UNIVERSIDAD NACIONAL DE TUMBES

Facultad de Ingeniería Pesquera y Ciencias del Mar

Escuela Profesional Académico de Ingeniería Pesquera Acuícola

Tema:
Técnicas de extracción de ADN

Curso:
Biologia Molecular

Docente:
Tessy Peralta Ortiz

Estudiantes:
Majuan Neyra Segundo
Ramirez Celi Yoberth
Silva Pinzon Angel
Protocolo de extracción de ADN, Método
CHELEX
Comprobar que disponemos de todo el material y equipos necesarios para la
extracción.
 Extracción de ADN, Método CHELEX
Sacar del congelador una alícuota
de 300 µL de CHELEX 10% por cada
Preparar solución CHELEX 10%
muestra.
Añadir 50 μL de cultivo (o un
poco de cultivo en agar) a su
respectiva alícuota.

Encender el bloque térmico e Agitar en el vórtex durante 10-

Agitar en el vórtex durante 10-15 incubar los tubos a 95°C
segundos con cuidado para evitar 15
durante 30 minutos con
que se abran las tapas de los viales. agitación.

Pasar el sobrenadante a un Purificar el

Centrifugar 5 minutos a alta nuevo tubo de 1,5 mL con sobrenadante(kit de
velocidad (>10.000 rpm). cuidado de no arrastrar Chelex purificación).

Almacenar a -20°C.
 Protocolo de Extracción de ADN,
Método NaCl
Comprobar que disponemos de todo el material y equipos necesarios para la extracción
 Extracción de ADN, Método
NaCl
Añadir 600µL de tampón de extracción (0.05MTris – 0.1M EDTA), 70µl de SDS al 10% y 20µL de proteinasa K (20mg/mL).

Añadir 600µL de tampón de extracción (0.05MTris – 0.1M EDTA), 70µl de SDS al 10% y 20µL de proteinasa K (20mg/mL).

Añadir 200µL de NaCl 5M y mezclar durante 20 minutos

Centrifugar la muestra a velocidad máxima a 4°C durante 20 minutos.

Transferir 800µL de sobrenadante (ADN extraído) a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1.5mL.

Añadir 700µL de alcohol absoluto e incubar un mínimo de 2

horas a -20°C.
 Extracción de ADN, Método
NaCl
Centrifugar la muestra durante 15 minutos a máxima velocidad a 4°. Descartar el sobrenadante.

Lavar el pellet de ADN añadiendo 800µL de etanol frío al 70% y centrifugar durante 15 minutos a máxima velocidad a 4°C.
Descartar el sobrenadante.

Secar el pellet a temperatura ambiente durante un mínimo de 4 horas. Evitar secar durante más tiempo ya que el ADN
podría degradarse.

Resuspender el pellet en 150µL de H2O doblemente destilada.

El extracto de ADN puede ser guardado a 4°C durante un día.

Para un almacenamiento prolongado guardar a -20°C
EXTRACCIÓN DE
ADN EN
INVERTEBRADOS
: E.Z.N.A.
MOLLUSC KIT
 Mediante su incubación en el
tampón de lisis a una temperatura
Contener el material Aplicar vortex hasta que se mezcle de 65ºC, adición del tampón de
El ADN obtenido es estable a 4ºC por
adecuado períodos largos de tiempo (hasta 2
completamente e incubar a 55°C precipitación, incubación en hielo
años) y congelado a -20ºC por más
elisis de la muestra durante 15 minutos, y
(Equipos – Materiales tiempo (más de 3 años).
(aproximadamente 20 mg de tejido) centrifugación durante 10
durante 1 hora minutos.n el bloque térmico con
y reactivos) agitación durante 3 horas o si se
prefiere toda la noche.

Una vez que el El paso de desproteinización Precipitación del ADN con

precipitado está seco
respuspende en
volumen adecuado
agua bidestilada.
También es aplicable a la hora de
se obtener ADN genómico de calidad en
(mediante el empleo de la proteinasa isopropanol, centrifugación 10
K) es opcional por lo que en el caso
un cantidad suficiente para análisis de
de no contar con esa enzima se puede minutos, lavado del
PCR, con fines de investigación precipitado y resuspensión del
de básica.
obtener de igual forma un ADN de
alta calidad. ADN en agua.

Podemos realizar la comprobación de

la presencia de ADN en nuestra
solución tomando 1 µL de dicha
disolución previamente mezclada con
4 µL de agua y 1 µL de tampón de
carga y lo cargamos en un gel de
agarosa al 1% y lo corremos en una
electroforesis a 150 voltios.
Visualizaremos nuestro ADN
genómico como una banda de más de
1500 pares de bases al exponer el gel
teñido con bromuro de etidio a la luz
ultravioleta en un transiluminador
UV.
 Protocolo Convencional
modificado por fenol
Cloroformo
1. Muestra de larvas de camarón aproximadamente de 1g dentro de un tubo cónico de 2ml,
agregar 1ml de ten para maceración

2. Homogenizar(30 sg) la muestra macerada del tubo agregando

1ml mas de ten

VORTEX
3. Incubar a 65°C por 10 minutos en baño seco

4. Centrifugar a 10 000 g por 10min a 4 °C

5. Enfriar a -20°C por 7min y se trasnfeiere a nuevos

tubos CENTRIFUGA
 EXTRACCIÓN DEL ADN, MÉTODO CON FENOL-CLOROFORMO

1. Añade SDS y ARNasa a los tubos cónicos, se incubaron a 37 °C Para luego añadir fenol con
un pH 6,6 y llevarlo al vortex.

SDS ARNasa

2. Se añade cloroformo y fenol a una proporción 1:1 se agita y se procede a centrifugar, se

repitió el proceso más de una vez para asegurar el material genético.
EXTRACCIÓN DEL ADN, MÉTODO CON FENOL-CLOROFORMO

3. Queda el sobrenadante que se divide en dos partes iguales en nuevos tubos cónicos y se
añade etanol absoluto y acetato sódico donde se almacena durante una hora a -20 °C.

4. Los tubos se dejan secar con la tapa abierta dentro de una cámara laminar durante 1 hora
y para finalizar la extracción se añade te
se deja resupender a una temperatura de 4 °C durante toda la noche.

ADN OBTENIDO
Referencias Bibliográficas
• Granda, A. (2021). Evaluación de dos métodos para la extracción de ADN de larvas de camarón
(Penaeus vannamei) cultivadas en laboratorio [Universidad Politécnica Salesiana, Tesis de Ingeniero
en Biotecnologia de los Recursos Naturales]. https://dspace.ups.edu.ec/handle/123456789/20783

• Quinteiro, J., Manent, P., Clemente Janeiro De Assunçao, P. A., Medina Alcaraz, C., & Sarmiento
Herrero, R. (2015). Guía de procedimientos y protocolos genéticos de especies marinas.
https://www.researchgate.net/publication/297918867_GUIA_DE_PROCEDIMIENTOS_Y_PROTOCOLO
S_GENETICOS_DE_ESPECIES_MARINAS

• Oficina Española De Patentes Y Marcas España Solicitud De Patente A1. (2007).

https://patentimages.storage.googleapis.com/45/eb/ce/f7206da44b9071/ES2332757A1.pdf

• Cordón, M. (2021). Identificación de los productos pesqueros comercializados en

Guatemala por medio de análisis genéticos [Universidad del Valle Guatamela, Tesis de
Licenciada en Biología]. https://repositorio.uvg.edu.gt/handle/123456789/4170