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FLUORESCENCIA
MOLECULAR

ANÁLISIS INSTRUMENTAL
M.C. LILIA ESTHER LANDÍN RODRÍGUEZ

Proteínas fluorescentes de distintos colores

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FUNDAMENTO
La fluorescencia molecular es la técnica que mide
la cantidad de radiación electromagnética emitida
por una molécula que absorbe previamente
radiación ultravioleta-visible.

En general cuando una molécula absorbe

radiación desde el estado electrónico y vibracional
fundamental hasta un estado electrónico y
vibracional excitado para que se produzca
luminiscencia, es necesario que la sustancia
absorba previamente radiación de longitud de
onda adecuada.

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ESPECIES FLUORESCENTES
Una sustancia será fluorescente o no
dependiendo de su estructura y del medio
químico, aunque el rendimiento cuántico y el
tipo de transición influyen en la fluorescencia.

 Compuestos con anillos aromáticos

 Compuestos de carbonilo alifáticos y
alicíclicos
 Estructuras de doble enlace muy conjugados

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𝐹 = 𝐾𝑐 + 𝐹𝐵
Donde K es una constante de propocionalidad y depende de la
eficacia cuántica del proceso de fluorescencia

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Espectrofluorímetro

Registrador

COMPONENTES DE LOS FLUORÓMETROS Y

DE LOS ESPECTROFLUORÍMETROS

 Lámpara de arco de mercurio a baja presión

equipada con una ventana de sílice fundida. Esta
fuente emite lineas para producir la excitación
previa a la fluorescencia a 254, 302, 313, 546, 578,
691 y 773 nm. Las líneas individuales se pueden
aislar con filtros de interferencia.

 Lámpara de arco de Xenon de alta presión, de 75 a

450 W. El espectro es continuo desde
aproximadamente 300 a 1300 nm

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FACTORES QUE AFECTAN A LA

FLUORESCENCIA
La conjugación efectiva entre los enlaces π es mayor si
estos se encuentran en el mismo plano, y por ello las
sustancias mas intensamente fluorescentes son aquellas
que poseen menor número de grupos funcionales sobre
anillos aromáticos en su molécula.
Así en los hidrocarburos aromáticos no sustituidos, la
eficacia cuántica aumenta conforme la hace el número de
anillos.

No presentan fluorescencia

En cuanto a los sistemas heterociclos

más simples como furano, piridina......
no presentan fluorescencia, pero la
fusión de éstos con un anillo
bencénico hace que aumente la
absortividad molar y la probabilidad
de absorber fluorescencia.

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Experimentalmente se observa
que la fluorescencia se
favorece en aquellas moléculas
que poseen estructuras rígidas
o que tienen anillos o forman
quelatos. Así por ejemplo, el
bifenilo es poco fluorescente
mientras que el fluoreno lo es
mucho.

8-hidroxiquinoleína
Complejo Zin-8-hidroxiquinoleína

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EFECTOS AMBIENTALES
Efecto de la temperatura:
La eficacia cuántica decrece con el aumento de la
temperatura, ya que esta contribuye al aumento de las
colisiones entre moléculas, y por tanto a la desactivación
mediante colisión.
Efecto del disolvente:
La eficacia cuántica de la fluorescencia aumenta con
la viscosidad del disolvente debido a que disminuye
las colisiones. Sin embargo, la pérdida del disolvente y
la capacidad para la formación de enlaces por
puentes de hidrógeno son críticos, ya que afecta a la
naturaleza del estado excitado.

EFECTO DEL PH
-Afecta la longitud de onda y la
intensidad de emisión.

-Esto es debido a que el pH

afecta principalmente a la
carga y formas resonantes.

-Algunas sustancias presentan

una fluorescencia tan
sensible a los cambios del pH
que pueden usarse La anilina presenta fluorescencia en la
como indicador ácido-base. región visible en medio neutro o alcalino,
pero no en medio ácido.

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 Efecto del oxígeno disuelto y de los iones

paramagnéticos:
La presencia de oxígeno disuelto reduce la intensidad de
emisión de una solución fluorescente. Este efecto es debido
a la oxidación de la sustancia fluorescente.

 Relación entre intensidad de fluorescencia y

concentración:
Cuando la concentración de una muestra es muy alta o es
muy absorbente, tienen lugar unos procesos de
autoabsorción de la radiación de excitación y de la
emisión fluorescente.

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ANÁLISIS CUANTITATIVO
Esta técnica es útil en la determinación de trazas tanto de
compuestos inorgánicos, como orgánicos o biológicos.
En el análisis de iones inorgánicos, existen dos tipos de
métodos:

- Métodos directos: basados en la reacción del analito con

un agente de complejación para formar un complejo
fluorescente por ej. Cationes Al3+ con rojo de alizarina.

- Métodos indirectos: Dependen de la desactivación de la

fluorescencia también llamada quenching, como resultado
de la interacción del analito con un reactivo fluorescente.
Ej. Aniones, F- con complejo Al3+ con alizarina.

ANÁLISIS DE COMPUESTOS ORGÁNICOS Y

BIOLÓGICOS

-hidrocarburos aromáticos policíclicos PDH5.

Entre las reacciones químicas empleadas para crear
compuestos luminiscentes, podemos señalar:
a) Reacciones de marcaje en las que un fluoroforo se
une directamente al analito con el fin de hacerlo más
detectable. Ej. Cl (Cloruro de densilo con aminas
secundarias, poteinas, aminoácidos y fenoles).
b) Reacciones basadas en la formación de complejos
metálicos. Los iones metálicos pueden servir para hacer
fluorescente a un analito. Ej. Análisis de tetraciclina.

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