Tapia Ibañez Oswaldo AFMP II Gpo: 1502

Fluorometría
Fundamento:
La espectrometría de fluorescencia (también llamada fluorometría o
espectrofluorimetría) es un tipo de espectroscopia electromagnética que analiza la
fluorescencia de una muestra. Se trata de utilizar un haz de luz, por lo general luz
ultravioleta, que excita los electrones de las moléculas de ciertos compuestos y
provoca que emitan luz de una menor energía, generalmente luz visible.
En la espectroscopia de fluorescencia, primero se excita la muestra mediante la
absorción de un fotón de luz, desde su estado electrónico basal a uno de los
distintos estados vibracionales del estado electrónico excitado. Las colisiones con
otras moléculas causan que la molécula excitada pierda energía vibracional hasta
que alcanza el estado vibracional más bajo del estado electrónico excitado.

La molécula desciende luego a uno de los distintos niveles de vibración del estado
electrónico basal, emitiendo un fotón en el proceso. Como las moléculas pueden
caer a cualquiera de los diferentes niveles de vibración en el estado basal, los
fotones emitidos tendrán diferentes energías y, por lo tanto, frecuencias. Así pues,
mediante el análisis de las diferentes frecuencias de luz emitida por
espectrometría de fluorescencia, junto con sus intensidades relativas, se puede
determinar la estructura de los diferentes niveles de vibración.
La fluorescencia casi siempre se observa desde el estado electrónico más bajo E1
hasta el estado fundamental E0. Además, la fluorescencia por lo general ocurre
solo desde el nivel vibracional más bajo de E1 hacia varios niveles vibracionales
de E0 porque los procesos de conversión interna y relajación vibracional son muy
rápidos en comparación con la fluorescencia. Por lo tanto, un espectro de
fluorescencia usualmente consiste en una sola banda con muchas líneas
separadas por muy poco espacio que representan transiciones desde el nivel
vibracional más bajo de E1 hasta los diferentes niveles vibracionales de E0.

Los compuestos que contienen anillos aromáticos producen la emisión de

fluorescencia molecular más intensa y útil. Aunque ciertos compuestos
carbonílicos alifáticos y alicíclicos, así como las estructuras de doble enlace
altamente conjugadas, también manifiestan fluorescencia, hay muy pocos de estos
compuestos comparados con el número de compuestos fluorescentes que
contienen sistemas aromáticos. La mayoría de los hidrocarburos aromáticos no
sustituidos presentan fluorescencia en solución; en ellos, la eficiencia aumenta con
el número de anillos y su grado de condensación. Los heterocíclicos más simples
como piridina, furano, tiofeno y pirrol no presentan fluorescencia molecular, pero
las estructuras de anillos fusionados que contienen estos anillos sí la manifiestan.
La sustitución en un anillo aromático provoca desplazamientos en la longitud de
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onda de los máximos de absorción y cambios correspondientes en las bandas de

fluorescencia. Además, la sustitución frecuentemente afecta la eficiencia de la
fluorescencia.
Instrumentos:
Existen distintos tipos de instrumentos de fluorescencia. En la figura 25-8 se
muestran diagramas ópticos de los instrumentos típicos. Si los dos selectores de
longitud de onda son filtros, el instrumento se denomina fluorómetro. Si ambos
selectores de longitud de onda son monocromadores, el instrumento es un
espectrofluorómetro. Algunos instrumentos son híbridos y usan un filtro de
excitación junto con un monocromador de emisión. Los instrumentos de
fluorescencia pueden incorporar un diseño de doble haz para compensar cambios
en la potencia radiante de la fuente con el tiempo y la longitud de onda. Los
instrumentos que corrigen la distribución espectral de la fuente se llaman
espectrofluorómetros corregidos.
Las fuentes de radiación para la fluorescencia generalmente son más poderosas
que las fuentes de absorción típicas. En la fluorescencia, la potencia radiante
emitida es directamente proporcional a la intensidad de la fuente, pero la
absorbancia es esencialmente independiente de la intensidad de la fuente, ya que
se relaciona con la razón de potencias radiantes.
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Fluorómetro de filtro

Espectrofluorómetro
Como resultado de estas diferentes dependencias de la intensidad de la fuente,
los métodos de fluorescencia suelen ser de uno a tres órdenes de magnitud más
sensibles que los métodos basados en la absorción. Las lámparas de arco de
mercurio, las lámparas de arco de xenón, las lámparas de arco de xenón y
mercurio, y los láseres son fuentes de fluorescencia típicas. Los monocromadores
y los transductores generalmente son similares a los utilizados en los
espectrofotómetros de absorción. Los fotomultiplicadores siguen utilizándose en
los espectrofluorómetros de alta sensibilidad, pero en años recientes los
dispositivos de carga acoplada y los dispositivos de inyección de carga, así como
los con-juntos de diodos, se han vuelto muy populares. La sofisticación, las
características de desempeño y el costo de los fluorómetros y los
espectrofluorómetros varían mucho, al igual que en los espectrofotómetros de
absorción. En general, los instrumentos de fluorescencia son más caros que los
instrumentos de absorción de calidad correspondiente.

La fosforescencia es un fenómeno de fotoluminiscencia bastante similar a la

fluorescencia. Un estado electrónico molecular en el cual todos los espines
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electrónicos están apareados se dice que está en un estado de singlete. Por otra
parte, el estado fundamental de un radical libre es un estado de doblete porque el
electrón impar puede asumir dos orientaciones en un campo magnético. Cuando
uno de un par de electrones en una molécula se excita a un nivel de energía más
alto se puede producir un estado de singlete o de triplete. En el estado de singlete
excitado, el espín del electrón promovido sigue siendo opuesto al del electrón
restante.
Las transiciones desde un estado de singlete excitado a un estado de singlete
fundamental producen fluorescencia molecular. Esta transición de singlete a
singlete es altamente probable y, por ende, el tiempo de vida de un estado de
singlete excitado es muy corto (10-5 s o menos). Por otro lado, las transiciones
desde un estado de triplete excitado a un estado de singlete fundamental
producen fosforescencia molecular. Debido a que la transición de triplete a singlete
produce un cambio en el espín del electrón, esto es mucho menos probable.
Como resultado, el estado de singlete tiene un tiempo de vida mucho mayor
(generalmente de 10-4 s a 104 s).
El largo tiempo de vida de la fosforescencia también es una de sus desventajas.
Debido a que el estado excitado tiene una vida relativamente larga, los procesos
no radiativos tienen tiempo de competir con la fosforescencia por la desactivación.
Por lo tanto, la eficiencia del proceso de fosforescencia, así como la intensidad de
fosforescencia correspondiente, es relativamente baja. Para aumentar la
eficiencia, la fosforescencia comúnmente se observa a bajas temperaturas en
medios rígidos como los vidrios. Otro método es adsorber el analito en una
superficie sólida o encerrarlo en una cavidad molecular (micela o cavidad de
ciclodextrina), lo cual protege el frágil estado de singlete. Esta técnica se conoce
como fosforescencia a temperatura ambiente.