La inmunohistoquímica es una técnica basada en la tinción de tejido fijado e incluido

en parafina, procedente de biopsias

con anticuerpos específicos marcados con una enzima que torna visible un sustrato
invisible.
El complejo antígeno-anticuerpo se identifica en el tejido mediante microscopia,
localizándolo allí donde se ha unido a moléculas específicas presentes en las células
del tejido en estudio.
IHC- INMUNOHISTOQUIMICA

La inmunohistoquímica es una técnica utilizada para determinar la presencia y el

nivel específico de proteínas celulares. IHC mide la expresión proteica utilizando
especialmente anticuerpos etiquetados o marcados que se unen a las proteínas de
interés. El anticuerpo se mezcla con componentes celulares de un tumor. Después
de un determinado tiempo, la mezcla se enjuaga y sólo los anticuerpos que se
unieron se quedan. La presencia de anticuerpos puede ser detectada utilizando un
microscopio porque las áreas que se unieron al anticuerpo se verán diferentes. Las
muestras con más proteínas se unirán más al anticuerpo por lo que el cambio de
color aumentará. Esto permitira que la prueba no sólo revele si está presente
la proteína sino una cantidad relativa de la proteína. Los resultados de la prueba
se basan en la capacidad de las células teñidas o el porcentaje de células teñidas

• 1. Preparación de la muestra
• 2. Recuperación de epítopo
• 3. Manejo de las muestras
• 4. Permeabilización
• 5. Bloqueo
• 6. Escoger el anticuerpo primario
• 7. Anticuerpos de control
• 8. Dilución del anticuerpo
• 9. Lavados
• 10. Detección
La inmunohistoquímica permite visualizar proteínas en un tejido intacto y que
retiene su microestructura. Una de las ventajas de esta visualización “en tiempo real” es
que permite la comparación del estado de un tejido enfermo en relación a uno sano,

1. Preparación de la muestra
Las muestras de tejido pueden ser procesadas mediante congelación o por fijación. De
forma general, congelando las secciones se consigue que la conformación de la proteína
diana quede inalterada. Ello permite que el anticuerpo se una con más afinidad

el procedimiento más utilizado para fijar e incluir tejidos es mediante fijación con
formaldehido
Otros usuarios, con el fin de aumentar la afinidad del anticuerpo primario, prefieren fijar
las muestras con una solución 50:50 (v/v) de metanol:acetona o un bien al 4%

2. Recuperación de epítopo
La fijación con formaldehido causa reticulación de proteínas en el tejido. La principal
ventaja es que permite mantener la estructura del tejido pero desnaturaliza los
epítopos de a reconocer por el anticuerpo. Es por ello que la recuperación del antígeno se
suele realizar mediante aumento de temperatura o enzimáticamente. Estos factores
(temperatura y pH) deben ser testados y puestos a punto. Llegados a este punto, se
recomienda utilizar una batería de métodos para cada par de anticuerpo y tejido a testar.
De esta manera, dispondremos de la combinación de tratamientos que más se adapta a un
anticuerpo en un tejido concreto.

Un buen punto de partida consiste en hervir en tampón citrato a pH 6.0 un minuto o

dos en el microondas. En secciones congeladas no es necesario realizar recuperación de
antígeno. A pesar de esto, los portaobjetos deben ser secados al aire durante al menos una
hora antes de iniciar la tinción. Posteriormente, las muestras son tratadas con xileno y
rehidratadas con alcohol y agua desionizada.

3. Manejo de las muestras

Una vez las muestras han sido rehidratadas, es importante no dejarlas deshidratar. Utiliza
una bandeja o cubeta específica para obtener una cámara húmeda y así llevar a cabo
tus experimentos de IHC. Alternativamente, si no dispones de una de estas cámaras,
puedes diseñar una utilizando papel de cocina humidificado en agua.

Un truco realmente bueno, consiste en utilizar un PAP pen – un marcador especial que
proporciona una fina capa hidrofóbica cuando se dibuja alrededor de una muestra –
para mantener las disoluciones únicamente en las regiones de interés. Su uso no es esencial
pero puede ser de gran utilidad ya que te permitirá ahorrar anticuerpo.

4. Permeabilización
Para muchas proteínas es muy recomendable añadir un paso de permeabilización al
protocolo. Para proteínas transmembranales, puede ser un paso evitable ya que los
epítopos suelen estar en la parte extracelular. La permeabilización implica el tratamiento
con un detergente (for ejemplo Triton-X100 d
5. Bloqueo
La solución de bloqueo se une a lugares de unión que no son específicos dentro del tejido
con el fin de prevenir la unión no específica de los anticuerpos primario y/o
secundario. Las secciones se incuban con una solución proteica que es inocua al progreso
de nuestra IHC, un buen ejemplo es la albúmina sérica bovina o también conocida por sus
siglas en inglés: BSA. También podríamos utilizar suero del huésped utilizado en el
anticuerpo secundario. Un buen comienzo puede ser iniciar con una solución 3% de BSA e
incubar durante 20 o 30 minutos.

Escoger el anticuerpo primario

Para escoger qué anticuerpo se adapta mejor a nuestra muestra tendremos que tener en
cuenta factores como: los niveles de expresión de la proteína de interés en ese tejido y
que otros anticuerpos se pueden utilizar en ese tejido para realizar la co-localización.
Deberás utilizar anticuerpos producidos en diferentes especies con el fin de poder
distinguirlos a la hora de incubar con los respectivos anticuerpos secundarios. Por otro
lado, deberás tener en cuenta si un anticuerpo monoclonal o bien policlonal se adapta
más a tus necesidades. Los anticuerpos monoclonales ofrecen un señal más específico
mientras que los policlonales pueden ofrecer más señal en casos en que los niveles de
expresión de la proteína de interés sean bajos.

7. Anticuerpos de control
Existen algunas opciones para testar la especificidad de un anticuerpo primario.

• El control ideal para testar la especificidad de un anticuerpo primario sería utilizar

un tejido que no contenga la proteína de interés, como por ejemplo, el tejido de un
ratón knock-out o células en que la proteína diana se ha silenciado mediante un
siRNA.
• La técnica de western blot se suele utilizar para detectar si la proteína de interés
tiene el tamaño correcto. Si se detectan múltiples bandas en la membrana, ello
indica que el anticuerpo no es capaz de detectar de forma específica.

• La especificidad del anticuerpo se puede chequear mediante pre-incubación del

anticuerpo primario con el péptido antigénico (test de adsorción). Este proceso no
es necesario en aquellos anticuerpos purificados por afinidad.

• Si es anticuerpo ha sido generado de forma casera, se recomienda hacer un WB

utilizando sueros de diferentes etapas del proceso de obtención del anticuerpo,
para determinar si la banda que representa a tu proteína es detecta en las
fracciones correctas de la etapa de purificación del anticuerpo.
Dilución del anticuerpo
Normalmente, se proporciona una guía de las diluciones a testar conjuntamente con el
anticuerpo. De todas formas, diluciones desde 1:50 a 1:300 son buenos puntos de partida
para iniciar la optimización del protocolo. Se recomienda realizar un panel de diluciones
cada vez que se adquiera un nuevo anticuerpo. En general, una vez diluido el anticuerpo en
solución de bloqueo (por ejemplo, 3% de BSA en PBS), incuba durante 1 o 2 horas a
temperatura ambiente o bien toda la noche a 4ºC.

9. Lavados
Los lavados para eliminar el exceso de anticuerpo primario se suelen realizar con PBS. Un
lavado rápido seguido de tres lavados de duración igual a 5 minutos es más que suficiente.
Las secciones congeladas pueden ser un tanto frágiles, de tal forma que es recomendable
verter la solución de lavado utilizando una pipeta Pasteur. En buen truco es utilizar Tris-
buffered Saline (TBS) en vez de PBS.

Detección
La detección del anticuerpo primario se suele realizar utilizando anticuerpos secundarios
contra inmunoglobulinas de la especie huésped en que se ha realizado el anticuerpo
primario. Estos anticuerpos secundarios pueden estar conjugados a un fluoróforo (por
ejemplo FITC) o bien a una enzima cromogénica (como por ejemplo la peroxidasa de
rábano;

• El background o ruido de fondo puede variar entre experimentos. Añade siempre

un control negativo, es decir una muestra en la que se ha omitido la incubación con
anticuerpo primario.
• Diluye el anticuerpo secundario en solución de bloqueo y en un factor de dilución
entre 1:800 y 1:1000.