un conjunto de
nutrientes generalmente complejos que hacen posible el crecimiento bacteriano. Estas
bacterias obtienen del medio las fuentes de C, N, P, K, Na, Mg, y otros elementos o
sustancias necesarias para nutrirse.

Condiciones que debe de cumplir un medio de cultivo:

 Debe tener la composición de nutrientes adecuada a las necesidades del mo.

 Debe tener unas condiciones fisicoquímicas apropiadas de tº (debe ser la óptima),
grado de humedad, pH, presión osmótica, y presencia o ausencia de oxígeno.

Componentes usuales en los medios de cultivo:

 Extractos: se preparan a partir de ciertos órganos o tejidos animales o vegetales

(carne, hígado, cerebro, semillas). Ejemplos: extracto de carne, de levadura… Son
fuente de C, N, sales inorgánicas, y otros nutrientes muy variados.
 Peptonas: mezclas complejas de compuestos orgánicos nitrogenados y sales
minerales que se obtienen por digestión enzimática o química de proteínas
animales o vegetales (soja, carne, gelatina, etc.). Son muy ricas en péptidos y
aminoácidos. 
 Cloruro sódico: proporciona un adecuado equilibrio osmótico.
 Tampones estabilizadores del pH: necesarios para contrarrestar las variaciones de
pH por la acumulación de los productos resultantes del metabolismo bacteriano.
 Agentes solidificantes: para medios sólidos y semisólidos. El más común es el agar,
usado como agente gelificante para dar solidez a los medios de cultivo (la gelatina y
la albúmina se usan poco).
 Agentes reductores: promueven la
anaerobiosis. Entre los más usados están
cisteina, y ácido ascórbico.
 Agentes selectivos: La adición de
determinadas sustancias al medio de
cultivo puede convertirlo en selectivo:
  Colorantes: cristal violeta, azul de metileno, verde brillante… se usan por su
efecto tóxico sobre G+.
 NaCl a altas concentraciones, como p. ej., Agar Manitol-sal para el S. Aureus.
 Bilis o sales biliares.
 Antibióticos: los más usados son cloranfenicol, vancomicina, cefalosporinas de
3ª generación (entre otros); también se usan algunos antifúngicos como
nistatina y anfotericina B.
 Cicloheximida o actidiona: se añade a los medios micológicos para impedir el
crecimiento de hongos ambientales.

 Azúcares: pueden añadirse con fines nutritivos o para investigar la actividad

metabólica.
 Indicadores de pH: su presencia es esencial para detectar variaciones en la acidez o
alcalinidad del medio causadas por el metabolismo bacteriano. Estas variaciones se
aprecian por el cambio de color del indicador.

Tipos de medios de cultivo (los más frecuentes):

- Definidos: aquellos en los que conocemos la identidad de las sustancias que lo

Según forman. Ej.: medio Koser.
composición: - Indefinidos: aquellos que contienen sustancias complejas cuya composición es
difícil de determinar con precisión. Se usan más que los anteriores. Ej.: AN.

- Líquidos (caldos): sin agar en su composición, sino que contienen agua + 1 o más
fuentes de C, sales minerales, y a veces, factores de crecimiento, vitaminas…
Usos: para pruebas bioquímicas, identificación de bacterias, hacer recuentos
bacteriológicos por turbidimetría (muy útil en levaduras), hacer inóculos,
obtener metabolitos 1ºs o 2ºs creados por lo mo (como antibióticos)…
Favorecen mucho el desarrollo y multiplicación de bacterias porque éstas
difunden por todo el medio, por lo que encuentran fácil las sustancias para
nutrirse. Generalmente se usan para enriquecimiento o identificación. Ej.: caldo
nutritivo.
Según - Sólidos: aquellos con la proporción de agar igual o mayor de 15 g/L.
estado
físico: Usos: aislamiento, purificación, visualización del crecimiento de colonias, posible
identificación a través de medios específicos y diferenciales, elaboración de
antibiogramas…
Han supuesto un gran avance en técnicas de bacteriología.
- Semisólidos: intermedios entre los líquidos y los sólidos, cuya proporción de
agar suele ser menor de 5 g/L, pero siempre una cantidad que le confiera
consistencia semisólida.
 Usos: para ciertas pruebas bioquímicas, como p.ej. la prueba de oxidación-
fermentación, que permite conocer el tipo de metabolismo (oxidativo o
fermentativo) de la bacteria problema y para determinar la movilidad
bacteriana.

- Generales o comunes: adecuados para el cultivo de la mayoría de mo (no

exigentes), por la facilidad con la que se desarrollan en ellos. Ej.: AN.
- Enriquecidos: medios generales que llevan añadidos nutrientes que permiten el
crecimiento de bacterias difíciles de cultivar (mo exigentes). Ej.: agar chocolate.
- Enriquecimiento: medios líquidos generales con sustancias que favorecen el
crecimiento de un mo determinado e inhiben el de otros. Ej.: caldo selenito en
un cultivo de Salmonella (inhibe el crecimiento de otras Enterobacterias).

Según - Específicos: para cultivar determinadas especies bacterianas o usados con fines
utilidad/ determinados. Ej.: agar Mueller-Hinton para realizar un antibiograma.
aplicación - Selectivos: con componentes que permiten el desarrollo de ciertos mo e inhiben
el de otros. Ej.: agar McConkey es selectivo para enterobacterias e inhibe crecer
G+.
- Diferenciales: con similares propiedades a los selectivos, pero con la
característica de que presentan sustancias que al ser o no usadas por las
bacterias del medio, darán información suplementaria y específica. Ej.: medio
Levine.
- Medios de mantenimiento de cepas: suelen contener los nutrientes necesarios
para mantener vivas las cepas periodos de tiempo + o - largos, manteniéndose a
tº bajas (según el medio) como para impedir el crecimiento de las bacterias.

- Medios deshidratados o liofilizados: se preparan añadiendo la cantidad de agua

correspondiente, en condiciones asépticas o, una vez preparados, se esterilizan
en el autoclave. Son de composición variable y pueden ser básicos o más
complejos.
- Medios ya preparados: elaborados por casas comerciales, presentan un control
de calidad y características específicas adecuadas a cada tipo de cultivo.
- Medios sólidos en placas de Petri: proporcionan una superficie grande como
para visualizar bien las colonias microbianas (mejor que en un tubo). Se usan
mucho para obtener cultivos puros partiendo de una colonia previamente
aislada.
 - Medios sólidos en tubo: tubos con agar solidificado inclinado para aumentar la
superficie donde se produce el crecimiento microbiano tras la siembra. Las
siembras se harán por estría y, en muchos casos, por picadura. Estos medios son
Según su
útiles para observar crecimiento microbiano aerobio si se siembra por estría o
presentación
anaerobio si es por picadura, y para conservar de cepas.
- Medios líquidos en tubo: no permiten visualizar colonias, sino que se usan para
pruebas bioquímicas que permiten determinar la reducción de nitratos a
nitritos, la fermentación de glucosa… No contienen agar.
- Medios semisólidos en tubo: se siembran por picadura y son un térmido medio
entre líquidos y sólidos. Se usan en pruebas bioquímicas la de movilidad, la de
oxidación-fermentación…
- Medios de doble fase en frasco: son frascos formados por una fase sólida y otra
líquida, y los mo crecen en el mismo medio y pueden ser aerobios o anaerobios.
Suelen tener obturadores de caucho para aislar al medio, y se usan para
determinar rapidamente mo en sangre.
4. PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO: ASPECTOS GENERALES

Reconstrucción del medio deshidratado: para ello, seguimos las indicaciones de la

etiqueta. Suele hacerse con agua destilada en recipientes de vidrio bien limpios, y el calor
favorece y a veces imprescindible para la disolución de algunos componentes.

Para ajuste del pH: con NaOH y HCl, y se controlará con un pHmetro.

Reparto en recipientes de los medios de cultivo:

A) En tubos: se usan pipetas cuando se requiere un volumen determinado en cada

tubo, o se hace “a ojo” cuando no se requiere un volumen concreto. En este caso,
para que todos los tubos tengan un volumen similar de medio, marcamos con un
rotulador una señal para saber hasta dónde llenar. Este fraccionamiento se hace
antes de esterilizar, por lo que lo que se esteriliza es el tubo con el medio de cultivo.

Esterilización de los medios preparados: algunos medios no pueden esterilizarse en

autoclave por sus componentes termolábiles, por lo que los hervimos o
esterilizamos por filtración. Si no, será a 110-121 ºC 15-20 min. Finalizada la
esterilización, los medios líquidos se dejan enfriar a tº ambiente, y los sólidos en
tubo se inclinan si es necesario.

B) En placas: la mayoría de medios se usan repartidos en placas de Petri. El reparto no

debe hacerse con el medio recién salido del autoclave pues formaría agua de
condensación en la placa, sino que esperamos a que el medio no queme al tacto (a
45-50 ºC), y lo realizaremos en la zona aséptica creada por el mechero para así evitar
contaminaciones.

La altura del medio debe ser aprox. 4 mm y debemos asegurarnos que todo el
fondo de la placa esté cubierto. Tras ello, dejamos enfriar las placas a tº ambiente
colocadas en torres (permite su lento enfriamiento lento, lo que disminuye la
 condensación de vapor de agua en la tapa). Una vez frías (con el agar solidificado),
se invierten (para evitar que si hay condensación de agua, ésta caiga sobre el medio) y
se forman torres con ellas, las cuales se meten en bolsas de plástico que se cierran
lo mejor posible.

Conservación de los medios una vez preparados:

Para impedir la desecación de los medios sólidos y la evaporación de los medios líquidos:

o Tubos y frascos de cierre hermético: se conservan varios meses a tº ambiente.

o Los de tapón metálico o algodón graso (cubierto con papel parafinado): no resisten
más de un mes, pues se deshidratan.

o Placas de Petri: aguantan una semana refrigeradas a 4ºC y bastantes semanas si se

colocan dentro de una bolsa de plástico cerrada herméticamente.

Todos los medios se conservan mejor en oscuridad, refrigerados, y en atmósfera de

humedad relativa mínima. Se deben rotular correctamente.

5. CONTROL DE CALIDAD

Control de calidad de los medios de cultivo generales: Los diferentes caracteres

organolépticos (color, textura, precipitación, hidratación, pH) deben controlarse antes del
uso de cualquier medio. Este control es visual y detecta fallos en la preparación o
conservación del medio.

o pH del medio: tras prepararlo:

- si es caldo, se mide su pH con un pHmetro,

- si es un agar, se mide su pH antes de autoclavarlo y, tras autoclavarlo, antes de

que solidifique, se diluye 1/10 en una vaso con agua purificada y se mide su pH
con un pHmetro. La lectura debe mantenerse dentro del margen indiciado en el
frasco.

o Eficacia del medio: se comprueba el crecimiento de mo según las indicaciones de

uso del medio. En caso de que éste sea selectivo, debe inocularse también con un
mo que no deba crecer.

Control de calidad de los medios de cultivo para pruebas biquímicas:

El control de los medios de cultivo usados para pruebas bioquímicas (descarboxilasas,

ureasa, oxidación-fermentación de azucares, etc.) se realiza ensayando mo cuya actuación
bioquímica sobre el medio sea conocida (control).

Siempre se debe realizar en paralelo un control de positividad y otro de negatividad.

 TEMA 5: TÉCNICAS DE SIEMBRA. ESTUDIO DE COLONIAS BACTERIANAS.
CONTADOR DE COLONIAS BACTERIANAS: DESCRIPCIÓN, FUNCIONAMIENTO,
MANEJO, Y MANTENIMIENTO

1. INTRODUCCIÓN: DEFINICIONES PREVIAS

Fases para la realización de un cultivo:

1) Obtención de una muestra -> muestreo.

2) Transporte.
3) Siembra.
4) Incubación.

Conceptos:

o Inoculación: acto de agregar o depositar una cantidad de material (inóculo) que,

presuntamente, contiene mo, a un medio de cultivo. Tras ello, suele repartirse el
inóculo por el medio de cultivo, y puede hacerse de forma homógeneo (como en los
recuentos), heterogéneo (como en aislamientos), o no hacerse reparto.
o Inóculo: cantidad suficiente y representativa del mo problema.
o Siembra: inoculación + reparto del inóculo (cuando no repartimos el inóculo, la
siembra implica solo la inoculación).

Elección de la técnica de siembra -> Elegir una técnica de siembra de entre las existentes
depende de los objetivos que tengamos y tambien de las características de la muestra.

2. MATERIAL USADO EN LA REALIZACIÓN DE SIEMBRAS

 COMUNES A LOS LABORATORIOS QUÍMICO Y MICROBIOLÓGICO

 Tubos de ensayo y gradillas. -- Probetas

 Pipetas: calibradas y pipetas Pasteur. -- Mechero Bunsen

 ESPECÍFICOS DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

 Placas de Petri. -- Algodón graso.

 Pipetas automáticas y puntas estériles desechables. – Guantes y mascarilla
 Pipetas de seguridad. -- Material específico para
 Tubos de cultivo, con cierre hermético o no. procesar anaerobios.
 Asa de platino o de nicrón (alambre metálico).
 Hilo de platino o de nicrón. También se le llama aguja de nicrón
 DESCRIPCIÓN Y USO DE ALGUNOS DE ESTOS MATERIALES

a) Asa de nicrón

Consta de: mango (mango de Kolle) + asa propiamente dicha.

El mango tiene una parte de plástico aislante térmico, que es la zona por la que lo cogemos,
y que es la única que debe entrar en contacto con la mano durante el flameo y la siembra. El
resto del mango es una varilla metálica alargada, en cuyo extremo tiene un mecanismo para
fijar el nicrón.

El asa como tal es de nicrón (aleación de Ni y Cr) que resiste muchos calentamientos al rojo
vivo en presencia de aire sin oxidarse. Es alargada y su extremo está cerrado de forma
circular (debe estar cerrado pues sino, al tomar muestras líquidas, no se forma en su interior la
lámina de líquido deseada y se tomará un volumen de muestra inferior al buscado). Las asas
calibradas son aquellas que toman un volumen conocido de muestra cuya viscosidad sea
similar a la del agua.

En el uso del asa destacan algunos aspectos importantes (precauciones):

 Se esterilizará antes y después de usar.

 La esterilización se hará poniendo el nicrón al rojo vivo en la llama oxidante del
mechero Bunsen.
 Cuando debamos introducir la parte metálica del mango (la varilla alargada) en un
recipiente, se flameará sin ponerla al rojo vivo.
 Cuando se toma una muestra, es imprescindible esperar a que el asa se enfríe (si no,
esterilizaremos por calor la parte de la muestra que toquemos con el asa).
 Cuando sembremos sobre medios con agar, debemos tener cuidado de no romper
el medio, es decir, no hacerlo lento, sino con atención en lo que se está haciendo.

Existen tambien asas estériles de un solo uso, pero generan muchos residuos.

b) Hilo o aguja de nicrón

Se usa con frecuencia para hacer siembras en profundidad (en picadura), y se hace en
medios sólidos contenidos en tubos.

La muestra, que suele ser una colonia pura, se toca con la punta del hilo (sin profundizar
mucho en la colonia) y se introduce el hilo en el medio contenido en el tubo, penetrándolo
hasta casi la base del tubo (hay varias modalidades de este tipo de siembra).

También se usa en resiembras para obtener aislamientos más eficaces: cuando hay varias
colonias muy cercanas entre ellas, con el asa podríamos tocar varias de ellas sin querer
(debido a que acaba en círculo). Sin embargo, con el hilo podemos tomar, gracias a su
punta, una sola parte de entre las colonias que están cercanas, facilitando así obtener
cultivos puros. (Para ello también es necesario que la mano no tiemble).

Sigue las mismas precauciones que el asa de nicrón.

 c) Asas de Digralsky

Son asas de vidrio, metálicas, o de poliestireno, con forma de triángulo más o menos
abierto. Se usan para extender el inóculo líquido previamente adicionado a la placa a través
de, por ejemplo, una micropipeta.

Se esterilizan en la estufe Pasteur o en autoclave, aunque se suele hacer metiéndola en

alcohol, prendiéndola en la llama y sacarla de ahí una vez se agote el alcohol en la zona
aséptica.

d) Hisopos

Se usan para tomar muestras e incluso en muchos casos, llevan un medio de transporte
incorporado que permite transportar la muestra sin que se deseque, deteriore o
contamine.

Sirven para extender muestras en medios de cultivo, y se suelen comercializar estériles,

listos para usar, y desechables.

e) Pipetas

Se pueden disponer individual o en paquetes, y pueden ser de vidrio reutilizables por

esterilización o de plástico (generalmente desechables).

Pueden ser graduadas, es decir, contienen volúmenes específicos (se aspira el volumen con
peras, por ejemplo) o pipetas Pasteur (sin volúmenes graduados).

También hay micropipetas automáticas que suelen usarse para la siembra de volúmenes
pequeños en un determinado medio de cultivo.

3. MÉTODOS DE SIEMBRA EN MEDIOS SÓLIDOS

3.1. MÉTODOS DE SIEMBRA EN PLACA

Estos métodos se aplican sobre medios con agar contenidos en placas de Petri.

Uso: aislar (con o sin identificación), realizar recuentos de gérmenes, y realizar

antibiogramas.

A) MÉTODO DEL AGOTAMIENTO DEL ASA

Uso principal: aislamiento de mo. En un medio diferencial nos puede ayudar también en la
identificación.

Procedimiento: consiste en inocular una placa y tocar a continuación el inóculo con el asa,
haciendo estrías sobre la superficie de la placa.
En la zona del inóculo, las bacterias están tan cerca (a veces en contacto) que sus colonias
crecerán juntas, siendo imposible aislarlas. Al hacer estrías, pretendemos que, a medida que
el asa avanza sobre el agar, se vayan agotando las bacterias que inicialmente portaba el asa.
Así, llega un momento en el que las células serán depositadas una a una y suficientemente
distanciadas sobre la superficie del agar, de forma que podremos obtener colonias aisladas.

Formas de inocular para después extender por agotamiento del asa:

a. Una placa puede inocularse directamente con el asa, siempre y cuando la muestra
sea líquida o pastosa.

b. Los inóculos líquidos pueden también aplicarse con una pipeta Pasteur estéril o una
pipeta automática de punta estéril. En mb clínica también se usa una gota de líquido
biológico procedente de una jeringa.

c. Cuando la muestra se ha tomado con un escobillón, éste puede frotarse en una

zona reducida (1 o 2 cm2).

Diferentes técnicas de agotamiento del asa:

La extensión del inóculo se hace tocando la superficie del agar en donde está depositado el
inóculo y, a partir de ahí, se hacen estrías sobre el agar.

Hay varias técnicas y, en todas ellas, hay que tener en cuenta (precauciones):

 La presión del asa sobre el agar no debe ser excesiva ya que se rompe el medio,
disminuyendo la calidad de la siembra realizada.

 La mayoría de las estrías no deben tocarse unas con otras. Un contacto ocasional no
es grave. Lo que nunca debe ocurrir es que se crucen formando ángulo.

 Para aprovechar bien la placa, hay que conseguir la mayor longitud posible de
recorrido total del asa. Esto se logra cuando las estrías están muy juntas, aunque
esto ocasione contactos ocasionales entre estrías paralelas.

5 técnicas de agotamiento del asa:

1) Siembra en estría única o en zig-zag.

2) Técnica de los 4 cuadrantes : la base de la placa se rotula de modo

que quede dividida en 4 cuadrantes. El agotamiento se hace
desde el borde (en donde estará depositado el inóculo) hasta
elcentro.

Se usa para aislamientos en los que basta mucha menos

superficie de agar de la que tiene la placa. Cada cuadrante se usa
para una muestra distinta, por lo que hay que rotular la identificación de la muestra
 en cada cuadrante. Esta técnica permite reducir el gasto
de placas a la cuarta parte.

3) Técnica de siembra en estrías múltiples: se hacen un

grupo de estrías paralelas de modo que no lleguen al
centro de la placa. Tras ello, se gira la placa 1/5 de vuelta y,
tocando algunas de las últimas estrías de ese grupo, se hace otro conjunto de
estrías. Esto se repite hasta unos 5 grupos de estrías, aprovechando por último el
centro de la placa.

4) Técnica de siembra en estrías múltiples con flameo intermedio : es una variante del
anterior que consiste en flamear el asa entre cada grupo de estrías. Así, se consigue
un agotamiento más rapido ya que al iniciar cada grupo de estrías, el asa sólo
contiene las bacterias recién arrastradas del grupo que acabamos de tocar.

Se usa para aislamientos cuando se sospecha que la carga bacteriana del inóculo es
muy elevada, y se considera la técnica de agotamiento más eficaz. Para ahorrar
tiempo puede usarse dos asas, de modo que mientras una se enfría, se usa la otra.
Este flameo debe usarse siempre para el inóculo más concentrado que haya: una
colonia microbiana.

5) Técnica de los 3 giros: es similar a la de las estrías múltiples, pero

con solo 3 grupos de estrías.

6) Técnica de siembra de los 3 giros con flameo intermedio: se

siembra por un tercio de la superficie del medio, tras lo cual, se
flamea el asa y, sin cargar muestra, giramos la placa 90º y
sembramos en el tercio superior de la misma. Volvemos a flamear el
asa, la dejamos sin cargar, y giramos la placa otros 90º, sembrando
 en estría en el tercio superior. Las colonias aisladas aparecerán generalmente en la
última zona sembrada.

Esta técnica, con o sin flameo, es la más usada de las técnicas de agotamiento de asa.

B) MÉTODO DE SIEMBRA EN SÁBANA

Significa cubrir toda la superficie del agar con inóculo, de modo que éste quede repartido
de la forma más homógenea posible. Fines: realizar antibiogramas, y hacer recuentos
semicuantitativos de gérmenes totales.

 Realización de antibiogramas:

Cuando se quiere estudiar la sensibilidad de una bacteria a un determinado antibiótico, se

hace una siembra de cultivo puro de la bacteria en sábana en una placa de Petri (una grande
de unos 15 cm de diámetro) y se depositan en ella discos con distintos antibióticos:

 Si la bacteria es sensible a los antibióticos, los discos tendrán un halo alrededor en el

que no hay crecimiento de colonias (llamado halo de inhibición).

 Si la bacteria es resistentes, los discos no tendrán halo de inhibición o será muy

pequeño.

La medida del diámetro del halo es útil para obtener resultados comparables. Esta técnica
se llama antibiograma y de uso diario en mb clínica para decidir qué antibiótico usar para
tratar la infección de un paciente.

Técnicas de siembra en sábana

1) Técnica de siembra en sábana con hisopo (escobillón) : para hacer antibiogramas se

suele usar el agar de Mueller Hintor:

i) Se prepara una suspensión de colonias puras de la bacterias que va a

estudiarse. No debe ser muy espesa ni muy diluida, podemos establecer su
concentración adecuada por comparación visual con una escala de turbidez
llamada escala de McFarland.

ii) Obtenida la suspensión, en un tubo de ensayo, se empapa un hisopo y se

exprime sobre las paredes del tubo para que no gotee…

iii) … y hacemos estrías por toda la placa.

iv) Se gira la placa 90º y se vuelve a extender.

2) Técnica de siembra en sábana con asa en L (asa Digralsky):

 i) Preparamos la suspensión como antes partiendo del mismo medio (difiere
de la técnica anterior en el utensilio usado para hacer la siembra).

ii) Se deposita un pequeño volumen de inóculo sobre el medio de la placa de

Petri.

iii) Se extiende el inóculo con el asa Digralsky por toda la superficie del medio
mediante un movimiento de rotación.

iv) Se deja secar y se incuba.

3) Técnica de siembra en sábana para recuento semicuantitativo. Siembra en
superficie: se usa para recuentos de bacterias en muestras en las que sólo se
necesita una precisión aproximada (como en el estudio de infecciones urinarias o
de determinadas muestras de alimentos).

Las variantes de esta técnica consisten en depositar en el centro de

la placa un volumen medido de inóculo y extenderlo por toda la
placa lo más homogéneo posible mediante un asa normal o una en L.
Si se usa un asa normal, puede hacerse así (haciendo una única
estría con los tramos muy juntos, sin importar si a veces contactan):

Un método similar se usa en mb de alimentos: se llama recuento por siembra en

superficie, y se usa agar de recuento en placa (PCA) en placas de Petri. En ella, se
inocular 0.1 mL de muestra, que se extiende con asa de vidrio en L.

Son mejores los métodos de siembra en masa (el siguiente).

C) MÉTODO DE SIEMBRA EN MASA

Consiste en inocular a un medio sólido en todo su volumen, no sólo en su superficie. Para

ello, se mezcla el inóculo líquido con el medio a tº lo suficientemente elevada para que el
medio se mantenga fundido. Sin embargo, la tº debe ser lo suficientemente baja como para
no matar los mo que se desea hacer crecer: esto se consigue enfriando el medio fundido
hasta 45-55 ºC en baño termostatizado. Principal uso: recuento cuantitativa.

Hay 2 técnicas principales:

1) Técnica de de inoculación
del medio previa al vertido
en placa: permite producir
una distribución de colonias
muy uniforme (mejor que
otros métodos). Se usa para
aislamientos y
antibiogramas, y para
recuento de gérmenes
viables.
 Incoveniente: los recuentos obtenidos son inferiores a los reales porque parte de la
mezcla medio + inóculo queda adherida a las paredes el tubo de ensayo. (En el tubo
se mezcla medio e inóculo, y luego se vierte a la placa).

Consiste en pipetear en un tubo de ensayo un determinado volumen de medio de

cultivo fundido no muy caliente y a continuación, añadir 1 mL aprox de inóculo y
mezclar ambos componentes bien. Después, se vierte todo el contenido el tubo en la
placa de Petri, se deja solidificar, tras lo cual, invertimos la placa y se incuba. Así, las
bacterias formarán colonias tanto en la superficie como en el fondo de la placa.
2) Técnica de siembra en masa con
inoculación en la placa vacía: consiste
en pipetear 1 mL aprox de muestra e
introducirlo directamente en el interior
de la base de una placa de Petri vacía,
tras lo que se añaden unos 15 mL de PCA
(el medio) previamente licuado y
matenido en baño maría a 50 ºC. La
placa se tapa y el contenido se mezcla
deslizándola sobre la mesa con
movimientos circulares, en cruz… pero
evitando que el medio toque la tapa. Se deja enfriar hasta solidificar, tras lo cual, la
placa se invierte y se incuba (el inócilo (primero) y el medio se mezclan directamente
en la placa).

Es un procedimiento de recuento cuantitativo muy usado en mb de alimentos y

otros campos, pero no para usos clínicos. Es mejor para recuento que cualquiera de
los procedimientos anteriores. Permite contar bacterias, levaduras y también
esporas de hongos miceliformes.

3.2. MÉTODOS DE SIEMBRA EN TUBO DE AGAR

Los medios sólidos en tubo pueden prepararse con tres fines:

 Identificación: para ello, se usan medios diferenciales.

 Conservación de cultivos.

 Cultivo de gérmenes de crecimiento especialmente lento: Mycobacterium spp. (3-4

semanas).

Los tubos con medios sólidos suelen prepararse dejando que el medio solidifique estando el
tubo inclinado, por lo que obtenemos“tubos inclinados” o “en pico de flauta”. A veces,
también se preparan con agar enfriado en posición vertical y obtenemos “tubos con agar
horizontal”.

Hay varias formas de sembrar tubos con medio sólido. Describiremos estas:
 A) SIEMBRA EN PROFUNDIDAD (EN PICADURA)

La muestra, normalmente una colonia pura, se toma con la

punta del hilo de siembra (sin profundizar en la colonia), tras
lo que introducimos el hilo en el tubo con medio,
perforándolo en su centro y penetrando hasta casi la base
del tubo. Puede hacerse tanto en tubos con agar inclinado,
en pico de flauta, o con agar horizontal.

B) SIEMBRA POR ESTRÍA EN SUPERFICIE INCLINADA

Esta técnica es aplicable sólo a tubos con ágar inclinado.

Tras tomar la muestra con el asa, se introduce hasta el fondo de la superficie del ágar y se
va avanzando hacia arriba mientras se hacen estrías. Esto suele usarse para renovar
cepas (resiembra), para pruebas bioquímicas en medios diferenciales, etc…

C) SIEMBRA EN PICADURA SEGUIDA DE ESTRÍAS EN SUPERFICIE INCLINADA

Es una técnica importante aplicable sólo a los tubos con ágar inclinado o en pico de flauta.

Consiste en una siembra en profundidad seguida de una siembra de estrías:

 1º, se hace la siembra en profundidad con el hilo de nicrón, pero no se perfora el centro
de la superficie del agar, sino cerca de su borde menos profundo para después tener
mucha superficie de agar para sembrar en estría.

 Al subir con el hilo, después de perforar el medio, cuando la punta llega a la superficie,
se comienzan a hacer las estrías muy juntas hasta la parte superior del agar.

La realización de estrías con el hilo hay que hacerla con sumo cuidado para no cortar la
superficie del agar con su punta.

Esta técnica se usa mucho con medios diferenciales como el agar de hierro Kligler, muy
utilizado en la diferenciación de enterobacterias. Tiene usos clínicos y en mb de alimentos.

3.3. CULTIVO E IDENTIFICACIÓN DE HONGOS

Las levaduras y mohos pueden cultivarse en placa depositando directamente un fragmento

de micelio o extendiendo una muestra que contenga esporas o células sobre la superficie
de un medio adecuado en placa.

Para su recuento total (en forma vegetativa o en forma de esporas), se hace una siembra
en masa con inoculación previa en placa, igual que con las bacterias.

Las técnicas de identificación de mohos consisten, casi exclusivamente, en su estudio

morfológico, tanto macroscópico (aspecto de sus colonias) como microscópico:

 El aspecto mascrocópico de las colonias puede estudiarse directamente sobre el agar

de la placa en la que crece.
 El estudio microscópico puede realizarse con preparaciones en fresco secas o húmedas
con detergentes, tratamiento con KOH al 10 %, y tinciones diversas.

4. MÉTODOS DE SIEMBRA EN MEDIOS LÍQUIDOS

4.1. MÉTODOS DE SIEMBRA

A) SIEMBRA CON ASA: el asa cargada con el inóculo se sumerge en el medio

líquido y se agita hasta homogeneizar.

B) SIEMBRA CON ESCOBILLÓN: se hace igual que con el asa.

C) SIEMBRA CON PIPETA: se pipetea el volumen adecuado de inóculo, se

introduce en el medio líquido, y se agita hasta homogeneizar.

D) SIEMBRA CON JERINGA Y AGUJA: suele usarse para siembra en frascos

sellados con tapón de caucho. Estos frascos pueden contener una
atmósfera anaerobia, aerobia, o microaerófila. Son de uso normal para
hemocultivo (cultivo de sangre que se hace cuando se sospecha de que el
paciente tiene una infección y el mo infeccioso ha pasado a la sangre).

4.2. USO DE LOS MEDIOS DE CULTIVO LÍQUIDOS

A pesar de ser inadecuados para el aislamiento, los medios de cultivo líquidos continúan
siendo útiles por distintos motivos, entre los que destacamos:

 Los mejores medios de enriquecimiento son líquidos.

 Pueden usarse para conservar mo.

 Pueden usarse para realizar antibiogramas y determinar la concentración mínima

inhibitoria (C.M.I.).

 Hay mo que no crecen en medios sólidos, como algunas bacterias muy grandes, y
muchos protozoos y algas.

5. SIEMBRA DE ANAEROBIOS

La siembra de anaerobios estrictas puede realizarse en unas condiciones u otras según la

tolerancia de éstos al oxígeno: hay bacterias anaerobias extremadamente sensibles al O2,
por lo que mueren rápidamente por exposición al éste. Así, deben ser sembradas utilizando
técnicas especiales. La más usada es la de siembra en una cámara anaeróbica con guantes:
consiste en una cámara hermética con atmósfera sin O2. El panel frontal debe ser
transparente y estar perforado con dos largos y resistentes guantes de goma unidos de
modo hermético que servirán para que el operador introduzca desde fuera de la cámara
sus manos y así manipule las muestras mantenidas en atmósfera anaerobia en el interior de
la cámara.

La misma cámara suele servir como cámara de cultivo.

Estas cámaras anaerobias son de uso corriente en laboratorios de hospitales.

6. ASPECTO DE LAS COLONIAS. FORMAS DE CRECIMIENTO MICROBIANO.

6.1. FORMAS DE CRECIMIENTO MICROBIANO

En la superficie de un medio de cultivo sólido podemos distinguir 3 formas de

crecimiento macroscópico:

a) Crecimiento en colonias: forma normal de crecimiento de bacterias y

levaduras. Estos mo forman masas de células originadas a partir de una sola
o de varias.

b) Crecimiento en oleadas: característico de algunas especies bacterianas,

especialmente de las del gº Proteus. Inicialmente, se produce una colonia,
pero su crecimiento es invasivo, de forma que se extiende por una gran
zona de la placa llegando a cubrir colonias de otras bacterias.

Este crecimiento se da en oleadas sincronizadas para casi todos los

individuos de la colonia. Por cubrir otras colonias de mo llega a ser un
problema que debe y puede evitarse (medio CLED para urocultivo).

c) Crecimiento en colonias de hongos miceliformes : tienen varias peculiaridades que las

diferencian de colonias bacterianas o de levaduras: los mohos son organismos
multicelulares y a veces no son microbios, sino que una colonia está formada por un
solo individuo mascroscópico; su aspecto es filamentoso y a veces pulverulento (muy
diferente del aspecto compacto de las colonias bacterianas).

Cuando una célula viva bacteriana o de levadura se deposita sobre la superficie de un medio
de cultivo, produce una colonia. Sin embargo, también produce una sola colonia una
agrupación de células de la misma especie. Las células o grupos de células que crecen
suficientemente separadas dan lugar a colonias aisladas, óptimas para aislar mo. Sin
embargo, las células que se depositaron muy cerca unas de otras, forman colonias que
terminan tocándose y a veces forman una masa de colonias no distinguibles unas de otras
 Al crecimiento de colonias que llegan a contactar unas con otras se le llama crecimiento
confluente.

6.2. IMPORTANCIA DEL ASPECTO DE LAS COLONIAS

Las colonias bacterianas pueden tener a simple vista aspectos muy diferentes. La
importancia de esto reside en que 2 colonias con aspectos muy diferentes en la misma
placa es seguro que corresponden a 2 mo diferentes: esto facilita el reconocimiento y
aislamiento de mo. Sin embargo, hay que tener presente que 2 especies microbianas
distintas pueden producir colonias idénticas o muy parecidas.

El aspecto de las colonias de una especie depende en gran medida del medio de cultivo
usado. Sin embargo, en un mismo medio, la misma bacteria siempre dará colonias de
aspecto similar (suponiendo que el resto de factores, como tiempo de incubación, tº, etc.,
no han cambiado). Esto hay que tenerlos también en cuenta para identificar bacterias.

6.3. DESCRIPCIÓN DEL ASPECTO DE LAS COLONIAS

Cuando caracterizamos una bacteria por el aspecto de sus colonias, hay que describirlas. Sin
embargo, antes hay que seleccionar las colonias adecuadas: describiremos sólo colonias
aisladas y preferiblemente las que crecen bien separadas unas de otras, pues son las más
típicas. Por otra parte, entre las colonias de una misma bacteria puede haber también
diferencias de tamaño debido a que una de ellas (más pequeña) proceda de una sola célula
mientras que otra un poco más grande proceda de una agrupación de células.

De una colonia se puede describir: Forma (circular, irregular, puntiforme, etc.), Perfil (corte
diametral vertical, también llamada elevación), Contorno (también llamado borde o
margen), Superficie: (lisa o rugosa; si no se menciona, se sobreentiende que es lisa),
Consistencia (cremosa, mucosa, seca o dura. Para observar esta característica, hay que
tocar la colonia con el asa), Tamaño (grande, mediana o pequeña), Abundancia (sólo se
menciona cuando las colonias son muy abundantes en relación al resto de tipos de colonias
o son escasas), Características ópticas: color, paso de la luz (transparente, opaca o
translúcida -> cuando no se dice nada se sobreentiende que es opaca; si se dice que es
translúcida sin mencionar el color se entiende que tiende al blanco), reflejo de la luz
(brillante o mate), Olor (sólo se hace referencia al olor de la placa cuando es muy
característico), y Cualquier otra característica llamativa.

7. SUBCULTIVO O RESIEMBRA

7.1. DEFINICIÓN DE SUBCULTIVO O RESIEMBRA

Cuando una muestra se siembra en un medio, se dice que se está haciendo una 1ª siembra.
Llamamos resiembra o subcultivo al acto de hacer una siembra de mo ya cultivados en
otro medio de cultivo (medio que puede ser igual o diferente del primero).

7.2. USO DE LA RESIEMBRA

 Se usa ampliamente en aislamiento, teniendo en cuenta que cuando se quiere lograr un

aislamiento, nunca se debe considerar cultivo puro o una colonia crecida en la placa de
 la 1ª siembra. Muchas veces lo que parece una colonia pura es producto de un
crecimiento mixto. Hay que hacer una resiembra y si en la 2ª placa obtenemos colonias
de sólo un tipo, podremos decir que tenemos un cultivo puro.

 Otra de sus utilidades es rejuvenecer un cultivo conservado: Una vez ha transcurrido

cierto tiempo, los cultivos conservados comienzan a tener mayor proporción de células
envejecidas que no conservan sus características originales. Conviene entonces
rejuvenecerlos mediante una resiembra en un medio fresco.

8. CONSERVACIÓN DE CULTIVOS

La mayoría de los laboratorios necesitan cultivos de determinadas cepas de algunos mo. Estas
cepas deben resembrarse periódicamente para mantenerlas vivas, lo que conlleva riesgos de
contaminación y de selección involuntaria de cepas mutantes que se apartan de las
características deseadas. Para superar estas dificultades, existen en España y en otros países
de la U.E. bancos de mo con colecciones de cultivos tipo. En los bancos de mo éstos se
conservan liofilizados.

Los laboratorios de mb pueden obtener de los bancos de mo las cepas deseadas. Una vez
recibidas, las cepas pueden conservarse mediante:

8.1. SUBCULTIVOS SERIADOS

Las cepas se conservan períodos cortos.

Se siembran 2 tubos con caldo, se incuban hasta que el crecimiento sea notable y activo y,
en fase logarítmica, se refrigeran y conservan así 1-2 meses: 1 de los tubos se usa para tomar
porciones que serán usadas en laboratorio, y el otro para hacer una resiembra más
adelante.

8.2. DESECACIÓN DE CULTIVOS

Las cepas se conservan períodos largos.

Hay 2 métodos. En ambos, un cultivo puro en medio líquido es desecado en un desecador

de vacío que contiene un potente desecador químico. El soporte sólido sobre el que se ha
desecado el caldo se refrigera. Se reconstituye mediante incubación en un tubo de caldo.

8.3. CONGELACIÓN

Las cepas se conservan períodos largos.

En un tubo con tapón a rosca se prepara una suspensión densa de bacterias en agua del
grifo esterilizada o en leche desnatada y se congela a -20 ºC.
 8.4.LIOFILIZACIÓN

Las cepas se conservan indefinidamente.

Se prepara una suspensión de bacterias u hongos (procedentes de un caldo, o mejor, de

una colonia sobre agar) en un líquido de composición diversa (suero más caldo, leche
desnatada, etc.) pero que siempre con glucosa o sacarosa a [ ] elevada. La suspensión se
liofiliza.

Cuando sea necesario renovar las cepas desecadas o liofilizadas, es preferible recurrir de
nuevo a un banco con una colección de cultivos tipo.
 TEMA 6: CONCEPTO DE INCUBACIÓN Y PARÁMETROS FUNDAMENTALES

1. INTRODUCCIÓN: DEFINICIONES PREVIAS

Incubación: es la última fase de la obtención de un cultivo microbiano, que se realiza tras la

siembra. Consiste en el mantenimiento de un medio de cultivo sembrado con la muestra
que se está estudiando, en las condiciones adecuadas para su crecimiento y durante el
tiempo necesario para ello.

2. PARÁMETROS DE INCUBACIÓN

Algunas de las condiciones necesarias para que crezcan los mo son: nutrientes, humedad
adecuadas, osmolaridad adecuada, pH adecuado, ausencia de inhibidores… -> Éstas son
directamente proporcionadas por el medio de cultivo, pero otras no (como la tº, luz…).

Parámetros de incubación: son las condiciones ambientales que afectan al crecimiento de

los mo y que son proporcionadas por el entorno ambiental en el que se encuentra el medio
de cultivo. Es decir, no están relacionadas con el medio de cultivo en sí ni por otras
sutancias o seres vivos acompañantes en el inóculo (antibióticos, mo competidores o
depredadores…).

Los más importantes son: composición de la atmósfera, tº, y tiempo. Otros, como la luz,
son secundarios, aunque pueden ser decisivos en algunas aplicaciones, como por ejemplo,
en el cultivo de algas o cianobacterias con fines de investigación.

A. TEMPERATURA DE INCUBACIÓN

a. Rangos de temperatura de incubación

Cada mo presenta una tº óptima más o menos estricta a la cual, sus funciones metabólicas y
por tanto, su crecimiento, tienen un rendimiento máximo. Por encima y por debajo de ella,
hay unos márgenes de tº dentro de los cuales el mo puede proliferar y presenta actividad:

 Algunos mo son psicrófilos, es decir, debes incubarse a tº entre 15 y 20 ºC. Otros, a tº

entre 4-6 ºC. Su uso no es muy frecuente.

 Las tº entre 28 y 32 ºC son muy usadas en

mb de alimentos para incubar especies
bacterianas, ya que una tº de 30º C adecuada
para incubar hongos (tanto patógenos
humanos de muestras clínicas, como
aquellos presentes en alimentos).

 La mayoría de las bacterias patógenas de

muestras clínicas se incuban a 35-37 ºC, ya
que son tº próximas a las que han crecido.
Hay tº superiores a 37 ºC que son usadas o bien para incubar mo termófilos (uso poco
frecuente) o bien para aplicaciones especiales: E. coli crece bien entre 44-46 ºC, mientras
que la mayoría de enterobacterias lactosa positivas no lo hacen, por lo que esta tº de
incubación se usa para realizar cultivos selectivos.

b. Estufas de cultivo y dispositivos similares

La mayoría de las incubaciones se hacen a tº superiores a la tº ambiente  el principal

instrumento de incubación es la estufa de cultivo. Las convencionales constan de:

 Caja cuyas paredes incluyen un aislamiento térmico para minimizar las pérdidas de
calor. Su forma es cúbica (o al menos similar) para conseguir una baja relación
superficie/volumen (una forma esférica tiene una mejor relación S/V, pero con el
inconveniente de no contar con caras planas). Las más usadas tienen un v = 80 L.

 Doble puerta: una exterior, aislada térmicamente y con juntas aislantes en todo su
perímetro, y otra interior transparente que permite una observación rápida del
interior de la estufa sin alterar su tº.

 Interior con bandejas para aprovechar todo su volumen.

 Resistencia eléctrica para su calefacción, junto a una o varias de sus paredes

internas.

 Termostato regulable que controla el funcionamiento de la resistencia. La sonda del

termostato debe estar en el interior de la caja, separada de la pared, y nunca en una
esquina ni en la pared que contiene la resistencia, pues las lecturas serían falsas.
Incluso así, hay diferencias de temperatura entre puntos diferentes de la estufa.

 Es imprescindible introducir uno o varios termómetros fiables en el interior de la

estufa para conocer con veracidad la tº real. Deben poder leerse sin abrir la puerta
transparente interior.

También existen cámaras de cultivo en las que caben una o varias personas. Realizan las
funciones de una estufa de cultivo, y constan de los mismos elementos, excepto en que:

 Tienen estanterías en lugar de bandejas pequeñas.

 No tienen puerta transparente.

 Tienen iluminación interior.

Se usan cuando el volumen de muestras es muy elevado (laboratorios de hospitales

grandes…).

En la incubación de mo psicrófilos suele ser necesario usar sistemas con termostatización

completa (estufas que incluyen un sistema de refrigeración también controlado por un
termostato y que entra en funcionamiento cuando la tº del laboratorio es superior a la de
incubación).

B. ATMÓSFERA DE INCUBACIÓN

a. Incubación en condiciones aerobias

La mayor parte de los mo de importancia en mb alimentaria y clínica son aerobios o

anaerobios facultativos. Por tanto, pueden incubarse en una estufa convencional con
atmósfera de aire. Para incubar mo que crecen en atmósferas distintas, se usan sistemas
especiales (los que vienen a continuación).

b. Sistemas de incubación de anaerobios

Hay distintos sistemas que permiten crear el ambiente anaerobio necesario para su
crecimiento:

a) Jarras de anaerobiosis (jarras de cristal herméticamente cerradas): sistema más

usado para crear una atmósfera anaerobia. También se usa para crear atmósferas
capnófilas (bacterias que para su crecimiento, requieren una atmósfera rica en CO2).
Las hay de varias marcas, y se usan principalmente para cultivos en placas. El diseño
es similar en todas ellas:

- Constan de un cilindro de plástico transparente al que se sujeta una tapa

hermética con unas pinzas que se aprietan con un sistema de rosca.

- De la tapa suele colgar el depósito del catalizador.

- Dentro del cilindro se colocan las placas sembradas.

- Además, incluye una bolsa que contiene un sistema generador de atmósfera

anaerobia y un indicador de anaerobiosis.

- Se cierra la jarra y se introduce en una estufa convencional.

 Hay varios sistemas generadores de anaerobiosis comercializados (Oxoid, BioBag,
etc.). Consisten en una bolsita que contiene reactivos químicos. Tras abrirla por el
extremo indicado, se introduce la cantidad de agua que el fabricante indica, se
mete la bolsa en la jarra que contiene ya las placas sembradas, y se cierra la tapa.
Entonces, en la bolsa se produce una reacción química que libera H2, el cual
reacciona con el O2 gracias a un catalizador contenido en el depósito de la tapa.
Esta reacción consume el O2 contenido en la jarra hasta niveles inferiores al 1%. Cada
sobre generador puede transformar un volumen limitado de aire. En jarras de
volúmenes mayores, es necesario introducir dos o más bolsas generadoras.

Es preferible usar un catalizador de Pd llamado catalizador “frío” porque no es

necesario usarlo en caliente, y porque no ocasiona riesgo de explosión entre el H2 y
el O. El catalizador se inactiva con el exceso de humedad y el H2S, por lo que es
necesario reactivarlo tras cada uso calentándolo en una estufa durante 1’5- 2 horas
a 160 ºC.

Además de la bolsita, debe introducirse una tira impregnada con un indicador

químico que, mediante cambios de color, indica si la atmósfera generada es la
adecuada.

Muchos anaerobios se desarrollan mucho mejor si la atmósfera contiene un 5-8 % de

CO2. Es por ello por lo que la misma bolsita también contiene un sistema de
generación de CO2 . Así, al agregar agua dentro de la bolsita generadora, se
produce una reacción ácido-base que libera CO2 hasta los niveles deseados.

Una alternativa al uso de generadores de H2 y CO2 es el sistema de “evacuación-

reemplazo”: la jarra debe disponer de una conexión al vacío que permita bajar hasta
60mm de Hg. Así, el aire se extrae y es reemplazado por N2 con un 5-10% de H2 y un
5-10% de CO2. Se repite el ciclo vaciado-llenado un par de veces y la jarra se incuba
en estufa convencional. Debe incluirse un indicador de anaerobiosis.

Este sistema se usa menos que por necesitar una inversión en equipo, aunque el
coste de los gases es inferior al del coste de las bolsas generadoras necesarias para
la misma cantidad de muestras

b) Bolsas de anaerobiosis (bolsas de plástico herméticas; cultivo de una sola placa):

consiste en usar bolsas de plástico sellables en las que se introducen las placas a
incubar (las hay individuales o para varias placas). Después, se introduce un sistema
generador de gases de varios que hay comercializados y un indicador de
anaerobiosis, se sella la bolsa, y se incuba en estufa convencional.

c) Cámaras libres de O2 (de anaerobios): la atmósfera empleada es principalmente de

N2 (80-90 %), pero también incluye un 5-10 % de H2 y un 5-10 % de CO2.
 Se usa para incubación de grandes cantidades de placas y para siembra de
anaerobios muy sensibles al O2. También permite realizar dentro de ella con toda
comodidad las pruebas bioquímicas necesarias para la identificación de los mo (se
trabaja con guantes conectados a la cámara).
d) Habitaciones libres de O2 (donde los técnicos trabajan con equipos autónomos).

e) Sellado de medio de cultivo: tras inocular un tubo con caldo, se sella con parafina o
vaselina estéril. El agente reductor que contiene el medio elimina el O2 que pudiera
haber entrado.

f) Frascos de hemocultivos: son frascos sellados con tapón de caucho que contienen
caldo en atmósfera anaerobia. La inoculación se realiza con jeringa y aguja a través
del tapón de caucho. Últimamente también se comercializan en cajas de plástico.

Muchos medios de cultivo específicos para mo anaerobios contienen sustancias reductoras

para eliminar pequeñas cantidades de O2 que pudieran entrar en ellos: tioglicolato, ácido
ascórbico, o Na2S, principalmente.

Los medios sólidos con estas sustancias reductoras mantienen fácilmente un ambiente
anaerobio en zonas alejadas 2-3 cm de la superficie en contacto con el aire, aunque no se
use una atmósfera anaerobia. Esto es fácil de conseguir en tubos con agar, el inconveniente
es que las colonias no tienen una morfología característica y, además, el acceso a ellas es
difícil. Esto dificulta su uso y hacen preferible el empleo de medios sólidos en placa, a pesar
de tener que emplear atmósfera anaerobia.

c. Sistemas de incubación de microaerófilos

Unas condiciones de baja concentración de O2 como las requeridas por los microaerófilos
pueden crearse mediante el uso de jarras de anaerobiosis con sobres adecuados para crear
un ambiente microaerófilo.

También pueden crearse en un caldo si se le agrega una pequeña cantidad de agar. Esta
cantidad de agar (menor de la necesaria para solidificar el medio) aumenta la viscosidad del
mismo, inhibiendo las corrientes de convección. Así, el O2 que está en contacto con la
superficie del líquido, difunde con mucha dificultad por el resto del líquido, de forma que se
crea un ambiente microaerófilo a 1-2 cm por debajo de la superficie del caldo.

Un sistema que permite obtener condiciones intermedias entre las capnófilas y las
microaerófilas es el frasco con vela: es un frasco con cierre hermético en el que se
introducen las placas sembradas y una pequeña vela de cera encendida. A continuación, se
cierra la tapa. La vela consumirá entre un 3-5 % del O2 del aire del frasco, y libera un
porcentaje similar de CO2. Esta atmósfera se usa para el cultivo de determinadas bacterias,
y tiene la ventaja de ser muy barato.
 d. Sistemas de incubación de capnófilos

Los microorganismos capnófilos (Brucella spp., Neisseria patógena y Haemophilus spp., entre
otros) pueden cultivarse en una estufa de incubación que difiere de las convencionales en:

o Las puertas tienen un cierre hermético para impedir el intercambio de gases con el
exterior.

o En la estufa penetra, desde cilindros a presión, una mezcla de gases denominada

carbógeno: aire que contiene entre un 5 y un 10% (v/v) de CO2. La purga del aire del
interior de la estufa se realiza cada vez que se abre la puerta, o bien mediante
alimentación continua desde los cilindros de gas. Debe controlarse periódicamente la
concentración de gas.

Otra posibilidad consiste en usar bolsas de plástico sellables como las que hay para
anaerobiosis. El generador de gases produce CO2, pero no consume O2.

C. TIEMPO DE INCUBACIÓN

El tiempo de incubación es el tiempo necesario para que los mo investigados formen

colonias visibles que permitan su aislamiento y su estudio.

El tiempo depende del mo y de las condiciones de cultivo, aunque puede establecerse

algunas reglas generales:

 La mayoría de bacterias requieren 24 o 48 horas de incubación. Sin embargo, algunas

especies (entre las hay varias anaerobias) necesitan hasta 7 días de incubación.
Destacan por su lentitud las micobacterias, que necesitan varias semanas de
incubación, Brucella un mes al menos, y Leptospira 2 o 3 meses.

 Los mohos crecen más lentos que las bacterias, aunque entre unas especies y otras
pueden haber grandes diferencias. Los tiempos de incubación suelen estar entre 5 y 60
días.

 Las levaduras suelen requerir tiempos de incubación mayores que las bacterias e
inferiores a los mohos, aunque hay excepciones en ambos sentidos: algunas forman
colonias en 48 horas, mientras que otras pueden tardar unos 10 días.

En las placas que son incubadas más de 1 semana, se corre el riesgo de que el medio se
seque. Para evitarlo, se introducen en una bolsita de plástico o bien se sella la unión entre
base y tapa con cinta de celofán adhesivo. Este último procedimiento es el más adecuado
para los hongos, pues impide la dispersión de esporas debido a una apertura ocasional de la
placa.
Estas esporas son peligrosas si son de hongos patógenos y, cuando no, también son
perjudiciales, pues aumenta el nivel de contaminación del laboratorio y, con ello, la
probabilidad de contaminar medios de cultivo recién preparados.

D. HUMEDAD DE LA ATMÓSFERA

A la mayor parte de los mo para incubar les basta con el agua que proporciona el medio de
cultivo. Sin embargo, algunos necesitan para su crecimiento que la atmósfera tenga un
elevado contenido en humedad -> son los mo humidófilos.

Una estufa convencional no cumple esta condición, pero es fácil incubando las placas
envueltas en una bolsa de plástico cerrada.

3. INEXISTENCIA DE CONDICIONES DE INCUBACIÓN GENERALES

No existen unas condiciones de incubación válidas de modo general para todos los mo, ya
que hay factores imprescindibles para el crecimiento de unos, que son tóxicos o inhibidores
para otros. Por ejemplo, la incubación en presencia de O2, es imprescindible para mo
aerobios estrictos. pero supone la inhibición para mo anaerobios estrictos.

La elección de unos determinados parámetros de incubación siempre supone la inhibición

de un grupo más o menos amplio de mo.