UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES

“ZARAGOZA”

Cuestionario 1: FORMULACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

INTEGRANTES:

Ayala Hilario Guadalupe

Bautista Gallardo Blanquita Nayeli

Cortes Domínguez Beatriz

Hernández García Susana

Martínez Sánchez Elsa Adriana

Martínez Vázquez Reyna

Olvera Vite Erika

Romero Carrasco José Manuel

Sánchez Gómez Paula

Velasco López José

Grupo: 1901 Semestre 2009-1

LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA FARMACÉUTICA

18 AGOSTO 2008
CUESTIONARIO DE LA PRÁCTICA 1:

FORMULACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVOS.

1.- ¿Qué es un medio de cultivo, que finalidad tiene formularlo y con base a qué se
debe formular?

Cualquier sustancia que pueda ser usada para el cultivo de microorganismos, puede ser
llamada un medio (en latín medium, cuyo plural es media), ó dicho con mayor precisión, un
medio de cultivo.
Los medios de cultivo sirven para dos propósitos principales:

 Fomentar el crecimiento microbiano en forma que puedan comprobarse las

características de cultivo.
 Facilitar algunas reacciones bioquímicas, que luego pueden ser demostrables
por observación directa, o bien indirectamente por subsecuente reacción en
presencia de algunos reactivos adicionales.

Como es natural, todas estas reacciones de cultivo así como las bioquímicas, dependen de
la composición del medio y de la naturaleza del cultivo que se estudie. Los medios de cultivo
se pueden clasificar en cuatro tipos diferentes:
 Medios básicos.
 Medios enriquecidos.
 Medios Selectivos, diferenciales y de enriquecimiento.
 Medios especiales.

Las bacterias pueden ser divididas en autótrofas y heterótrofas. Las primeras comprenden
las bacterias del suelo y el agua que obtienen carbono y nitrógeno de la atmósfera y de la
materia inorgánica simple. Las bacterias heterótrofas requieren compuestos orgánicos más
complejos como fuente de carbono y nitrógeno, así como proteínas o sus derivados, también
requieren carbohidratos y grasas. Este último grupo de organismos es el más importante en
bacteriología médica.
Las variaciones en la composición del medio pueden alterar estas características. Las
condiciones que ha de cumplir un medio de cultivo son:

Una composición de nutrientes adecuada a las necesidades de ese microorganismo.

Como fuentes de energía tenemos:

         a. Fuente de carbono: Algunas bacterias son capaces de utilizar sustancias muy
sencillas, otras azucares simples y complejos, otros gas carbónico, hidrocarburos o incluso
hidrocarbonados diferentes.

         b. Fuente de nitrógeno: Esta fuente de energía la van a formar las proteínas, péptidos o
aminoácidos.
Otros requerimientos no energéticos de los microorganismos son:

         a. Fuentes de azufre: Lo hacen mayoritariamente en forma de sulfatos.

         b. Fuente de fósforo: En forma de fosfatos

         c. Iones metálicos: A concentraciones muy bajas (zinc, manganeso, cobre, cobalto,
molibdeno)

d. Factores de crecimiento: Corresponden a algún tipo de aminoácido (cisteína), factores

específicos (F. X o F. V) o incluso vitaminas o bases púricas y pirimídicas.

         e. Factores de arranque: Son sustancias que van a permitir a la bacteria salir de su fase
de latencia. Esto se consigue con glucosa o iones que estimulen su crecimiento.

         f. Factores inhibidores: Son componentes que van a impedir el crecimiento como la
azida sódica (gram-), los antibióticos, la eosina azul de metileno (gram +)

Proteínas: se suministra generalmente como “peptonas”, que se encuentran disponibles en

el comercio, preparadas por digestión parcial de carne con enzimas pépticas; consisten en
polipéptidos, dipéptidos y aminoácidos.

Carbohidratos: Suministran carbono para las síntesis, y además su fermentación libera

energía utilizable en el metabolismo.

Factores accesorios de Crecimiento: Son también requeridos por algunas bacterias. Entre
ellos están las vitaminas del complejo B (tiamina, ácido nicotínico, piridoxina, biotina). Estas
suministran enzimas necesarias que las bacterias son incapaces de sintetizar. Otros factores
necesarios para algunas bacterias son obtenidos de nutrimentos más complejos, como el
suero, la sangre, la yema de huevo, etc.

Sales minerales: Elementos como potasio, sodio, calcio, etc.; también son requeridos por
algunas bacterias en su desarrollo.

2. ¿Qué es crecimiento microbiano?

El crecimiento microbiano se puede definir como un aumento de tamaño de la célula

conforme transcurre el tiempo; este se debe al incremento ordenado de los componentes
celulares (estructuras, orgánulos y otros componentes celulares) y no esta relacionado con el
almacenamiento de nutrientes por parte de la célula. Una vez que esta alcanza su tamaño
máximo, la masa celular sufre una duplicación o replicación, en la cual la célula se divide en
dos, provocando un aumento en el número de células. De ahí que en el caso de los
microorganismos, el crecimiento y la reproducción se encuentren estrechamente
relacionados.

Los microorganismos requieren un ambiente óptimo para crecer, los requerimientos

esenciales para el crecimiento incluyen:
Aporte adecuado de nutrientes: los nutrientes son necesarios para el crecimiento,
mantenimiento y la división de la célula. Dentro de los compuestos empleados como
nutrientes tenemos a los azúcares y carbohidratos, aminoácidos, esteroles, alcoholes,
hidrocarburos, metano, sales inorgánicas, dióxido de carbono, aunque la utilización de estos
depende del tipo de enzimas con que cuente el microorganismo para su procesamiento y/o
transformación. Además de éstos, la célula requiere fuentes de carbono, nitrógeno, fosfato,
sulfuro entre otros para poder sintetizar el material para su supervivencia.

Fuente de energía: la energía resulta necesaria para realizar las reacciones químicas
esenciales de una célula viva, así como para la motilidad y transportación de los nutrientes.
Esta energía se obtiene de fuentes ambientales, y varían dependiendo del tipo de
microorganismo.
Fototrópico – toma su energía de la luz
Quimiotrófico – obtiene su energía del procesamiento de compuestos químicos tomados del
ambiente

Agua: la mayor parte de la célula se encuentra conformada pos agua (cerca del 80%),
durante el crecimiento, los nutrientes y desechos se transportan en forma de disoluciones, es
decir disueltos en agua, por ello se requiere que el medio donde se desarrolla el
microorganismo contenga las cantidades adecuadas de agua para el desarrollo de éste.
Cabe mencionar que cada tipo de microorganismo y cada especie de ellos tiene sus
requerimientos específicos.

Temperatura apropiada: los microorganismos presentan una temperatura óptima de

crecimiento, en la cuan se observa una tasa máxima de crecimiento, y esta es especifica
para cada microorganismo. Conforme la temperatura se aleja del punto óptimo el crecimiento
del microorganismo se ve afectado. Los microorganismos se han clasificado de acuerdo a su
preferencia por ciertas temperaturas en:
Termófilos – su temperatura óptima de crecimiento es por encima de los 45 °C, se localizan
en abonos, fuentes termales, aberturas hidrotermales en aguas oceánicas.
Termodúricas – son aquellas que se pueden adaptar a crecer en condiciones a las cuales
otros microorganismos morirían.
Mesófilos – su crecimiento óptimo es a una temperatura entre 15 y 45 °C. se localizan en una
amplia gama de habitats, dentro de estas se encuentran los microorganismos patógenos.
Psicrófilo – su crecimiento óptimo de observa a temperatura por debajo de los 15 °C. habitan
en mares polares.
Psicrotrofa – puede crecer a bajas temperaturas, aunque su crecimiento óptimo se observa
por encima de los 15 °C y menor a los 20 °C

pH apropiado: el pH óptimo de crecimiento es 7; la gran mayoría de los microorganismos

no puede crecer en condiciones de fuerte acidez o alcalinidad, los microorganismos
acidófilos gustan de condiciones de pH ácidas, cuyo pH óptimo de crecimiento se observa
entre 2 y 4. los microorganismos alcalófilos crecen óptimamente bajo condiciones alcalinas a
pH por encima de 8.

niveles de oxigeno adecuados: algunas bacterias necesitan oxígeno para crecer

(aerobias), mientras que otras bacterias crecen mejor en ausencia de éste (anaerobias),
existe un grupo al cual puede crecer en presencia o ausencia de oxígeno (anaerobias
facultativas) y otras requieren condiciones muy bajas de oxígeno, pero en ausencia de éste
mueren (microaerófilas).

Iones inorgánicos: los microorganismos requieren cantidades bajas de iones como cloruro,
magnesio, entre otras, las concentraciones altas de éstos pueden inhibir o detener el
crecimiento de los microorganismos. Las funciones de los iones son varias, algunos de los
iones actúan en la membrana, otros en el sistema del citocromo, en la actividad enzimática y
como reguladores; también ayudan en la regulación osmótica de la célula. De acuerdo a las
concentraciones óptimas de cloruro de sodio para su crecimiento, los microorganismos se
clasifican en:
Halotolerantes – pueden crecer en concentraciones de hasta 2.5 M
Halófilas – crecen en presencia de concentraciones altas de electrolitos (al menos 1.5 M y
hasta 3 o 4 M para crecimiento óptimo)

Para que el microorganismo crezca con la tasa más alta, dichos factores deben tener cierto
equilibrio, ya que ninguno de ellos por si sólo puede favorecer el crecimiento. En cambio, si
los factores no proporcionan el ambiente propicio, la tasa de crecimiento del microorganismo
es baja y puede producirse la muerte.

El crecimiento microbiano puede estudiarse de dos formas:

a) de una célula individual: en éste se considera el aumento del tamaño de los organelos,
así como la producción de los componentes, compuestos y estructuras necesarias
para la replicación del material genético y producir la replicación celular. Este
fenómeno se determina a través del ciclo celular que conlleva varias etapas. Se
conocen diversas formas de replicación celular, las cuales dependen del tipo de
microorganismo que se este estudiando. Dentro de estas tenemos:
 Escisión binaria: que es la más común entre bacterias, algas y protozoos. En
esta de una célula madre se producen dos células hijas del mismo tamaño y por
tanto, idénticas.
 Gemación: es este fenómeno se observa en desarrollo o crecimiento de una
yema que aumenta de tamaño hasta casi igualar a la célula madre.
 Escisión asimétrica: en esta de una célula madre se producen dos células hijas
que no son idénticas entre sí.
 División en diatomeas: en esta la división de cada célula, provoca que las
paredes silíceas y rígidas provoque una disminución en el tamaño de las células
hijas en cada división, hasta que su tamaño es tan reducido que se produce una
meiosis y se forma una auxospora que germina hasta alcanzar el tamaño de la
célula madre original.
 Crecimiento hifal: se presenta principalmente en los hongos, consiste en es un
proceso muy semejante a la gemación.

b) de una población: en éste se hace la observación del aumento en el número d

individuos de la población de acuerdo al aumento de masa y al tiempo que tarda en
producirse dicho aumento. Este estudio suele realizarse en medios sólidos (agares,
suelo, alimentos, etc.) o bien en medios líquidos (caldos de cultivo, jugos, etc.). el
fenómeno puede observarse mediante un monitoreo en el laboratorio, o bien como
parte de la naturaleza.
En el medio de crecimiento tiene lugar una secuencia de eventos característica llamada ciclo
de crecimiento, el cual se puede describir por medio de una grafica del peso seco celular,
contra el periodo de incubación.

Figura 1. Ciclo de crecimiento.

1. Fase lag Inmediatamente. Después de la inoculación no es posible que ocurra crecimiento

aparente durante algún tiempo.
2. Fase exponencial o fase log, La población de m.o se duplica y continua replicándose a periodos
regulares.
3. Fase estacionaria. Se caracteriza por ningún crecimiento neto. De hecho el crecimiento puede
estar ocurriendo, pero esta equilibrado por la rapidez de muerte o lisis celular.
4. Fase de declinación. La rapidez de muerte puede volverse más rápida.
5. Fase de aceleración y desaceleración. El crecimiento varía en función de la concentración de
substrato residual en cultivos limitados por el sustrato.

3.¿Cuáles son las principales fuentes de carbono usadas en procesos microbiológicos

industriales y cual es su función?

R= Las principales fuentes de carbono usadas actualmente son:

a) Xilosa. Esta se ha usado solamente como nutriente en la preparación de la enzima

glucosa isomerasa.
b) Glucosa. Se ha usado frecuentemente en fermentaciones destinadas a productos
altamente purificados de valor elevado. La glucosa utilizada se forma por la hidrólisis
acida o enzimática de almidón de maíz o de papa y se puede agregar como polvo,
pasta o jarabe.
c) Sucrosa. Es el substrato principal para la fermentación del ácido cítrico, pero se
agrega principalmente como melazas ya sea a partir de remolacha o caña de azúcar.
La melaza de remolacha es un líquido almibarado de color pardo que contienen
aproximadamente 50% de sucrosa. Además de azucares, las mezclas contienen 30%
de materia seca que consiste en compuestos nitrogenados que pueden ser de valor.
Estas se han usado como fuente de carbono para la producción de etano, acetona y
butano.
 d) Lactosa. A menudo la lactosa pura no se usa como fuente de carbono excepto para la
producción de algunos antibióticos, pero el suero producido durante la manufactura de
queso contiene niveles altos de lactosa, la cual se usa para la producción de etanol y
acido cítrico.
e) Maltosa. Esta presente en la malta, el extracto de malta y en el mosto de cerveza. Se
usa raramente fuera de la industria cervecera excepto para trabajo de laboratorio.
f) Almidón. Es una reserva importante de carbohidratos en las plantas y se usa puro o
como un componente de las papas, trigo, avena, cebada, sorgo, maíz, etc. El almidón
se puede usar directamente después de la gelificación para la producción de acetona
o butanol.
g) Dextrina. Es el producto de la degradación del almidón con la enzima alfa-amilasa y se
ha usado para la producción de algunos antibióticos.
h) Inulina. Esta es la reserva de carbohidratos en el agua turma y en la achicoria:
representa aproximadamente el 25% del peso seco. Su rompimiento enzimático o
levulina y fructosa ha permitido su uso como substrato.
i) Celulosa. Esta junto con la lignina, hemicelulosa y pectina, son los componentes
principales de las paredes de las células vegetales y como tal representa una fuente
enorme de carbohidratos.
j) Metanol. Se ha usado como fuente de carbono para la producción de proteína
unicelular.
k) Etanol. Usado tradicionalmente para la producción de vinagre, se ha utilizado también
para producir proteína unicelular.
l) Glicerol. Se usa a menudo para fermentaciones en la producción de esteroides o
antibióticos.
m) Ácidos carboxílicos. El ácido acético se ha usado recientemente como una fuente de
carbono barata y el ácido succínico se usa en la producción de pectinasas.
n) Grasas. Las grasas y los aceites se emplean a menudo como adiciones a los medios
o como antiespumantes, pero no como únicas fuentes de carbono.
o) Hidrocarburos. El metano, el n-butano y el n-pentano se han usado como fuentes de
carbono para la producción de proteína unicelular, pero solo las n-parafinas se han
empleado extensivamente como fuente de carbono.

4.- ¿Cuáles son las principales fuentes de nitrógeno usadas en procesos

microbiológicos industriales y con qué finalidad se emplea?

Junto con la fuente de carbono, es vital una fuente de nitrógeno. En los medios de laboratorio
el nitrógeno se aporta normalmente como sales de amonio o nitrato, pero para los procesos
industriales se usan otras fuentes.

Estas fuentes se muestran en la tabla 1, que se presenta a continuación:

Tabla 1. Fuentes de nitrógeno para la fermentación.
Fuente de nitrógeno Comentarios
Sales de
Amonio Principalmente para usos de laboratorio
Nitrato Principalmente para usos de laboratorio
Orgánica
Úrea No estable en la esterilización.
Harinas
Harina de soya Usada frecuentemente
Harina de semillas de algodón Contiene gosipol
Harinas de semillas de nabo No se puede usar como alimento para
animales
debido a su toxicidad, por consiguiente se
usa en
las fermentaciones.
Harina de maíz
Harina de maíz gelatinada Subproducto del proceso de molienda del
maíz en
húmedo.
Harina de pescado No estable en la esterilización.
Licor de maíz empapado Gran variedad en su composición.
Extractos de levadura Para usos de laboratorio.
Proteínas hidrolisadas Usado principalmente para productos
farmacéuticos.
Residuos de destilación Usado con frecuencia para ganado.

La úrea se ha usado con Candida utilis pero no es estable durante la esterilización y, por lo
tanto, su valor es limitado. La harina de soya, de semilla de algodón, de semilla de nabo, de
maíz y de pescado, se usan como fuentes de nitrógeno. El licor de maíz es un subproducto
del proceso de almidón de maíz y se usa frecuentemente como fuente de nitrógeno, ya que
contiene aminoácidos, vitaminas y sales minerales.

Una mezcla de nitrato y amonio se utiliza en todos los medios estándar como fuente de
nitrógeno. Muchas células vegetales pueden no ser capaces de tolerar altas cantidades de
amonio utilizado en estos medios. Esa es la razón por la cual las formulaciones se han
contemplado diferentes nutrientes para satisfacer la exigencia de diferentes especies. Se ha
establecido que la composición de las células varía en los medios complementados con
nitrato o amonio.

La máxima cantidad de nitrógeno mineral asimilada por las células cultivadas se utiliza para
la biosíntesis de aminoácidos, proteínas (incluyendo enzimas) y los ácidos nucleicos. La
disponibilidad de metabolitos nitrogenados primaria en grandes cantidades tiene un efecto
directo sobre la síntesis de metabolitos secundarios.
5. ¿Cuál es la importancia de los macroelementos y microelementos en la formulación
de un medio de cultivo?

Es de gran importancia, ya que la mayor parte de los procariotes requieren un

compuesto orgánico de alguna clase como fuente de carbono, ya que son los bloques de
construcción con los cuales las células construyen las macromoléculas y otras estructuras
importantes, así mismo sirven para generar energía, sin ser incorporados directamente al
material celular.
Los centenares de compuestos que existen en una célula viva se forman a partir de
una cantidad relativamente pequeña de materias primas que se encuentran como nutrientes
en el medio ambiente. Cada compuesto esta formado por uno o pocos elementos químicos
básicos que se obtienen a partir de nutrientes diferentes. Los elementos requeridos en
cantidades muy grandes, llamados macronutrientes son carbono, hidrógeno, oxígeno,
nitrógeno, fósforo, azufre, potasio, magnesio y sodio. Los micronutrientes u oligonutrientes,
tales como el hierro, cobre, cobalto, molibdeno, magnesio y zinc; aunque se requieren en
pequeñas cantidades, son indispensables para la nutrición del microorganismo.

Macronutrientes

Nitrógeno: es el componente principal de las proteínas y de los ácidos nucleicos, esta

presente en el polisacárido complejo peptidoglucano, la capa rígida de la pared celular de la
mayor parte de las bacterias. La mayoría de las bacterias son capaces de utilizar el
amoniaco como la única fuente de nitrógeno y otras muchas pueden utilizar el nitrato.

Fósforo: se encuentra en la naturaleza en forma de fosfatos orgánicos e inorgánicos, la

mayor parte de los microorganismos utilizan los fosfatos inorgánicos para su crecimiento.

Azufre: requerido por su papel estructural en los aminoácidos cisterna y metionina, y por que
esta presente en numerosas vitaminas

Potasio: es necesario ya que diversas enzimas son activadas por este macronutriente.

Magnesio: interviene en la estabilización de los ribosomas, de las membranas celulares y los

ácidos nucleicos, así como para la actividad de muchas enzimas, principalmente las que
participan en la transferencia de fosfato.

Calcio: ayuda en la estabilización de la pared celular y desempeña un papel importante en la

estabilidad al calor de las endosporas bacterianas.

Hierro: necesario ya que se encuentra en diversas enzimas celulares, especialmente en las

que participan en la respiración.

Micronutrientes

Cobalto: necesario para formar la vitamina B 12.

Zinc: desempeña un papel estructural en muchas enzimas incluyendo la anhidrasa

carbónica, el alcohol deshidrogenado, las RNA y DNA polimerasas y otras proteínas de unión
del DNA.
Molibdeno: presente en la enzima nitrogenasa, la cual participa en la reducción del N 2, para
la fijación de nitrógeno.

Cobre: juega un papel en algunas enzimas respiratorias, siendo un sitio de reacción con el
O2.

Manganeso: es un activador de muchas enzimas y también se encuentra en algunas

superóxido dismutasa, enzimas de crítica importancia para eliminar la toxicidad a algunas
formas tóxicas del oxígeno.

Níquel: presente en las enzimas hidrogenasas cuya función es captar el H 2.

6. ¿Qué métodos se emplean para evaluar el crecimiento microbiano, en qué

consisten y cómo se clasifican?

En general los ensayos de cuantificación microbiana se agrupan en métodos directos y

métodos indirectos o culturales; con los primeros se determina la cantidad total de
microorganismos (vivos y muertos), en tanto que con los segundos se cuantifica únicamente
a los microorganismos vivos (viables).

Métodos directos. Se establece la población total de los microorganismos existentes en una

muestra. Tiene la ventaja de ser rápidos, sin embargo, a través de ellos es imposible
diferenciar a las células vivas de las muertas. La estimación total de microorganismos se
realiza por turbidimetria, microscopia o con contadores electrónicos.

El número de células de una población se puede medir contándolas bajo el microscopio,

método que se llama recuento directo al microscopio. El pequeño tamaño de la mayoría
de los microscopios y su gran densidad de población hacen necesario emplear cámaras
especiales como la de Petroff-Hausser o hemocitómetros para contar el número de células
de una muestra. Existen tres aspectos que son limitantes en el empleo del conteo
microscópico directo; primero, es tedioso y por tanto poco práctico para una gran cantidad de
muestras; segundo, no es muy sensible debido a que cuando menos deben estar presentes
106 células bacterianas por mL antes de que una sola célula pueda observarse en el campo
microscópico; tercero las células vivas no pueden diferenciarse de las muertas. En estas
cámaras de conteo hay una retícula grabada sobre la superficie de una placa de vidrio con
cuadros de un área pequeña conocida. Sobre cada cuadro de la reja hay un volumen de
magnitud conocida, muy pequeño pero medido con mucha precisión. Se debe contar la
cantidad de células por unidad de área de la retícula. Bajo el microscopio, dando una medida
del número de células por el pequeño volumen de la cámara.

Método de Breed. Un volumen conocido de nuestra (0.01ml) se distribuye uniformemente en

una superficie conocida (2.0cm2), la preparación se examina al microscopio que ha sido
calibrado de tal forma que se conoce el diámetro del campo microscópico, recuentan los
microorganismos en diversos campos, se obtiene el valor medio de las células por campo y
éste se multiplica por el número de campos del microscopio comprendidos en la preparación
con lo que se obtiene el número de microorganismos existentes en el volumen extendido,
que al multiplicarse por 100 indica el total de microorganismo/ml o gramo de muestra original.

Recuento en cámara de Petroff-Hausser. Este tipo de cámara es una placa de vidrio de

ingeniosa precisión, consiste en un portaobjeto con un área central o plataforma central
hundida, esta depresión tiene una profundidad uniforme (0.002cm) y esta grabada con un
sistema cuadriculado de dimensiones constantes. Toda la rejilla abarca una superficie de
0.01cm2, dividida en 25 cuadros grandes que miden 0.02cm por lado. Para este recuento se
coloca una gota de cultivo suspensión de la muestra en el área hundida y un cubreobjetos
que debe reposar en los bordes de la superficie alta de la placa de vidrio. Considerando la
distancia entre el cubreobjetos y la superficie garbada es de 0.02cm, es posible relacionar el
número de células observadas en la superficie de un cuadro. Considerando los volúmenes se
puede calcular la concentración de microorganismos por mililitro. Este método es igual al de
Breed, es útil para muestras que contiene alta concentración de microorganismos

Contadores electrónicos. Existen varios modelos para efectuar el recuento de

microorganismos, en estos se hace pasar un volumen conocido de la muestra a través de un
pequeño orificio de 5-10m de diámetro, mediante la manipulación con una micropipeta de
mercurio. La resistencia eléctrica a través del orificio está se altera cada vez que un
microorganismo pasa través de él, la modificación de la resistencia se amplifica y registra
electrónicamente

La masa bacteriana se puede determinar directamente en términos de peso seco. Éste

método aunque lleva tiempo, es especialmente útil como referencia de trabajo de aislamiento
y purificación y para la calibración básica de otros métodos.

Peso seco. El método mas usado para medir el crecimiento microbiano es secar volúmenes
conocidos de cultivo celular lentamente hasta obtener un peso constante. Cuando se trate de
células que sedimentan rápidamente, como las levaduras, esto usualmente implica
centrifugación (4-6x103rpm) de muestras de cultivo en tubos de centrifuga prepesados
lavando el concentrado con una solución isotónica salina seguida por una segunda
centrifugación. Luego las células son colocadas en un horno a 90 ° C durante unas 20 horas
o a 105 ° durante 6-10 horas hasta alcanzar un peso constante.

Las muestras de cultivo se filtran a través de membranas hidrofílicas con un tamaño de poro
de 0.2 m. las células retenidas en el filtro, se lavan con solución salina isotónica y los filtros
se colocan en un horno a 90 o a 105° C hasta obtener un peso constante. Usualmente el
peso seco es alrededor del 20-30 % del peso húmedo.

Peso húmedo. Este requiere simplemente de la centrifugación o filtración de muestras de

cultivo seguidas por el pesado directo. Aunque es un método extremadamente rápido es
importante estandarizar correctamente el procedimiento ya que se mide el agua tanto
intracelular como extracelular, los cual puede ocasionar errores considerables.

Volumen de células empacadas. Mediante la centrifugación de muestras del cultivo en

tubos de centrifugan graduados se puede determinar rápidamente el volumen de células
empacadas (VCE). Éste método es muy inexacto especialmente cuando se miden pequeños
cambios en la población celular.
Métodos indirectos. Se basa en que indica que cualquier célula viable inoculada en un
medio de cultivo se multiplica y produce datos de fácil identificación tales como: la formación
de colonias en el agar o la producción de turbiedad, gas o cambios de pH en los cultivos
líquidos.

Recuento en placa. Hay dos métodos para realizar un recuento en placa: el método de
siembra en placa por extensión y el método de vaciado en placa.

En el método de siembra en placa por extensión se extiende un volumen de un cultivo diluido

apropiadamente no mayor a 0.1 mL sobre la superficie de una placa de agar, utilizando una
varilla de vidrio estéril. Entonces la placa se incuba hasta la aparición de colonias. Se infiere
que cada colonia se originó de una sola célula y contando el número de colonias se puede
calcular la cantidad de células viables en una muestra.

Vaciado en placa o placa servida. La muestra se mezcla con agar líquido, se toma con una
pipeta un volumen conocido de 0.1-1.0 mL de cultivo y se pasa a una caja de Petri estéril;
entonces se adiciona un medio de agar fundido y se mezclan bien mediante un suave
movimiento giratorio de la placa sobre la superficie de la muestra. Con las placas servidas se
pueden emplear volúmenes de muestra muy grandes (1.0 mL o más) siendo posible el
conteo de las suspensiones que se obtienen de alimentos o suelos homogeneizados. Sin
embargo para usar el método de vaciado en placa el microorganismo que se desee emplear
debe soportar brevemente la temperatura de 45° C del agar fundido sin perder la vitalidad.

Con ambos métodos es importante que el número de colonias no sea demasiado grandeza
que en placas muy atestadas, algunas células pueden no formar colonias y la cuenta es
errónea. También es esencial que el número de colonias no sea demasiado pequeño, caso
en el cual la significación estadística de la muestra calculada será muy baja. La práctica
común, que tiene, mayor significado estadístico es la de contar solamente aquellas placas
que tengan entre 30 y 300 colonias.

Un método más sencillo y más útil para obtener una estimación relativa de la masa celular
consiste en medir la turbidez. La turbidez, se puede medir con un dispositivo que funciona
eléctricamente llamado colorímetro o espectrofotómetro. Con tal dispositivo la turbidez se
expresa en unidades de absorbancia. Cuando se utiliza en mediciones turbidimétricas debe
recordarse que puede variar la correlación entre turbiedad y cuenta viable durante el
crecimiento y la muerte de un cultivo; las células pueden perder viabilidad sin que pierda la
turbiedad del cultivo.

Para los microorganismos la absorbancia es proporcional a la cantidad de células así como

su peso por lo que las lecturas de turbidez se pueden utilizar como sustituto de la cuenta.
Para efectuar el recuento de células se debe preparar una curva estándar para cada uno de
los organismos estudiados relacionando el número de células con la masa de las células o la
absorbancia.

Masa de un componente celular. En los casos donde se dificulte el uso de otros métodos,
la cantidad de un componente celular, la cual es una cantidad constante de peso seco total
se puede usar para estimar la concentración de células o de biomasa. Se han usado
componentes, como el nitrógeno, proteína NRA, DNA y ATP celulares. Pueden surgir
dificultades ya que varía la cantidad de éstos componentes en la célula, a menudo
considerablemente durante el crecimiento de las células, especialmente cuando las
condiciones de éste son diferentes.

Mediciones físicas. El crecimiento de las células va acompañado siempre de generación de

calor. Se ha demostrado que hay una relación directa entre la cantidad de calor producido y
la concentración de biomasa. Éste método es directo, no requiere de muestreo y es
instantáneo, es más adecuado para birreactores a gran escala puesto que la cantidad de
calor generado en escala pequeña puede ser demasiado pequeña para ser medida
adecuadamente. Para cultivos aeróbicos es posible medir la rapidez de captación de oxígeno
ya que se ha demostrado que está directamente relacionado con la concentración de
biomasa.

7. Cuál es el fundamento de la técnica DNS para determinar azucares reductores?

Es una técnica de oxido reducción que se basa en la capacidad de la glucosa para reducir el
ácido 3,5-dinitrosalicílico bajo determinadas condiciones; esta reducción produce una
coloración que se hace más intensa a medida de que aumenta la concentración de azucares
reductores. El fundamento de esta técnica consiste en la oxidación de la glucosa, sin
embargo, la glucosa en solución acuosa se encuentra en su forma cíclica que es muy estable
y por lo tanto no reacciona. Por esta razón es necesario calentar la muestra para que el anillo
se abra, dejando expuesto el grupo aldehído, dando lugar a una reacción de oxidación. Para
que la reacción se lleva a cabo también es necesario mantener la solución en pH alcalino,
permitiendo la oxidación de la glucosa, en esta oxidación el carbono del grupo aldehído se
convierte en ácido carboxílico por la pérdida de protones y la ganancia de oxígeno,
obteniéndose de esta forma el ácido glucónico, por otro lado, el ácido 3,5-dinitrosalicílico es
reducido gracias a la acción del tartrato de sodio y potasio y de la oxidación de glucosa. El
ácido pierde sus configuraciones 3 o 5, principalmente la 3, por ser más reactiva, quedando,
3-amino-5-nitrosalicílico el cual produce una coloración amarilla. La coloración es
proporcional a la concentración de glucosa. Al frenar la reacción con hielo, hace que la
molécula de glucosa se cierre y adquiera nuevamente su configuración piranosa.

8. ¿Qué es un azúcar reductor y ejemplos?

Un azúcar reductor es aquel que tiene una función aldehído ó que está en equilibrio con un
azúcar que lo posee. Las propiedades reductoras de los azucares dependen de la presencia
del grupo aldehído o cetona, reales o potenciales.

Al calentar ciertas soluciones de azucares, en presencia de determinados iones metálico, el

grupo carbonilo se oxida y el Ion metálico se reduce.
En el caso de los azucares reductores, la presencia de una base produce amplia enolización,
especialmente en un pH alto y con una temperatura elevada. Esto facilita las reacciones de
oxidación (pH neutro o ácido); por lo tanto estos azucares se vuelven agentes poderosos
capaces de reducir al Cu++ a Cu+, Ag+ a Ag, etc. Los azucares reductores pueden reaccionar
con distintos agentes oxidantes.
Ejemplos de azucares reductores:

La glucosa es el azúcar reductor más abundante en el organismo. Su concentración en la

sangre está sometida a un cuidadoso mecanismo de regulación en individuos sanos y, en
personas que padecen diabetes, aumenta sustancialmente. Esto lleva a que éste sea el
azúcar reductor generalmente considerado en las reacciones de glucosilación no enzimática
de interés biológico.

Aldosas: porque tienen un aldehído en su forma de cadena abierta.

Cetosas: porque por enolización se establece un equilibrio con una aldosa.

Disacáridos que tienen una función hemiacetal libre (maltosa).

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