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Optimización de nanopartículas
lipídicas para administración
intramuscular
de las vacunas de ARNm
Kimberly J. Hassett,1 Kerry E. Benenato,1 Eric Jacquinet,1 Aisha Lee,1 Angela Woods,1 Olga Yuzhakov,1 Sunny
Himansu,1 Jessica Deterling,1 Benjamin M. Geilich,1 Tatiana Ketova,1 Cosmin Mihai,1 Andy Lynn,1
Iain McFadyen,1 Melissa J. Moore,1 Joseph J. Senn,1 Matthew G. Stanton,1,2 Örn Almarsson,1 Giuseppe
Ciaramella,1,3 y Luis A. Brito1
1Moderna
Therapeutics, 200 Technology Square, Cambridge, MA 02139, EE.UU.

Las vacunas de ARNm pueden dar respuesta a muchas

necesidades médicas no satisfechas que no pueden abordarse
con las tecnologías de vacunación convencionales. Para
aprovechar plenamente el potencial de las vacunas de ARNm es
esencial disponer de una tecnología de administración potente y
bien tolerada. Los estudios preclínicos y clínicos han
demostrado que el ARNm administrado por vía
intramuscular (IM) con nanopartículas lipídicas (NPL) de
primera generación genera una fuerte respuesta inmunitaria.
A pesar de los avances logrados en los últimos años, sigue
habiendo grandes oportunidades de mejora, ya que las LNP
más avanzadas se diseñaron para la administración
intravenosa (IV) de siRNA en el hígado. En este trabajo se
analizó un panel de lípidos ionizables biodegradables
patentados para determinar su expresión e inmunogenicidad
en un modelo de roedor cuando se administran por vía
intravenosa. Se seleccionó un subconjunto de compuestos y
se evaluó su tolerabilidad, inmunogenicidad y expresión en
roedores y primates no humanos. Se identificó una
formulación principal que produjo una respuesta inmunitaria
robusta con tolerabilidad mejorada. Y lo que es más
importante para las vacunas, el aumento de la estimulación
inmunitaria innata impulsada por las PRL no equivale a un
aumento de la inmunogenicidad, lo que ilustra que la
tolerabilidad de las vacunas de ARNm puede mejorarse sin
afectar a su potencia.
INTRODUCCIÓN
Desde la primera inmunización activa, las vacunas han aumentado
la esperanza de vida y mejorado la salud pública, salvando
1,2
innumerables vidas. En la actualidad, existen diversas tecnologías
para el desarrollo de vacunas, como los virus vivos y atenuados, las
proteínas recombinantes, los péptidos sintéticos,
1 identificaron el lípido ionizable como el principal impulsor de la
glucoconjugados y los ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos (ADN y
Las vacunas basadas en ARNm ofrecen varias ventajas sobre otras tecnolo
vectorizadas. Por último, las proteínas producidas por vacunas
basadas en ácidos nucleicos pueden ofrecer una presentación más
natural al sistema inmunitario, lo que se traduce en una mejor
respuesta de las células T.4 Aun así, más de dos décadas después del
primer informe de prueba de concepto,5 ninguna vacuna basada en
ácidos nucleicos ha sido aprobada para su uso en humanos.
Un factor clave que obstaculiza el desarrollo de vacunas de ADN y
ARNm es la falta de un sistema de administración potente y bien
tolerado. Dado que el ADN requiere su administración en el
núcleo, un proceso intrínsecamente ineficaz, se necesitan dosis
elevadas (1-2 mg) y un dispositivo de electroporación para generar
respuestas inmunitarias sólidas. Aunque los recientes avances en la
electroporación de ADN han demostrado ser prometedores, la
adopción generalizada de la tecnología probablemente será limitada
debido a la necesidad de un dispositivo especializado y al dolor
asociado a la electroporación. 6–8 Una ventaja del ARNm sobre el
ADN es que el ARNm sólo requiere liberación citosólica. En
roedores, los primeros estudios mostraron que la administración
intramuscular de ARNm formulado con tampón puede dar lugar a
niveles mensurables de inmunogenicidad.9 Sin embargo, un reciente
ensayo de fase I de una vacuna de ARNm contra la rabia
administrada en tampón Ringer no produjo inmunogenicidad a
menos que se administrara con un dispositivo de inyección
intradérmica de alta presión.10
Aunque prometedores, estos resultados ponen de relieve la
necesidad de tecnologías de administración intracelular más
potentes para las vacunas de ARNm. Una de estas tecnologías son
las nanopartículas lipídicas (NPL). Las LNP suelen estar
compuestas por un lípido ionizable, colesterol, un lípido PEGilado
y un lípido auxiliar como la distearoylfosfatidilcolina (DSPC). Los
primeros trabajos con pequeños ARN interferentes (siARN)
los
potencia.11–13 Los fármacos
gías. Pueden producirse rápidamente con un tiempo de desarrollo y
unos costes reducidos utilizando una plataforma de fabricación y
- ción comunes, independientemente del
antígeno. A diferencia de la fabricación de otras vacunas, estos
una proteína recombinante. El antígeno se expresaría in situ, lo que
permitiría el envío previo de dominios transmembrana, si fuera
necesario, y la formación de complejos multiméricos. 3 Además, los
ácidos nucleicos no sufren inmunidad antivectorial como los virus.
Recibido el 28 de septiembre de 2018; aceptado el 26 de enero de
2019; https://doi.org/10.1016/j.omtn.2019.01.013.
2
Dirección actual: Generation Bio, 215 First Street, Suite 150, Cambridge, MA 02142,
EE.UU.
3
Dirección actual: Beam Therapeutics, 325 Vassar Street, Cambridge, MA
02139, EE.UU.
Correspondencia: Luis A. Brito, Moderna Therapeutics, 200 Technology
Square, Cambridge, MA 02139, USA.
Correo electrónico: luis.brito@modernatx.com

Terapia molecular: Ácidos nucleicos Vol. 15 Abril 2019 ª 2019 Los autores. 1 Este
es un artículo de acceso abierto bajo licencia CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc- nd/4.0/).
 Terapia molecular:
Ácidos nucleicos

Figura 1. Farmacocinética de las Farmacocinética de las LNP que contienen MC3 tras la administración IM en ratones Concentración de lípidos (nanogramos por gramo) tras la
administración IM de ARNm modificado que codifica luciferasa formulado en LNP que contienen MC3 (triángulos grises) en músculo, hígado y bazo hasta 24 h después de la
inyección (n = 3 por grupo por punto temporal).

advanced LNP contiene el lípido ionizable MC3 y ha demostrado Las observaciones de efectos adversos de leves a moderados en
ser segura en humanos tras la administración intravenosa (IV) de nuestro trabajo clínico con MC317 y los datos que mostraban una
siRNA.14 Nuestros propios ensayos de vacunas con PNL basadas en

una dosis de 100 mg de ARNm modificado. Sin embargo, en

consonancia con otras vacunas,15,16 observamos efectos adversos
locales y sistémicos de leves a moderados.17 Dado que las vacunas
se administran a personas sanas, desde recién nacidos de un día
hasta ancianos, las características críticas para una amplia adopción
de la vacuna son una reactividad mínima en el lugar de la
inyección y una alta tolerabilidad. Hasta la fecha, las únicas PNL
evaluadas para la administración intramuscular (IM) de vacunas de
ARNm fueron opti- mizadas originalmente para la administración
IV de ARNsi en el hígado.18,19 Aunque hay informes preclínicos de
nuevas PNL que se están evaluando para vacunas, no se ha
proporcionado ninguna justificación sobre la composición o
selección de la formulación.20–22

Aquí describimos la evolución racional y la selección de una

formulación mejorada para la administración IM de ARNm,
centrándonos en el impacto del componente lipídico ionizable
como principal impulsor de la expresión y la tolerabilidad. Nuestra
experiencia previa con la administración IV de los lípidos
ionizables patentados mostró un aclaramiento rápido en
comparación con MC3,23 lo que mejora la tolerabilidad sistémica.
Nuestro trabajo aquí ilustra que la formulación ideal para la
expresión IV no es necesariamente ideal para la expresión IM.
Además, también mostramos que el aumento de la estimulación
inmunitaria innata impulsada por la PNL no es necesaria para
aumentar la inmunogenicidad, lo que ilustra que tenemos la
oportunidad de mejorar la tolerabilidad de la vacuna sin afectar a su
potencia.

RESULTADOS

2 Terapia molecular: Nucleic Acids Vol. 15 Abril 2019

 w w w . m o le c u l a r t h e ra p y .o r g
l a n ál i si s d e l t e j i d o m u s c u lar reveló que,
lenta eliminación de MC3 tras la administración IV 23 alimentaron
la hipótesis de que los efectos adversos podrían estar relacionados
con la presencia prolongada de MC3 en el lugar de la inyección.
La espectrometría de masas

Terapia molecular: Nucleic Acids Vol. 15 Abril 2019 3

 Terapia molecular:
IM, la concentración de MC3 sólo disminuyó en un 50% en Ácidos nucleicos
comparación con Cmax (Fig. 1A). Además, MC3 también era
detectable en el hígado y el bazo 24 h después de la inyección IM
(Figuras 1B y 1C). Así pues, la administración IM de LNPs de
ARNm formuladas con MC3 produjo una exposición local y
sistémica prolongada a los lípidos.

El objetivo del trabajo aquí descrito era identificar un nuevo lípido

ionizable con una tolerabilidad mejorada y una potencia igual o
mejor que la del MC3. Para ello, examinamos 30 nuevas LNP,
cada una de las cuales contenía un lípido ionizable diferente en
lugar de MC3. Cada formulación de LNP mantuvo la misma
relación lípido-nitrógeno-fosfato (N:P) y la composición molar de
los componentes lipídicos (lípido ionizable, colesterol, fosfolípido
y lípido de polietilenglicol [PEG]). La coformulación de ARNm
que codifican la luciferasa y el antígeno hemo- aglutinina (HA)

como la inmu- nogenicidad en el mismo estudio. La actividad de

la luciferasa se midió mediante imágenes de cuerpo entero 6 h
después de la inyección de la primera dosis. La inmunogenicidad
se evaluó cuantificando los títulos de inmunoglobulina (Ig)G a-
H10 2 semanas después de la segunda dosis, que se administró 3
semanas después de la primera. Todos los lípidos ionizables
estudiados contienen una amina terciaria con colas lipídicas que
contienen ésteres para permitir un rápido metabolismo in vivo.23
Además, también probamos el lípido que contiene amonio
cuaternario N- [1-(2,3-Dioleoiloxi)propil]-N,N,N- trimetilamonio
(DOTAP).

En consonancia con nuestras publicaciones anteriores, el ARNm

formulado con MC3 produjo títulos robustos y expresión de
proteínas a una dosis baja (0,001 mg por kg). 17,24 En cambio, no
observamos expresión proteica o inmunogenicidad detectables en
las LNP que contenían DOTAP (Figura 2A). Muchos de nuestros
nuevos lípidos biodegradables demostraron ser superiores a MC3
tanto en expresión proteica como en inmunogenicidad tras la
administración IM. Sin embargo, no se observó una fuerte relación
entre la expresión proteínica

4 Terapia molecular: Nucleic Acids Vol. 15 Abril 2019

 w w w . m o le c u l a r t h e ra p y .o r g
l a n ál i si s d e l t e j i d o m u s c u lar reveló que,

Figura 2. Expresión e inmunogenicidad de las LNP que contienen nuevos lípidos ionizables en ratones
(A) Treinta nuevas LNP lipídicas, de la A a la E0 se compararon con un control de LNP D (MC3) en cuanto a expresión e inmunogenicidad. Los lípidos están ordenados de izquierda a
derecha en orden de pKa desde bajo
(A) a alta (DOTAP). Expresión medida por luminiscencia en flujo (fotones por segundo) 6 h después de la administración de ARNm modificado que codifica luciferasa administrado a
0,5 mg/kg IV en ratones CD-1, 0,01 mg/kg IM o 0,001 mg/kg IM en ratones BALB/c (n = 5 por grupo). Inmunogenicidad medida por títulos de IgG específicos de H10 medidos 2
semanas después de dos dosis administradas con 3 semanas de intervalo administradas IM a 0,001 mg/kg IM en ratones BALB/c (n = 5 por grupo). Los datos se representan como
log2 fold change comparado con MC3. Los cuadrados que contienen una X indican un cambio >4 veces (log2 ) inferior al de MC3. (B) El aumento del pliegue log2 en la expresión
se comparó con el cambio del pliegue log2 en la inmunogenicidad al nivel de dosis baja administrada IM (0,001 mg/kg). Los cinco
nuevos lípidos principales y las LNP MC3 están etiquetados en consecuencia: MC3 (triángulos grises), lípido H (círculos verdes), lípido M (naranja
cuadrados), lípido P (rombos morados), lípido Q (triángulos invertidos de color canela) y lípido N (hexágonos amarillos). (C) Lípido pKa frente al aumento del pliegue de
inmunogenicidad a 0,001 mg/kg IM para los lípidos A a E0 . (D) Anticuerpo IgG circulante (microgramos por mililitro de suero) 6 h después de la administración de 0,2 mg/kg de ARNm
modificados que codifican la cadena pesada y la cadena ligera de un anticuerpo monoclonal antigripal formulado en una proporción de masa 2:1 en LNPs que contienen MC3 o lípidos
novedosos (n = 5 por grupo). *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p <
0,0001, ANOVA unidireccional ordinario con prueba de comparaciones múltiples de Dunnett de cada nuevo lípido frente a MC3.

e inmunogenicidad (r = 0,54). De los 14 lípidos que produjeron

títulos de a-H10 IgG superiores a MC3, cuatro lípidos produjeron
con MC3, mientras que cuatro lípidos produjeron una actividad de
Figura 2B). Los dos lípidos
con los títulos de IgG a-H10 más elevados fueron sólo 1,3 veces
mejores que MC3 en lo que respecta a la expresión proteica, lo que
ilustra que la expresión proteica tras la administración IM fue un
mal predictor de la inmunogenicidad.
difiere del rango óptimo de pKa para la administración intravenosa
de siARN y ARNm, que se ha descrito entre 6,2 y 6,6. Las eficiencias
de encapsulación de ARNm y los tamaños de las LNP oscilaron entre
el 69% y el 100%, y entre 50 y 142 nm.11,23
encapsulación del ARNm y los tamaños de las PNL oscilaron entre el
69% y el 100% y entre 50 y 142 nm, respectivamente. Aunque no
hubo relación entre la efi ciencia de la encapsulación y la expresión
de la proteína IM o la inmu-

También encontramos poca correspondencia en el rango entre las

LNP con respecto a la expresión IM frente a IV (Figura 2A), lo que
ilustra que las for- mulaciones pueden comportarse de forma
diferente cuando se administran localmente frente a
sistémicamente. Una posible explicación de la falta de correlación
entre el rendimiento IM e IV podría ser que las propiedades físicas
o químicas óptimas difieren entre las dos rutas. Un factor
determinante de la inmunogenicidad fue el pKa del lípido, con un
rango de
6,6-6,9 es el óptimo para la inmunogenicidad IM (Figura 2C). Esto
Terapia molecular: Nucleic Acids Vol. 15 Abril 2019 5
 w w w . m o l e c ul a r th e r a p y. o rg
n o g e n ic i d a d , e x i st í a u n a relación entre
de la PNL, siendo las formulaciones con mejores resultados las de
75-95 nm (Figuras S1A y S1B).

Para un estudio más detallado, elegimos los cinco lípidos

ionizables que mostraban el mayor aumento en los títulos de IgG
a-H10 en comparación con MC3 (símbolos de colores en la Figura
2; estructuras en la Figura 3A). En particular, el pKa de los cinco
lípidos era muy cercano a 6,75 (Figura 2C). Como medida
adicional de la potencia, se comparó la capacidad de cada PNL
líder para impulsar la expresión de un anticuerpo IgG secretado
tras la administración IM en ratones (Figura 2D). A excepción del
lípido Q, los otros cuatro lípidos produjeron mayores
concentraciones séricas de IgG que MC3 (p < 0,05).

Para comprender la biodegradabilidad de estos lípidos, medimos

los niveles de lípidos tras la administración IM. Como era de
esperar, la administración IM de estas LNP en ratones CD-1 fue
seguida de una rápida eliminación (Figuras 3B-3D). Todos los
lípidos principales se degradaron más rápidamente que el MC3 en
el músculo (figura 3B), el bazo (figura 3C) y el hígado (figura
3D). 24 h después de la inyección, la cantidad de lípidos presentes
en el músculo disminuyó considerablemente desde los niveles
máximos de todas las formulaciones probadas, aunque los lípidos
H y Q no volvieron a los niveles basales a las 48 h. Los niveles de
lípidos en el hígado y el bazo siguieron de cerca a los de MC3.

Terapia molecular: Nucleic Acids Vol. 15 Abril 2019 5

 Terapia molecular:
Ácidos nucleicos

Figura 3. Estructura química y farmacocinética de los lípidos de plomo

(A) Estructuras químicas y pKa del MC3 y de los nuevos lípidos. (B-D) Concentración de lípidos (nanogramos por gramo) tras la administración IM de ARNm modificado que
codifica la luciferasa formulado en LNPs que contienen lípido H (círculos verdes), lípido M (cuadrados naranjas), lípido P (rombos morados), lípido Q (triángulos invertidos de
color tostado) y lípido N (hexágonos amarillos) en (B) músculo, (C) hígado y (D) bazo hasta 48 h después de la inyección (n = 3 por grupo por punto temporal).

cebado inmunitario.
Los niveles de lípidos IM, aunque el lípido H mostró un pico a las 6
h que descendió a las 24 h en el bazo y el hígado.

Se evaluó la inmunogenicidad en primates no humanos (PSN) tras

inyecciones IM de ARNm de H10N8 formulado con los cinco
lípidos principales como PNL. Los títulos de anticuerpos por ELISA
(Figura 4A) y HAI (Figura 4B) no fueron estadísticamente
diferentes en ningún grupo (ANOVA unidireccional, p > 0,05),
salvo que el

(ANOVA unidireccional, p < 0,01) por ELISA y tras la segunda

dosis (ANOVA unidireccional, p < 0,001) por HAI. Las respuestas
inmunitarias fueron mensurables tras una única dosis mediante
ELISA. Tras una segunda dosis, tanto los títulos de HAI como los
de ELISA aumentaron considerablemente, lo que indica un fuerte
6 Terapia molecular: Nucleic Acids Vol. 15 Abril 2019
 www.moleculartherapy.or
También probamos la expresión proteica de los cinco lípidos
principales en los PSN. Se inyectaron 500 mg de ARNm de IgG
formulado en PNL por vía IM y se controlaron los niveles de
expresión de anticuerpos en suero durante 2 semanas. Mientras
que tres de los cinco lípidos seleccionados produjeron una
expresión comparable a la de las PNL basadas en MC3, el lípido H
(p < 0,001) y el lípido M (p = 0,05) mostraron una expresión
Fig.
4C). En el caso del lípido H, la concentración máxima de
anticuerpos medida
24 h después de la inyección fue tres veces superior a la
concentración de anticuerpos medida con el material formulado
con MC3.

Para evaluar la tolerabilidad en los PSN, se monitorizó el lugar de

la inyección en busca de edema (Figura 4D) y eritema (Figura 4E)
1 y 3 días después de la inyección y se clasificó en función de la
gravedad. A pesar del aumento de la proteína

Terapia molecular: Nucleic Acids Vol. 15 Abril 2019 7

 Terapia molecular:
Ácidos nucleicos

Figura 4. Expresión e inmunogenicidad en primates no humanos

(A y B) Inmunogenicidad medida por (A) ELISA específica de H10 o (B) HAI en los días 0, 21 (3 semanas después de la primera dosis) y 42 (3 semanas después de la segunda
dosis). Cada dosis en monos cynomolgus contenía 5 mg de ARNm modificado que codificaba H10N8 formulado en PNL que contenían MC3 (triángulos grises), lípido H (círculos
verdes), lípido M (cuadrados naranjas), lípido P (diamantes morados), lípido Q (triángulos invertidos de color tostado) o lípido N (hexágonos amarillos) (n = 3 por grupo). (C) Niveles
circulantes de IgG (en microgramos por mililitro) tras una administración IM de 500 mg en monos cynomolgus de ARNm modificado que codifica anticuerpos de cadena pesada y ligera en
una proporción de peso 2:1 formulado en LNPs que contienen MC3 o lípidos nuevos (n = 3 por grupo). (D y E) Se monitorizó el lugar de la inyección para detectar (D) edema y (E)
eritema 1 y 3 días después de la inyección. (F) Niveles circulantes de IL-6 (en picogramos por mililitro) 6 h después de la administración.# p > 0,05;## p > 0,001, ANOVA de dos vías con
prueba de comparación múltiple de Dunnett de cada lípido frente a MC3 en cada punto temporal. **p > 0.01;
****p > 0,0001, prueba z de áreas bajo la curva (AUC) para cada nuevo lípido frente a MC3.

Los PSN inyectados con PNL a base de lípidos H no mostraron

Los niveles séricos de interleucina (IL)-6 fueron comparables para
signos de hinchazón o enrojecimiento 1 o 3 días después de la
todos los lípidos según el ANOVA unidireccional (Figura 4F). Las
inyección, y todos los PSN recibieron una puntuación de 0 tanto
PSN del grupo MC3 con los niveles más altos de
para edema como para eritema. Todos los demás lípidos novedosos
evaluados provocaron puntuaciones de leves a moderadas para
edema y eritema en al menos 1 animal dosificado. Un NHP del
grupo MC3 recibió una puntuación de 3 en edema el día 1 tras la
inyección, que se resolvió a una puntuación de 1 el día 3 tras la
inyección. Todos los lípidos probados, excepto el lípido H,
provocaron una puntuación de eritema de 1 en al menos una PSN.

8 Terapia molecular: Nucleic Acids Vol. 15 Abril 2019

 w ww .m ole c ul ar th er ap y . o r g
d e IL -6 ta m b ié n m o s t r a ron el nivel más
indica una fuerte respuesta inmune innata en ese animal
individual.

Para evaluar y comparar la tolerabilidad local de las diferentes

PNL lipídicas ionizables, administramos 0,01 mg o 0,1 mg de
ARNm exprimiendo prM-E del virus Zika formulado en MC3,
lípido H, lípido M, lípido P, lípido Q o lípido N en ratas Sprague-
Dawley IM. Se midieron las citocinas séricas en ratas que
recibieron tanto la dosis alta como la baja 6 h después de la
administración, utilizando un panel Luminex de 22plex. Se
observaron cambios en la eotaxina, GRO-alfa,

Terapia molecular: Nucleic Acids Vol. 15 Abril 2019 9

 Terapia molecular:
Ácidos nucleicos

Figura 5. Tolerabilidad en ratas

Se midieron las concentraciones séricas (en picogramos por mililitro) de las citocinas (A) eotaxina, (B) GRO-alfa, (C) IP-10, (D) RANTES y (E) MCP-1 6 h después de una única
administración IM de 0,01 mg o 0.1 mg de ARNm modificado que codifica prM-E del virus Zika formulado en LNPs que contienen MC3 (gris), lípido H (verde), lípido M (naranja), lípido P
(púrpura), lípido Q (bronceado) o lípido N (amarillo) (n = 3 por grupo). (F-I) Secciones histológicas representativas teñidas con H&E 2 días después de una única administración IM de 0,1
mg de ARNm modificado que codifica prM-E del virus Zika formulado en LNPs que contienen MC3 o lípido H en el (F y H) músculo y (G e I) piel. (F) músculo MC3; (G) piel MC3;
(H) músculo lipídico H;
(I) piel lipídica H.

linfocitos que distendían el endomisio, el epimisio y el

IP-10, RANTES y MCP-1 (Figuras 5A-5E). A excepción de IP-10
en la dosis de 0,01 mg, el lípido H indujo la menor producción
sistémica de citocinas.

Cuarenta y ocho horas después de la administración, se sacrificaron

los animales y se recogieron los puntos de inyección, se
parafisieron, se seccionaron, se tiñeron con H&E y fueron revisados
ciegamente por un patólogo (Tabla 1). Para evaluar, comparar y
clasificar la tolerabilidad local de cada PNL, se evaluaron y
clasificaron varios
células mixtas en el lugar de la inyección y en la dermis, la necrosis
El
ARNm formulado con MC3 fue el lípido probado peor tolerado,
mientras que el lípido H fue el mejor tolerado (Figuras 5F-5I).

Las ratas dosificadas con formulaciones de MC3 tanto a dosis altas

como bajas mación de células mixtas
dependiente de la dosis caracterizada por edema; numerosos
neutrófilos intactos y degenerados; macrófagos; y unos pocos
1 Terapia molecular: Nucleic Acids Vol. 15 Abril 2019
 www.moleculartherapy.or
tejido conectivo adyacente del músculo y comprimiendo las
Figuras 5F y S3A). También
se observó una degeneración y/o necrosis multifocal dependiente de la dosisvecespor células

extendió a la porción subcutánea de la piel (Figuras 5G y S3B). El

tejido subcutáneo estaba expandido por edema y numerosos
neutrófilos intactos y degenerados, macrófagos y unos pocos
linfocitos.

observada en las ratas a las que se administró lípido H fue menor

en magnitud y gravedad en comparación con las ratas a las que se
administró MC3 (Figura 5H). La cantidad relativa de neutrófilos
degenerados también fue menor, y cabe destacar que hubo menos
- ers. La
mación desde el lugar de la
inyección muscular al tejido subcutáneo fueron también menos
graves y con mucho menos edema que en los animales a los que se
administró MC3 (Figura 5I).

Terapia molecular: Nucleic Acids Vol. 15 Abril 2019 1

 Terapia molecular:
Ácidos nucleicos

Tabla 1. Resumen de patología

Formulación y dosis Necrosis de la de células Neutrófilos degenerados de células Neutrófilos degenerados

fibra muscular mixtas mixtas
MC3
0,01 mg 2.3 2.4 1.7 2 0
0,1 mg 2.3 2.7 3.3 2 1
Lípido H
0,01 mg 1 1.8 1 0 0
0,1 mg 1.3 2.9 2.3 1.3 0
Lípido M
0,01 mg 2 2 1.3 1.7 0
0,1 mg 1.7 2.7 2 2 0
Lípido P
0,01 mg 2.3 2.2 1.7 1.3 0
0,1 mg 2.3 2.8 2.3 2.3 0.7
Lípido Q
0,01 mg 2.3 2.2 2 0.7 0
0,1 mg 2 2.9 3 2.5 1
Lípido N
0,01 mg 0.7 1.4 2 0 0
0,1 mg 1.3 2 2.3 0 0
que codifica prM-E del virus Zika formulado en LNPs que contenían MC3 o lípido H. Se
registraron las puntuaciones histopatológicas medias en una escala de 0-4 para los eventos que ocurrían en el músculo y la piel.

DEBATE proteínas tras la administración intravenosa son los que se

Las vacunas de ARNm administradas con PNL pueden dar encuentran en el pK .11,13,23 Sin embargo, los mejores lípidos con
respuesta a numerosas necesidades médicas no satisfechas a las que
respecto a la expresión de proteínas tras la administración IV tenían
no se puede acceder con las tecnologías de vacunación actuales.
generalmente pKa s más bajos que los mejores lípidos para la
Múltiples informes del campo del siARN han demostrado que el
expresión de proteínas tras la administración IM. Lípidos como el V
lípido ionizable es el principal impulsor de la potencia de las
(pKa = 6,87) y el AC (pKa = 7,09) muestran poco a
PNL.11–13 En este trabajo, observamos el impacto de la identidad del
lípido ionizable en la expresión, inmunogenicidad y tolerabilidad
cuando se administra IM. Nuestra hipótesis de trabajo era que la
inclusión de un lípido biodegradable en una PNL daría lugar a
vacunas con mayor tolerabilidad, ya que el lípido se eliminaría
rápidamente del lugar de la inyección tras la administración del
ARNm, y otros tejidos también tendrían una exposición mínima al
lípido debido a la descomposición metabólica y la eliminación.
Curiosamente, a lo largo de nuestro cribado inicial, observamos
poca correlación entre la expresión y la inmunogenicidad de la
vacuna, lo que indica que la expresión por sí sola no es suficiente
para identificar formulaciones vacunales de ARNm mejoradas.
También observamos una divergencia en las mejores formulaciones
de expresión entre las vías de administración IV e IM.

Se cree que el pK ionizable de los lípidosa afecta a la opsonización

escape endosomal. El pK óptimo de los lípidos a para la eliminación

mediada por siRNA en el hígado se sitúa entre 6,2 y 6,5, en
consonancia con nuestro hallazgo de que el pK a óptimo para el
transporte y la expresión de ARNm en el hígado se sitúa entre 6,2 y
6,8. Sin embargo, los mejores lípidos con respecto a la expresión de

1 Terapia molecular: Nucleic Acids Vol. 15 Abril 2019

 w w w .m o le c ul ar th e ra p y .or g
La s L N P n o m o s tr ar o n e xpresión tras la
algunos de los lípidos más exprimidos tras la administración IM,
lo que indica una diferencia aún por determinar entre estas dos
vías de administración. Diferentes tipos de células han
mostrado

necesidad de trabajo adicional para comprender mejor el

rendimiento de las PNL en el contexto de la entrega de ARNm a
través de múltiples tejidos. 25,26 También descubrimos que el pK
lipídico óptimoa para la inmunogene- nicidad se situaba entre 6,6 y
6,8. Independientemente del transporte citosólico de ARNm, el pK
de los lípidosa también puede desempeñar un papel en las
interacciones de la formulación con el sistema inmunitario.
Aunque esta área de investigación no se ha explorado a fondo, un
informe reciente ilustra cómo los lípidos ionizables pueden
impulsar la captación y transfección en células inmunitarias, lo
que demuestra áreas potenciales de investigación para la
administración de vacunas de ARNm mediada por PNL. 27 Aunque
se descubrió que el pK a de los lípidos era un factor importante para
la inmunogenicidad, no era el único factor, ya que muchos lípidos
se encontraban dentro de ese rango de pKa y no eran mejores que
el control MC3. Además de las diferencias en pKa , el lípido H

en consonancia con nuestro informe publicado anteriormente

sobre esta clase de lípidos (Figura S4).23

Múltiples informes anteriores hablan de la necesidad de un

equilibrio entre la expresión y la estimulación inmunitaria para
una po- tencia óptima de la vacuna de ARNm.28,29 Pollard et al.
documentaron el impacto negativo de la señalización del
interferón en la magnitud de la expresión del ARNm.29 Todos los
ARNm que utilizamos conte
uridina para minimizar la activación inmunitaria innata.24,30 Dado
que el ARNm es inmuno-silencioso en comparación con el ARNm
canónico que contiene uridina, tanto la selección de antígenos
como la señalización por interferón pueden tener un impacto
negativo en la magnitud de la expresión del ARNm.

Terapia molecular: Nucleic Acids Vol. 15 Abril 2019 1

 Terapia molecular:
Ácidos nucleicos

y el sistema de administración son importantes para generar

ionizables para su inclusión en formulaciones de vacunas de ARNm.
respuestas inmunitarias potentes. Se ha demostrado que las LNP
Nos centramos en el componente lipídico ionizable de la PNL, ya
son adyuvantes eficaces para las vacunas de subunidades proteicas,
que se ha demostrado previamente que es el principal impulsor de la
pero no está clara la importancia de ese mecanismo adyuvante para
potencia y tolerabilidad de la PNL. Dada su mejor tolerabilidad y
inducir respuestas inmunitarias a partir de una vacuna de ARNm.
mayor expresión de antígeno, las formulaciones que identificamos
Anteriormente demostramos que las LNP basadas en MC3
tienen potencial para aplicaciones de inmunización activa y pasiva.
generaban una activación inmunitaria innata y un potente
31
La histopatología pre sentada aquí para el lípido
H, comparada con la de MC3, es consistente con una tolerabilidad
mejorada y una estimulación inmune innata reducida. La reducción

citocinas sistémicas apoyan la hipótesis de que las vacunas de

ARNm pueden no requerir una fuerte respuesta adyuvante para
obtener respuestas inmunitarias potentes.

La tolerabilidad y seguridad mejoradas mediadas por la inclusión

de lípidos biodegradables dentro de las PNL se correlacionan bien
con la semivida de los lípidos tras la administración IV.23,32 Los
lípidos ionizables de plomo en este estudio mostraron una
biodegradabilidad mejorada mientras mantenían los títulos
inmunitarios en comparación con MC3. Los datos de tolerabilidad
sugieren que esta mayor biodegradabilidad conduce a una
ión en el lugar de la inyección. Nuestros
datos también muestran que no se requiere un tiempo de residencia
prolongado del lípido ionizable tras la transfección para obtener una
respuesta inmunitaria robusta. De hecho, se prefiere la eliminación
a la resid
indeseable en el lugar de la inyección más allá del momento en que
se elimina el antígeno proteico. Curiosamente, los datos también
indican que la biodegradabilidad no es el único factor en la
tolerabilidad: el lípido H fue el lípido mejor tolerado y, sin embargo,
mostró una biodegradabilidad similar a la de los otros lípidos
principales probados. La degradación y la tolerabilidad de los
metabolitos lipídicos contribuyen probablemente a la tolerabilidad
de cualquier formulación.

Otros componentes, como el PEG, pueden desempeñar un papel en

la po- tencia de la vacuna debido al impacto de las respuestas anti-
PEG que han sido bien descritas para los terapéuticos liposomales
administrados por vía intravenosa. Hasta la fecha, no hay
información publicada sobre el impacto de las respuestas anti-PEG
en otras vías de administración. En el c a m p o de la
administración de vectores víricos se ha descrito cómo la
inmunidad antivectorial puede reducir sustancialmente la respuesta
inmunitaria e incluso impedir por completo el refuerzo de la
vacuna cuando se utiliza un vector homólogo tanto para el cebado
como para el refuerzo.33 Dado que observamos un aumento
sustancial de los títulos inmunitarios tras una segunda dosis, no
creemos que una respuesta neutralizante antiPEG afecte a las
vacunas basadas en PNL que describimos aquí.

La tolerabilidad de cualquier vacuna nueva es un criterio de

rendimiento clave, ya que las vacunas se administran a individuos
sanos a lo largo de diferentes etapas de la vida, desde neonatos de

rendimiento y la evaluación de la tolerabilidad de nuevos lípidos

1 Terapia molecular: Nucleic Acids Vol. 15 Abril 2019

ew raw py
w .m o le
.o rg cu la rt h
MM
Y A T
É TE R IA L E S
ODOS representó gráficamente frente al pH
e del tampón de ensayo. Al
Síntesis y formulación de ARNm por triplicado con logaritmo del punto de in- PNL.
Las secuencias UTR y los procesos de producción de ARNm se reactivos TNS y LNP.
realizaron como se ha descrito previamente.19 Las mediciones de
fluorescencia se
sintetizó in vitro mediante transcripción mediada por la ARN
realizaron con un lector
polimerasa T7 a partir de una plantilla de ADN linealizada, que
de microplacas Synergy
incorpora las UTRs 50 y 30 H1 (BioTek
utiliza Cap1 y la sustitución completa de la uridina por N1-metil- Instruments, Winooski,
VT, EE.UU.), con
procede de la cepa H10N834y el ARNm que codifica el prM-E del excitación a 325 nm y
Zika utilizó las secuencias señal de la IgE humana emisión a 435 nm. La
(MDWTWILFLVAAATRVHS) y los genes prM y E de una cepa intensidad de
asiática del ZIKV (Micronesia 2007; GenBank: EU545988), que fluorescencia se
es
>99% idéntica a las cepas estadounidenses circulantes. 35 Todas las
secuencias de codificación se generaron mediante un algoritmo
propio.

Las formulaciones de LNP se prepararon mediante un

procedimiento modificado de un método descrito
anteriormente.17 etanol en
proporciones molares de 50:10:38,5:1,5 (lípido
ionizable:DSPC:cho- lesterol:lípido PEG). Las LNP formuladas
con el lípido ionizable MC3 se utilizaron como control a lo largo
de estos estudios y se produjeron como se ha descrito
previamente.11 Los nuevos lípidos ionizables se sintetizaron como
se ha descrito anteriormente.36 La mezcla de lípidos se combinó
con un
4,0) o acetato de soja 25 mM (pH 5,0) que contenía ARNm en
una proporción de volumen de 3:1 (acuoso:etanol) utilizando un
- tems, Vancouver,
BC, Canadá). La proporción de nitrógeno presente en la
relación ionizable N:P se fijó en 5,67 para cada formulación. Las
formulaciones se dializaron contra PBS (pH 7,2) o 20 mM Tris
(pH 7,4) con 8% de sacarosa en casetes de diálisis Slide-A-Lyzer
(Thermo Scien-
18 h. Las formulaciones se concentraron utilizando
ultracentrífugos Amicon (EMD Millipore, Billerica, MA,
EE.UU.),
y se
almacenaron a 4o C (PBS) o -20o C (20 mM Tris-8% sacarosa)
hasta su uso. Se analizó el tamaño de las partículas, la
encapsulación de ARN y la endotoxina de las formulaciones. Se
comprobó que todas las LNP tenían un tamaño de entre 50 y
142 nm mediante dispersión dinámica de la luz, con una
encapsulación superior al 69% y una endotoxina <3 EU/mL.
Los lípidos de plomo seleccionados para su posterior
evaluación tenían entre 66 y 107 nm, con una encapsulación
superior al 72%.

pKa Análisis
Los tampones de ensayo (tampones que contienen 150 mM de
cloruro sódico, 10 mM de fosfato sódico, 10 mM de borato sódico
y 10 mM de citrato sódico) se ajustaron con hidróxido sódico o
ácido clorhídrico para crear tampones con rangos de pH entre pH
3 y pH 11,5. En una placa negra de 96 pocillos se combinaron 300
mM de sal sódica de ácido 6-(p-toluidino)-2-naftalenosulfónico en
DMSO (reactivo TNS) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.),
PNL y tampón de ensayo. Cada unidad de pH de tampón se repitió

Terapia molecular: Nucleic Acids Vol. 15 Abril 2019 1

le asignó el pK aparentea de la
Terapia molecular:
Ácidos nucleicos

1 Terapia molecular: Nucleic Acids Vol. 15 Abril 2019

 w w w. m o le cu la r th er ap y .o rg completamente la HA fue el título notificado para esa
y se u ti li zó s u e ro p ar a e l análisis de

Todos los experimentos con animales y su cría siguieron las Therapeutics, Cambridge
directrices de los NIH (NIH publication #8023, octava edición) y
del Consejo Nacional de Investigación d e EE.UU.. Se adquirieron
ratones BALB/c hembra de 5-8 semanas de edad a Charles River
Laboratories (Wilmington, MA, EE.UU.) y se alojaron en Moderna
Therapeutics (Cambridge, MA, EE.UU.). Los ratones se
aclimataron durante al menos 3 días antes de iniciar el estudio.
estudio. Los estudios iniciales de cribado murino evaluaron la
expresión y la inmunogenicidad en el mismo estudio, ya que el
trabajo previo demostró que la coformulación de los dos ARNm no
afectaba a los resultados individuales (datos no mostrados). En los
días 1 y 22, se inyectaron en los cuádriceps de los ratones 50 mL de
formulaciones de nanopartículas lipídicas que encapsulaban una
cantidad igual de ARNm de luciferasa y de H10N8. 6 h después de
la dosis, los animales recibieron una inyección intraperitoneal de 3
mg de luciferina y se les tomaron imágenes en un sistema de
imágenes in vivo (IVIS Spectrum, PerkinElmer, Waltham, MA,
EE.UU.). Los días 21 y 36, se sangró a los ratones por la cavidad
submandibular. El suero se separó de la sangre por centrifugación y
luego se utilizó para evaluar la inmunogeneidad mediante ELISA.
Se calcularon las medias geométricas de los grupos para cada PNL
evaluada y se compararon con la media geométrica del grupo MC3
del mismo estudio (expresión) o de todos los grupos MC3 probados
(inmunogenicidad).

Eliminación de lípidos en un modelo murino

Las hembras de ratón CD-1 se adquirieron y alojaron en los
laboratorios Charles River. Los ratones se aclimataron durante al
menos 3 días antes de iniciar el estudio. Se inyectaron 50 ml de
ARNm de luciferasa formulado en LNPs por vía IM. A las 1, 2, 4, 8 y
24 h de la inyección, se sacrificaron 3 ratones y se recogieron el
plasma, el bazo, el hígado, el músculo del lugar de la inyección y
los ganglios linfáticos. Los tejidos se congelaron y se enviaron a
Agilux (Worcester, MA, EE.UU.) para evaluar los lípidos restantes
mediante espectroscopia de masas.

Cuantificación de lípidos por LC-MS/MS Las muestras de tejido se

homogeneizaron con la sonda Omni tras la adición de 19
equivalentes (p/v) de agua. Los lípidos y las proteínas se
precipitaron y analizaron frente a patrones de calibración
preparados en un blanco coincidente. La separación cromatográfica
y la cuantificación se realizaron con un sistema de cromatografía
líquida y espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS). Las
muestras se separaron en una columna Clipeus C8 (Higgins
Analytical, Mountain View, CA, EE.UU.) equili- brada con un
35% de disolvente A que contenía 5 mM de ácido fórmico en un
50% de metanol (H2 O:MeOH:FA, 50:50:1) y un 65% de disolvente
B que contenía 5 mM de ácido fórmico en metanol (MeOH:FA,
100:1; Thermo Fisher Sci-
detección de señales se utilizó un sistema MS/MS
de triple cuadrupolo (Applied Biosystems, API 5500) operado en
modo de iones positivos.

Tolerabilidad en un modelo de rata

Las ratas hembra Sprague-Dawley se adquirieron en los
laboratorios Charles River y se alojaron en Moderna
Terapia molecular: Nucleic Acids Vol. 15 Abril 2019 1
 Terapia molecular:
Ácidos nucleicos
MA, EE.UU.. A las ratas se les inyectaron 100 ml que contenían
10 o 100 mg de ARNm formulado en PNL. 6 h después de la
inyección, se extrajo sangre,

1 Terapia molecular: Nucleic Acids Vol. 15 Abril 2019

 w w w. m o le cu la r th er ap y .o rg completamente la HA fue el título notificado para esa
y se u ti li zó s u e ro p ar a e l análisis de
TX, EE.UU.). 48 h después de la inyección, se sacrificaron las glóbulos rojos de pavo (Lampire Biological Laboratories, Everett,
ratas y se recogieron el hígado, el lugar de la inyección, el PA, EE.UU.) a los pocillos de las placas de 96 pocillos, se mezclaron
músculo y la piel. Los tejidos se seccionaron, se tiñeron con H&E, y se incubaron a temperatura ambiente durante 45
fueron evaluados por un patólogo ciego certificado y se
clasificaron en una escala de 0 a 5 en función de la gravedad de la
neurosis miocárdica, la infiltración de células mixtas en el
músculo y la piel y los neutrófilos degenerados en el músculo y la
piel.

Expresión e inmunogenicidad en PSN

Los estudios con PSN se llevaron a cabo en los Laboratorios
Charles River (Sherbrooke, QC, Canadá) con monos cynomolgus
ingenuos, de 2 a 5 años de edad y 2-3 kg de peso. Los animales se
alojaron en jaulas perforadas de acero inoxidable, en un ambiente
con temperatura y humedad controladas (21-26o C y 30-70%,
respectivamente), con un ciclo automático de 12 h/12 h de
oscuridad/luz. Se alimentó a los animales con el pienso para

al día. Las pruebas de tuberculina se realizaron a la llegada a las

instalaciones de ensayo. El plan y los procedimientos del estudio
fueron aprobados por el IACUC de los servicios preclínicos de
Sherbrook (PCS-SHB). Los experimentos con animales y su cría
se ajustaron a las directrices de los NIH (Publicación nº 8023,
octava edición), el Consejo Nacional de Investigación de EE.UU.
y el Consejo Canadiense para el Cuidado de los Animales
(CCAC).

Para evaluar la expresión, se inyectaron 300 ml de ARNm (cadena

pesada y cadena ligera en una proporción peso:peso de 2:1) en
PNLs de cynomolgus por vía IM que codificaban un anticuerpo.
Se monitorizó el lugar de la inyección para detectar eritema y
edema y se clasificó la gravedad de 0 (sin reacción) a 4 (reacción
grave). Se recogió sangre 6 h antes de la dosis y 2, 6, 24, 48, 96,
168, 264 y 336 h después de la inyección para medir los niveles de
anticuerpos. La sangre de -6, 48 y 336 h se utilizó para medir los
marcadores de hematología, coagulación, dímero D y química
clínica.

Para evaluar la inmunogenicidad, los monos cynomolgus

recibieron inyecciones IM de 5 mg de PNL formulada con ARNm
H10N8 en 100 ml los días 1 y 22. Se recogieron 0,5 ml de sangre
de la vena periférica el día 22 y el día 43 después de la dosis y se
centrifugaron a 1.200 x g durante 10 minutos a 4 C para
separar el suero. Se recogieron 0,5 mL de sangre de una vena
periférica el día 22 y el día 43 después de la dosis y se
centrifugaron a 1200 x g durante 10 min a 4o C para separar el
suero. El suero se almacenó a -80o C hasta su análisis mediante
el ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HAI) y ELISA.

Ensayo HAI
Los títulos de IHA de las muestras de suero se determinaron
mediante un protocolo descrito anteriormente.17 Los sueros se
trataron primero con la enzima destructora de receptores (RDE)
para inactivar los inhibidores no específicos. La RDE se inactivó
incubándola a 56o C durante 30 minutos. Los sueros tratados se
diluyeron en placas de 96 pocillos, se mezclaron con una cantidad
estandarizada de HA recombinante (8 unidades de HA de H10N8;
Medigen, Frederick, MD, EE.UU.) y se incubaron durante 30
minutos a temperatura ambiente. A continuación, se añadieron
minutos. La muestra de suero más diluida que Terapia molecular: Nucleic Acids Vol. 15 Abril 2019 1
 Terapia molecular:
Cada muestra de suero se analizó por triplicado y los Ácidos nucleicos
resultados se presentan como la media geométrica de los 3
resultados.

1 Terapia molecular: Nucleic Acids Vol. 15 Abril 2019

 w w w. m o le cu la r th er ap y .o rg completamente la HA fue el título notificado para esa
y se u ti li zó s u e ro p ar a e l análisis de

Anti-H10N8 ELISA Revisión y edición, K.J.H., M.J.M., y L.A.B.; Visualización, K.J.H.,

Las placas de 96 pocillos Nunc MaxiSorp (Thermo Fisher, I.M., y
Rochester, NY, EE.UU.) se recubrieron a 100 ml por pocillo con 1 L.A.B.; Supervisión, K.E.B., C.M., J.J.S., M.G.S., O.A. y G.C.
mg/mL de proteína H10 en PBS durante toda la noche a 4o C. Las
placas se lavaron tres veces con PBS que contenía 0,1% de Tween
20 (tampón de lavado). Se añadieron 200 mL de Superblock
(Pierce, Rockford, IL, EE.UU.) a cada pocillo y se incubaron a 37o
C durante al menos 1,5 h y después se lavaron tres veces con
tampón de lavado. En cada pocillo, se añadieron 100 mL de PBS
que contenían 5% de suero de cabra (GIBCO, Gaithersburg, MD,
EE.UU.) con 0,1% de Tween 20, y el suero se diluyó en serie y se
incubó durante 2 h a 37o C. Se lavaron las placas tres veces y se
añadieron 100 mL de anticuerpo IgG antiratón de cabra conjugado
con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Southern Biotech,
Birmingham, AL, EE.UU.) diluido 1:20.000 en PBS que contenía
5% de suero de cabra con 0,1% de Tween 20 y se incubaron
durante 1 h a 37o C. Se lavaron las placas tres veces y se añadieron
100 mL de sustrato de peroxidasa SureBlue TMB Microwell
(Kirke- gaard & Perry Labs, Milford, MA, EE.UU.) a cada pocillo
y se incubaron durante 15 min. Se añadieron 100 mL de solución
de parada de TMB (Kirkegaard & Perry Labs, Milford, MA,
EE.UU.) a cada pocillo y se leyeron las placas a 450 nm. El valor
medio del blanco se restó de cada muestra. Los títulos se

DO 450nm (densidad óptica 450 nm) = 0,6 (normalizado a un

estándar incluido en cada placa).

Detección de anticuerpos monoclonales

Las placas QUICKPLEX de 96 pocillos (MSD) se recubrieron con
100 mg de proteína de captura de 1 mg/mL en PBS por pocillo y se
incubaron durante la noche a 4o C. Las placas se lavaron con PBS
con 0,5% de Tween 20 tres veces. Se realizaron diluciones seriadas

100 ml en la placa y luego se incubaron a temperatura ambiente

durante 1,5 h, con agitación a 120 rpm. Las placas se lavaron con
PBS con 0,5% de Tween 20 tres veces. Se añadieron 50 mL de IgG
antihumana de cabra (sulfoetiquetada) afín a 0,5 mg/mL a cada
pocillo y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente, con
agitación a 120 rpm. Tras la incubación, las placas se lavaron seis
veces y se añadieron 150 mL de tampón de lectura MSD T a cada
pocillo. Las placas se leyeron en un instrumento MSD (Meso Scale
Diagnostics, Rockville, MD, EE.UU.).

INFORMACIÓN COMPLEMENTARIA
La Información complementaria incluye Métodos complementarios

https://doi.org/10. 1016/j.omtn.2019.01.013.

CONTRIBUCIONES DE LOS AUTORES

Conceptualización, G.C. y L.A.B.; Metodología, K.J.H., K.E.B., E.J.
y L.A.B.; Análisis formal, K.J.H. e I.M.; Investigación, K.J.H., E.J.,
A.
Lee, A.W., O.Y., S.H., J.D., B.M.G., T.K. y A. Lynn;
Redacción - Borrador original, K.J.H., y L.A.B.; Redacción -

minutos. La muestra de suero más diluida que Terapia molecular: Nucleic Acids Vol. 15 Abril 2019 1
 Terapia molecular:
Ácidos nucleicos
CONFLICTOS DE INTERESES
Todos los autores son empleados actuales o anteriores de
Moderna Therapeutics y poseen opciones sobre acciones y/o
acciones de la empresa.

2 Terapia molecular: Nucleic Acids Vol. 15 Abril 2019

 www.moleculartherapy.or
AGRADECIMIENTOS
Nos gustaría dar las gracias al grupo de Producción Preclínica de
Moderna por la producción de ARNm y al grupo de Ciencias No
Clínicas de Moderna por los experimentos in vivo. Este trabajo fue
financiado por Moderna Therapeutics.

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marzo de 2017, y publicada el 27 de julio de 2017.