Código:

PROCEDIMIENTO Versión:

Determinación de Ortofosfatos en aguas Fecha Aprobación:

1. OBJETIVO

Realizar el análisis fisicoquímico para la determinación de Ortofosfatos en agua de

acuerdo con lo establecido en el método de referencia 4500-P E del Standard
Methods for de Examination of Water and Wastewaters 23 Ed.

ALCANCE

Este procedimiento comprende las actividades desde, la recepción de las

muestras en el área de trabajo para la determinación de Ortofosfatos en agua,
hasta la emisión de los resultados a la Dirección de Factores de Riesgo.

2. RESPONSABLE

Son responsables de la aplicación de este procedimiento los profesionales

universitarios del área de análisis fisicoquímicos de alimentos.

3. DEFINICIONES Y TÉRMINOS

ORTOFOSFATO O FOSFORO REACTIVO: forma de fósforo, principalmente

inorgánico, presente en las aguas que se determina directamente por la prueba
colorimétrica sin hidrólisis preliminar ni destrucción oxidativa de la materia
orgánica. Se presenta en forma suspendida o disuelta.

LDSP: Laboratorio Departamental de Salud Pública.

SISLAB: Sistema de Información del Laboratorio Departamental de Salud Pública.

4. CONTENIDO

4.1. Condiciones generales

 Cumplir las normas de bioseguridad de la institución.

 Las muestras se deben conservar refrigeradas entre 2-6°C herméticamente
cerrada.
 Al momento de analizar las muestras es necesario que estas se encuentren
a temperatura ambiente.
 Realizar el análisis de Ortofosfatos dentro de las 24 horas siguientes a la
toma de muestras.
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4.2. Principio de análisis

El Molibdato de Amonio ((NH4)6Mo7O24) y el Tartrato de Antimonio y Potasio
(K(SbO)C4H4O6) reaccionan en medio ácido con los Ortofosfatos presentes para
formar un heteropoliácido –ácido fosfomolibdico- que es reducido por el ácido
ascórbico formando un complejo azul de Molibedeno intensamente coloreado.

4.3. Reactivos

 Agua destilada

 Ácido Sulfúrico (H2SO4) 5N: diluir 70mL de Ácido Sulfúrico concentrado

hasta 500mL con agua destilada.

 Solución de Tartrato de Antimonio y Potasio (K(SbO)C4H4O6-1/2H2O):

disolver 1,3715g de K(SbO)C4H4O6-1/2H2O en 400mL de agua destilada;
aforar hasta 500mL en balón volumétrico. Almacenar en un recipiente de
vidrio cerrado.

 Solución de Molibdato de Amonio ((NH4)6Mo7O24-4H2O): disolver 20g de

(NH4)6Mo7O24-4H2O en 500mL de agua destilada. Almacenar en un
recipiente de vidrio cerrado.

 Solución de Ácido Ascórbico 0,1M: disolver 1,76g de ácido ascórbico en

100mL de agua destilada. Esta solución es estable por 1 semana a 4°C.

 Reactivo combinado: mezclar los siguientes reactivos en su orden y

proporciones para 100mL de reactivo combinado: 50mL de Ácido Sulfúrico
(H2SO4) 5N, 5mL de solución de Solución de Tartrato de Antimonio y
Potasio (K(SbO)C4H4O6-1/2H2O), 15mL de Solución de Molibdato de
Amonio ((NH4)6Mo7O24-4H2O) y 30mL de solución de ácido ascórbico 0,1M.
Mezclar después de la adición de cada reactivo. Dejar que todos los
reactivos alcancen la temperatura ambiente antes de mezclarlos. Si se
forma turbidez agitar y dejar en reposo por unos minutos hasta que
desaparezca la turbidez. El reactivo es estable por 4h.

 Fenolftaleína 0,1%: pesar 0,1g de fenolftaleína y diluir hasta 100mL con de

Etanol (C2H5OH) al 95%(v/v).

 Solución Stock de fosfatos (50,0mgPO4-P/L): disolver 219,5mg de

KH2PO4 anhidro en agua destilada y diluir hasta 1000mL.
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 Solución estándar de fosfatos (2,50mgPO4-P/L): diluir 50mL de la

Solución Stock de fosfatos (50,0mgPO4-P/L) hasta 1000mL con agua
destilada.

Nota: en el mercado es posible encontrar Material de Referencia (MR) de

1000mgPO4/L (equivalente a 326,138mgPO4-P/L), que puede ser empleado
en lugar de la solución Stock de fosfatos. En caso de emplear esta solución
estándar (MR) preparar la siguiente solución intermedia:

 Solución intermedia de fosfatos (3,26138mgPO4-P/L): diluir 1mL del MR

(326,138mgPO4-P/L) hasta 100mL con agua destilada.

4.4. Equipos y materiales

Espectrofotómetro UV
Celda de 5cm
Erlenmeyer de 125mL
Balones volumétricos de 50, 100, 500, 1000mL.
Pipetas volumétricas de 1mL, 2mL, 10mL, 15mL, 25mL
Transferpipeta de 100-100µL.

4.5. Descripción del procedimiento

4.5.1. Acondicionamiento de la muestra: el LDSP recibe 2 unidades por

muestra, las cuales deben ser rotuladas con el código interno del laboratorio y
almacenadas en refrigeración (2-6°C). Agitar vigorosamente cada unidad y tomar
aproximadamente 200mL de cada una, mezclar en un frasco de vidrio tapa rosca y
marcar el recipiente con el código interno de la muestra.

4.5.2. Adecuación del material: preparar el material y reactivos necesarios para

la realización del análisis y marcar la vidriería utilizada con el código interno de la
muestra, según corresponda.

4.5.3. Preparación de la muestra: tomar 50mL de la muestra sin filtrar para

determinar ortofosfato total o 50mL filtrada a través de un filtro de tamaño de poro
de 0,45µm para determinar ortofosfato soluble, en un Erlenmeyer de 125mL limpio
y seco. Adicionar 0,05mL (1 gota) de indicador de fenolftaleína. Si aparece un
color rojizo adicionar gota a gota solución de Ácido Sulfúrico (H2SO4) 5N hasta
que el color desaparezca.
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4.5.4. Preparación de la muestra fortificada: tomar 50mL de la muestra sin

filtrar para determinar ortofosfato total o 50mL filtrada a través de un filtro de
tamaño de poro de 0,45µm para determinar ortofosfato soluble, en un Erlenmeyer
de 125mL limpio y seco. Adicionar 0,05mL (1 gota) de indicador de fenolftaleína.
Si aparece un color rojizo adicionar gota a gota solución de Ácido Sulfúrico
(H2SO4) 5N hasta que el color desaparezca. Adicionar una cantidad conocida de la
solución estándar de fosfatos (2,5mgPO4-P/L) o de la Solución intermedia de
fosfatos (3,26138mgPO4-P/L) según aplique. A continuación se definen las
adiciones con cada una de las soluciones anteriormente descritas:

a. Muestra fortificada a partir de la solución estándar de fosfatos

(2,5mgPO4-P/L): a 50mL de muestra, adicionar 0,250mL de la solución
estándar de fosfatos (2,5mgPO4-P/L). En este caso la adición será de
0,0125mgPO4-P/L.

b. Muestra fortificada a partir de la solución intermedia de fosfatos

(3,26138mgPO4-P/L): a 50mL de muestra, adicionar 0,200mL de la
solución intermedia de fosfatos (3,26138mgPO4-P/L). En este caso la
adición será de 0,0130mgPO4-P/L.

4.5.5. Preparación del estándar de control: el estándar de control puede ser

preparado a partir de la solución estándar de fosfatos (2,5mgPO4-P/L) o de la
Solución intermedia de fosfatos (3,26138mgPO4-P/L) según aplique. A
continuación se define la forma de preparar el estándar de control con cada una
de las soluciones anteriormente descritas:

a. Estándar de control a partir de la solución estándar de fosfatos

(2,5mgPO4-P/L): tomar 2mL de la solución estándar de fosfatos
(2,5mgPO4-P/L) y diluir hasta 50mL con agua destilada. En este caso la
concentración del estándar de control será de 0,100mgPO4-P/L.

b. Estándar de control a partir de la solución intermedia fosfatos

(3,26138mgPO4-P/L): tomar 2mL de la solución intermedia de fosfatos
(3,26138mgPO4-P/L) y diluir hasta 50mL con agua destilada. En este caso
la concentración del estándar de control será de 0,130mgPO4-P/L.

4.5.6. Preparación de blanco de reactivos: tomar 50mL de agua destilada en un

Erlenmeyer de 125mL limpio y seco. Adicionar 0,05mL (1 gota) de indicador de
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fenolftaleína. Si aparece un color rojizo adicionar gota a gota solución de Ácido

Sulfúrico (H2SO4) 5N hasta que el color desaparezca.

4.5.7. Desarrollo de color: a 50mL de muestra, muestra fortificada, estándar de

control y blanco de reactivos, adicionar 8mL de reactivo combinado y mezclar.
Cronometrar el tiempo transcurrido desde la adición del reactivo combinado. Medir
la absorbancia de la muestra a 880nm después de 10 minutos y antes de 30
minutos de la adición del reactivo combinado. La concentración de la muestra se
determina directamente de la curva de calibración. En este caso el blanco de
reactivos se emplea como solución de referencia.

4.5.8. Corrección por turbidez o interferencias de color: el color natural de las

aguas generalmente no interfiere a la longitud de onda empleada en el método.
Para muestras muy turbias o coloreadas, es necesario preparar un blanco de
muestra. Para esto tomar 50mL de la muestra sin filtrar, o de muestra filtrada, en
un Erlenmeyer de 125mL limpio y seco. Adicionar a la muestra todos los reactivos
excepto el ácido ascórbico y el Tartrato de Antimonio y Potasio y sustraer la
absorbancia del blanco de muestra de la absorbancia de la muestra.

4.5.9. Curva de calibración: para la determinación de ortofosfatos es necesario

elaborar una curva de calibración con al menos 5 niveles de concentración entre
0,01mgPO4-P/L y 0,25mgPO4-P/L por triplicado. Al graficar de la absorbancia a
880nm, de cada una de las soluciones, versus la concentración se obtendrá una
línea recta. Los estándares de la curva de calibración pueden ser preparados a
partir de la solución estándar de fosfatos (2,5mgPO4-P/L) o de la Solución
intermedia de fosfatos (3,26138mgPO4-P/L) según aplique. A continuación se
define la forma de preparar la curva de calibración a partir de cada una de las
soluciones anteriormente descritas:

4.5.10. Curva de calibración a partir de la solución estándar de fosfatos

(2,5mgPO4-P/L): tomar 0,200mL, 1,000mL, 2,000mL, 3,000mL y 5,000mL de la
solución estándar de fosfatos y diluir hasta 50mL con agua destilada. Estas
soluciones corresponden a 0,01mgPO4-P/L, 0,05mgPO4-P/L, 0,10mgPO4-P/L,
0,015mgPO4-P/L y 0,25mgPO4-P/L, respectivamente. Una vez preparadas las
soluciones anteriores adicionar 8mL de reactivo combinado y mezclar.
Cronometrar el tiempo transcurrido desde la adición del reactivo combinado. Medir
la absorbancia de cada solución a 880nm después de 10 minutos y antes de 30
minutos de la adición del reactivo combinado. En este caso el blanco de reactivos
se emplea como solución de referencia.
 Código:

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4.5.11. Curva de calibración a partir de solución intermedia de ortofosfatos

(3,26138mgPO4-P/L): tomar 0,153mL, 0,767mL, 1,533mL, 2,300mL y 3,833mL de
la solución intermedia de fosfatos y diluir hasta 50mL con agua destilada. Estas
soluciones corresponden a 0,01mgPO4-P/L, 0,05mgPO4-P/L, 0,10mgPO4-P/L,
0,15mgPO4-P/L y 0,25mgPO4-P/L, respectivamente. Una vez preparadas las
soluciones anteriores adicionar 8mL de reactivo combinado y mezclar.
Cronometrar el tiempo transcurrido desde la adición del reactivo combinado. Medir
la absorbancia de cada solución a 880nm después de 10 minutos y antes de 30
minutos de la adición del reactivo combinado. En este caso el blanco de reactivos
se emplea como solución de referencia.

4.5.12. Cálculos y expresión de los resultados

 Curva de calibración: graficar la absorbancia versus la concentración,

para cada nivel de la curva de calibración y determinar la ecuación y el R 2
de la curva graficada.

La ecuación de la curva será del tipo:

𝐴𝐵𝑆 = 𝑚⌈𝐶⌉ + 𝑏

Donde:
𝐴𝐵𝑆 = Absorbancia a 880nm
𝑚 = Pendiente
𝐶 = Concentración (mgPO4-P/L)
𝑏 = Intercepto

 Concentración de ortofosfatos: a partir de la ecuación de la curva de

calibración determinar la concentración de ortofosfatos empleando la
siguiente ecuación:

𝐴𝐵𝑆 − 𝑏
[𝐶] = ∗ 𝐹𝐷
𝑚

Donde:
𝐹𝐷 = factor de dilución

Debido a que la Resolución 2115 de 2007 establece el límite máximo

permisible de ortofosfatos expresado como mgPO4/L es necesario convertir
los resultados empleando la siguiente ecuación:
 Código:

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𝑚𝑔𝑃𝑂4 [𝐶] ∗ 94,9714

=
𝐿 30,9738

Donde:
94,9714 = Peso molecular de PO4
30,9738 = Peso molecular del P

4.6. Aseguramiento de la calidad

Se desarrollan los siguientes controles internos.

 Curva de calibración: verificar que el R2 de la curva sea ≥0,98; de lo

contrario repetir el análisis de la curva de calibración. La curva de
calibración será realizada mensualmente y se dejara registro en el formato
código

 Blanco de reactivos: preparar con cada tanda de análisis un blanco como

se describe en 4.5.6. La concentración de ortofosfatos (mgPO4-P/L)
determinada en el blanco del método debe ser menor a la mitad del límite
de cuantificación del método. De lo contrario lavar el material, preparar
nuevamente los reactivos y reanalizar el lote de muestras correspondiente.

 Cartas de control de estándares: analizar por duplicado un estándar de

control (4.5.5.) por cada lote de muestras. Registrar el resultado de cada
duplicado en la Carta de control X estándares, y hacer seguimiento de los
resultados obtenidos de acuerdo con lo establecido en el procedimiento
Código Elaboración e Interpretación de cartas de control.

 Cartas de control fortificados: analizar por duplicado una muestra

fortificada (4.5.4.), por cada lote de muestras. Registrar el resultado de cada
duplicado en la Carta de control X fortificados, y hacer seguimiento de los
resultados obtenidos de acuerdo con lo establecido en el procedimiento
Código Elaboración e Interpretación de cartas de control.

4.7. Valores de referencia: el valor máximo permisible de fosfatos en aguas de

consumo humano es de 0,5mgPO4/L (0,163mgPO4-P/L) de acuerdo con lo
establecido en la Resolución 2115 de 2007.

4.8. Reporte de resultados: generar el reporte de resultados en conjunto con

los demás análisis realizados a la muestra, dejando copia en el sistema de
información SISLAB. Revisar el reporte, corregir los errores si los hay y almacenar
 Código:

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Determinación de Ortofosfatos en aguas Fecha Aprobación:

el archivo pdf. en la carpeta de resultados del alimento correspondiente. Enviar el

reporte de resultados a la Dirección de Factores de Riesgo en archivo pdf.

5. DOCUMENTOS DE REFERENCIA

Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater/. American Public
Health Association (APHA), American Water Works Association (AWWA), Water
Environmental Federation (WEF). 4500-P E 23 Ed. 2017.

6. REGISTROS

T.
Responsabl Lug. Disp.
Código Nombre Recuperación Protección Retenció
e Almacenamiento Final
n
Profesional
Universitario Archivo
Protocolo de Archivo físico área Archivo físico Archiv
FO-M2- análisis físico área Cinco (5)
ensayo alimentos- área alimentos- o
P5-120 fisicoquímic alimentos- años
fisicoquímico ambiente ambiente central
o de ambiente
alimentos
Archivo
Archivo digital – Archivo digital – digital –
carta de Archiv
Profesional carpeta carpeta carpeta Cinco (5)
control X o
Universitario aseguramiento de aseguramiento aseguramie años
estándares central
la calidad de la calidad nto de la
calidad
Archivo
Archivo digital – Archivo digital – digital –
carta de Archiv
Profesional carpeta carpeta carpeta Cinco (5)
control X o
Universitario aseguramiento de aseguramiento aseguramie años
fortificados central
la calidad de la calidad nto de la
calidad

7. CONTROL DE CAMBIOS

VERSION FECHA RAZON DE LA ACTUALIZACION

Implementación de protocolo siguiendo
el método de referencia SM 4500-P E
23 Ed– 2017.