What is CISH? What is RISH?

La hibridación cromogénica in situ, o CISH, permite la detección de amplificación de genes,

translocaciones de cromosomas y número de cromosomas. CISH utiliza reacciones convencionales
catalizadas por peroxidasa o fosfatasa a
lcalina para teñir secciones de tejido fijadas en formalina e incluidas en parafina (FFPE) de 4-5 μm
de espesor. Las secciones congeladas y las muestras citológicas también se pueden teñir. Los
resultados se visualizan bajo un microscopio de luz convencional. CISH depende de la capacidad de
las sondas de ADN y ARN marcadas para hibridarse (unirse) in situ a secuencias específicas de
ADN o ARN complementario en la muestra de tejido. CISH con sondas de ADN a veces se
denomina DISH, mientras que CISH con sondas de ARN se denomina RISH. Luego, los resultados
de la hibridación de la sonda se visualizan dentro del contexto de la morfología del tejido
circundante. Esto significa que los patólogos pueden ver la morfología del tejido y las aberraciones
genéticas simultáneamente.

What are the similarities and differences between CISH and FISH?

Ambas técnicas se basan en la eficacia y especificidad de la hibridación de ácidos nucleicos para

localizar secuencias específicas de ADN y ARN en células y tejidos. FISH, o hibridación
fluorescente in situ, se basa en sondas de ADN o ARN marcadas directamente con fluoróforos o
con biotina. Cuando se utilizan etiquetas de biotina, la detección se logra con proteínas de unión a
biotina marcadas con fluoróforo, como la estreptavidina. Imágenes en FISH requiere un
microscopio de epifluorescencia equipado con los filtros adecuados para visualizar la luz emitida
por los fluoróforos utilizados. Por lo general, los microscopios de fluorescencia deben estar
equipados con una cámara CCD y los resultados generalmente se procesan con un software de
análisis de imágenes. Una clara ventaja de FISH es que es posible la tinción multicolor
(multiplexación).

CISH se basa en sondas de ADN y ARN marcadas con haptenos no fluorescentes como la biotina y
la digoxigenina. Estas sondas hapteniladas se detectan en un segundo paso utilizando estreptavidina
o anticuerpos anti-hapteno conjugados con enzimas como HRP y fosfatasa alcalina. Los sustratos
cromogénicos para estas enzimas se utilizan para localizar los ácidos nucleicos diana en las
secciones. Los cromógenos como DAB, AEC, NBT/BCIP y Fast Red producen precipitados
coloreados insolubles que tiñen los objetivos de ácido nucleico.

Se puede usar un microscopio de luz común para obtener imágenes de los resultados de CISH y, a
diferencia de FISH, la evaluación histológica de los tejidos es posible simultáneamente si los
portaobjetos se contrastan adecuadamente. Aunque se ha realizado CISH multicolor, es mucho más
difícil hacerlo con éxito, en comparación con FISH. Sin embargo, a diferencia de FISH, los
portaobjetos teñidos con CISH se pueden archivar como cualquier otro portaobjetos de patología.

How does CISH compare to FISH and IHC?

Please view the comparison table below:

   CISH   FISH   IHC 

 Signal stability Archivable Fades over time Archivable

Microscope used Bright-field Fluorescence Bright-field

Magnification  40x  60–100x  20–40x

Protocol length Overnight + 3 hr, 55 Overnight + 3 hr, 12 3 hr, 2 min

min min

Morphology  Good  Limited  Good

Amount of training  Medium  High  Low

required

Internal control  Yes  Yes  No

Interpretation Objective/quantitative Objective/quantitative Subjective/qualitative

Overall cost  Moderate  High  Low

What is the minimum magnification I need to see FISH and CISH signals with a

microscope?

La imagen óptima de los resultados de FISH generalmente se logra con un aumento de 100X. Los
resultados de CISH generalmente se resuelven con un aumento de 40X.
 What kind of FISH probes and kits do you offer?

Vendemos 2 tipos de kits FISH que le permiten analizar múltiples objetivos y visualizar señales co-
localizadas en una sola muestra. Mediante el uso de etiquetas de fluoróforo espectralmente distintas
para cada sonda de hibridación, este enfoque le brinda el poder de resolver varios elementos
genéticos o múltiples patrones de expresión génica a través de una pantalla visual multicolor.
Ofrecemos kits de detección FISH Tag™ para análisis de rutina y kits TSA™ basados en tiramida
que permiten la amplificación de la señal para la detección de objetivos muy raros o de baja
abundancia.

How should I prepare my sample for CISH?

Los tejidos deben fijarse en formalina tamponada neutra durante al menos 12-24 horas antes de la
inclusión en parafina. Las secciones de tejido deben tener un grosor de 4-5 μm y montarse en
portaobjetos de microscopio de vidrio tratados con reactivo HistoGrip™ (n.º de cat. 008050),
portaobjetos SuperFrost Plus o Fisherbrand Superfrost. Estos últimos tienen una carga positiva
permanente en su superficie, lo que ayuda a que las secciones de tejido y las células se adhieran
electrostáticamente a ellos. Por lo tanto, en la mayoría de los casos, no es necesario aplicar
adhesivos especiales para tejidos u otros revestimientos a los portaobjetos antes de usarlos.

Sin embargo, también se utilizan otros tipos de portaobjetos de vidrio para IHC, CISH y FISH,
aunque es posible que deban tratarse para promover la adherencia del tejido. Los métodos
comúnmente utilizados incluyen recubrir los portaobjetos con varios reactivos que ayudan a que los
tejidos se adhieran al vidrio. Estos materiales incluyen poli-L-lisina, cromo-alumbre-gelatina,
albúmina de Mayer, pasta de almidón, colágeno y 3-aminopropiltrietoxisilano (APES o TES). Se
recomienda encarecidamente nuestro reactivo de recubrimiento de portaobjetos llamado reactivo
HistoGrip™ (n.º de cat. 008050). El reactivo HistoGrip™ crea una fuerte unión entre el tejido y la
superficie del portaobjetos. La digestión enzimática y otros procedimientos de recuperación de
antígenos, e incluso las temperaturas utilizadas en CISH y FISH, no eliminarán los tejidos adheridos
con el concentrado HistoGrip™. Nuestras pruebas mostraron que un recubrimiento concentrado
HistoGrip™ da como resultado una mejor adherencia al tejido que uno compuesto de poli-L-lisina.
No son necesarios pasos especiales de desparafinización y rehidratación antes de CISH o FISH,
aunque recomendamos encarecidamente que utilice disolventes nuevos para evitar el arrastre de
parafina y xileno.

Do you offer specific tips for the heat treatment step of CISH?

Un paso de importancia central en CISH es la temperatura de incubación durante el paso de

tratamiento térmico. Esto representa el primer paso de recuperación de antígenos en el protocolo
CISH. Es fundamental que la muestra se caliente a 98 °C durante 15 minutos en el tampón de
pretratamiento incluido en el kit de pretratamiento de tejidos Spot-Light (n.º de cat. 008401) que
recomendamos. Esto se puede lograr de una de las siguientes maneras.

1) Horno de microondas: coloque los portaobjetos en un frasco Coplin de plástico que contenga el
tampón de pretratamiento y tápelo sin apretarlo. Coloque una sonda de temperatura en un recipiente
separado que contenga agua o tampón, pero sin tapa. Fije la temperatura a 93°C. Configure el
temporizador durante 15 minutos cuando la temperatura alcance los 93 °C. Tenga en cuenta que la
temperatura en el frasco con la tapa debe ser de ~98 °C. Los portaobjetos se pueden transferir a
agua desionizada inmediatamente después.

2) Olla a presión: Una vez que el agua esté hirviendo dentro de la olla, programe el temporizador
durante 10 minutos y aplique el peso de la boquilla de vapor. Abre la olla a presión cuando la
presión interna haya bajado a 0, momento en el que la temperatura interior rondará los 95°C.

3) Placa caliente: Caliente el tampón de pretratamiento en un vaso de precipitados. Después de que

la temperatura del tampón supere los 98 °C, coloque los portaobjetos y caliéntelos durante 15
minutos. Para evitar que el tampón se evapore, cubra el vaso sin apretar con una cubierta de vidrio o
papel de aluminio.

4) Vaporizador: asegúrese de que la temperatura del tampón de pretratamiento alcance los 98-100
°C antes de colocar los portaobjetos en el recipiente. Luego, cocínalos al vapor durante 20 minutos.

Es importante tener en cuenta que el tiempo de incubación comienza después de que el tampón se
precalienta a las temperaturas requeridas, no mientras se está calentando.

What are your best practices for CISH during the pepsin digestion step?

El paso de digestión con pepsina representa la segunda fase de la recuperación del antígeno. Este
paso se puede realizar a temperatura ambiente oa 37°C. Para el primero, deje que la solución de
pepsina alcance la temperatura ambiente primero. Si desea realizar la digestión a 37 °C, debe
precalentar la pepsina a 37 °C antes de aplicarla en sus secciones. Según el tipo de tejido y el
método de fijación utilizado, es posible que se requieran diferentes tiempos de incubación. Por
ejemplo, sugerimos una digestión con pepsina de 10 minutos a temperatura ambiente o 3 minutos a
37 °C para secciones de tejido mamario humano.

Hemos observado que la digestión excesiva puede debilitar o eliminar la señal CISH y evitar la
contratinción de los núcleos celulares. La digestión insuficiente también puede disminuir o eliminar
la señal CISH, pero aún podrá contrateñir los núcleos.

What is the lowest incubation temperature and minimum time that you suggest for

the DNA denaturation for CISH?

Para la desnaturalización, la temperatura y el tiempo de incubación más bajos que

sugerimos son 92 °C durante 2 min. Para mejores resultados, recomendamos usar 94-95°C
por 5 min.

How do you recommend I carry out the hybridization step for CISH?

Nuestro procedimiento recomendado para aplicar la sonda a los portaobjetos es el siguiente.

Según el tamaño de la sección de tejido, se puede aplicar un volumen inicial de 15 µL de la
sonda al cubreobjetos o directamente a la sección de tejido con una pipeta. A continuación,
los bordes del cubreobjetos se sellan al portaobjetos con cemento de caucho. Si decide no
cubrir los portaobjetos, es importante realizar incubaciones posteriores a 37 °C en una
cámara humidificada.

Para la hibridación, 12 horas a 37 °C pueden ser suficientes, pero sugerimos una incubación
durante la noche para obtener mejores resultados. De hecho, siempre que el espécimen no
se seque, la hibridación se puede extender a 72 horas, si se desea. Le sugerimos que selle de
forma segura los cubreobjetos a sus portaobjetos aplicando cemento de goma en los bordes
para formar un sello hermético.

Can CISH or FISH be performed with frozen sections?

No, CISH y FISH se pueden realizar con muestras citológicas, pero no con cortes

congelados.

Para el paso de pretratamiento de CISH, ¿cómo debo manejar mis preparaciones celulares en
comparación con las secciones FFPE? ¿Qué hay de las muestras de cromosomas de células o
metafases?

Para CISH con preparaciones celulares, el paso de pretratamiento es diferente al de las

secciones FFPE. Con las células, recomendamos omitir el paso de tratamiento térmico, pero
usar el tratamiento con enzima pepsina para la recuperación de antígenos. El resto del
protocolo para CISH con FFPE es el mismo. Para muestras de cromosomas en metafase o
células, recomendamos el siguiente protocolo CISH modificado:

1) Sumergir los portaobjetos en tampón SSC 2x durante 60 minutos a 37 °C.

2) (Opcional) Pretrate las células con el reactivo de pretratamiento de células SPoT-Light™

(n.º de cat. 00-8402) durante 5 min a 37 °C. Es posible que se requieran variaciones en el
tiempo de incubación (2 a 10 min), según el tipo de célula y cómo se hacen los
portaobjetos. Recuerde que una digestión excesiva con pepsina provocará la pérdida de la
estructura de los núcleos y los cromosomas, mientras que una digestión inadecuada puede
provocar la pérdida de la señal.

3) Lavar los portaobjetos tres veces en agua destilada a temperatura ambiente durante 2
minutos.

4) (Opcional) Fijar posteriormente las células sumergiendo los portaobjetos en formalina

tamponada al 10 % durante 1 minuto a temperatura ambiente.

5) Lavar los portaobjetos tres veces en agua destilada a temperatura ambiente durante 2
minutos cada vez.
6) Deshidratar los portaobjetos en etanol al 70 %, 85 %, 95 % y 100 % durante 2 min cada
uno y luego secarlos al aire durante 20 minutos a temperatura ambiente.

7) Los portaobjetos ahora están listos para ingresar al protocolo de tinción CISH. Continúe
con los pasos de desnaturalización e hibridación. Luego debe agregar la sonda, hibridar
durante la noche y realizar la detección como de costumbre.